Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Pinus elliottii is an important forestal culture, whose seeds, in terms of health quality, display high vulnerability to fungal pathogenic agents, especially to the association of especially by association of Fusarium spp. which is a responsible agent for seedlings losses in the nursery. This study aims to determine the appropriate method to assess the pathogenicity of Fusarium sp. associated with seeds of P. elliottii, and characterize the fungus, morphological- and molecularly, on its species level, as well as to verify the efficiency of its in vitro and in vivo biological control. Pathogenicity to different treatments were applied: T1 - Contact + Fusarium sp.; T2 - Contact + film coating + Fusarium sp.; T3 - film coating + Fusarium sp.; T4 film coating; T5 - Contact PDA and T6 - No treatment. Morphological characterization was performed using a specific identification key for the genus Fusarium, and the molecular identification, we sequenced three genomic regions of isolate, which are: ITS, elongation factor 1-α and beta-tubulin. In tests of biological control used is Trichoderma spp. and Bacillus subtilis in the commercial forms Agrotrich Plus® and Rizolyptus®, respectively. The control tests were performed in vitro by the method of paired comparison of cultures (pathogen x antagonist) and in vivo tests were carried out in nursery conditions. Fusarium s species that was identified on the seeds was characterized as Fusarium sambucinum, which is pathogenic to P. elliottii, when the seeds are inoculated via contact to the fungal culture during 48 hours. Microbilization of seeds with Bacillus subtilis and Trichoderma spp. provided improvement on the germination potential of them, and, in the case of Agrotrich Plus®, reduced the incidence of rot agent fungi, such as Penicillium sp. and Aspergillus sp.. The antagonistic agents were efficient on the in vitro control of F. sambucinum. Rizolyptus® stood out against the pathogen on the in vivo biocontrol test; it reduced seedlings losses and increased values of their length, as well as, of their green and dry masses. / Pinus elliottii é uma espécie de importância no setor florestal e que apresenta vulnerabilidade na qualidade sanitária de suas sementes, especialmente pela associação de Fusarium spp., responsável por perdas de plântulas no viveiro. O presente trabalho tem como objetivo determinar o método adequado para avaliar a patogenicidade de Fusarium spp. associado a sementes de P. elliottii e caracterizar morfologica e molecularmente o patógeno em nível de espécie, bem como verificar a eficiência do controle biológico in vitro e in vivo do fungo. Para patogenicidade foram aplicados diferentes tratamentos: T1- Contato + Fusarium sp.; T2 - Peliculização + Contato + Fusarium sp.; T3 - Peliculização + Fusarium sp.; T4 Peliculização; T5 - Contato com meio BDA e T6 - Sem tratamento. A caracterização morfológica foi realizada, utilizando uma chave de identificação específica para o gênero Fusarium, e para a identificação molecular, foram sequenciadas três regiões genômicas do isolado, sendo elas: ITS, fator de elongação 1- α e beta-tubulina. Nos testes de controle biológico utilizou-se Trichoderma spp. e Bacillus subtilis, nas formas comerciais Agrotrich Plus® e Rizolyptus®, respectivamente. Os testes de controle in vitro foram realizados pelo método de confronto pareado de culturas (antagonista x patógeno) e os testes in vivo, foram desenvolvidos em condições de viveiro. A espécie de Fusarium identificada nas sementes foi caracterizada como Fusarium sambucinum, patogênico a P. elliottii, quando inoculado via contato com a cultura fúngica por 48 horas. A microbiolização das sementes com Rizolyptus® e Agrotrich Plus® promoveu incremento no potencial germinativo e, no caso do Agrotrich Plus®, reduziu a incidência de fungos apodrecedores como Penicillium sp. e Aspergillus sp. Os antagonistas foram eficientes no controle in vitro de F. sambucinum e, no teste de biocontrole in vivo, o produto Rizolyptus® destacou-se, reduzindo as perdas de plântulas causadas pelo patógeno, assim como, potencializando as variáveis de comprimento de plântula, massa verde e massa seca.

The papaya culture is extensively cultivated in the world, where Brazil meets as worldwide the producing greater. Amongst the problems main inherent to the culture, the root and fruit rots are distinguished, caused by Phytophthora palmivora. The present work had for objective to control P. palmivora in seedling of papaya cv. Sunrise solo, through methods of biological, physical and chemical control. They had been tested four Trichoderma isolated (T. koningii - T3; T. harzianum - T13; Trichoderma sp. - T152D and T. polysporum - TP) and five fungicides "in vitro" (copper oxychloride - 2; 3 e 4g/L; mancozeb - 2; 3 e 4g/L; metalaxyl + mancozeb - 2,5; 3,5 e 4g/L; thiophanate-methyl - 6; 7 e 8g/L and carbendazim - 0,5; 1,0 e 1,5mL/L) and "in vivo", as well as the solarization of the substratum in solar collectors. They had been made still, test of volatile, not volatile metabolites and hyperparasitism for the Trichoderma isolated. In the biological control "in vitro", used the plate technique, while in the in vivo control, the substratum was dealt with Trichoderma of isolated and integrated form, before the infestation of the ground. In the chemical control, the fungicides had been tested "in vitro" adding them in BDA medium, while "in vivo" the seedlings roots had been immersed during 10 minutes in the fungicides solution. The solarization of the substratum was carried during 24, 48 and 72 hours, in solar collectors of 10 and 15 cm of diameter, becoming infested itself, previously the substratum with the pathogen (40 mL of inocule with approximately 20 sporangia for mL/ vase). The