Komplexe Lebenszyklen sind eine häufige, aber anspruchsvolle Lebensweise von Parasiten. Parasiten mit komplexen Lebenszyklen infizieren nacheinander mehrere Wirte und passen sich an verschiedene ökologische Nischen an. Werden in diesem Szenario dieselben Gene in allen Wirten einheitlich exprimiert? Die Hypothese der adaptiven Entkopplung besagt, dass verschiedene Stadien in einem komplexen Lebenszyklus genetisch und evolutionär unabhängig sind, was bedeutet, dass die Selektion auf Parasitenmerkmale in einem Wirt keine Auswirkungen auf Merkmale in anderen Wirten hat. Wir haben diese Hypothese anhand von zwei Parasitenarten getestet: dem Bandwurm Schistocephalus solidus und dem Fadenwurm Camallanus lacustris. Die Transkriptomsequenzierung wurde an Proben während ihrer komplexen Lebenszyklen durchgeführt. Die Genexpressionsanalyse wurde durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die zwischen den Wirten, zwischen den Funktionsstadien und zwischen den Bedingungen unterschiedlich exprimiert werden. Darüber hinaus wurde mit einer Analyse der Anreicherung von Gensätzen untersucht, ob ähnliche biologische Funktionen von ähnlichen Genen in verschiedenen Stadien kodiert werden. Unsere Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in der Genexpression zwischen den verschiedenen Stadien, wobei keine positive Korrelation zwischen Stadien mit derselben Aufgabe oder demselben Wirt beobachtet wurde. Gene, die in einem Stadium hochreguliert (oder herunterreguliert) werden, werden in anderen Stadien nicht in ähnlicher Weise exprimiert. Dies spricht für die Unabhängigkeit der einzelnen Stadien bei der Genexpression, die es den Parasiten ermöglicht, ihren Phänotyp als Reaktion auf unterschiedlichen Selektionsdruck zu modulieren. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese der adaptiven Entkopplung bei parasitären Würmern und bieten Einblicke in den evolutionären Erfolg dieser Lebensweise. / Complex life cycles are a common but demanding lifestyle among parasites. Parasites with complex life cycles sequentially infect multiple hosts, adapting to various ecological niches using information encoded within a single genome. In this scenario, are the same genes expressed consistently across all hosts, as might occur when parasite stages perform similar functions? The adaptive decoupling hypothesis posits that different stages in a complex life cycle are genetically and evolutionarily independent, meaning selection on parasite traits in one host does not affect traits in other hosts. We tested this hypothesis using two species of parasites: the tapeworm Schistocephalus solidus and the nematode Camallanus lacustris, both of which have three-host life cycles. Transcriptome sequencing was performed on samples throughout their complex life cycles, generating transcriptomes from 10 stages of S. solidus and 7 stages of C. lacustris. Gene expression analysis was conducted to identify genes differentially expressed between hosts, between functional stages, and between conditions. Additionally, gene set enrichment analysis assessed whether similar biological functions are encoded by similar genes across stages. Our findings demonstrate significant differences in gene expression across stages, with no positive correlation observed between stages sharing the same task or host. The highest correlation occurred between stages sampled close in time. In conclusion, the lack of positive correlation between different life cycle stages indicates that genes up-regulated (or down-regulated) in one stage are not similarly expressed in other stages. This evidence supports the independence of each stage in gene expression, enabling parasites to modulate their phenotype in response to different selective pressures. These findings corroborate the adaptive decoupling hypothesis in parasitic worms with complex life cycles, offering insights into the evolutionary success of this lifestyle.

