Made available in DSpace on 2014-07-29T15:01:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carolina Braz Silva.pdf: 810800 bytes, checksum: 70f05bacdef63b8aef2325761ace6cca (MD5) Previous issue date: 2011-08-23 / The organophosphate insecticides have been widely used for agricultural purposes. In the environment, organophosphates have been found in various environmental matrices, resulting in a growing environmental concern, among these compounds stands out Acephate, organophosphate and was registered by ANVISA reassessed in 2009, due to their toxicological and carcinogenic potential. The development of this work sought to select strains of Trichoderma harzianum capable of stimulating enzyme production by Trametes villosa and Pycnoporus sanguineus to promote the reduction of toxicity of Acephate. First there was the selection of strains of T. harzianum then became mixed cropping of selected strains of T. harzianum with Trametes villosa and T. harzianum with Pycnoporus sanguineus to determine the potential production of enzymes, and further tests were carried out with concentrations of 10% and 50% Acephate then held the toxicity test to assess the reduction of toxicity of Acephate. The results obtained in the experiments show that linhanges T. harzianum are good producers of lignin peroxidase (45 U.mL-1) and manganese peroxidase (23 Uml-1), the strains of T. harzianum were able to increase the production of Laccase in culture with T. villosa (20.57 Uml-1) and assessed that the fungi produced more enzymes in the presence of 50% Acephate. In toxicity tests, the samples with 10% Acephate addressed by the fungi indicated that compared to control, the association of P. sanguineus and Trichoderma T47 increased by 94% of cholinesterase, indicating a decrease in its toxicity, the association of P. sanguineus and Trichoderma harzianum ALL42 increase of 93% and the association between T. villosa and T. harzianum T39, an increase of 100% of cholinesterase, indicating that fungi were able to reduce the toxicity of Acephate. / Os inseticidas organofosforados têm sido amplamente utilizados para fins agrícolas. No ambiente, os organofosforados têm sido encontrados em diversas matrizes ambientais, resultando em uma crescente preocupação ambiental, dentre estes compostos destaca-se o Acefato, organofosforado que teve seu registro reavaliado pela ANVISA em 2009, devido ao seu potencial toxicológico e carcinogênico. O desenvolvimento deste trabalho buscou selecionar linhagens de Trichoderma harzianum capazes de estimular a produção enzimática por Trametes villosa e Pycnoporus sanguineus a fim de promover a diminuição da toxicidade do Acefato. Primeiramente realizou-se a seleção das linhagens de T. harzianum, em seguida fez-se o cultivo misto das linhagens selecionadas de T. harzianum com Trametes villosa e T. harzianum com Pycnoporus sanguineus para verificar o potencial de produção das enzimas, e posteriormente foram realizados os ensaios com concentrações de 10% e 50% de Acefato, em seguida realizou-se os teste de toxicidade para avaliar a redução da toxicidade do Acefato. Os resultados obtidos nos experimentos demonstram que as linhanges de T. harzianum são bons produtores de Lignina peroxidase (45 U.mL-1) e Manganês peroxidase (23 UmL-1), as linhagens de T. harzianum foram capazes de aumentar a produção de Lacase no cultivo com T. villosa (20,57 UmL-1) e que os fungos avaliados produziram mais enzimas na presença de 50% de Acefato. Nos testes de toxicidade, as amostras com 10% de Acefato tratadas pelos fungos indicaram que em relação ao controle, a associação de P. sanguineus e o Trichoderma T47 teve aumento de 94% de Colinesterase, indicando diminuição de sua toxicidade, na associação de P. sanguineus e Trichoderma harzianum ALL42 aumento de 93% e na associação entre T. villosa e o T. harzianum T39, aumento de 100% de Colinesterase, indicando que os fungos foram capazes de reduzir a toxicidade do Acefato.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Patricia Ribeiro dos Santos.pdf: 1037396 bytes, checksum: e99d81a176db1d0496423b4ece2cefbd (MD5) Previous issue date: 2010-03-03 / Biological control is a natural process that regulates the number of individuals existing in a population, by the action of another individual called "natural enemies or biological control agent (parasitoids, predators and pathogens), causing biotic mortality. Fungi that act as antagonists of phytopathogenic fungi have been used to control the disease, and 90% of these applications have been made using strains of fungi of the genus Trichoderma. The genus Trichoderma (Ascomycetes) Hypocreales, belonging to the class and brings Hifomicetos species that are among the soil fungi most commonly found in nature. There are several problems related to the nomenclature of individuals of this gender. Molecular tools such as markers and DNA Barcode has been used in identification of Trichoderma but also another fungi. The objective of this work was to identify isolates of Trichoderma spp. using only molecular tools. Analysis using markers make possible the observation of the high degree of genetic variability between these individuals, but proved problematic when the sample size was increased. The identification of individuals using DNA Barcode was possible only for a few individuals who show the need