Os insetos são capazes de sobreviver em diversos ecossistemas do planeta e, mesmo estando constantemente expostos à ameaça de infecção microbiana, permanecem livres de infecções na maior parte do tempo. Essa capacidade de sobrevivência aliada à larga distribuição dos insetos em regiões totalmente diferentes tem estimulado a pesquisa de novos agentes terapêuticos nesta classe devido à descoberta de diversos componentes de mecanismos inespecíficos de combate à infecção, sendo possível sua aplicação no controle de diversas doenças. Todavia, apesar de um grande número de moléculas de defesa ter sido identificado a partir de vários insetos, pouca informação sobre suas aplicações está disponível. Desta forma, o presente trabalho elucida o perfil transcriptômico geral e dos genes de defesa do tegumento de Podalia orsilochus durante sua fase larval. Como consequência, os transcritos e os dados obtidos permitirão o auxílio em pesquisas posteriores, seja para comparação, citação, conhecimento biológico e das respostas de defesa ou das relações de filogenia do animal. / The insects are able to survive in diverse ecosystems on earth, and even being constantly exposed to the threat of microbial infections, remain free of infection for most of the time. This survivability combined with the wide distribution of insects in totally different regions has stimulated the search for new therapeutic agents in this class due to the discovery of several components of nonspecific mechanisms to fight infection, and possible implementation in the control of various diseases. However, despite a large number of defense molecules have been identified from various insects, little information is available on their applications. Thus, this paper elucidates the general transcriptomic profile and integument of defense gene Podalia orsilochus during their larval stage. As a result, the transcripts and the data obtained will aid in further research, to compare, reference, biological knowledge and defense or animal phylogeny relationships.

As toxinas de veneno de serpentes têm como principal função alterar a homeostase das presas para fins de alimentação ou defesa. O estudo aprofundado da composição do veneno de serpentes é importante para a produção de soros antiofídicos mais eficientes, para a descoberta de novos fármacos e na compreensão de processos biológicos, ecológicos e evolutivos. As pesquisas com toxinas têm mostrado uma versatilidade natural, refinada pela evolução, na diversificação de funções em famílias de proteínas recrutadas de suas funções endógenas, por meio de sucessivas duplicações e acumulo de mutações levando a uma evolução acelerada. A miríade de toxinas disponíveis e sua diversidade de funções ainda não foram completamente descritas. A combinação das análises em larga escala do transcriptoma de novo da glândula de veneno e do proteoma do veneno permite elaborar um perfil mais completo do toxinoma do veneno, permitindo inclusive um aumento na sensibilidade da detecção de toxinas pouco representadas e inesperadas nos venenos. O objetivo geral deste estudo foi analisar o toxinoma do veneno de uma das mais perigosas espécies australianas, a Pseudonaja textilis (Elapidae). Foi possível identificar no veneno as toxinas: fatores de coagulação de veneno do complexo protrombinase, subunidades de fosfolipases A2 (PLA2) da neurotoxina textilotoxin e PLA2 de atividade procoagulante, neurotoxinas tipo three-finger toxin (3FTx), inibidores de protease do tipo-kunitz textilinin, e pela primeira vez, uma nova variante de 3FTx, lectinas tipo C, CRiSP além de indícios de toxinas de lagarto Heloderma e outras proteínas candidatas a toxinas como calreticulin e dipeptidase 2. Metaloproteinases, pouco estudadas em Elapidae, foram clonadas e detectadas no veneno por ensaios de fracionamento e imunoreatividade. A análise do transcriptoma identificou novas isoformas e variantes de toxinas, principalmente das 3FTx e dos inibidores de serinoproteases, assim como transcritos de toxinas que não foram detectadas no veneno e que merecem mais investigações. O quadro de sintomas com acidentes em humanos é bem explicado pelas toxinas identificadas, porém, em seu habitat natural, as toxinas pouco conhecidas e até então não descritas devem ter funções importantes e específicas na predação. Identificar esta diversidade de variantes é importante para entender o modo de ação das toxinas. / Snake venom toxins alter prey homeostasis for feeding or defense. In depth studies of venom composition are important for better antivenom production, for new drugs lead and discovery and for better understanding of biological, ecological and evolutionary processes. Research on toxins have shown the natures way of innovating, refined by evolution, diversifying functions of protein families recruited from their endogenous function to the venom gland by successive gene duplication and mutation accumulation, leading to an accelerated evolution. A myriad of available toxins and diversity of functions is still available for discovery. Combining high throughput techniques such as venom gland de novo transcriptomics and venom proteomics, one can assess and observe a more complete profile of the snake toxinome, additionally allowing an upscale in low represented and unexpected toxin detection. The aim of this project was to investigate the venom toxinome of one of the most dangerous Australian species, Pseudonaja textilis (Elapidae). The toxins identified in it venom was: protrombinase complex coagulation factors, neurotoxic textilotoxin phospholipase A2 (PLA2) subunits and procoagulant PLA2, neurotoxic three-finger toxins (3FTx), Kunitz-type protease inhibitor textilinin, and for the first time, a new long 3FTx, C-type lectins, CRiSPs, as well as evidences of lizard toxins from Heloderma genus and other toxin candidates calreticulin and dipeptidase 2. Metalloproteinases, little investigated in Elapidae, was cloned and detected in the venom after fractionation and immunoassay. The transcriptome revealed new toxin variants and isoforms, specially 3FTx and serine protease inhibitors, as well as transcripts from toxins not detected in the venom that deserves further investigation. Human accident symptoms are well explained by the identified toxins, however, in its natural environment, little known and undescribed toxins must have specific and important role in predation. Identifying this diversity is important to better understand toxins ways of action.