Trichoderma isolated T3, T13 and TP had been most efficient in the inhibition of the growth of P. palmivora "in vitro", however, only the isolated TP produced volatile and not volatile metabolites. On the other hand, all the isolated ones had presented capacity to hyperparasite the pathogen. In the biological control "in vivo" no isolated one was capable to reduce the severity of the disease. The solarization of the substratum increased significantly the seedlings survival, when compared to the witness. It didn t have significant differences between the periods of solar exposition, however, the diameter of 15 cm presented one better efficiency, with 87% of seedlings survival. The products most efficient in the pathogen inhibition "in vitro" had been oxicloreto de cobre, mancozeb and metalaxyl + mancozeb, while "in vivo" the five fungicides had presented similar efficiency, not having significant difference between the dosages tested. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A cultura do mamoeiro é extensamente cultivada no mundo tendo o Brasil como o maior produtor. Dentre os principais problemas inerentes à cultura, destacam-se as podridões do pé e do fruto, causadas por Phytophthora palmivora. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o controle de P. palmivora em plântulas de mamoeiro cv. Sunrise solo, utilizando métodos de controle biológico, físico e químico. Foram testados quatro isolados de Trichoderma (T. koningii - T3; T. harzianum - T13; Trichoderma sp. - T152D e T. polysporum - TP) e cinco fungicidas in vitro (oxicloreto de cobre - 2; 3 e 4g/L; mancozeb 2; 3 e 4g/L; metalaxyl + mancozeb 2,5; 3,5 e 4g/L; tiofanato metílico 6; 7 e 8g/L; e carbendazim 0,5; 1,0 e 1,5mL/L) e in vivo na dosagem recomendada pelo fabricante, bem como a solarização do substrato em coletores solares. Foram feitos ainda, testes de metabólitos voláteis, não voláteis e hiperparasitismo para os isolados de Trichoderma. No controle biológico in vitro , utilizou-se a técnica de confrontamento em cultivo pareado, enquanto no controle in vivo , o substrato foi tratado com os isolados de Trichoderma de forma isolada e integrada, antes da infestação do solo com o patógeno. No controle químico, os fungicidas foram testados in vitro adicionando-os ao meio BDA, enquanto in vivo as raízes das plântulas foram imersas durante 10 minutos na solução dos fungicidas. A solarização do substrato foi realizada durante 24, 48 e 72 horas, em coletores solares de 10 e 15 cm de diâmetro, infestando-se, previamente o substrato com o patógeno (40 mL do inoculo com aproximadamente 20 esporângios por mL / vaso). Os isolados de Trichoderma T3, T13 e TP foram os mais eficientes na inibição do crescimento de P. palmivora in vitro , no entanto, apenas o isolado TP produziu metabólitos voláteis e não voláteis. Por outro lado, todos os isolados apresentaram capacidade de hiperparasitar o patógeno. Já no controle biológico in vivo nenhum isolado foi capaz de reduzir a severidade da doença. A solarização do substrato aumentou significativamente a sobrevivência das plântulas quando comparada à testemunha. Não houve diferenças significativas entre os períodos de exposição solar, entretanto, o diâmetro de 15 cm apresentou uma melhor eficiência, com 87% de sobrevivência das plântulas. Os produtos mais eficientes na inibição do patógeno in vitro foram oxicloreto de cobre, mancozeb e metalaxyl + mancozeb, enquanto in vivo os cinco fungicidas apresentaram eficiência semelhante, não havendo diferença significativa entre as dosagens testadas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of the present study was to evaluate the effect of Trichoderma spp. on the physiologic potential of seeds and melon seedlings and also to evaluate the effect of Trichoderma spp. in melon seeds through the inoculation technique of water restriction. Two experiments were accomplished: in the first one, they were used as treatment of seeds, biological products to the base of Trichoderma spp. in the formulation it liquid and powder, besides the fungicide Captan isolated SC® and associate to the biological products. In the second experiment the technique of water restriction was used, where the treatments consisted of: BDA; BDA + manitol - 0,6MPa; BDA + manitol -0,8MPa; Trichoderma spp.; BDA + manitol -0,6 MPa +Trichoderma spp; BDA + manitol -0,8MPa + Trichoderma spp. The physiologic quality of the seeds was evaluated by a group of tests accomplished in controlled conditions of laboratory and greenhouse. Trichoderma spp. it was shown to be efficient in the germination test and cold without soil. In the evaluation of melon seedlings, Trichodel® and Agrotrich® using half of the recommended dose, separately or associate to the chemical fungicide, they presented the best results. The manitol use -0,8MPa + Trichoderma spp. was shown higher to the other treatments in the germination tests and test of cold without soil. Therefore, the same result was not obtained when it was evaluated the seedlings. Therefore, the technique of the water restriction it wasn t efficient in the inoculation of Trichoderma spp. / O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito de Trichoderma spp. sobre o potencial fisiológico de sementes e mudas de melão e também avaliar o efeito de Trichoderma spp. em sementes de melão através da técnica de inoculação da restrição hídrica. Foram realizados dois experimentos: no primeiro, foram utilizados como tratamento de sementes, produtos biológicos à base de Trichoderma spp. na formulação liquida e pó, além do fungicida Captan SC® isolado e associado aos produtos biológicos. No segundo experimento utilizou-se a técnica de restrição hídrica, onde os tratamentos consistiram de: BDA ; BDA + manitol -0,6MPa; BDA + manitol -0,8MPa; Trichoderma spp.; BDA + manitol -0,6 MPa+Trichoderma spp; BDA + manitol -0,8MPa + Trichoderma spp. A qualidade fisiológica das sementes foi avaliada por um conjunto de testes realizados em condições controladas de laboratório e em casa de vegetação. Trichoderma spp. mostrou-se ser eficiente nos teste de germinação e frio sem solo. Na avaliação de plântulas e mudas de melão, Trichodel® e Agrotrich® utilizando metade da dose recomendada, isoladamente ou associado ao fungicida químico, apresentaram os melhores resultados. O uso de manitol -0,8MPa + Trichoderma spp. mostrou-se superior aos demais tratamentos nos testes de germinação e teste de frio sem solo. Porém, o mesmo resultado não foi obtido quando avaliou-se as plântulas. Portanto, a técnica de da restrição hídrica não foi eficiente na inoculação de Trichoderma spp.