This thesis is a part of the project aimed at sequencing the genome and transcriptome of the bank vole (Clethrionomys glareolus). The role of natural selection in the evolution of mitochondrial DNA (mtDNA) has been subject to much discussion; while some studies did not provide evidence that selection affected the phylogeography of the studied species, other considered adaptive evolution important. The bank vole is the key model we use to study the adaptation to climate change. As with other species, the phylogeography of the bank vole has been based on the variation of a small part of mtDNA. The goal of the thesis was to sequence the entire mitochondrial genome for representatives of all main mtDNA lineages of the bank vole using the Sanger and Illumina technologies, and to assess the role of selection and adaptation in the evolution and phylogeography of this species. The adaptive evolution in mtDNA probably was not the main driving force during the postlacial colonization of Europe. However, signatures of adaptive evolution have been found - an amino acid change with possible functional consequences in one gene and an excess of radical changes in physical- chemical properties of amino acids in populations at the latitudinal (northern and southern) extremes of the bank vole distribution. Key...

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Knochenmarks-Stromazellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Forschung gerückt. Es konnte gezeigt werden, dass sie durch Bereitstellung von Überlebenssignalen essenziell für die Erhaltung hämatopoetischer Nischen sind. Stromales Interleukin-7 (IL-7) konnte dabei für T Zellen als Überlebenssignal identifiziert werden. Gemeinsam ist allen Stromazellen die Expression des Oberflächenmarkers CD106/VCAM-1. Ein effizientes Protokoll erlaubte die qualitative wie quantitative Isolation von Stromazellen aus dem murinen Knochenmark mit anschließender ex vivo Microarray-Analyse. Die auf diese Weise ermittelten Kandidaten-Marker wurden auf Proteinebene via Histologie und (Hochdurchsatz-) Durchflusszytometrie validier. Dazu gehören z.B. die Marker CD1d, gas6 oder ANXA2R. CD1d wurde als guter Interimsmarker für VCAM-1+PECAM-1- Stromazellen identifiziert, wohingegen die IL-7-Produzenten in der Population von CD200int/BP 1+/CD73+/CD105- angereichert sind. Gleiches gilt für den Transkriptionsfaktor Prrx1. CD55, BP-1 and Cadherin-11 zeigten eine Expressionsmuster in Abhängigkeit des verwendeten IL-7-Reportermaus-Haplotyps. Für BP-1 und Cadherin 11 konnte die Abwesenheit von reifen Lymphozyten als Ursache des Feedbacks ausgeschlossen werden. Die Haplotypen der Reportermaus legten auch eine monoallele Expression des IL-7 nahe. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen VCAM-1+ (IL-7+/-) Stromazellen als heterogene Population, wenn es nach der Vielzahl der möglichen exprimierten Marker geht. Zwischen vielen dieser Marker gibt es aber wiederum auf Zelloberflächenebene einen großen Überlapp. Die funktionelle Relevanz dieser Oberflächenmarker-Diversität wird in weiteren Arbeiten zu klären sein, gibt aber den Stromazellen ein breites Repertoire vor, um Interaktionen mit Lymphozyten zu initiieren, modulieren und inhibieren. Abschließend ist zu erwarten, dass diese Erkenntnisse in die klinische Behandlung der Stroma-Nischen in Autoimmun-Fragestellungen einfließen. / Bone marrow stromal cells receive increasing amounts of attention lately. They have been shown to support survival of hematopoietic stem cells as well as memory lymphocytes which is of great importance when targeting the perseverance of autoimmune diseases. CD4+ memory T lymphocytes reside in the proximity of VCAM-1 expressing stromal cells which provide them with survival signals such as Interleukin-7. Herein, a protocol was developed to quantitatively obtain VCAM-1+ and VCAM-1+ IL-7+/- stromal cells via enzymatic/mechanic digestion and cytoskeleton-inhibition. Ex vivo gene expression analysis was performed from sorted, pure cells with good recovery. Candidate genes/markers were validated in (high-throughput) flow cytometry and histological analysis including subsequent semi-automated colocalization was performed. CD1d was found to be good surrogate marker for VCAM-1+PECAM-1- non-endothelial stroma while the population of CD200int/BP-1+/CD73+/CD105- stromal cells is greatly enriched in IL-7 producers which was equally true for the stromal transcription factor Prrx1. CD55, BP-1 and Cadherin-11 were found to be differentially expressed in differing IL-7 reporter mice haplotypes. The reporter mice haplotypes revealed monoallelic expression features of IL-7. All methodologies suggest that VCAM-1+ as well as IL-7+/- stromal cells are heterogeneous by marker expression yet don’t cluster extensively in flow cytometry co-stains. The functional relevance of the marker diversity described in this thesis remains to be tested but insinuates a broad repertoire for bone marrow stroma cells for new interaction pathways with lymphocyte subsets. Ultimately, this knowledge will hopefully feedback to clinical questions of autoimmunity for targeted treatment of stromal niches.