for the high quality sequences obtained by sequencing. The phylogenetic analysis was extremely difficult because is time consuming and required much time to perform the analysis. However by Neighbor-joining analysis was observed that when using databases such as BLAST error rate in identifying these species is high due to deposition of sequences of isolates incorrectly identified. / Controle biológico é um processo natural, que regula o número de indivíduos existentes em uma população, pela ação de outro indivíduo chamado de inimigo natural ou agente de controle biológico (parasitóides, predadores e patógenos), causando mortalidade biótica. Fungos que atuam como antagonistas de fungos fitopatogênicos têm sido usados para controlar a doença, sendo que 90% dessas aplicações tem sido feitas utilizando-se linhagens de fungos do gênero Trichoderma. O gênero Trichoderma (Ascomycetes), ordem Hypocreales, pertencente à classe dos hifomicetos e reúne espécies que se encontram entre os fungos de solo mais comumente encontrados na natureza. Vários são o problemas relacionados à nomeclatura de indivíduos desses gênero. Ferramentas moleculares, como marcadores e DNA Barcode tem sido usadas na identificação não só de Trichoderma mas também de outro fungos. Esses trabalho teve como objetivo identificar isolados de Trichoderma spp. Utilizando somente ferramentas moleculares. A análise utilizando marcadores RAPD posiibilitaram uma observação do alto grau de variabilidade genética existente entre esses indivíduos, ma se mostrou problemática quando o número amostral foi aumentado. A identificação de indivíduos utilizando DNA Barcode só foi possível para poucos indivíduos o que demonstra a necessidade de que as sequências obtidas sejam de alta qualidade. A análise filogenética se mostrou extremamente difícil, devido a demanda de tempo necessária para a realização das análises. Entretanto através da análise de Neighbor-joining foi possível observar que quando se utiliza bancos de dados como o BLAST a taxa de erro na identificação dessas espécies é grande devido ao depósito de sequências de isolados incorretamente identificados.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte I regiane.pdf: 912177 bytes, checksum: 0b47e257840020aec3acb3cb01014dba (MD5) Previous issue date: 2008-05-29 / The β-1.3-glucanases have several functions in the cell as fungal metabolic in hydrolysis of polysaccharides for possible cellular assimilation; morphogenetic function in the hydrolysis or modifications of the cell wall, which includes growth and extension of the wall, altering the structure and composition of the wall and autolysis. In addition to presenting ecological importance, since these enzymes are involved in biological control, through the process of mycoparasitism. The gender Trichoderma comprises a group of filamentous fungi, saprophytic soil, found on decomposing organic matter in the rhizosphere, and some plants. Considering the importance of β-1.3 glucanases proposing in this study to evaluate the production of β-1.3 - glucanases by T. asperellum using different sources of carbon and nitrogen. The enzyme was produced using cell wall of Rizoctonia solani (PCRS), chitin, chitosan, starch, cellulose, sucrose, maltose, lactose, celobiose and glucose. The best production of enzymes was obtained in the middle containing PCRS, with two bands of activity of polyacrylamide gel were found. Furthermore, the effect of varying concentrations of ammonium sulfate (2, 4, 6, 8, 20, 40 and 60 mM) in the production of β-1.3-glucanase was evaluated during the growth of the fungus in PCRS. A great increase in activity of the enzyme was detected in the presence of nitrogen source. We can see that there was a considerable increase in the expression of the enzyme of low molecular weight at this culture conditions. / As b-1,3-glucanases apresentam diversas funções na célula fúngica como metabólica, na hidrólise de polissacarídeos para eventual assimilação celular; função morfogenética, na hidrólise ou modificações da parede das células, que inclui o crescimento e extensão da parede, alterando sua estrutura e sua composição e autólise. Além de apresentar importância ecológica estas enzimas estão envolvidas no controle biológico, através do processo de micoparasitismo. O gênero Trichoderma compreende um grupo de fungos filamentosos saprófitas de solo, encontrados sobre matéria orgânica em decomposição e na rizosfera de algumas plantas. Considerando a importância das b-1,3-glucanases propõe-se neste trabalho a avaliação da produção de b-1,3-glucanases por T. asperellum utilizando diferentes fontes de carbono e nitrogênio. A enzima foi produzida utilizando parede celular de Rizoctonia solani (PCRS), quitina, quitosana, amido, celulose, sacarose, maltose, lactose, celobiose e glicose. A melhor produção de enzimas foi obtida n o meio contendo PCRS, sendo detectadas duas bandas de atividade em gel de poliacrilamida. Além disto, o efeito de concentrações variadas de (NH4) 2SO4 (2, 4, 6, 8, 20, 40 e 60 mM) na produção de b-1,3-glucanases foi avaliado durante o crescimento do fungo em PCRS. Um aumento considerável na atividade da enzima foi detectado na presença desta fonte de nitrogênio. Pode - se observar que houve um aumento considerável na expressão da enzima de menor massa molecular nestas condições de cultivo.

