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Analise funcional do regulador de transcrição do tipo bZIP AtbZIP9 de Arabidopsis thaliana atraves da superexpressão de seus genes alvos / Fucntional characterization of the Arabidopsis thaliana bZIP transcription factor AtbZIP9 by overexpression of its target genesSilveira, Amanda Bortolini, 1983- 28 March 2007 (has links)
Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Silveira_AmandaBortolini_M.pdf: 20873886 bytes, checksum: 0c34c8a141f7bb11f8f3176ba7a976e0 (MD5)
Previous issue date: 2007 / Resumo: O crescimento e o desenvolvimento dos organismos são baseados na capacidade celular de expressão gênica diferencial que resulta, principalmente, do controle da taxa de iniciação da transcrição por fatores reguladores de transcrição (FTs). FTs do tipo Basic Leucine QQjJer(bZIP) fQram descritos em todos os eucariotos. Seu domínio conservado é constituído de uma região de ligação ao DNA rica em aminoácidos básicos, flanqueada a um zíper de leucinas responsável pela dimerização. Em angiospermas, os bZIPs são reguladores importantes de processos específicos como fotomorfogênese, desenvolvimento de órgãos, elongação celular, controle do balanço de carbono/nitrogênio, mecanismos de defesa, via de sinalização de hormônios e sacarose, controle osmótico e florescimento. Mostramos que os genomas de Arabidopsis thaliana e Orysa sativa
codificam para um conjunto completo e não redundante de 76 e 113 fatores bZIP respectivamente, que foram organizados em 11 grupos de proteínas evolutivamente relacionadas e 33 Possíveis Grupos de Genes Ortólogos (PoGO) de mono e eudicotiledôneas, o que deve permitir racionalizar o processo de caracterização funcional destes fatores em angiospermas. O Grupo C, que inclui genes homólogos ao lócus de regulação Opaco-2 (02) de milho, está organizado em três PoGOS, que possivelmente desempenham três funções ancestrais de angiospermas. Em Arabidopsis estas três
possíveis funções ancestrais estão representadas por quatro genes (bZIP' 02 !1omologous, Bzo2h), Bzo2h3/AtbZIP63 (PoGO C1), Bzo2h1/AtbZIP10 e Bzo2h4/ AtbZIP25 (PoGO C2) e Bzo2h2/AtbZIP9 (PoGO C3). Visando um melhor conhecimento sobre a evolução das funções dos fatores bZIP de angiospermas do Grupo C, iniciamos a caracterização funcional de~tes quatro reguladores, focando principalmente em AtbZIP9, um gene único representativo de uma função ancestral de angiospermas e cujo papel ainda é desconhecido. Notamos que a expressão de AtbZIP9 é restrita as células do floema e regulada por glicose, ácido abscísico e citocinina, sugerindo que este gene integra as vias de sinalização destes sinais metabólicos e hormonais no floema. Abordagens de genética reversa como RNAi, knockout e superexpressão não permitiram elucidar de maneira clara a atuação de AtbZIP9 no ciclo de vida de Arabidopsis, indicando que mecanismos de regulação pós-transcricional e/ou redundância genética atuam sobre
este gene. Visando dar continuidade e ampliar o estudo funcional de AtbZIP9, foram obtidas linhagens transgênicas de Arabidopsis expressando versões modificadas deste gene que codificam para proteínas ativadoras constitutivas fortes da transcrição. Estas novas versões de AtbZIP9 são teoricamente capazes de ativar de maneira constitutiva a expressão dos genes alvos de AtbZIP9, contornando assim, as dificuldades decorrentes
da análise de famílias gênicas que apresentam redundância funcional. Quando comparados a plantas selvagens, transformantes primários para ativadores constitutivos fortes apresentaram diversas alterações de morfologia foliar, além de mudanças metabólicas e fisiológicas como acúmulo de compostos fenólicos em folhas, sintomas de morte celular e senescência. A análise destes transformantes ainda sugere uma possível
participação de AtbZIP9 no controle do desenvolvimento do sistema vascular de raízes e folhas. Suspeitamos que as alterações de morfologia foliar e fisiologia observadas possivelmente representem conseqüências de mudanças nas propriedades funcionais de transporte do floema, decorrentes de defeitos no processo de diferenciação e organização das células do cilindro vascular / Abstract: Transcriptional regulatory factors (TFs) play an important role in controlling growth and development of ali organisms. bZIPs TFs have been described in ali eukaryotes and are characterized by a basic aminoacid rich DNA binding domain and a leucine zipper, responsible for dimerization. bZIPs have been reported to act in several different plantspecific processes such as organ development, cell elongation, defense mechanism,
hormones and sucrose signalization, light response, control of nitrogen/carbon balance, osmotic control and flowering. We showed that Arabidopsis thaliana and Orysa sativa genomes encode a complete and non-redundant set of 76 and 113 bZIP transcription factors, respectively, which were divided into 11 unique groups of homologous genes. More detailed phylogenetic analysis led to the identification of 33 Possible Groups of Monocot and Eudicot Orthologous Genes (PoGO), which allows rationalizing functional studies in angiosperms. Group C, which includes genes homologous to the maize
Opaque-2 locus, is formed by three PoGOs, suggesting that this group represents three ancestral functions among angiosperms. In Arabidopsis these three possible ancestral functions may be represented by the bZIP Qpaque-2. homologous genes (Bzo2h), Bzo2h3/AtbZIP63 (PoGO C1), Bzo2h1/AtbZIP10 and Bzo2h4/AtbZIP25 (PoGO C2) and Bzo2h2/AtbZIP9 (PoGO C3). To get insight into the evolution pattern and function of
Group C members, we have iniciated the functional characterization of the Bzo2h genes concentrating initially on AtbZIP9, a unique gene that represents an ancestral function and for which no functional informational is available. We showed that AtbZIP9 expression is restricted to phloem cells and regulated by glucose, abscisic acid and cytokinin, suggesting that this gene is an element of the signalization pathways of these metabolic
and hormonal signals in the phloem. Reverse genetic approaches such as RNAi, knockout and superexpression failed to reveal the biological function of AtbZIP9 in Arabidopsis life cycle and suggested that post-transcriptional regulation and/or functional redundancy may act on AtbZIP9. In order to improve our Rnowledge on AtbZIP9 function, Arabidopsis transgenic lines expressing constitutive transcriptional activator versions of AtbZIP9 were