The avian immune system is a complex system of defence mechanisms that protect bird hosts against threats from ubiquitous pathogens. According to the co-evolutionary models, variability in immune traits of hosts is the key component providing ability to adapt and enhance their defence mechanisms in presence of constant selective pathogen pressure. Domestic chicken (Gallus gallus f. domestica) is used as a model organism in avian biology and also is one of the most important food-producing animals, not only for their meat but also for the egg production. Unfortunately, in research usually only inbred chicken lines are used and modern poultry husbandry is tight with unilateral breeding towards highly productive breeds. Those approaches decrease intra-population polymorphism in chickens. However, especially in case of farm animals, searching and extending the pool of immune variability and enhancing pathogen resistance is crucial for sustaining healthy and biologically secure populations and their products. Morphologically highly distinct traditional chicken breeds, which have evolved for hundreds years under different selective pressures, may represent this desirable immunological variability. In my thesis I described variability in chosen immunological traits, haematological parameters and proteomic...

The development of plant flowers represents a complex process controlled by numerous mechanisms. The creation of double homozygous mutant of both β subunits (sometimes also referred to as basic transcription factor 3) of nascent polypeptide associated complex in Arabidopsis thaliana (further referred to as nacβ1 nacβ2) caused quite a strong defective phenotype including abnormal number of flower organs, shorter siliques with a reduced seed set, and inferior pollen germination rate together with a lower ovule targeting efficiency. Previously, NAC complex was described to be formed as a heterodimer composed of an α- and β-subunit, which binds ribosome and acts as a chaperone in Saccharomyces cerevisiae. In plants, NACβ is connected to stress tolerance and to plant development as a transcription regulator. However, little is known of NAC heterodimer function in plants. In this thesis, yeast two hybrid system (Y2H) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays were used to verify the NAC heterodimer formation in A. thaliana and to establish any potential interaction preferences between both NACβ paralogues and five NACα paralogues. To deepen the understanding about molecular mechanisms behind the nacβ1 nacβ2 phenotype, flower bud transcriptome of the nacβ1 nacβ2 double homozygous mutants...

The avian immune system is a complex system of defence mechanisms that protect bird hosts against threats from ubiquitous pathogens. According to the co-evolutionary models, variability in immune traits of hosts is the key component providing ability to adapt and enhance their defence mechanisms in presence of constant selective pathogen pressure. Domestic chicken (Gallus gallus f. domestica) is used as a model organism in avian biology and also is one of the most important food-producing animals, not only for their meat but also for the egg production. Unfortunately, in research usually only inbred chicken lines are used and modern poultry husbandry is tight with unilateral breeding towards highly productive breeds. Those approaches decrease intra-population polymorphism in chickens. However, especially in case of farm animals, searching and extending the pool of immune variability and enhancing pathogen resistance is crucial for sustaining healthy and biologically secure populations and their products. Morphologically highly distinct traditional chicken breeds, which have evolved for hundreds years under different selective pressures, may represent this desirable immunological variability. In my thesis I described variability in chosen immunological traits, haematological parameters and proteomic...