As toxinas de veneno de serpentes têm como principal função alterar a homeostase das presas para fins de alimentação ou defesa. O estudo aprofundado da composição do veneno de serpentes é importante para a produção de soros antiofídicos mais eficientes, para a descoberta de novos fármacos e na compreensão de processos biológicos, ecológicos e evolutivos. As pesquisas com toxinas têm mostrado uma versatilidade natural, refinada pela evolução, na diversificação de funções em famílias de proteínas recrutadas de suas funções endógenas, por meio de sucessivas duplicações e acumulo de mutações levando a uma evolução acelerada. A miríade de toxinas disponíveis e sua diversidade de funções ainda não foram completamente descritas. A combinação das análises em larga escala do transcriptoma de novo da glândula de veneno e do proteoma do veneno permite elaborar um perfil mais completo do toxinoma do veneno, permitindo inclusive um aumento na sensibilidade da detecção de toxinas pouco representadas e inesperadas nos venenos. O objetivo geral deste estudo foi analisar o toxinoma do veneno de uma das mais perigosas espécies australianas, a Pseudonaja textilis (Elapidae). Foi possível identificar no veneno as toxinas: fatores de coagulação de veneno do complexo protrombinase, subunidades de fosfolipases A2 (PLA2) da neurotoxina textilotoxin e PLA2 de atividade procoagulante, neurotoxinas tipo three-finger toxin (3FTx), inibidores de protease do tipo-kunitz textilinin, e pela primeira vez, uma nova variante de 3FTx, lectinas tipo C, CRiSP além de indícios de toxinas de lagarto Heloderma e outras proteínas candidatas a toxinas como calreticulin e dipeptidase 2. Metaloproteinases, pouco estudadas em Elapidae, foram clonadas e detectadas no veneno por ensaios de fracionamento e imunoreatividade. A análise do transcriptoma identificou novas isoformas e variantes de toxinas, principalmente das 3FTx e dos inibidores de serinoproteases, assim como transcritos de toxinas que não foram detectadas no veneno e que merecem mais investigações. O quadro de sintomas com acidentes em humanos é bem explicado pelas toxinas identificadas, porém, em seu habitat natural, as toxinas pouco conhecidas e até então não descritas devem ter funções importantes e específicas na predação. Identificar esta diversidade de variantes é importante para entender o modo de ação das toxinas. / Snake venom toxins alter prey homeostasis for feeding or defense. In depth studies of venom composition are important for better antivenom production, for new drugs lead and discovery and for better understanding of biological, ecological and evolutionary processes. Research on toxins have shown the natures way of innovating, refined by evolution, diversifying functions of protein families recruited from their endogenous function to the venom gland by successive gene duplication and mutation accumulation, leading to an accelerated evolution. A myriad of available toxins and diversity of functions is still available for discovery. Combining high throughput techniques such as venom gland de novo transcriptomics and venom proteomics, one can assess and observe a more complete profile of the snake toxinome, additionally allowing an upscale in low represented and unexpected toxin detection. The aim of this project was to investigate the venom toxinome of one of the most dangerous Australian species, Pseudonaja textilis (Elapidae). The toxins identified in it venom was: protrombinase complex coagulation factors, neurotoxic textilotoxin phospholipase A2 (PLA2) subunits and procoagulant PLA2, neurotoxic three-finger toxins (3FTx), Kunitz-type protease inhibitor textilinin, and for the first time, a new long 3FTx, C-type lectins, CRiSPs, as well as evidences of lizard toxins from Heloderma genus and other toxin candidates calreticulin and dipeptidase 2. Metalloproteinases, little investigated in Elapidae, was cloned and detected in the venom after fractionation and immunoassay. The transcriptome revealed new toxin variants and isoforms, specially 3FTx and serine protease inhibitors, as well as transcripts from toxins not detected in the venom that deserves further investigation. Human accident symptoms are well explained by the identified toxins, however, in its natural environment, little known and undescribed toxins must have specific and important role in predation. Identifying this diversity is important to better understand toxins ways of action.