obtained. Since such modified versions of AtbZIP9 are theoretically able to promote the superexpression of AtbZIP9 target genes, this strategy should be independent of functional redundancy. When compared to wild type plants, primary transformants for constitutive transcriptional activator versions of AtbZIP9 showed alterations of leaf morphology, as well as metabolic and physiologic modifications, such as phenolic compound accumulation in leaves, cell death and senescence symptoms. Analyses of this transformants also suggest that AtbZIP9 is possibly involved in the control of leaf and root
vascular system development. We suspect that the alteration of leaf morphology and physiology observed in primary transformants possibly reflects consequences of changes in phloem transport functional properties, due to defects in vascular cylinder cell differentiation and organization / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular
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Transcrições para violão: soluções técnico-musicais para interpretação de obras selecionadas de Claude Debussy e Maurice RavelCarvalho, Diogo Salmeron 05 November 2012 (has links)
Esta dissertação apresenta doze transcrições, realizadas pelo próprio autor, de obras selecionadas de Maurice Ravel e Claude Debussy. A realização das transcrições teve como referencial teórico a análise de duas das mais importantes transcrições da história do violão: - Siete Canciones Populares Españolas - original de Manuel de Falla para piano e voz, transcritas para violão e voz por Miguel Llobet - Venetian Gondola Song - original de Felix Mendelssohn para piano (livro I das Canções sem palavras, op. 19), transcrita por Francisco Tárrega O livro Guidelines for Style Analysis, de Jan LARUE foi o referencial teórico para as análises musicais. Os comentários analíticos se restringem à sua relação com os processos de transcrição. A arte da transcrição está diretamente associada ao violão e seu desenvolvimento. Uma perspectiva da história da transcrição para violão a partir do final do século XIX é apresentada e discutida. Soma-se a esta discussão a figura de Franz Liszt, um dos principais transcritores (para piano) da história da música. As transcrições são analisadas a fim de se abordar a problemática que cada uma envolve. A \"fidelidade musical\" é o principal foco deste trabalho, ou seja, a realização dos elementos musicais e ideia estética da obra original em seu novo meio: o violão. Para isso é necessário realizar uma transcrição idiomática, e os processos utilizados para esta busca são também apresentados e discutidos. / This dissertation presents twelve transcriptions, made by the own author, of selected works by Maurice Ravel and Claude Debussy. The realization of the transcriptions had as a theorical referential the analysis of two of the most important transcriptions of the history of the guitar: - Siete Canciones Populares Españolas - original work by Manuel de Falla for piano and voice, transcribed for guitar and voice by Miguel Llobet - Venetian Gondola Song - original work by Felix Mendelssohn for piano (book I from the Songs without words, op. 19), transcribed by Francisco Tárrega The book Guidelines for Style Analysis, by Jan LARUE was the theorical reference for the musical analysis. The analytical comments are confined to their relationship with the processes of transcription. The art of transcription is directely associated to the guitar and its development. A perspective of the history of transcription for the guitar starting at the middle of the XIX century is presented and discussed. Adds to this discussion the figure of Franz Liszt, one of the most important transcribers (for the piano) in the history of music. The transcriptions are analysed in order to address the problem that each one involves. The \"musical fidelity\" is the main focus of this work, namely the realization of musical elements and aesthetic idea of the original work on its new instrument: the guitar. To achieve this is necessary to work on an idiomatic transcription, and the processes used on this quest are also presented and discussed.
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Redução da expressão do GLUT4 induzida por palmitato não envolve estresse de retículo endoplasmático em células musculares L6. / Decreased expression of GLUT4 palmitate-induced does not involve endoplasmic reticulum stress in L6 muscle cells.Silva, Patricia Ebersbach 11 December 2013 (has links)
Altas concentrações de ácidos graxos saturados desencadeiam resistência à insulina no músculo esquelético e o estresse de retículo endoplasmático (RE) é sugerido neste processo. Este estudo objetivou investigar, em células musculares L6, os efeitos do tratamento com palmitato sobre o estresse de RE e a ativação do NF-kB, relacionando-os com o prejuízo na expressão do GLUT4. Pelos resultados, observou-se que o tratamento com 0,75 mM de palmitato induziu redução no conteúdo de GLUT4 e Slc2a4. Os marcadores de estresse como GRP78, PERK/EIF2a e IRE1a/XBP-1/TRAF2 apresentaram pouca ativação. O fator transcricional NF-kB apresentou-se aumentado em seu conteúdo proteico e RNAm. A atividade de ligação do NF-kB à região promotora do Slc2a4 mostrou aumento independente do grau de fosforilação de IKK. Em suma, observou-se que o palmitato reprime a expressão do Slc2a4 e que induz pouco estresse de RE em células L6. Por outro lado, a participação do NF-kB parece ser importante no controle deste fenômeno reduzindo a expressão do Slc2a4 e prejudicando a homeostasia da glicose. / High concentrations of saturated fatty acids trigger insulin resistance in skeletal muscle and endoplasmic reticulum stress (ER) is suggested in this process. This study aimed to investigate, in L6 muscle cells, the effects of palmitate treatment on ER stress pathways and activation of NF-kB, relating them to the impaired expression of GLUT4. The results showed that treatment with 0.75 mM of palmitate induced reduction in the amount of GLUT4 and Slc2a4. Stress markers such as GRP78, PERK/EIF2a and IRE1a/XBP-1/TRAF2 showed little activation. The transcription factor NF-kB were increased in protein content and mRNA. The binding activity of NF-kB to the promoter region of Slc2a4 showed increased independent from the phosphorylation of IKK. Finally, it was observed that palmitate represses the expression of Slc2a4 and that this fatty acid induces little activation of reticulum stress pathways in L6 cells. On the other hand, the involvement of NF-kB appears to be important to control this phenomenon, reducing the expression of Slc2a4 and impairing glucose homeostasis.