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Black foot disease has described occurrence in most major wine-growing regions of the world. In Brazil, for over a decade researchers have reported the occurrence of the disease in the Serra Gaúcha region. The disease is associated mainly with fungi of the genera Campylocarpon and Ilyonectria. Because these are soil-borne pathogens, their control is limited and little is known about the use of biological products or use of resistant rootstocks. Therefore, the objective of this study was to evaluate commercial products based on Trichoderma spp. and Bacillus spp. in controlling Campylocarpon pseudofasciculare and check the occurrence of resistance in different rootstocks to Campylocarpon pseudofasciculare and Ilyonectria macrodidyma. Tests were carried out in vitro in the Phytopathology Laboratory for Universidade Federal de Santa Maria, in order to verify the efficiency of species of the genera Trichoderma and Bacillus from commercial products in pathogen control, through the method of pairing cultures and volatile metabolites In vivo test was performed in a greenhouse to evaluate the potential for biocontrol of commercial products against the pathogen inoculated in Vitis vinifera seedlings cv. Bordô, grafted on Paulsen 1103. In addition, in the greenhouse, the reaction was studied in rootstocks inoculated with Campylocarpon pseudofasciculare and Ilyonectria macrodidyma. The pairing cultures test with products based on Bacillus spp. and Trichoderma spp. showed an average value of mycelial inhibition growth of 46 and 41%, respectively. In the test of volatile metabolites isolates of Trichoderma spp. better controlled the pathogen, with an average reduction of mycelial growth of 61.5%. In in vivo testing for biocontrol Bacillus subtilis increased the length and dry weight of shoot and all treatments had better parameters than the treatment that received only the pathogen, indicating that these products are able to lessen the severity of the disease on vine plants. In the reaction test, all rootstock proved susceptible to the pathogens. / A doença pé-preto da videira tem ocorrência descrita na maioria das grandes regiões vitícolas do mundo. No Brasil, há mais de uma década pesquisadores relataram a ocorrência da doença na região da Serra Gaúcha. A doença está associada principalmente a fungos do gênero Campylocarpon e Ilyonectria. Por se tratarem de patógenos de solo, seu controle é limitado e pouco se sabe sobre a utilização de produtos biológicos ou de porta-enxerto resistente. Assim sendo, o objetivo deste estudo foi avaliar produtos comerciais à base de Trichoderma spp. e Bacillus spp. no controle de Campylocarpon pseudofasciculare e verificar a ocorrência de resistência em diferentes porta-enxertos a Campylocarpon pseudofasciculare e Ilyonectria macrodidyma. Foram realizados ensaios in vitro no Laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal de Santa Maria, a fim de verificar a eficiência de espécies dos gêneros Trichoderma e Bacillus, oriundas de produtos comerciais, no controle do patógeno, através do método de pareamento de culturas e metabólitos voláteis. Também foi realizado teste in vivo, em casa de vegetação, para avaliar o potencial de biocontrole dos produtos comerciais sobre o patógeno inoculado em mudas de Vitis vinifera cv. Bordô, enxertadas em Paulsen 1103. Além disso, em casa de vegetação, foi estudada a reação de porta-enxertos inoculados com Campylocarpon pseudofasciculare e Ilyonectria macrodidyma. No ensaio de pareamento de culturas com os produtos à base de Bacillus spp. e Trichoderma spp., o valor médio de inibição de crescimento micelial foi de 46 e 41%, respectivamente. No teste de metabólitos voláteis, isolados de Tricoderma spp. controlaram o patógeno, com média de redução de crescimento micelial de 61,5%. Em ensaio in vivo, todos os tratamentos com produtos foram capazes de controlar os sintomas da doença, quando comparados ao tratamento que recebeu apenas o patógeno, indicando que esses produtos são capazes de diminuir a severidade da doença em plantas de videira. No ensaio de reação de porta-enxertos, todas as plantas se mostraram suscetíveis aos patógenos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Grapevines are one of the most cultivated fruits in the world, and many factors can affect its potential income and longevity, including pathogens attack. In 1990, black foot disease of grapevine began to worry producers and agronomists in various places of the planet where the crop was grown. Since 1999, plants with disease symptoms have been observed in Brazil. However, little is known about this disease in the southern region of the country. Thus, this study aimed to: 1) characterize isolates of the Ilyonectria spp. and Campylocarpon pseudofasciculare associated with black foot disease and study their pathogenicity; 2) evaluate Bacillus subtilis and Trichoderma spp. on the control in vitro and in vivo of Ilyonectria macrodidyma. For that, symptomatic plants