La diabetis tipus 1 (DT1) és una malaltia autoimmunitària produïda per una destrucció selectiva de les cèl.lules β dels illots de Langerhans pancreàtics, productores d'insulina. La seva etiologia és desconeguda, però se sap que hi intervenen factors de susceptibilitat genètica, factors ambientals i estocàstics. En els darrers anys s'han identificat algunes alteracions immunològiques en pàncrees de pacients amb DT1, com la presència d'un infiltrat leucocitari als illots. L'estudi d'aquests processos ha estat dificultat per la manca d'accés al teixit pancreàtic i per tant, les característiques de l'autoimmunitat en la DT1 es basen en un nombre limitat d'observacions. En aquesta Tesi Doctoral es descriuen els perfils d'expressió gènica d'una col.lecció generada pel nostre grup de mostres pancreàtiques de pacients en diferents fases de progressió de la malaltia -inici clínic, inici recent i cronificació-. Els perfils descrits mitjançant microarrays demostren l'augment d'expressió de gens del sistema immunitari, destacant les vies de presentació antigènica, molècules d'adhesió, resposta humoral, factors inflamatoris i de la immunitat innata i gens amb funció immunoreguladora. Les dades posen de manifest la persistència de la resposta inflamatòria i immunitària al llarg dels anys, essent més prominent en pàncrees total que en illots purificats. El teixit exocrí presenta una reducció de trànscrits a l'inici clínic i una afectació inflamatòria. Als illots, a més de la reducció de trànscrits propis de cèl.lules β, destaca la reducció de trànscrits del sistema nerviós i la sobreexpressió de factors que reflexen un intent de regeneració insular. Per la caracterització del pàncrees en la DT1 s'ha estudiat també el microquimerisme matern, com a fenòmen associat a l'autoimmunitat. La presència de cèl.lules d'origen matern, capaces de travessar la barrera fetoplacentària durant l'embaràs i d'implantar-se en teixits de l'hoste, s'ha associat a diverses malalties autoimmunitàries. Tot i que és una hipòtesi encara per demostrar, les cèl.lules maternes podrien ser cèl.lules potencialment autoreactives, cèl.lules diana de l'autoimmunitat -per la seva semial.logenicitat- o bé cèl.lules amb funció reparadora o de regeneració. En aquest estudi s'identifica la presència de cèl.lules β d'origen matern. Les cèl.lules pancreàtiques d'origen matern es detecten en major freqüència en pacients que en controls.Una alternativa a la manca d'accés al teixit diana en la DT1 són els models experimentals de la malaltia. El ratolí no obès diabètic (NOD) és un model espontani de diabetis autoimmunitària àmpliament estudiat que desenvolupa una patogènesi amb característiques similars a la DT1 humana. En aquesta Tesi Doctoral es defineixen alteracions a l'òrgan diana del model derivat NOD RIP-IFNβ, ratolins transgènics que expressen la citocina antiviral i proinflamatòria IFNβ a les cèl.lules β. Aquests ratolins desenvolupen una DT1 agressiva amb un alt component d'immunitat innata i característiques més semblants a la DT1 humana, com l'edat d'inici prematura i la mateixa incidència entre sexes. En la diabetis mediada per IFNβ s'observa un augment d'expressió de citocines i quimiocines proinflamatòries en pàncrees, contribuïnt a la DT1 prematura amb un alt component d'immunitat innata. Paral.lelament, també es detecta un augment de Reg2 -factor de regeneració β i autoantigen en DT1- a les cèl.lules β, concordant amb la inflamació, amb una hiperplàsia insular i amb l'acceleració de la malaltia. Les alteracions immunològiques identificades i descrites en aquesta Tesi Doctoral demostren que l'autoimmunitat a l'òrgan diana de la DT1 és un procés extraordinàriament més complex del que s'havia descrit fins l'actualitat. Els resultats obtinguts indiquen que l'autoimmunitat contra les cèl.lules β és un procés crònic en el que hi intervenen factors inflamatoris i de la immunitat innata, i que progressa malgrat els intents d'immunoregulació i regeneració als illots pancreàtics. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease caused by the selective destruction of insulin- producing pancreatic β cells. T1D aetiology is unknown, although genetic, enviromental and stochastic susceptibility factors are involved in the disease. During the last years, few immunological alterations have been identified in the pancreases from T1D patients, such as the presence of a leukocytic infiltrate in the islets. The study of these processes has been difficulted by the lack of access to the pancreatic tissue. Therefore, the features of autoimmunity in T1D are based on a limited number of observations.In this Doctoral Thesis, gene expression profiles for a collection of pancreatic samples generated by our group at different disease checkpoints -clinical onset, recent onset and longstanding- have been defined. It has been established a comparison between total pancreas and its purified endocrine component (target). The profiles described by microarray analysis demonstrate the gene expression increase of immune system genes, highlighting pathways such as antigen presentation, adhesion molecules, humoral response, inflammation, innate immunity and immunoregulation. These data evidence the persistence of inflammatory and immune response at chronic stages, being more prominent in the total pancreas than in purified islets. Exocrine tissue shows a reduction of transcripts at the clinical onset and a production of inflammatory factors. In the islets, besides the reduction of β cell transcripts, there is a downregulation of nervous system genes and an overexpression of genes that suggest an attempt of islet regeneration. During the caractherization of T1D pancreases, maternal microchimerism has also been studied, as a phenomenon associated to autoimmunity. The presence of cells of maternal origin, able to cross the placental barrier during pregnancy and to implant in the host tissues, has been associated to many autoimmune diseases. Hypothetically, but not still demonstrated, cells of maternal origin could be potentially autoreactive cells, target cells of the autoimmune response -because of their semiallogenicity- or cells with a repair/regeneration function. In this study, the presence of β cells of maternal origin has been identified. Pancreatic cells of maternal origin are found in a higher frequency in patients than in controls. An alternative to the lack of access to the target tissue in T1D is the study of experimental models of the disease. Nonobese diabetic (NOD) mouse is a spontaneous model of autoimmune diabetes widely studied that develops a pathogenesis with similar features to human T1D. In this Doctoral Thesis, many alterations have been defined in the target organ of the NOD-derived model NOD RIP-IFNβ, a mice model expressing transgenically the antiviral and proinflammatory cytokine IFNβ in the β cells. These mice develop an agressive T1D with a strong innate immunity component and show features more similar to human T1D such as the juvenile onset and the equal sex incidence. In T1D mediated by IFNβ, an increase in pancreatic proinflammatory cytokines and chemokines has been found, contributing to the premature onset with a strong innate immunity component. In parallel, an increase in Reg2 expression -regeneration factor and T1D autoantigen- has been found in β cells, according to the inflammatory response, the insular hyperplasia and the acceleration of the disease.The immunological alterations identified and described in this Doctoral Thesis demonstrate that autoimmunity in the target organ of T1D is a process extraordinarily more complex than previously described. The data obtained indicate that autoimmunity against β cells is a chronic process, in which inflammatory and innate immunity factors participate and that progresses instead of the attempts of immunoregulation and islet regeneration.