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Estudo da regulação transcricional do COL18A1 e análise funcional do domínio Frizzled / Study COL18A1 transcription regulation and function analysis of Frizzled domainKague, Erika 19 June 2009 (has links)
A conclusão do seqüênciamento do genoma de múltiplos vertebrados trouxe um importante desafio para entender e predizer função, particularmente para seqüências não-codificantes, a partir de seqüências primarias de DNA. A hipótese de que a conservação evolutiva prediz seqüências funcionais é comumente aceita, inclusive para seqüências envolvidas na regulação da transcrição gênica, mesmo que a conservação de seqüências tenha gerado imperfeitas predições de enhancers (acentuadores) funcionais. O colágeno tipo XVIII é um componente da maioria das membranas basais; mutações no gene COL18A1 levam a síndrome de Knobloch, uma doença autossômica recessiva caracterizada por degeneração vitreoretiniana e macular e encefalocele occipital. O COL18A1 tem 43 exons que transcrevem três isoformas a partir de dois promotores diferentes. As três isoformas apresentam um complexo modelo de expressão tecido-específico, incluindo expressão em rim, pulmão, cérebro e retina. Os níveis de expressão do COL18A1 são considerados clinicamente importantes na vasculogenese, e em predisposição para o hepatocarcinoma e diabetes tipo 2. Dessa forma, a identificação de regiões regulatórias fornecerá indícios sobre a regulação da expressão do COL18A1 em estados normal e patogênico. Além disso, a endostatina e o FRZC18 são fragmentos proteolíticos do colágeno XVIII envolvidos na sinalização Wnt. No entanto, o papel in vivo do FRZC18 ainda não foi estudado. Uma profunda investigação do papel deste domínio na via de sinalização Wnt é indubitavelmente necessária, bem como a compreensão da regulação do COL18A1 pela via de Wnt. Empregamos um sistema eficiente de teste em zebrafish para analisar o potencial funcional de elementos enhancers na regulação transcricional do COL18A1. Identificamos quatro elementos enhancers que controlam a transcrição consistente com o COL18A1 endógeno de zebrafish, em tecidos incluindo retina, rim, vasos sanguíneos, intestino, cartilagem e fígado. Apesar dos algoritmos utilizados não tenham detectado conservação em seqüências não-codificantes de humanos à teleósteos no lócus do COL18A1 estudado, as seqüências humanas funcionaram apropriadamente em zebrafish transgênicos. Adicionais análises computacionais post hoc revelaram similaridade entre seqüência humana e de zebrafish dentro ou próximo das quatro regiões enhancers. Testamos funcionalmente o FRZC18 com superexpressão de seu RNAm em embriões de zebrafish. Este experimento resultou em embriões com fenótipos que assemelharam à mutantes da via não-canônica de Wnt (slb e ppt). Este resultado aponta o FRZC18 como um antagonista da via de sinalização não-canônica de Wnt, possivelmente por interação com Wnt11 e Wnt5. Dissecamos o promotor 1 do COL18A1, o qual mostrou características de genes housekeeping e similaridades com o promotor 2 do COL18A1. Também mostramos possível ligação de TCF/LEF aos promotores do COL18A1. A via de Wnt levou à redução de atividade dos promotores do COL18A1 e também redução dos níveis de expressão através de superexpressão de β-catenina. Este trabalho elucidou de forma geral, os elementos regulatórios em cis do COL18A1 e melhor caracterizou o seu papel na via de sinalização Wnt como um antagonista também da via não-canônica e como um alvo da via canônica. / The completion of multiple vertebrate genome sequences has presented an important challenge to understand and predict function from primary DNA sequence, particularly for noncoding sequence. It is commonly hypothesized that evolutionary conservation predicts functional DNA sequences, including those involved in regulating gene transcription, although sequence conservation has proven to be an imperfect predictor of enhancer function. Type XVIII collagen is a component of most basement membranes; mutations in the COL18A1 gene lead to Knobloch Syndrome, an autosomal recessive disease characterized by vitreoretinal and macular degeneration and occipital encephalocele. COL18A1 has 43 exons that transcribe three isoforms from two different promoters. The three isoforms display complex patterns of tissue-specific expression, including in kidney, lung, brain, and retina. Expression levels of COL18A1 are thought to be clinically important in vasculogenesis, and in predisposition to hepatocarcinoma and diabetes type 2. Therefore, identification of the regulatory regions will provide insight into normal and pathogenic regulation of COL18A1 expression. Furthermore, endostatin and FRZC18 are cleaved fragments from collagen XVIII that are involved in Wnt signaling, however in vivo role of FRZC18 has not been investigated yet in any model organism. Thus, a deeper investigation of FRZC18 role in Wnt signaling is indubitable necessary, as well as a comprehension of COL18A1 regulation by Wnt signaling. We have employed an efficient system of transgenesis in the zebrafish to functionally evaluate potential enhancer elements regulating COL18A1 transcription. We identified four enhancer elements that control transcription consistent with zebrafish endogenous COL18A1, in tissues including retina, kidney, blood vessels, gut, cartilage and liver. Although the algorithms we used did not detect noncoding conservation from human to teleosts at the COL18A1 locus, the human sequences functioned appropriately in zebrafish transgenics. Additional post hoc computational analysis revealed detectable sequence similarities between human and zebrafish in or near two of the four enhancer regions. We tested one of these zebrafish regions and confirmed orthologous enhancer activity. We functionally tested FRZC18 with its mRNA overexpression in zebrafish embryos. This experiment resulted in embryos with phenotype remaining slb and ppt, mutants of non-canonical wnt components. This result points FRZC18 as an antagonist of non-canonincal Wnt signaling possibly by interaction with Wnt11 and Wnt5. We dissected COL18A1 promoter 1 and it showed characteristics of a housekeeping gene and similarities with promoter 2 and we also showed possible TCF/LEF binding to COL18A1 promoters. Wnt signaling responded to downregulate promoter activity of COL18A1 and also decrease its expression by overexpression of s-catenin. This work broadly elucidated COL18A1 cis regulatory elements and better characterized its role in Wnt signaling as an antagonist of noncanonical and also as a target of canonial signaling.