were collected in georeferenced vineyards of Rio Grande do Sul. Isolation of the pathogen occurred from necrotic fragments of roots and crown for further study of the etiology and pathogenicity. In vitro tests (volatile metabolites and pairing of cultures) and in vivo (Vitis vinifera cv. Merlot grafted on Paulsen 1103) were performed to evaluate the control efficiency of Bacillus subtilis and Trichoderma spp., obtained from different commercial products, over Ilyonectria macrodidyma. Morphological characterization and multi-gene analysis of three regions (ITS, β-tubulin and histone H3) confirmed the existence of Ilyonectria macrodidyma, Ilyonectria robusta, "Cylindrocarpon" pauciseptatum and Campylocarpon pseudofasciculare associated with black foot disease. All 20 isolates were pathogenic to Vitis labrusca cv. Bordô, resulting in reduced mass of roots and shoots, roots and crown necrosis, vascular lesions, wilting of shoots and plant death. Bacillus subtilis and Trichoderma spp. were effective in inhibiting the mycelial growth of I. macrodidyma through volatile metabolites and pairing of culture tests. / A videira é uma das principais frutíferas cultivadas no mundo, sendo que diversos fatores podem afetar seu potencial de rendimento e longevidade, incluindo o ataque de patógenos. A partir da década de 90, a doença pé-preto da videira começou a preocupar viticultores e técnicos em várias locais do planeta onde a cultura é cultivada. Desde 1999, vem sendo observadas plantas com sintomas da doença no Brasil. Porém, pouco se conhece sobre essa enfermidade na região sul do país. Assim, este trabalho objetivou: 1) caracterizar isolados de Ilyonectria spp. e Campylocarpon pseudofasciculare associados à doença pé-preto, bem como estudar sua patogenicidade e 2) avaliar Bacillus subtilis e Trichoderma spp. no controle in vitro e in vivo de Ilyonectria macrodidyma. Para isso, plantas sintomáticas foram coletadas em vinhedos georreferenciados do Rio Grande do Sul. Isolamento do patógeno se deu a partir de fragmentos necrosados de raízes e colo para posteriores estudos de etiologia e patogenicidade. Foram realizados testes in vitro (metabólitos voláteis e pareamento de culturas) e in vivo (Vitis vinifera cv. Merlot enxertada em Paulsen 1103) para avaliar a eficiência de Bacillus subtilis e Trichoderma spp., obtidos de diferentes produtos comerciais no controle de Ilyonectria macrodidyma. O estudo de caracterização morfológica e análise multi-gene de três regiões (ITS, β-tubulina e histona H3) confirmaram a existência de Ilyonectria macrodidyma, Ilyonectria robusta, Cylindrocarpon pauciseptatum e Campylocarpon pseudofasciculare associados à doença pé-preto. Todos os 20 isolados foram patogênicos a Vitis labrusca cv. Bordô, resultando em redução de massa de raízes e parte aérea, necrose no colo e raízes, lesões vasculares, murchamento de parte aérea e morte de plantas. Bacillus subtilis e Trichoderma spp. foram eficazes na inibição do crescimento micelial de I. macrodidyma através de testes de metabólitos voláteis e pareamento de culturas.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5135.pdf: 1934880 bytes, checksum: 392e2dc3d6c55b9eb87de4bb33adec6d (MD5) Previous issue date: 2013-02-05 / Universidade Federal de Sao Carlos / The sugarcane bagasse is a lignocellulosic material that can be converted into ethanol by action of cellulases and xylanases. These enzymes act synergistically to convert cellulose and hemicellulose into glucose. In order to obtain an enzyme that can perform dual function, a chimeric enzyme cellulase-xylanase denominated ThEg3Xyn3, was constructed by gene fusion in our laboratory. The fusion was performed by binding the C-terminus of an endoglucanase from Trichoderma harzianum to the N-terminus of a xylanase of the same fungus, separated by a linker. The chimeric enzyme was recombinantly produced in Pichia pastoris and purified for kinetic and biochemical characterization. The chimera demonstrated activity of both enzymes with maximum activity at 38 °C and pH 6.0, under these conditions, cellulolytic and xylanolytic activity was greater than of the parental enzymes. The results demonstrate that the chimeric enzyme can be efficient in hydrolysis of the biomass and satisfactory for the production of ethanol by the process of simultaneous saccharification and fermentation. / O bagaço da cana-de-açúcar é um material lignocelulósico que pode ser convertido em etanol pela ação de celulases e xilanases. Essas enzimas atuam sinergicamente para converter celulose e hemicelulose em glicose. A fim de obter uma enzima capaz de realizar dupla função, uma enzima quimérica celulase-xilanase denominada ThEg3Xyn3, foi construída em laboratório. A fusão foi realizada pela ligação do C-terminal de uma endoglucanase do fungo Trichoderma harzianum ao N-terminal de uma xilanase do mesmo fungo, separadas por um linker. A enzima quimérica foi recombinantemente produzida em Pichia pastoris e purificada para caracterização cinética e bioquímica. A quimera demonstrou atividade de ambas as enzimas com atividade máxima a 38 °C e pH 6,0, sob estas condições, a atividade celulolítica e xilanolítica foi maior do que das enzimas parentais. Os resultados demonstram que a enzima quimérica pode ser eficiente na hidrólise da biomassa e satisfatória para a produção de etanol pelo processo de sacarificação e fermentação simultâneas.