Submitted by DAYANE PIRES DA sILVA (dayane.pires@gmail.com) on 2018-01-08T15:08:42Z No. of bitstreams: 1 Dissertação-Dayane-P-Silva.pdf: 2117641 bytes, checksum: 84ef5f066f1227762225a77378463439 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Aparecida Puerta null (dripuerta@rc.unesp.br) on 2018-01-08T18:45:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_dp_me_rcla.pdf: 1634008 bytes, checksum: bdbcd2e8a01570fb3ba3429c9ddcd0d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-08T18:45:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_dp_me_rcla.pdf: 1634008 bytes, checksum: bdbcd2e8a01570fb3ba3429c9ddcd0d5 (MD5) Previous issue date: 2016-08-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Relações de simbiose com micro-organismos são descritas como uma forma de inovação evolutiva que permite a alguns animais acesso aos nutrientes que de outra forma não estariam disponíveis. As formigas da tribo Attini são conhecidas pelo hábito de cultivar fungos que lhes fornecem nutrientes. Parte destes nutrientes são obtidos quando o fungo fornece enzimas que são instáveis ou mesmo ausentes nas formigas. No presente trabalho nós mostramos que as formigas Attini apresentam amilases submetidas a uma baixa pressão seletiva e grande quantidade de substituições de aminoácidos potencialmente deletérias. Esses dados reforçam a hipótese de que a função da amilase das formigas foi substituída pela amilase fúngica. Nós também demonstramos que, tal como ocorre com as Attini derivadas, a Attini basal Mycocepurus goeldii é deficiente em duas enzimas da via de síntese de arginina, a argininossuccinato liase e a argininossuccinato sintase. Esses dados indicam que a complementação pelo fungo de deficiências enzimáticas das formigas é um evento ancestral na história evolutiva das Attini. / Symbiotic relationships with microorganisms are described as a form of evolutionary innovation that allows some animals access to nutrients which otherwise would not be available. The Attine ants are known for the habit of cultivating fungi which provide them with nutrients. Some of these nutrients are obtained when the fungus provides enzymes that are unstable or even absent in ants. In this work we show that the Attini ants presents amylases subjected a low selective pressure and a large amount of potentially harmful amino acid substitutions. These data corroborates the hypothesis that the function of amylase of ants was replaced by fungal amylase. We also demonstrate that, just as with derived Attine, in the basal Attine Mycocepurus goeldii two enzymes is deficient in arginine synthetic pathway, the argininosuccinate lyase and argininosuccinate synthase. These data indicate that supplementation of deficient enzymes in ants made by fungal is an ancient event in the evolutionary history of Attine. / FAPESP: 2014/15939-3.

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Flávia Maria de Souza Carvalho / Coorientador: Roberto Hirochi Herai / Banca: Henrique Ferreira / Banca: José Belasque Júnior / Banca: Marcos Túlio de Oliveira / Banca: Alessandro de Mello Varani / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial. Atualmente não há uma maneira eficiente de controle do cancro, e novos métodos devem ser desenvolvidos para o tratamento desta doença. Assim, o estudo dos mecanismos utilizados pela Xac durante o processo infeccioso pode revelar novos alvos para o desenvolvimento de compostos farmacológicos que possam eliminar ou controlar o patógeno. Neste estudo, a técnica de RNA-Seq foi utilizada para a identificação de genes diferencialmente expressos (GDE) na Xac em condições in vivo e in vitro. Para isso, cinco variedades de citros com níveis diferentes de suscetibilidade ao cancro cítrico, e meios de cultura indutores de fatores de virulência foram utilizados. Muitos dos genes que codificam para proteínas relacionadas ao sistema de secreção tipo 3 (T3SS), enzimas extracelulares, resposta ao estresse oxidativo, transportadores de ferro e fósforo foram induzidos pela Xac nas condições in vivo. No entanto, in vitro, os perfis de expressão para estes mesmos genes foram diferentes. Estes dados permitiram compreender melhor o ambiente intracelular do hospedeiro, e como este se relaciona com os mecanismos de ativação dos fatores de virulência e patogenicidade de Xac. Neste sentido, os dados apresentados neste estudo mostraram que o T3SS é o principal fator de virulência expresso por esta bactéria em condições in vivo. Além disso, nossos resultados sugerem t... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a major disease affecting citrus worldwide. Currently there is no effective way of cancer control, and new methods must be developed for the treatment of this disease. Thus, the study of the mechanisms used by Xac during the infectious process can reveal new targets for the development of pharmacologic compounds that can eliminate or control the pathogen. In this study, RNA-Seq technique was used to identify Xac differentially expressed genes (DEG) in vivo and in vitro conditions. For this purpose, five citrus varieties with different levels of susceptibility to citrus canker and culture mediums inducing virulence factors were used. Many of the genes encoding proteins of the type 3 protein secretion system (T3SS), extracellular enzymes, oxidative stress response, iron and phosphorus transport were induced in Xac in vivo conditions. However, the expression profiles for these same genes were different than observed in vitro conditions. These data allowed us to better understand the intracellular environment of the host, and how this relates to the activation mechanisms of pathogenicity and virulence factors in Xac. In this context, the data presented in this study show the T3SS as the main virulence factor expressed by the bacteria in vivo conditions. Furthermore, our results also suggest that low concentrations of inorganic phosphorus (Pi) and nitrogen, that bacteria sense in the plant apoplast, are ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Título original: Expressão gênica em mecanismos de tolerância ao Al3+ comparando espécie de cerrado (Styrax camporum) e limoeiro 'cravo' (Citrus limonia cv. cravo) / Orientador: Gustavo Habermann / Banca: Douglas Silva Domingues / Banca: Celso Luis Marino / Banca: Rafael Vasconcelos Ribeiro / Banca: Jorge Fernando Pereira / Resumo: Presente em solos ácidos, o alumínio principalmente encontrado na sua forma tóxica (Al3+) tem como principal efeito a diminuição do crescimento radicular. O Cerrado ocorre no centro-oeste do Brasil sob solos ácidos (pH <4) e com alto teor de alumínio (Al). Citrus limonia cv 'Cravo' Osbeck e Styrax camporum Pohl compartilham localização geográfica e características edáficas em que se estabelecem, no entanto exibem respectivamente sensibilidade e tolerância ao Al. O presente trabalho visa elucidar mecanismos envolvidos no estresse por Al3+ a nível de expressão gênica radicular. Para as duas espécies foi feita uma análise de transcriptoma para avaliar os efeitos do Al por uma perspectiva global, e a partir destes resultados alguns genes foram selecionados para avaliação ao longo de experimentos de hidroponia mantido por 60 dias. São discutidas estratégias de tolerância e sensibilidade ao Al nas duas espécies, juntamente com análises de biometria, quantificação hormonal e anatomia que corroboram o comportamento sensível de Citrus e tolerante de Styrax por diversas vias. Além disso, o último capítulo trata da dependência do pH em um importante mecanismo de tolerância ao Al em trigo envolvendo exsudação de ácido orgânico / Abstract: Present in acid soils, aluminum mainly found in its toxic form (Al3+) has as main effect the decrease of root growth. Cerrado occurs in central-western Brazil under acid soils (pH <4) and high aluminum content (Al). Citrus limonia (Osbeck) and Styrax camporum (Pohl) share geographic location and edaphic characteristics in where they are settled, however exhibiting respectively Al-sensitivity and Al-tolerance. The present work aims to elucidate the mechanisms involved in Al3+ stress at root gene expression level. For both species, a transcriptome analysis was performed to evaluate the effects of Al in a global perspective, and from these results some genes were selected for evaluation in hydroponic experiments maintained for 60 days. Al tolerance and sensitivity strategies are discussed in both species, together with analyzes of biometrics, hormonal quantification and anatomy data that corroborate the Al-sensitive behavior of Citrus and Al-tolerance in Styrax by several routes. In addition, the last chapter deals with the dependence of pH on one important mechanism of Al tolerance in wheat involving organic acid exudation / Doutor

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-20T16:04:48Z No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-07T13:34:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T13:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / FAPESB / Helmintos modulam a resposta imune do hospedeiro e, consequentemente, protegem contra doenças inflamatórias. Diferentes classes de proteínas recombinantes derivadas destes parasitos, produzidas em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos, têm sido capazes de inibir respostas inflamatórias em modelos experimentais de doenças imunomediadas. A identificação do conteúdo proteico de frações do extrato somático de Trichuris trichiura com efeitos imunomodulatórios foi alcançada através de análises em sistema de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em uma abordagem proteômica que indicou proteínas candidatas a serem responsáveis por esta atividade biológica. Os resultados desta abordagem foram confirmados e expandidos pela análise transcriptômica do estágio adulto de T. trichiura usando tecnologia de sequenciamento de nova geração e uma estratégia de montagem de novo, onde vinte transcritos que codificam para as proteínas previamente detectadas foram identificados, sendo que cinco desses estão entre as sequências codificadoras de proteínas mais expressas no verme adulto. Estas análises contribuirão para a anotação funcional da sequência genômica de T. trichiurarecém disponibilizada e viabilizarão a produção de proteínas recombinantes codificadas por estes transcritos que poderãolevar ao desenvolvimento de novos medicamentos para a terapia de doenças alérgicas e autoimunes. / Helminths modulate the host immune response and, consequently, protect it against inflammatory diseases. Different classes of recombinant proteins derived from these parasites, produced in prokaryotic and eukaryotic expression systems, were able to inhibit inflammatory responses in experimental models of immune mediated diseases. The identification of the protein content of Trichuris trichiura somatic extract fractions with immunomodulatory effects was achieved by liquid chromatography coupled to mass spectrometry in a proteomics approach that indicated candidate proteins to be responsible for this biological activity. The results of this approach were confirmed and expanded by transcriptomic analysis of T. trichiura adult worm using next-generation sequencing technology and a de novo assembly strategy, where twenty transcripts that code for previously detected proteins were identified, and five of whom were among the most expressed protein-encoding sequences in the adult worm. These analyses will contribute to the functional annotation of the recently released draft genomic sequence of this nematode and will enable the production of recombinant proteins, encoded by these transcripts, that may lead to the development of new drugs for the treatment of allergy, autoimmune and other inflammatory diseases.