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O papel de dois fatores de transcrição ApiAP2 no controle da transcrição de genes variantes em Plasmodium falciparum / The role of ApiAP2 transcription factors in the control of variant gene transcription in Plasmodium falciparum.Cubillos, Eliana Fernanda Galindo 11 February 2016 (has links)
O parasita Plasmodium falciparum causa a forma mais grave da malária humana.Para evadir a resposta imune do hospedeiro, as formas assexuadas do parasita podem usar variação antigênica ou podem se diferenciar em formas sexuais como estratégia para sobreviver e garantir a sua transmissão para o mosquito.A base molecular desses processos ainda é pouco compreendida. Por manipulação genética, nos identificamos a participação de um fator de transcrição da família ApiAP2 ( PF3D7_1143100), no controle da transcrição de genes variantes e no desenvolvimento em formas sexuais na fase intraeritrocítica. Demonstramos ainda que um outro membro desta família, PF3D7_1466400, não é essencial no ciclo assexual de P. falciparum, já que seu silenciamento não afeto o normal desenvolvimento do parasita. / The parasite Plasmodium falciparum causes the most severe form of human malaria. To evade the host immune response, asexual parasite forms can employ antigenic variation or differentiation to gametocytes as a means to survive and secure their transmission to the mosquito. The molecular basis behind these processes is still poorly understood. By genetic manipulation, we indentified the participation of a ApiAP2 transcription factor, PF3D7_1143100, in the control of variant gene transcription as well as in the switching from asexual to sexual development in the intraerythrocytic stage. We also demonstrate that the ApiAP2 transcription factor PF3D7_1466400 is not essential in the asexual stage of P. falciparum, since its knockdown did not affect the normal development of the parasite.
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Influência da desnutrição proteica sobre a expressão de fatores de transcrição envolvidos no processo de diferenciação da célula tronco mesenquimal medular / Influence of protein malnutrition on the expression of transcription factors involved in differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellCunha, Mayara Caldas Ramos 15 June 2012 (has links)
Dados da literatura e do nosso grupo evidenciam que a desnutrição protéica compromete órgãos linfo-hematopoéticos e modifica a resposta imune. Sabendo que animais desnutridos apresentam hipoplasia severa de órgãos hematopoéticos e que o microambiente medular apresenta distintos moduladores que atuam sinergicamente para influenciar a sobrevivência, proliferação e o desenvolvimento das células hematopoéticas em todos os seus níveis de diferenciação, avaliamos em um modelo de desnutrição, alguns aspectos da complexa regulação do microambiente medular avaliando a expressão de fatores de transcrição envolvidos no processo de diferenciação da Célula Tronco Mesenquimal (CTM) e capacidade de produção de citocinas importantes para o controle da hematopoese. Camundongos Balb/C machos, adultos, adaptados em gaioleiros metabólicos foram separados nos grupos controles e desnutridos recebendo, respectivamente, ração normoprotéica (12% de proteínas) e hipoprotéicas (2% de proteínas). Após o grupo desnutrido perder cerca de 20% do peso inicial, os animais foram sacrificados para a avaliação nutricional e hematológica caracterizando a desnutrição. As células mesenquimais foram isoladas da medula óssea (MO) e caracterizadas imunofenotipicamente por citometria de fluxo mostrando populações de células em ambos os grupos com marcação positiva para CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, baixa marcação para CD34 e negativa para CD14, CD45. Na quantificação de fatores de transcrição por Western Blot verificou-se que células mesenquimais medulares de animais desnutridos apresentaram maior expressão de PPARγ e RUNX2, fato este que pode ser explicado, em parte, pelo remodelamento microambiental observado nesses animais. Sobrenadantes de células mesenquimais de animais desnutridos quantificados por Elisa apresentaram uma maior concentração de SCF e uma redução na concentração de G-CSF e GM-CSF. As alterações encontradas nos permitem concluir que a desnutrição compromete as células mesenquimais tanto no aspecto regulatório de fatores de transcrição, bem como na capacidade de produção de citocinas, contribuindo para o comprometimento do microambiente hematopoético e induzindo a falência medular comumente observada em situações de desnutrição protéica. / Data from literature and our group showed that protein malnutrition compromises lympho-hematopoietic organs and modifies the immune response. Knowing that malnourished animals show severe hypoplasia of hematopoietic organs and the bone marrow microenvironment has distinct modulators that act synergistically to influence survival, proliferation and development of hematopoietic cells in all levels of differentiation, we evaluated in a model of protein malnutrition, some aspects of the complex regulation of bone marrow microenvironment evaluating the expression of transcription factors involved in the differentiation of Mesenchymal Stem Cells, and the production capacity of cytokines which are important in the regulation of the hematopoiesis. BALB/c mice, males, adults adapted in metabolic cages were separated in two groups: control and malnourished groups receiving, respectively, normal protein diet (12% protein) and low protein (2% protein). After the malnourished group lost about 