Devido à sua importante atividade celulolítica, o fungo Trichoderma harzianum possui um grande potencial de aplicação na hidrólise da biomassa. No entanto, as celulases deste fungo filamentoso ainda não foram caracterizadas em profundidade. A celobiohidrolase I (CBHI) é a principal enzima celulolítica produzida por Trichoderma sp. e atualmente é uma das celulases mais investigadas para aplicações de biocombustíveis. A CBHI hidrolisa celulose cristalina à unidades solúveis de celobiose, o que a torna uma enzima chave para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa. O objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar a CBHI de Trichoderma harzianum (ThCBHI) bioquímica, biofísica e estruturalmente. Primeiramente foi estabelecido um protocolo de purificação eficiente da proteína a partir da expressão homóloga no fungo. A caracterização bioquímica ThCBHI mostrou que a proteína possui uma massa molecular de 66 kDa, pI de 5,23 e o pH e a temperatura de atividade ótima foram 5,0 e 50 ºC, respectivamente. A influência do pH e temperatura sobre as estruturas secundárias e terciárias e atividade enzimática da ThCBHI foram analisados por espectroscopia de CD, fluorescência e SAXS, e os resultados mostraram que as perturbações de pH e de temperatura afetam a estabilidade por dois mecanismos diferentes. As variações de pH podem modificar a protonação dos resíduos, afetando diretamente sua atividade, levando a desestabilização estrutural apenas em limites extremos de pH, como pH 9,0. A temperatura, por outro lado, tem uma influência direta sobre enovelamento e compactação da enzima, fazendo com que na temperatura em torno de 60 ºC ocorra perda da estrutura secundária, e terciária. Quando as análises foram realizadas na presença do produto de reação e também inibidor competitivo, celobiose, a estabilidade térmica da ThCBHI aumentou significativamente de 61,5 para 65,9 ºC. Os estudos estruturais e simulações de dinâmica molecular mostraram que a flexibilidade do resíduo Tyr260, em comparação com a Tyr247 do homólogo de T. reesei CBHI (TrCBHI), é aumentada devido às cadeias laterais curtas adjacentes de Val216 e Ala384 criando uma abertura adicional na face lateral do túnel catalítico. A ThCBHI também apresenta um loop encurtado na entrada do túnel de interação com a celulose, o que tem sido descrito como o responsável por interagir com o substrato de TrCBHI. Estas características estruturais podem explicar por que a ThCBHI apresenta maior valor de kcat e menor inibição pelo produto em comparação com TrCBHI. / Trichoderma harzianum is a fungus that has a considerable potential in biomass hydrolysis application due to its elevated cellulolytic activity. Cellulases from Trichoderma reesei have been widely used as model in studies of cellulose breakdown. However, cellulases from Trichoderma harzianum are less-studied enzymes which have not been characterized biophysically and biochemically as yet. CBHI, a cellobiohydrolase I, is the major cellulolytic enzyme produced by Trichoderma sp. and is currently one of the most investigated cellulases for biofuel applications. CBHI hydrolyzes crystalline cellulose to soluble cellobiose units, which turns it into a key enzyme for producing fermentable sugars from biomass. The aim of this work was to purify and characterize the CBHI of Trichoderma harzianum (ThCBHI). We established an efficient purification protocol of ThCBHI, from the homologous expression. The biochemical characterization of ThCBHI showed that the protein has a molecular mass of 66 kDa, a pI of 5,23, and the optimum pH and temperature for its activity are 5,0 and 50 ºC, respectively. The effect of pH and temperature on secondary and tertiary structure and enzymatic activity of ThCBHI were analyzed by CD and Fluorescence spectroscopy and showed that they affect protein stability by two distinct mechanisms. Variations of pH modify protonation of the residues, affecting directly its activity, leading to structural destabilization only at extreme pH values, such as pH 9, 0. On the other hand, temperature has direct influence on mobility, fold and compactness of the folding enzyme, at temperatures above 60 ºC, there is loss of secondary and tertiary structure. When the assays were conducted in the presence of the cellobiose, a competitive inhibitor, thermal stability of ThCBHI was significantly increased to 61,5 to 65,9 ºC. Structural studies and molecular dynamics simulations showed that the flexibility of Tyr260, in comparison to the Tyr247 from the homologous T. reesei CBHI, is enhanced due to the short side chains of adjacent Val216 and Ala384 residues and creates an additional gap at the side face of the catalytic tunnel. In addition, CBHI of T. harzianum has a shortened loop at the entrance of the cellulose-binding tunnel, which has been described to interact with the substrate in T. reesei CBHI. These structural features might explain why T. harzianum enzyme displays higher kcat value and lower product inhibition on both glucosides and lactosides substrates in comparison to T. reesei CBHI.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é o principal produtor de enzimas celulolíticas e hemicelulolíticas utilizadas para a produção de biocombustíveis a partir de biomassa lignocelulósica. Para que o custo de produção de etanol de segunda geração (2G), em escala industrial, seja competitivo, uma mistura eficiente de enzimas hidrolíticas é necessária para degradar a biomassa vegetal em açúcares fermentescíveis. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos de enzimas de interesse biotecnológico, o presente trabalho se propôs a analisar o perfil global do transcriptoma de T. reesei em presença de celulose, soforose e glicose como fontes de carbono, a fim de prover um melhor entendimento de como essas enzimas são produzidas por esse microrganismo. Para isso, foi utilizada a abordagem RNA-seq e duas linhagens de T. reesei: QM9414 (parental) e xyr1 (mutante). No Capítulo I, foram anlisados 22 genes que codificam celulases e xilanases, com o intuito de verificar a regulação da expressão gênica pelo fator de transcrição XYR1 em diferentes fontes de carbono. Foi observada uma dependência da fonte de carbono e redução da expressão destes genes que codificam celulases e xilanases quando se comparou a linhagem mutante com a parental, cultivados na presença de celulose e soforose. Na presença de glicose, a maior parte dos genes analisados apresentou aumento de expressão no mutante xyr1. Por meio de análises in silico foi identificado o elemento regulatório cis para o fator de transcrição XYR1 usando quatro conjuntos de dados de genes dependente-condição envolvendo os experimentos RNA-seq e qPCR-TR. Foram identificados dois motivos com o consenso de ligação proposto para o regulador XYR1 (nomeado PWMXYR1). Ao usar esses motivos identificados, foi analisada a presença e disposição dos putativos elementos regulatórios cis nesses conjuntos de dados, sendo que sítios com intervalos curtos foram mais associados a promotores dependentes de XYR1 do que sítios simples. Além disso, a abordagem utilizada permitiu a identificação de sítios de ligação XYR1, na região promotora dos genes cel7a e xyn1 e mapear a potencial sequência alvo do regulador na região promotora do gene cel6a. Adicionalmente, sete outros promotores (genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 e swo) apresentaram sítios de ligação putativos de XYR1. Usando a arquitetura do regulador PWMXYR1, foram identificados potenciais genes alvos de regulação direta por XYR1 no genoma de T. reesei. O mapeamento do referido sítio foi realizado, também, nos genes diferencialmente expressos na linhagem mutante xyr1, destacando que a regulação indireta desempenha um papel fundamental nas vias de sinalização. Estes resultados fornecem novas informações sobre os mecanismos de sinalização mediados por XYR1 na regulação de promotores de celulases. No Capítulo II, foi analisado o transcriptoma global da linhagem parental (QM9414) em diferentes fontes de carbono: celulose; soforose e glicose. Aplicando limites rigorosos de corte, 2060 genes foram identificados como diferencialmente expressos em pelo menos uma das fontes de carbono analisadas. Clusterização hierárquica desses genes diferencialmente expressos identificaram-se três possíveis regulons, representando 123 genes controlados por celulose, 154 genes controlados por soforose e 402 genes controlados por glicose. A análise da rede regulatória demonstrou a inter-relação existente entre as condições, permitindo a identicação de 75 genes específicos do crescimento em soforose e 107 de celulose. Esses resultados revelaram novos genes envolvidos na degradação da celulose, tais como: proteínas acessórias, transportadores, fatores de transcrição e CAZymes que respondem especificamente a presença de celulose ou soforose. No Capítulo III, analisou-se o perfil transcricional da linhagem mutante xyr1 comparando com a linhagem parental (QM9414), na presença das três fontes de carbono. As análises de expressão gênica revelaram que 2185 genes foram diferencialmente expressos na condição celulose, 2124 genes na condição soforose e 46 genes em glicose. Esses genes foram utilizados para analisar a inter-relação existente entre as condições, com destaque para grande número de genes exclusivos nas condições de indução (celulose e soforose). Por meio da clusterização hierárquica foram identificados 6 possíveis regulons, sendo 3 deles compostos por genes up-regulados e 3 regulons por genes down-regulados. Na ausência do regulador XYR1, a expressão de genes CAZys, fatores de transcrição, transportadores, entre outros, foram afetadas de modo dependente da fonte de carbono. Essas análises permitiram verificar que o fator de transcrição XYR1 é fundamental no processo de indução de enzimas de interesse biotecnológico, além de participar de outros processos bioquímicos/moleculares. Desse modo, todos os resultados obtidos fornecem informações sobre os eventos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica durante a adaptação de T. reesei frente a diferentes condições ambientais como: diferentes fontes de carbono e necessidades nutricionais. Contribuindo, assim, para uma melhor caracterização desse fungo filamentoso em relação à produção de enzimas e o desenvolvimento de mutantes metabólicos para utilização industrial. / The filamentous fungus Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is a major producer of cellulolytic enzymes used for biofuels production from lignocellulosic biomass. In order to achieve a low cost second generation ethanol production in industrial scale, an efficient mix of hydrolytic enzymes are required for the degradation of plant biomass into fermentable sugars. Given the growing demand for development of processes in order to reduce the cost of enzymes production, the present work proposes a large-scale transcriptomic analysis of T. reesei in presence of cellulose, sophorose, and glucose as carbon sources, in order to provide insights about the mechanisms of enzymes production by this microorganism. For this purpose, RNA-seq approach was employed, as well, as two T. reesei strains: QM9414 (parental) and xyr1 (mutant). In Chapter I, 22 genes encoding cellulases and xylanases were analyzed regarding the regulation through the transcription factor XYR1. This regulation seems to occur in a carbon source dependence manner, and the expression of cellulases and xylanases was diminished in the mutant strain compared to the parental strain in the presence of cellulose and sophorose. In glucose, most of the analyzed genes showed higher expression in the mutant compared to the parental strain. In silico analysis identified a cis regulatory element for XYR1 using four datasets of condition-dependent genes based on RNA-seq and qPCR experiments. Two binding motifs have been identified with the proposed consensus for the XYR1 (named PWMXYR1). Using these motifs, the presence and arrangement of putative cis regulatory elements was analyzed, and the results