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T14:37:08Z No. of bitstreams: 1 TESE RITA DE CASSIA PONTELLO RAMPAZZO.pdf: 4806860 bytes, checksum: 8062bd9dd8843e24004e4dfeb47291c3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T14:37:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE RITA DE CASSIA PONTELLO RAMPAZZO.pdf: 4806860 bytes, checksum: 8062bd9dd8843e24004e4dfeb47291c3 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, acomete entre 7 e 8 milhões de pessoas especialmente na América Latina e Caribe, apresentando manifestações em órgãos associados ao sistema digestivo e cardíaco. A principal manifestação na fase crônica determinada é a cardiopatia chagásica e pode acometer entre 10 e 30% dos indivíduos infectados. Diante da ineficiência do tratamento, estudos com ênfase na biologia de interação parasita-hospedeiro têm sido desenvolvidos na busca de moléculas inovadoras que possam ser usadas para a prevenção, tratamento e/ou diagnóstico. A aplicação da genômic a funcional na interação T. cruzi-célula hospedeira tem como desafio desvendar a regulação de genes na célula alvo, buscando estratégias que enfoquem mecanismos de sobrevivência e replicação do parasita. A abordagem cinética utilizada neste trabalho (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 24 horas de infecção) para analisar a expressão gênica global através da metodologia inovadora de RNA-Seq proporcionou um melhor entendimento dos eventos que culminam na ativação coordenada e temporal de moléculas durante a interação T. cruzi-cardiomiócito. Identificamos 572 genes modulados, sendo que 371 apresentavam expressão gênica induzida e 201 reprimidos. Nossos resultados revelam que o T. cruzi induz uma modulação gênica dinâmica com 18 genes alterados após uma hora de interação. No estágio inicial da infecção (1 a 4 horas), os genes modulados encontram-se relacionados com a estratégia de invasão do parasita e, principalmente, com a resposta de cardiomiócitos induzindo genes relacionados à resposta imune e atividade tripanocida. Neste contexto, evidenciamos a ativação de genes envolvidos com a resposta pró-inflamatória, estresse oxidativo e metabolismo de radicais livres indicativos da tentativa da célula cardíaca de conter a disseminação do parasita. Com o avanço da infecção, constatamos a modulação de genes integrados com o remodelamento do citoesqueleto e rigidez celular, provavelmente associado com a acomodação do parasita intracelular, e ainda repressão de genes relacionados com junções celulares e manutenção da arquitetura celular. Distúrbios na expressão de genes envolvidos em vias metabólicas mitocondriais apontam para uma deficiência energética e disfunção mitocondrial induzida pelo T. cruzi. Destacamos ainda alterações em genes associados à hipertrofia, principalmente relacionados à IL1 e IL6, receptor toll-like 2 e GSK3B, desde os tempos iniciais de infecção (1 a 4 horas). O remodelamento associado à matriz extracelular apresentou genes com padrão diminuído principalmente no ponto de 24 horas quando a taxa de infecção ultrapassa 75%, sendo as alterações relacionadas aos genes de colágeno e fibronectina. Genes associados à apoptose com perfil pró- e anti-apoptótico foram diferencialmente modulados nas diferentes fases da infecção, sugerindo que a indução ou repressão da apoptose pode estar diretamente relacionada a dispersão do parasita, controle da carga parasitária no hospedeiro e/ou escape da resposta imune Dessa forma, a identificação de genes importantes para adaptação do T. cruzi no microambiente da célula cardíaca aliada à modulação de genes envolvidos na resposta desta célula alvo contribuirá para aplicação de novas estratégias de controle deste parasita, possibilitando a seleção de potenciais alvos vacinais e/ou terapêuticos. / Chagas` disease, caused by Trypanosoma cruzi, affects between 7 and 8 million people especially in Latin America and Caribbean, presenting manifestations in organs associated with the digestive system and heart. The main clinical manifestation on symptomatic chronic phase is chagasic cardiophaty and may affect about 10 to 30% of infected individuals. Given the ineffectiveness of the treatment, studies with emphasis on biology of host-pathogen interaction have been carried out to search innovative molecules that can be used to prevention, treatment and/or diagnosis. The application of functional genomics in the T. cruzi-host cell interaction has as its goal to display the regulation of genes in the target cell, seeking strategies that focus on mechanisms of survival and replication of the parasite. The kinetic approach used on this research (1, 2, 3, 4, 5, 6 and 24 hours of infection) to analyse the global gene expression by RNA-Seq, an innovative methodology, provide a better understanding of events that culminate in coordinated and temporal activation of molecules during T. cruzi-cardiomyocyte interaction. We identified 572 modulated genes, where 371 were induced and 201 repressed. Our results indicate that T. cruzi induces a dynamic gene modulation with 18 genes altered after one hour of interaction. On early stage of infection (1 to 4 hours), the modulated genes are related to immune response and trypanocydal activity. In this context, we observed the activation of genes involved in pro-inflammatory response, oxidative stress and free radical metabolism indicating that the cardiac cell attempts to control the dissemination of the parasite. With the progression of the infection, it was evident the modulation of genes involved in cytoskeleton remodeling and cell stiffness, probably associated with intracellular parasite accommodation and repression of cell junctions genes as well as cell architecture maintenance genes. Alterations in expression of genes involved in metabolic pathways point to a mitochondrial dysfunction and energy deficiency induced by T. cruzi. We also point out changes in genes associated with hypertrophy, mainly related to IL1, IL6, toll like receptor 2 and GSK3B from early times of infection (1 to 4 hours). Remodeling associated to extracellular matrix showed genes with decreased expression mainly at 24 hours when the infection exceeds 75%, specially collagen- and fibronectin-related genes. In addition, genes associated to apoptosis with pro- and anti- apoptotic activity were differentially modulated in different stages of infection, suggesting that induction or repression of apoptosis may be directly related to parasite spread, the parasite load control in the host and/or escape of immune response. Thus, the identification of genes important to adaptation of T. cruzi on the microenviroment of the cardiac cell combined with modulation of genes involved in the response of the target cell will contribute to implementation of new strategies to control this parasite, allowing the selection of potential vaccine and/or therapeutic targets.