20% of initial weight, the animals were sacrificed and evaluated the nutrition status, as well as hematological parameters. Mesenchymal Stem Cells were isolated from bone marrow and immunophenotypically characterized by flow cytometry showing cells populations in both groups stained positive for CD90, CD271, Sca1, CD49e, CD13, low marking for CD34 and negative for CD14, CD45. In the measurement of transcription factors by Western Blot found that Mesenchymal Cells of bone marrow malnourished animals showed higher expression of RUNX2 and PPARγ. This fact can be explained, in part, by microenvironmental remodeling observed in these animals. Mesenchymal stem cells supernatants of malnourished mice quantified by Elisa presented a higher concentration of SCF and a reduced concentration of G-CSF and GM-CSF. The alterations found in malnourished animals allow us to conclude that malnutrition commits Mesenchymal Stem Cells on the expression of transcription factors involved in the regulatory aspects of the differentiation process, as well as at the capacity of cytokine production, contributing to an impaired hematopoietic microenvironment and inducing the bone marrow failure commonly observed in protein malnutrition states.
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Influência da hipóxia nas células tronco tumorais no câncer de mama em modelo in vivo de indução de hipóxia / Influence of hypoxia on cancer stem cells in breast cancer in an in vivo model of hypoxia inductionMenani, Paola Candido Rodrigues 15 April 2016 (has links)
Introdução: A hipóxia tumoral tem papel de fator prognóstico independente, estando relacionado a fenótipo mais agressivo, com maior capacidade de proliferação, invasão e disseminação metastática, além de maior resistência ao tratamento sistêmico e à radioterapia. As alterações do microambiente decorrente do baixo nível de oxigênio pode levar a formação de células tronco tumorais (CTTs) em células de câncer de mama, que são identificadas através da expressão de aldeído desidrogenase (ALDH1A1). Modelos experimentais para estudo da influência da hipóxia no desenvolvimento e progressão do câncer demonstram dados inconclusivos e controversos e estão limitados a modelos in vitro e modelos in vivo que submetem os camundongos a estado de hipóxia sistêmica. Em nosso estudo, desenvolvemos um modelo in vivo para estudar se o estado de hipóxia controlado, direcionado ao local do tumor, pode induzir a formação de CTT em câncer de mama de camundongos. Métodos: células da linhagem 67 NR foram introduzidas dentro do córtex renal de fêmeas de camundongos BALB/c. Foi colocado um clipe de aneurisma no hilo renal por 60 minutos para provocar hipóxia direcionada ao local do tumor. Os camundongos foram sacrificados após 24 horas ou 7 dias da hipóxia e foi realizada análise histológica para confirmar as mudanças induzidas pela isquemia na córtex renal e tumoral. Realizada dissecção tumoral microscópica e RT-PCR para análise da expressão CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, SOX 9 e ALDHA1(TaqMan® Gene Expression Assay) no grupo controle e da hipóxia. TBP e HPRT foram os genes housekeeping e o crescimento in vitro de linhagem de células 67NR, usado como referência. Resultados: Todos os camundongos enxertados com células 67NR no cortex renal desenvolveram tumores locais. Foi observada necrose tubular aguda (NTA), decorrente da hipóxia tecidual direcionada. Os genes foram diferentemente expressos, comparando com as linhagens celulares. Notamos aumento significativo da ativação da via da hipóxia por aumento da expressão gênica de CA9, HIF1A e HIF2A. Ocorreu uma modulação para formação de CTTs. Obervamos aumento de 2,9 e de 5,7 respectivamente, na expressão de SLUG, relação SLUG/SOX9 após 24 horas de hipóxia, redução de 2,7 vezes na expressão de SOX9 e não houve aumento na expressão de ALDH1. Entretanto, houve aumento de 2,1 vezes na expressão de ALDH1 7 dias após a hipóxia. Conclusão: Houve aumento da expressão de Slug e Slug/SOX9 precocemente ao aumento da expressão de ALDH1, em ambiente de hipóxia tumoral, o que sugere que há probabilidade de participação de Slug e SOX9 na formação de CTTs / The tumoral hypoxia is an independent prognostic factor in many solid malignat tumors. Low oxygen tension has been related to more aggressive phenotype, greater proliferation capacity, increased invasiveness and metastatic dissemination, and resistance to systemic treatment and radiotherapy. Changes in the microenvironment due low oxygen level lead to cancer stem cells formation (CSC) in breast câncer. The aldehyde dehydrogenase (ALDH1) cellular expression has been decribed as a CSC marker. Experimental models to study the influence of hypoxia on the development and progression of cancer have shown inconclusive and controversial data and are restricted to models in vitro and in vivo models in mice undergoing a state of systemic hypoxia. In our study, we developed an in vivo model to study whether the state of hypoxia controlled targeted to the tumor site may induce the formation of CSC in breast cancer in mice. Methods: 67 NR lineage cells were engrafted into the renal cortex of female BALB / c mice. Aneurysm clip was placed in the renal hilum for 60 minutes to induce hypoxia targeted to the tumor site. Mice were sacrificed after 24 hours or 7 days of hypoxia, and histological analysis was performed to confirm ischemia-induced renal cortex changes. Tumors were microdissected and RT-PCR was carried out to analyze the expression of CA9, HIF1A, HIF2A, Slug, Sox 9 and ALDHA1 genes (TaqMan® Gene Expression Assay) in