indicate that the sites with short intervals were stronger associated with XYR1 dependent promoters than single sites, even with high scores. Moreover, this approach allowed the identification of XYR1 binding sites in the promoter region of cel7a and xyn1, as well as, map the potential target sequence in the promoter of cel6a gene. In addition, seven other promoters from genes cel7b, cel61a, cel61b, cel3c, cel3d, xyn3 and swo presented XYR1 putative binding sites. Using the cis-regulatory architecture of PWMXYR1, potential targets for direct regulation by XYR1were identified in a genome wide manner. The putative binding sites were also mapped in the differentially expressed genes identified in the mutant strain xyr1, suggesting that indirect regulation plays a key role in signaling pathways. Taken together, the data provided here provides important information regarding signaling mechanisms mediated by XYR1 in the regulation of cellulases promoters. In Chapter II, the transcriptome of the parental strain (QM9414) was analyzed in three carbon sources, cellulose, sophorose and glucose. By applying a stringent cut-off threshold, 2,060 genes were identified as differentially expressed in at least one of the carbon sources analyzed. Hierarchical clustering of differentially expressed genes identified three possible regulons, representing 123 genes controlled by cellulose, 154 genes controlled by sophorose and 402 genes controlled by glucose. The analysis of the regulatory network demonstrated the interrelation between the conditions, allowing the identification of 75 genes specifically expressed in soforose and 107 in cellulose. These results revealed new players involved in cellulose degradation, such as accessory proteins, transporters, transcription factors and CAZymes, that specifically respond to the presence of either cellulose or sophorose. In Chapter III, a genome wide comparative transcriptional analysis were performed between the mutant xyr1 strain and the parental strain (QM9414) using the three carbon sources. Gene expression analysis revealed 2,185 genes differentially expressed in cellulose, 2124 genes in sophorose and 46 genes in glucose. These differentially expressed genes were used to analyze the relationship between the conditions, revealing a greater number of exclusive genes in theinducing conditions (cellulose and sophorose). The hierarchical clustering analysis revealed 6 possible regulons, being three composed by up-regulated genes and 3 regulons composed by down-regulated genes. In the absence of the regulator XYR1, the expression of CAZy genes, transcription factors among other genes were affected in a carbon-dependent manner. These analyses showed that the transcription factor XYR1 has an essential role in induction of enzymes of biotechnological interest and participates in other biochemical/molecular processes. Taken together these results provide important information about the molecular events, involved in gene expression regulation during T. reesei adaptation to different environments such as: carbon sources and/or nutritional needs, thus contributing to a better understanding of this filamentous fungus regarding the the production of enzymes and the development of mutants for industrial applications.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a atividade celulolítica de fungos isolados de bagaço de cana-de-açúcar e serapilheira, atuantes sobre bagaço de cana-de-açúcar e farelo de arroz como substratos. Dez isolados fúngicos de amostras de bagaço de cana-de-açúcar e material vegetal em decomposição foram avaliados quanto à atividade celulolítica, tendo como referências os fungos Trichoderma reesei QM9414 e T. reesei RUTC30. A atividade celulolítica foi estimada pela capacidade hidrolítica do extrato enzimático dos fungos crescidos em bagaço de cana-deaçúcar, com e sem pré-tratamento térmico e com diferentes proporções de farelo de arroz. A atividade celulolítica foi estimada tanto em papel de filtro, para celulase total, como a carboximetilcelulose sódica, para endoglucanase. Os isolados identificados por análise molecular através da região 26S rDNA foram: Aspergillus giganteus (S1), Aspergillus fumigatus (S2 e F4), Trichoderma viride/Trichoderma hamatum (S3 e S6), Trichoderma koningiopsis (TPB), Paecilomyces variotti (F1), Moniliophthora perniciosa (F2), Acremonium cellulyticus/Penicillium verruculosum (G3) e Trichoderma sp RA305 (MAD). O Trichoderma reesei QM9414 apresentou a maior atividade tanto para celulase total como para endoglucanase. O isolado F1 não diferiu estatisticamente para atividade de endoglucanase em relação à cepa QM9414 em substrato contento somente bagaço. O isolado MAD não diferiu estatisticamente para atividade de celulase total e endoglucanse em relação à cepa QM9414 em substrato contendo 10% de farelo de arroz. Os isolados TPB e S2 apresentaram as maiores atividades para endoglucanase em bagaço de cana-de-açúcar tratado. Tais resultados mostram que a biodiversidade em nichos, como o bagaço de cana-de-açúcar e materiais vegetais em decomposição, podem fornecer linhagens de fungos celulolíticos com grande potencial biotecnológico. / The objective of this work was to evaluate the cellulolytic activity of fungi isolated from sugarcane bagasse and decaying plant material, growing on sugarcane bagasse and rice bran as substrate. Ten isolates from sugarcane bagasse and decayed plant material were evaluated for their cellulolytic activity as compared to the fungi Trichoderma reesei QM9414 and T. reesei RUTC30. The cellulolytic activity was estimated by the hydrolytic capacity of the enzymatic extract of fungi grown on sugarcane bagasse, with and without pre-heat treatment and with different proportions of rice bran. It was used as substrates both filter paper, for total