LIMA, Beatriz de Sousa e. Tolerância de genótipos de Vigna unguiculata ao estresse salino: integração dos mecanismos moleculares, fisiológicos e bioquímicos. 2017. 139 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PGBioquímica (pg@bioquimica.ufc.br) on 2017-11-08T19:30:39Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_bselima.pdf: 8023473 bytes, checksum: 3a7160a365e703abea25a6d6c7065072 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-11-14T17:40:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_bselima.pdf: 8023473 bytes, checksum: 3a7160a365e703abea25a6d6c7065072 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-14T17:40:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_bselima.pdf: 8023473 bytes, checksum: 3a7160a365e703abea25a6d6c7065072 (MD5) Previous issue date: 2017 / Agricultural production has become a challenge in the arid and semi-arid regions of the world, as a result of the constant incidence of adverse environmental factors, such as abiotic stresses. Among them, the excess of salts in the soil is characterized by severely limiting the growth and development of the plants, causing serious damages due to the low yield of the crops. In this scenario, the selection of cultivars tolerant to salinity and / or genetic engineering of plants emerge as strategies of great importance. However, because stress tolerance is a multigenic phenomenon, the selection / identification of metabolic pathways, molecular markers and potential gene products constitute a challenge for studies on saline stress in plants. The present research was developed with the objective of integrating the molecular, biochemical and physiological mechanisms involved in the tolerance of cowpea (Vigna unguiculata) plants to saline stress. For this, plants of two genotypes of V. unguiculata endowed with differential tolerance to saline stress, Pitiúba and TVU, were used as experimental model. Saline stress promoted severe reductions in plant growth of both genotypes; however, increased biomass production under salinity was observed in TVU genotypes throughout the experimental period (8 and 16 days). The best performance of the TVU plants was attributed to the higher efficiency of the photosynthetic machinery, evidenced by the higher CO2 assimilation rates and by the higher photochemical efficiency of photosystem II (↑ electron transport rate - ETR and ↑ photochemical quenching - qP). In addition, in the presence of NaCl, the high photosynthetic efficiency coincided with the higher pigment content involved in the energy absorption of both chlorophyll a, b and total as well as carotenoids. Such responses were accompanied by increases in the expression of the PGR5-like protein 1A, HEMA (Glutamyl-tRNA reductase-binding protein), Light-harvesting complex I chlorophyll, as well as several structural genes of the thylakoidal CTE. TVU plants also limited the excessive accumulation of Na + in the stems and leaves and, consequently, established a higher K + / Na + ratio under stress. The results suggest that the control of ionic homeostasis was due to the efficient activation of defense routes, involving mechanisms of exclusion and Na + compartmentalization, since there was an increase in the expression of genes encoding SOS route components and V-ATPase genes. In addition, lower oxidative damages (↓ MDA) were observed in plant tissues of the TVU genotype, a result of the effective action of enzymatic and non-enzymatic antioxidants. The higher activity of the SOD, APX and GPX enzymes was correlated with the expression of the DEAD-box and Glutathione peroxidase genes. In this genotype, genes involved in auxin signaling (IAA), jasmonic acid (JA), gibberellins (GA), ethylene (ETHY), abscisic acid (ABA), H2O2, CIPK (CIPK3 and CIPK14) and innumerable transcription factors for example WRKY, MYB and bZIP) may have operated in the intricate network of responses that culminated in greater tolerance to salt stress. In contrast, the higher sensitivity of the Pitiúba genotype to saline stress was associated with the lower efficiency of the photosynthetic machinery and the excessive accumulation of toxic ions in the aerial tissues. Under salinity, decreases in CO2 assimilation rates were due to severe damage to the photosynthetic apparatus, since the maximum quantum efficiency of PSII (Fv / Fm) was seriously compromised shortly after the onset of stress, and this effect was intensified with the imposition of saline treatment. Associated with this, there was a progressive reduction in the effective quantum efficiency of the PSII (φPSII), which was accompanied by decreases in the ETR, as well as by the greater non-photochemical dissipation of electrons, especially in the last times of analysis. Another determinant factor for the lower efficiency of the photosynthetic machinery was the low accumulation of photosynthetic pigments, which probably resulted in the accumulation of energy in PSII and the higher production of reactive oxygen species (ROS). This phenomenon may have caused damage to cell membranes (↑ MDA), which intensified the degradation of the photosynthetic pigments and other structural components of the photosystems. As a result of the lower photochemical efficiency, photosynthetic rates (CO2 assimilation) were seriously compromised by salinity, which consequently restricted plant growth. The results of RNAseq demonstrated that Pitiúba plants also triggered an arsenal of genes in response to stress, including those focused on the control of ionic and redox homeostasis, photosystem repair, hormones, transcription factors, among