the control and hypoxia groups. TBP and HPRT were used as housekeeping genes and the cell lines 67NR gowing in culture plate was used as reference. Results: All mice engrafted with cells in the renal cortex 67NR developed local tumors. Acute tubular necrosis (ATN) was observed, resulting from the targeted tissue hypoxia. The genes were expressed differently, compared with cell lines. We notice a significant increase in activation of the hypoxia by increased gene expression of CA9, HIF1A and HIF2A, 24 hours after renal tumor ischemia. There was increased by 2.9 and 5.7 fold, respectively, in the expression of SLUG and SLUG/SOX9, no difference in ALDH1 and reduced by 2.7 fold in the expression of SOX 9, 24 hours after ischemia.There was increased by 2.1 fold in ALDH1 expression 7 days after ischemia. Conclusion: There was increased in expression of SLUG and SLUG/SOX9 early expression of ALDH1 in tumor hypoxia environment. This suggests are likely SLUG and SOX9 have role in cancer stem cell transformation
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Utilização de Análise Bioinformática e Validação por PCR Quantitativa em Tempo Real na Identificação da Indução Transcricional dos Fatores de Transcrição E2F1 e E2F4 em Linhagens de Glioblastoma. / Use of Bioinformatics Analysis and Validation by Quantitative Real-Time PCR to Identify the Transcriptional Induction of the Transcription Factors E2F1 and E2F4 in Glioblastoma Cell Lines.Donaires, Flavia Sacilotto 14 July 2011 (has links)
O emprego da metodologia de microarranjos no estudo do câncer tem permitido a identificação de genes com alterações em seus perfis de expressão, os quais estão direta ou indiretamente envolvidos na etiologia dessa doença. O crescente número de publicações de experimentos de expressão gênica em repositórios de dados de microarranjos demonstra que, em geral, a limitação não está na quantidade ou qualidade desses experimentos, mas no processamento desses dados. Dessa forma, há a necessidade de desenvolver metodologias de bioinformática que sejam capazes de analisar tais perfis de forma integrada, incluindo no contexto da análise, dados provenientes de outros experimentos. O desenvolvimento do câncer tem sido associado principalmente a distúrbios nos mecanismos de controle do ciclo celular, cujas vias são dependentes de uma maquinaria transcricional e de seus elementos regulatórios; entre estes últimos, os fatores de transcrição (FTs) têm sido estudados como potenciais alvos para a terapia molecular. No presente trabalho, um conjunto de dados de microarranjos realizados a partir de amostras de glioblastoma foi obtido em repositórios públicos (GEO e ArrayExpress). O teste estatístico SAM foi aplicado aos dados e os genes diferencialmente expressos (FDR 0,05), induzidos em glioblastoma (1.830 genes), foram submetidos a uma análise de associação a FTs (programa FatiGO+), a qual associou os FTs HNF1A, IRF7 e E2F (p 0,05) aos genes induzidos. Adicionalmente, a lista de genes foi submetida a uma análise de associação a um banco de dados de assinaturas transcricionais do software TBrowser, extraídas de diversos experimentos de microarranjos do GEO. Como resultado, 7.910 assinaturas foram associadas (p 0,01), sendo que as cem primeiras também foram relacionadas a FTs por meio de ferramentas disponibilizadas no próprio TBrowser. Os FTs E2F1 e E2F4 foram associados a mais de 80% das assinaturas analisadas. Dessa forma, ambas as análises apontaram o FT E2F, mais especificamente E2F1 e E2F4, como associados à lista inicial de genes fornecida pelo SAM. A expressão de E2F1 e E2F4 foi avaliada por meio da técnica de RT-PCR quantitativa em tempo real em amostras de RNA de sete linhagens de glioblastoma (T98, U251, U138, U87, U343, MO59J e MO59K). Interessantemente, ambos os genes foram apontados como superexpressos em todas as linhagens, a maioria com significância estatística. A família de FTs E2F apresenta papéis importantes no controle da proliferação celular e apoptose. Alguns membros atuam como oncogenes, e outros, como genes supressores de tumor, dependendo do contexto molecular nos quais se encontram. Muitos trabalhos da literatura têm apontado a importância desses FTs, especialmente E2F1, no processo de itumorigênese. Com base nos resultados obtidos no presente trabalho, o status de expressão (indução) de E2F1 e E2F4 é provavelmente associado ao glioblastoma. Esses FTs podem influenciar a expressão de uma série de genes cruciais, frequentemente alterados nessa doença, o que ainda requer um estudo mais detalhado, visando à validação desses FTs como biomarcadores, ou até mesmo como alvos moleculares que possam ser empregados no estabelecimento de novas modalidades de terapias. / The application of DNA microarrays in cancer research has provided the identification of abnormal expression profiles of a series of genes, which may be directly involved in the etiology of such disease. The increasing number of publications related to gene expression profile in microarray repositories has demonstrated that the limitation of such experiments is not associated with the quantity neither the quality of such experiments, but with data processing. Therefore, there is a great interest in the development of methodologies in bioinformatics that allow the integrated analysis of such profiles, including data set from other experiments. Cancer development has been associated mostly with changes in cell cycle control, whose intracellular pathways are dependent on the transcriptional machinery. Regulatory elements involved in transcription, which include transcriptional