Der mitteleuropäische Wasserfroschkomplex umfasst Pelophylax lessonae (Genotyp LL), Pelophylax ridibundus (RR) und deren Hybriden Pelophylax esculentus (LR), der sich hemiklonal durch Rückkreuzen mit LL in lessonae-esculentus (L-E)-Populationen oder RR in ridibundus-esculentus (R-E)-Populationen reproduziert. Außerdem können Hybriden in reine Hybridpopulationen (E) bilden, in denen triploide Individuen die Elternarten funktionell ersetzen. Bislang ist wenig über die molekularen Mechanismen bekannt, die der klonalen Gametenbildung in der Keimbahn der Hybridform zugrunde liegen. In dieser Studie wurden erstmalig 160 Gene der Elternarten untersucht, die an der Gametenbildung beteiligt sind. Zusätzlich wurden 131 SNPs von 52 dieser Gene von 652 Wasserfröschen aus 26 Populationen analysiert. Im Ergebnis wurden 14 SNPs von 10 Genen entdeckt, deren Frequenzen mit dem Populationssystem assoziiert waren. In Übereinstimmung mit ihren Funktionen könnten diese Gene im Zusammenheng mit den system-spezifischen hybridogenetischen Reproduktionsmodi stehen. Sowohl transkriptomische als auch SNP-Daten lieferten Hinweise auf genetische Introgression, d. h. einen Transfer lessonae-spezifischer Allelen in den ridibundus-Genpool oder umgekehrt. Außerdem wurde bei P. lessonae eine kryptische genetische Diversität beobachtet. SNP-Analysen ergaben auch, dass LR-Individuen aus E-Populationen eine höhere genetische Ähnlichkeit mit LR-Individuen aus R-E als aus L-E-Populationen aufweisen. Diese Ergebnisse werfen die Frage nach dem Ursprung der E-Populationen auf, von denen bisher angenommen wurde, dass sie aus L-E-Populationen hervorgegangen sind. Die neuen molekularen Daten stehen mit den hemiklonalen Fortpflanzungsmodi von P. esculentus im Einklang und unterstreichen, dass diese wahrscheinlich auf komplexen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Genen und Faktoren basieren. / The Central European water frog complex comprises Pelophylax lessonae (genotype LL), Pelophylax ridibundus (RR), and their hybridogenetic hybrid Pelophylax esculentus (LR), which reproduces by backcrossing with LL in lessonae-esculentus (L-E) populations or RR in ridibundus-esculentus (R-E) populations. In addition, hybrids are able to reproduce in all-hybrid (E) populations in which triploid individuals functionally replace the parental species. To date, little is known about the molecular mechanisms underlying clonal gamete formation in the hybrid germline. In this study, 160 genes from P. lessonae and P. ridibundus known to be involved in gametogenesis were characterized for the first time. In addition, 131 single nucleotide polymorphisms (SNP) from 52 of these genes were analyzed, derived from 652 water frogs of 26 populations. As a result of logistic regressions, 14 SNPs of 10 genes were detected whose frequencies were associated with the population system. Consistent with their functions during gametogenesis, these genes can be considered as candidates associated with the system-specific hybridogenetic modes, i.e. clonal inheritance of the L and/or R genomes. Both transcriptomic and SNP data provided evidence for genetic introgression, i.e. a transfer of lessonae-specific alleles into the ridibundus gene pool or vice versa. In addition, cryptic genetic diversity was observed in P. lessonae. SNP analysis also revealed that LR individuals from E populations exhibit higher genetic similarity to LR individuals from R-E than L-E populations where triploid frogs do not occur. These findings raise the question of the origin of E populations, which were previously thought to have arisen from L-E populations after the emergence of triploid hybrids. The new molecular data are consistent with the reproductive modes of P. esculentus and emphasize that clonal inheritance is most likely caused by complex interactions of different genes and genetic factors.