others. However, such mechanisms were not sufficient to mitigate the deleterious effects of NaCl and the plants were highly sensitive to salt stress. In the present study, the main metabolic pathways involved in the tolerance to salinity of V. unguiculata plants were identified, as well as potential genes for genetic improvement studies. / A produção agrícola tem se tornado um desafio nas regiões áridas e semi-áridas de todo o mundo, resultado da incidência constante de fatores ambientais adversos, como é o caso dos estresses abióticos. Dentre eles, o excesso de sais no solo caracteriza-se por limitar severamente o crescimento e desenvolvimento das plantas, acarretando graves prejuízos devido ao baixo rendimento das culturas. Nesse cenário, a seleção de cultivares tolerantes à salinidade e/ou a engenharia genética de plantas emergem como estratégias de grande importância. Todavia, como a tolerância ao estresse é um fenômeno de natureza multigênica, a seleção/identificação das vias metabólicas, marcadores moleculares e de potenciais produtos gênicos constituem um desafio para os estudos sobre estresse salino em plantas. A presente pesquisa foi desenvolvida com o objetivo de integrar os mecanismos moleculares, bioquímicos e fisiológicos envolvidos na tolerância de plantas de feijão-caupi (Vigna unguiculata) ao estresse salino. Para isso, plantas de dois genótipos de V. unguiculata dotados de tolerância diferencial ao estresse salino, Pitiúba e TVU, foram utilizadas como modelo experimental. O estresse salino promoveu reduções severas no crescimento das plantas de ambos os genótipos, contudo, uma maior produção de biomassa sob salinidade foi observada nas plantas do genótipo TVU, ao longo de todo o período experimental (8 e 16 dias). O melhor desempenho das plantas TVU foi atribuído a maior eficiência da maquinaria fotossintética, evidenciada pelas maiores taxas de assimilação de CO2 e pela maior eficiência fotoquímica do fotossistema II (↑ taxa de transporte de elétrons – ETR e ↑ quenching fotoquímico - qP). Além disso, na presença de NaCl, a elevada eficiência fotossintética coincidiu com o maior conteúdo de pigmentos envolvidos na absorção de energia, tanto de clorofila a, b e total quanto de carotenoides. Tais respostas foram acompanhadas por incrementos na expressão dos genes PGR5-like protein 1A, HEMA (Glutamyl-tRNA reductase-binding protein), Light-harvesting complex I chlorophyll, bem como de vários genes estruturais da CTE tilacoidal. Plantas TVU também limitaram o acúmulo excessivo de Na+ nos caules e folhas e, consequentemente, estabeleceram maior relação K+/Na+ sob estresse. Os resultados sugerem que o controle da homeostase iônica foi decorrente da ativação eficiente de rotas de defesa, envolvendo mecanismos de exclusão e compartimentalização de Na+, pois houve aumento na expressão de genes que codificam componentes da rota SOS e de genes da V-ATPase. Aliado a isso, observou-se menores danos oxidativos (↓ MDA) nos tecidos das plantas do genótipo TVU, resultado da ação efetiva de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. A maior atividade das enzimas SOD, APX e GPX foi correlacionada com a expressão dos genes DEAD-box e Glutathione peroxidase. Nesse genótipo, os genes envolvidos na sinalização por auxinas (IAA), ácido jasmônico (JA), giberelinas (GA), etileno (ETHY), ácido abscísico (ABA), H2O2, CIPK (CIPK3 e CIPK14) e inúmeros fatores de transcrição (por exemplo, WRKY, MYB e bZIP) podem ter atuado na rede intricada de respostas que culminou na maior tolerância ao estresse salino. Contrariamente, a maior sensibilidade das plantas do genótipo Pitiúba ao estresse salino foi associada com a menor eficiência da maquinaria fotossintética e o acúmulo excessivo de íons tóxicos nos tecidos aéreos. Sob salinidade, os decréscimos nas taxas de assimilação de CO2 foram resultado de danos severos ao aparato fotossintético, pois a eficiência quântica máxima do PSII (Fv/Fm) foi seriamente comprometida logo após o início do estresse, sendo esse efeito intensificado com a imposição do tratamento salino. Associado a isso, houve uma redução progressiva na eficiência quântica efetiva do PSII (ϕPSII), que foi acompanhada por decréscimos na ETR, bem como pela maior dissipação não fotoquímica de elétrons, principalmente nos últimos tempos de análise. Outro fator determinante para a menor eficiência da maquinaria fotossintética foi o baixo acúmulo de pigmentos fotossintéticos, o que provavelmente resultou no acúmulo de energia no PSII e na maior produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Esse fenômeno pode ter ocasionado danos as membranas celulares (↑ MDA), o que intensificou a degradação dos pigmentos fotossintéticos e de outros componentes estruturais dos fotossistemas. Como resultado da menor eficiência fotoquímica, as taxas fotossintéticas (assimilação de CO2) foram seriamente comprometidas pela salinidade o que, consequentemente, restringiu o crescimento das plantas. Os resultados do RNAseq demonstraram que as plantas Pitiúba também acionaram um arsenal de genes em resposta ao estresse, incluindo aqueles voltados para o controle da homeostase iônica e redox, reparo dos fotossistemas, hormônios, fatores de transcrição, dentre outros. Entretanto, tais mecanismos não foram suficientes para mitigar os efeitos deletérios do NaCl e as plantas foram altamente sensíveis ao estresse salino. No presente estudo foram identificadas as principais vias metabólicas possivelmente envolvidas na tolerância à salinidade de plantas de V. unguiculata, além de genes potenciais para estudos de melhoramento genético de plantas