cellulolytic activity, and sodium carboxymethyl cellulose, for endoglucanase activity. The isolates identified by molecular analysis using 26S rDNA region were: Aspergillus giganteus (S1), Aspergillus fumigatus (S2 and F4), Trichoderma viride/Trichoderma hamatum (S3 and S6), Trichoderma koningiopsis (TPB), Paecilomyces variotti (F1), Moniliophthora perniciosa (F2), Acremonium cellulyticus/Penicillium verruculosum (G3) and Trichoderma sp RA305 (MAD). Trichoderma reesei QM9414 showed the highest total cellulolytic activity and endoglucanase activity among all isolates. Isolate F1 was not statistically different for endoglucanase activity in relation to strain QM9414 using bagasse as substrate. Isolate MAD was not statistically different for total cellulose activity and endoglucanase activity in relation to strain QM9414 using substrate containing 10% of rice bran. Isolates TPB and S2 had the highest endoglucanase activities using sugarcane bagasse treated as substrate. These results show that biodiversity in niches, such as bagasse and decayed plant material, can provide strains of cellulolytic fungi with great biotechnological potential.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao de mestrado completa Amanda A Souza.pdf: 994299 bytes, checksum: 8cf098dd70299abaf08a216436f38888 (MD5) Previous issue date: 2011-06-29 / Trichoderma harzianum is a saprophytic fungus, known for its potential as a biological control agent of different phytopathogens that causes losses in crops. Its action is based on different mechanisms like volatile and non-volatile antibiotics production, competition for nutrient and space, production of hydrolytic enzymes and mycoparasitism. This fungus also plays an important role in the release of carbon, nitrogen and phosphorus from insoluble macromolecules to the medium, favoring the growth of plants. Phosphorus is a limiting nutrient for plant growth, however, over 80% of the phosphorus applied to the soil, it becomes unavailable, due to its adsorption, precipitation or conversion to organic form. One way to obtain phosphate compounds in soil is through the action of enzymes called phosphatases, which catalyze the hydrolysis of phosphate esters producing soluble phosphorus. High levels of acid phosphatase (ACP) were produced by Trichoderma harzianum ALL42. This study evaluated the ability of T. harzianumALL42produce acid phosphatases(ACPs) in minimal medium modified by varying the concentration of glucose and phosphate (KH2PO4). The results showed that the concentration of glucose and phosphate in the culture medium regulated the production of ACPs T. harzianum ALL42. Thisfungusproducedanacid phosphatase(ACPII) inculture mediumcontainingglucose0.5% and0.04% phosphate. Theenzymewaspartiallypurifiedby hydrophobic interaction chromatography on Phenyl Sepharose. A typical procedure provided 2,0 fold purification with 32.65 % yield. It was optimally active in the pH range 5,2 and at 50°C. The enzyme was heat-stable, retaining approximately 60% of its activity after heating for 60 min at 60°C. Kinetic parameters calculated for the hydrolysis of p-nitrophenyl phosphate by acid phosphatase were Km= 0,054 M and Vmax= 2,058 units.min-1. The enzyme was strongly inhibited by KH2PO4, FeCl3 and sodium tungstate. The enzyme is inhibited by KH2PO4 and sodium tungstate through mixed inhibition. The acid phosphatase hydrolyzed a number of phosphate esters ATP, ADP, AMP, D-glucose-1-phosphate, D-fructose-6-phosphate, includingphytic acid, showinganactivityofphytase. / Trichoderma harzianum é um fungo saprofítico, conhecido pelo seu grande potencial como agente de controle biológico de diferentes fitopatógenos. Sua ação é baseada em diferentes mecanismos como a produção de antibióticos voláteis e não-voláteis, competição por espaço e nutrientes, produção de enzimas hidrolíticas e o micoparasitismo. Esse fungo também desempenha um importante papel na liberação de carbono, nitrogênio e fósforo, a partir de macromoléculas insolúveis, para o meio, favorecendo o crescimento de plantas. O fósforo é um nutriente limitante para o crescimento da planta, entretanto, mais de 80% do fósforo aplicado diretamente no solo, torna-se indisponível, devido a sua adsorção, precipitação ou conversão para forma orgânica. Uma forma de se obter compostos fosfatados no solo é através da ação de enzimas denominadas fosfatases, que catalisam a hidrólise de ésteres fosfatados produzindo fósforo solúvel. Altos níveis de fosfatase ácida foram produzidos por Trichoderma harzianum ALL42. Neste trabalho avaliou-se a capacidade de T. harzianum ALL42 produzir fosfatases ácidas (ACPs) em meio mínimo modificado, variando a concentração de glicose e fosfato (KH2PO4). Os resultados obtidos demonstraram que, a concentração de glicose e fosfato no meio de cultura regulou a produção de ACPs por T. harzianum ALL42. Esse fungoproduziu uma fosfatase ácida (ACPII) em meio de cultura contendo glicose 0,5% e fosfato 0,04%. A enzima foi parcialmente purificada através da cromatografia de interação hidrofóbica Phenyl-Sepharose. O processo de purificação obteve um fator de purificação de 2,0 e rendimento de 32,65%. A atividade ótima encontrada foi na faixa de pH 5,2 e a 50 ºC. A enzima foi termoestável, mantendo aproximadamente 60% de sua atividade após incubação por 60 min a 60 ºC. Os parâmetros cinéticos calculados pela hidrólise de ƿ-nitrofenilfosfato pela fosfatase ácida foram de Km = 0,054 µmol e Vmáx = 2,028U.min-1. A enzima foi fortemente inibida por KH2PO4,FeCl3 e tungstato de sódio. A enzima foi inibida por KH2PO4 e tungstato de sódio por inibição mista. A fosfatase ácida hidrolisou todos os ésteres fosfatados testados (ATP, ADP, AMP, D-glicose-1-fosfato, D-frutose-6-fosfato, fenil fosfato de sódio), inclusive ácido fítico, demonstrando uma atividade de fitase.