factors (TFs), can be potential targets for molecular therapy. In the present study, a set of microarray data achieved from glioblastoma samples were obtained from public repositories (GEO and ArrayExpress). Data were submitted to statistical analysis using SAM, and 1,830 up-regulated genes (FDR 0.05) were submitted to TFs association analysis (FatiGO+ program). Those genes were associated to the TFs HNF1A, IRF7 and E2F (p 0.05). Moreover, the set of genes was submitted to a transcription signature bank data association analysis using the software TBrowser, extracted from GEO, which provided a wide range of data sets from microarray experiments. The analysis led to 7,910 associated signatures (p 0.01); out of them, the first 100 were related to TFs according to the tools available in TBrowser. The TFs E2F1 and E2F4 were associated to more than 80% from the analyzed signatures. Therefore, both analysis suggested that the TF E2F, specifically E2F1 and E2F4, were associated to the initial gene set obtained by the SAM analysis. The expression of E2F1 and E2F4 was evaluated by quantitative real-time PCR using RNA samples from seven glioblastoma cell lines (T98, U251, U138, U87, U343, MO59J and MO59K). Interestingly, both genes were found up-regulated in all cell lines. The E2F TFs family members present important roles in cell proliferation control and apoptosis. Depending on the molecular context involved, some members act as oncogenes and others as tumor suppressor genes. A great number of studies has suggested the importance of such TFs , specially E2F1, in the tumorigenesis process. According to the present results, the expression status (induced) of E2F1 and E2F4 may be associated with glioblastoma. These TFs may influence the abnormal expression of important genes in cancer, even though detailed studies should be necessary in order to validate these TFs as biomarkers or molecular targets for therapeutical intervention.
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Avaliação dos fatores indutores da transição epitélio-mesenquimal (EMT) na biologia das células endoteliais / Evaluation of inducing factors of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the endothelial cells biologyPinto, Mariana Tomazini 18 September 2015 (has links)
A transição endotélio-mesenquimal (EndMT) é uma forma especializada da transição epitéliomesenquimal (EMT) e é caracterizada pela alteração da morfologia celular para um formato fibroblastoide, perda da expressão dos marcadores endoteliais e ganho da expressão dos marcadores mesenquimais, bem como a aquisição de propriedades invasivas e migratórias. Entretanto, o mecanismo molecular envolvido nesse processo ainda não está totalmente elucidado. O objetivo desse trabalho foi avaliar os fatores indutores da EMT em células endoteliais (CEs) de fontes distintas por meio da superexpressão do fator de transcrição SNAIL e do tratamento com TGF-?2, bem como identificar os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. Para tal, as linhagens de CE da artéria pulmonar (HPAEC), pool de CE primária de veia de cordão umbilical (PHUVEC), CE da aorta (PAEC) e CE da artéria coronária (CAEC) foram induzidas em três condições distintas: I) TGF-?2; II) superexpressão do fator de transcrição SNAIL; III) superexpressão do fator de transcrição SNAIL associado ao tratamento com TGF-?2 (SNAIL+TGF-?2). Após a indução, a expressão dos genes relacionados com a EndMT foi analisada por PCR em tempo real (qPCR) e as CAECs foram as células que apresentaram maior mudança no perfil de expressão gênica, no qual o grupo SNAIL+TGF-?2 apresentou um aumento dos marcadores mesenquimal FN1, SM22, CNN1 e CD90. O grupo SNAIL+TGF-?2 também mostrou uma diminuição dos marcadores endoteliais CD31 e CDH5 por Western blot. Em seguida, a técnica de microarray foi realizada nas CAECs induzidas à EndMT e as análises revelaram um dendrograma cujo perfil mostrou que SNAIL e SNAIL+TGF-?2 se agrupam separadamente das outras condições. Os dados de microarray resultaram em uma rede na qual os genes mesenquimais COL1A1, COL1A2, FN1 e CNN1 estavam aumentados no grupo SNAIL+TGF-?2 comparado com o grupo controle. Os genes diferencialmente expressos entre a análise CT vs. SNAIL+TGF-?2 foram analisados quanto a participação em vias canônicas e a via de regulação da EMT foi uma das mais representadas, a qual inclui a via de sinalização Notch e Wnt. Nos dados de microarray, NOTCH3 e WNT5B estavam superexpressos no grupo SNAIL+TGF-?2 comparado com o controle. Sabendo que Wnt5b pode inibir a via ?-catenina, a expressão de NOTCH3, WNT5B e ?-CATENINA foi avaliada por qPCR e a expressão de NOTCH3 e WNT5B confirmou os dados do microarray e nenhuma diferença estatística foi observada na expressão de ?- CATENINA. Ainda, as CAECs induzidas foram submetidas ao ensaio de migração e de capacidade de formação de estruturas semelhantes a capilares. Foi observado que as CAECSNAIL+ TGF-?2 migraram significativamente comparadas com as outras condições e nenhuma das células induzidas (TGF-?2, SNAIL e SNAIL+TGF-?2) foram capazes de formar estruturas semelhantes a capilares. Alguns microRNAs foram selecionados e avaliados por qPCR. O miR-let7a foi significativamente expresso no grupo SNAIL e SNAIL+TGF-?2. O ensaio de perda e ganho de função do miR-let7a foi realizado, entretanto, a repressão ou a indução do miR-let7a não alterou a EndMT. Esses resultados sugerem que as CEs de fontes anatômicas distintas apresentam respostas diferentes quando estimuladas a sofrerem EndMT. Ademais, a associação entre SNAIL+TGF-?2 é um potente indutor para EndMT e essa indução