Die Entwicklung von enzymfreien, isothermen Nachweisverfahren für Nukleinsäuren, die mit der PCR konkurrieren können, ist seit langem ein Ziel. Eine potenzielle Strategie besteht darin, Nukleinsäure-templierte Reaktionen zu verwenden, bei denen das Templat (Analyt) als Katalysator fungiert und das Signal verstärkt. Die derzeitig verwendeten Strategien, wie Ligations- oder Transferreaktionen, sind jedoch in ihrer Empfindlichkeit aufgrund des Effekts der Produktinhibierung begrenzt. Um dies zu überwinden, müssen die Reaktanten nicht nur sequenzspezifisch an die DNA oder RNA binden, sondern die Produkte müssen sich auch von der DNA oder RNA wieder lösen können. Diese Arbeit stellt ein neues Paradigma für Nukleinsäure templierte Reaktionen vor: Das Loss-of-Affinity Prinzip. In diesem Prinzip werden Produkte generiert, die eine geringere Affinität zum Templat aufweisen als die Reaktanten. Dadurch wird die Produktinhibierung verhindert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Loss-of-Affinity Prinzip mit triplexbildenden, spaltbaren bis-PNA Sonden untersucht. Diese erfuhren eine C-O-Bindungsspaltung, ausgelöst durch die katalytische Photoreduktion eines Rutheniumkomplexes. Nach mehreren Optimierungsrunden zeigte eine 10-mer bis-PNA Sonde eine beeindruckende katalytische Effizienz. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Loss-of-Affinity Prinzip zur Überwindung der Produktinhibierung genutzt werden kann. Die verwendeten bis-PNAs zeigten jedoch eine stark unspezifische Bindung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die bis-PNA Sonden gegen PNA- und GPNA-Spermin Sonden ausgetauscht, um das Problem der unspezifischen Bindung zu überwinden. Die PNA- und GPNA Spermin Sonden zeigten die wahrscheinlich effizientesten, bisher bekannten Nukleinsäure templierten Reaktionen, welchee die meisten natürlichen Enzyme übertrafen. Darüber hinaus zeigten sie eine ausgezeichnete Sequenzspezifität. / Developing enzyme-free isothermal detection methods of nucleic acids that can challenge PCR has been a long-standing goal. One potential strategy revolves around nucleic acid-templated reactions, in which the template (analyte) can act as a catalyst and amplify the signal. However, current strategies such as ligation reactions or functional group interconversions are plagued by product inhibition, which limits the sensitivity. To overcome this, the reactants must not only bind to DNA or RNA in a sequence-specific manner, but the products must also be able to detach from the DNA or RNA. This work introduces a new paradigm to nucleic acid-templated reactions, the loss-of-affinity principle, which yields products that have a lower template affinity than the reactants. This prevents product inhibition. In the first part of this work, the loss-of-affinity principle was explored with triplex-forming immolative bis-PNA probes that underwent a C-O bond cleavage upon catalytic photoreduction using a ruthenium complex. After several rounds of optimization, a 10-mer bis-PNA demonstrated an impressive catalytic efficiency. These results demonstrate that the loss-of-affinity principle can be used to overcome product inhibition. However, the bis-PNAs demonstrated highly non-specific binding. In the second part of this work, the bis-PNAs were replaced with PNA- and GPNA-spermine probes to address the issue of non-specific binding. The PNA- and GPNA-spermine probes exhibited probably the most efficient nucleic acid-templated reactions to date, outperforming most natural enzymes. In addition, they demonstrated excellent sequence specificity.