pode ser mediada pelas vias de sinalização Notch e Wnt não canônica. / Endothelial-mesenchymal transition (EndMT) is a specialized form of epithelialmesenchymal transition (EMT) which is characterized by changes in cell morphology as a fibroblastoid conversion, expression of endothelial markers decreased, expression of mesenchymal markers increased and acquirement of invasive and migratory properties. However, the molecular mechanism associated with this process is not completely elucidated. The aim of this study was to evaluate the EMT-inducing factors in the endothelial cells (ECs) from different sources through the overexpression of the transcription factor SNAIL and through the treatment with TGF-?2, as well as to identify the molecular mechanisms involved in EndMT. For this purpose, primary pulmonary artery EC (HPAEC), primary pooled umbilical vein EC (PHUVEC), primary aortic EC (PAEC), primary coronary artery EC (CAEC) lineages were induced under three distinct conditions: I) TGF-?2; II) ectopic expression of SNAIL; III) ectopic expression of SNAIL associated with TGF-?2 (SNAIL+TGF- ?2). After the EndMT induction, the expression of the genes associated with EndMT was analyzed by Real time PCR (qPCR) and CAECs showed the most prominent alterations on their gene expression profile which showed that SNAIL+TGF-?2 group presented an increase of mesenchymal markers FN1, SM22, CNN1, and CD90 expression. CAEC-SNAIL+TGF-?2 group also showed a decrease of endothelial markers CD31 and CDH5 by western blot. Then, microarray was performed in CAECs after EndMT induction and hierarchical clustering analysis showed that the ectopic expression of SNAIL and SNAIL+TGF-?2 clustered separately from the other conditions. Microarray data resulted in a network which presented an upregulation of the mesenchymal genes such as COL1A1, COL1A2, FN1, and CNN1 in the CAEC-SNAIL+TGF-?2 compared to control cells. We analyzed the canonical pathways related to the differentially regulated genes between CAEC- SNAIL+TGF-?2 and control cells and the regulation of EMT pathways was the most represented, which includes Notch and Wnt signaling pathway. In the microarray data, NOTCH3 and WNT5B were overexpressed in CAEC-SNAIL+TGF-?2 compared to control. It is known that Wnt5b might inhibit the ?- catenin pathway. Therefore, NOTCH3, WNT5B and ?-CATENIN gene expression were analyzed by qPCR. NOTCH3 and WNT5B gene expression confirmed the microarray data and no statistical difference were observed in ?-CATENIN expression. Moreover, all the CAECs conditions were subjected to scratch migration assay and the formation of capillary-like structures assay. CAEC-SNAIL+TGF-?2 had a significant migration compared to other conditions and the three EndMT inductions (TGF-?2, SNAIL, and SNAIL+TGF-?2) were not able to form capillary-like structures. Some microRNAs were selected and evaluated by qPCR. The miR-let7a was significantly expressed in the SNAIL and SNAIL+TGF-?2 groups. The assay of gain or loss of function of miR-let7a was realized; however, the repression or induction of miR-let7a did not change the EndMT. These results suggest that endothelial cells from distinct anatomical sources have different responses when stimulated to undergo the EndMT. Moreover, the association between SNAIL+TGF-?2 is a potent inductor for EndMT and this induction can be mediated by Notch and non-canonical Wnt signaling pathway activation.
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A gênese da Pedagogia do Oprimido: o manuscrito / The genesis of the Pedagogy of the Opressed: the manuscriptSilva, Camila Teo da 07 August 2017 (has links)
A Pedagogia do Oprimido (FREIRE, 1968) é a principal obra do educador e escritor Paulo Freire. Seus manuscritos resistiram a diversas mudanças culturais, sociais e políticas, ficando por mais de 30 anos guardados no país onde fora inicialmente concebido, o Chile. O objetivo principal desta pesquisa é a transcrição do facsímile dos manuscritos originais, em formato de edição semidiplomática, que forma o corpus principal para analisar a forma de construção da obra, de acordo com o seu contexto histórico. Também buscamos traçar um perfil da forma de trabalho empregada pelo autor para a concretização deste livro bem como fazer um resgate histórico das principais ações anteriores a concepção da obra, para isso utilizamos a gentil colaboração, por meio de entrevistas e textos produzidos por pessoas que conviveram com o autor, bem como o relato deixado por ele no livro Pedagogia da esperança: um reencontro com a Pedagogia do Oprimido (FREIRE, 1996). / \"The Pedagogy of the Opressed\" (FREIRE, 1968) is Paulo Freire\'s, writer and educator, main work. His manuscripts withstood a variety of cultural, social and political changes, being kept away for over 30 years in the country where it was firstly conceived, Chile. The main objective with this research is the transcription of the facsimile of the manuscripts, in a semidiplomatic edition format, which forms the main corpus to analyse the form of the literary oeuvre\'s construction, accordingly with its historical context. We also aim to trace a profile of the author\'s working method for concretizing this book, as well as doing a historic recollection of the main actions that took place before the book\'s conception. For that we counted with the kind support, by interviews and texts, from people which accompanied the author, as well as a brief account left by him in the book \"Pedagogy of Hope: Reliving Pedagogy of the Oppressed\" (FREIRE, 1996).
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