Die Funktion und Spezifität von Natürlichen-Killer-T-Zellen (NKT) in angeborener und erworbener Immunität ist nicht vollständig geklärt. Die Mehrheit der NKT-Zellen erkennt alpha-galactosylceramid (alphaGalCer), ein Lipid eines marinen Schwamms mit ungeklärter Relevanz. Verschiedene mykobakterielle Lipide wurden isoliert und auf ihre CD1d-Bindung und NKT-Zell-Aktivierung untersucht. Phospatidylinositol-mannosid (PIM) von Mycobacterium bovis BCG konnte als erstes bakterielles NKT-Zell-Antigen identifiziert werden. PIM aktiviert CD1d-abhängig murine und humane NKT-Zellen zur IFN-gamma aber nicht zur IL-4 Produktion. Mehrere andere Lipid-Fraktionen aktivierten ebenfalls NKT-Zellen. Diese Stimulation war entweder eine direkte, T-Zell-Rezeptor (TZR)-vermittelte und/oder indirekte, Toll-like-receptor 2 (TLR2) vermittelte Aktivierung. Iso-globotrihexosylceramide (iGb3) wurde als das endogene NKT-Zell-Antigen beschrieben. IGb3 ist ubiquitär in Lysosomen vorhanden. Dies wirft die Frage nach der Regulation der Antigen-Verfügkarkeit und der Kontrolle der NKT-Zell-Aktivierung auf. Es konnte gezeigt werden dass die Regulation der Antigen-Verfügbarkeit essentiell für die Regulation der NKT-Zell-Aktivität ist. Unkontrolliertes Auftreten und erhöhte Konzentration von iGb3 führte zu einer substantiellen Reduktion der NKT-Zell-Zahl, vermutlich durch Aktivierungs-induziertem-Zelltod. Mit Hilfe von DNS-Microarray Analysen wurden die Gen-Expressionsprofile von naïven NKT-Zellen und klassischen CD4 T-Zellen, regulatorischen T-Zellen, NK-Zellen und aktivierten NKT-Zellen verglichen. Es konnte sowohl ein NKT-Zell-spezifisches Expressionsmuster etabliert als auch eine gemeinsame Expression von Genen in allen verglichenen Zelltypen identifiziert werden. Naive und aktivierte NKT-Zellen zeigen eine erhöhte Expression von Apoptose-regulierenden Genen welches auf eine starke Selbst-Kontrolle zur präzisen Regulation der eigenen Aktivität hinweist. / The function and specificity of Natural Killer T (NKT) cells in innate and acquired immunity still remains elusive. The vast majority of CD1d restricted NKT cells recognise alpha-galactosylceramid (alphaGalCer), derived from a marine sponge, a lipid of unclear physiological significance. Different mycobycterial glycolipids were isolated and examined for binding to CD1d as well as for their capacity of NKT cell stimulation. Phospatidylinositol-mannoside (PIM) derived from Mycobacterium bovis BCG was identified as the first bacterial lipid antigen presented by CD1d. PIM activated both murine and human NKT cells to secrete IFN-gamma but not IL-4 in a CD1d dependent manner. Additionally, several other lipid fractions with NKT cell activation capacities were identified. This activation was either a direct, T-cell-receptor (TCR) mediated and/or an indirect, toll-like-receptor 2 (TLR2) mediated activation. Iso-globotrihexosylceramide (iGb3) was described as the endogenous NKT cell antigen. iGb3 is a ubiquitously present lysosomal glycolipid which raises the question of regulation of antigen availability and NKT cell activation control. It could be shown that regulation of antigen availability plays a crucial role in regulation of NKT cell activation. Moreover, uncontrolled appearance and increased concentrations of the endogenous antigen iGb3 led to substantial decrease in NKT cell number, presumably by activation induced cell death. Using DNA Microarray analysis, the gene expression profiles of naïve NKT cells and classical CD4 T cells, regulatory T cells, NK cells as well as to activated NKT cells were compared. The profiles revealed a NKT cell specific gene expression pattern as well as expression of genes which NKT cells share with NK cells, conventional CD4+ T cells and Treg cells. Both, naïve and activated NKT cells display elevated expression of apoptosis regulating genes providing NKT cells with high degree of self-control to precisely regulate their own activity.