A crescente demanda por energia e a necessidade de promover o desenvolvimento sustentável colocam em foco os combustíveis renováveis. Dentro de biocombustíveis, os 2G ou segunda geração, têm como objetivo a utilização da energia contida na biomassa vegetal. Muitos microorganismos são capazes de excretar enzimas que quebram a lignocelulose, o principal componente das paredes celulares da planta, em açúcares fermentáveis. Os objetivos deste trabalho foram selecionar fungos filamentosos que produzem enzimas que degradam a biomassa e otimizar suas condições de cultivo. Quatro isolados e duas linhagems padrão foram testadas para a produção de celulases e identificadas pelo sequencimaneto da região ITS (Internal Transcribed Spacer). Após a caracterização inicial, três linhagens foram selecionadas e testadas em diferentes fontes de nitrogênio e carbono, e agentes tamponantes, visando o cultivo ótimo para cada delas. As condições ideais foram escolhidas com base em critérios de atividade enzimática, proteínas totais liberadas e pH. Após o estabelecimento das condições ótimas, os sobrenadantes das culturas foram liofilizados e o teor de proteínas determinado. O mesmo extrato foi testado quanto à FPA (Filter Paper Activity), atividades de β-glicosidase e xilanases, e quanto sua capacidade hidrolitica na biomassa pré-tratada. As linhagens selecionadas foram identificadas como Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) e a linhagem padrão Trichoderma reesei QM9414. A melhor combinação de fontes de nitrogênio foi a razão 4:3:3; 5:3:2 e 6:3:1 (sulfato de amónio, ureia e extrato de levedura) para F88, F811 e T. reesei, respectivamente. O ácido cítrico foi selecionado como agente tamponante para F88 e T. reesei, e PIPES para F811. Bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BPT), como fonte de carbono, foi o melhor para induzir a produção de celulases e xilanases por F88 e F811, enquanto, Solka-Floc® foi a melhor para T. reesei. As atividades de β-glicosidase e xilanase foram maiores em F811 do que para T. reesei. No entanto, para FPA, T. reesei apresentou o melhor rendimento. Nos ensaios de hidrólise, as conversões de glicana e xilana foram semelhantes para ambas as linhagens, mesmo havendo acúmulo de celobiose no ensaio de T. reesei. Comparando os dados obtidos para ambas linhagens, uma selvagem e outra que é considerada referência industrial, F811 se mostrou promissor para a produção de enzimas hidrolíticas e como consequência, a habilidade em transformar a biomassa em açúcares fermentáveis. / The increasing demand for energy and the necessity to promote sustainable development has focused on renewable fuels. Within the available biofuels, 2G or second generation, has the aim of releasing the energy contained in plant biomass. Many microorganisms are able to secret enzymes capable of breaking down lignocellulose, the main component of plant cell walls, into fermentable sugars. The objectives of this project was to select filamentous fungi that produce enzymes that degrade biomass and optimize the growth conditions for them. Four isolates and two standards strains were tested for the production of cellulases and identified by ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing. After initial characterization, three strains were selected and tested in different sources of nitrogen and carbon, and buffering agents for optimal growth. The ideal conditions were chosen based on the criteria of enzymatic activity, total proteins released and pH. After the ideal condition for each strain were established, cell free extracts from each culture were lyophilized and the total protein content determined. This extract was tested for FPA (Filter Paper Activity), β- glucosidase and xylanase activity and the hydrolysis assays were carried out using pretreated biomass. The selected strains were identified as Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) and the standard strain Trichoderma reesei QM9414. The best combination of nitrogen sources was the ratio 4:3:3; 5:3:2 and 6:3:1 (ammonium sulfate, urea and yeast extract) for F88, F811 and T. reesei, respectively. Citric acid was selected as buffering agent for F88 and T. reesei, and PIPES for F811. Steam exploded bagasse, as a carbon source, was the best to induce the cellulase and xylanase production for F88 e F811, while, Solka-floc® was better for T. reesei. The activities of β-glucosidase and xylanase were higher for F811 than for T. reesei. However, for FPA, T. reesei showed the best yield. In the hydrolysis assays, conversions of glucan and xylan were similar for both strains, even though there was an accumulation of celobiose in the T. reesei\'s assay. Comparing the data obteined for both strains, a wild type and an industrial reference, F811 showed as a promising strain to produce hydrolytic enzymes and as consequence, break down biomass into fermentable sugars.

Superóxido dismutases (SODs) são metaloenzimas que convertem o ânion superóxido em oxigênio molecular (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2). A presença de metal nessas enzimas está diretamente relacionada com seus mecanismos de catálise e com suas estruturas tridimensionais. Evolucionariamente, FeSOD e MnSOD podem ter evoluído de um gene ancestral comum, porque possuem sequências homólogas e estruturas cristalográficas sobreponíveis. Entretanto, a nível catalítico, ambas as proteínas divergiram o suficiente para que seus metais não possam ser intercambiáveis, produzindo uma enzima funcional, indicando que essas proteínas possuem alta especificidade por metal. O objetivo deste projeto de pesquisa é Identificar os determinantes estruturais do ajuste fino da especificidade por metal de MnSOD e FeSOD. Inicialmente, pretendese selecionar resíduos para mutagênese sítio-dirigida em TrMnSOD e TbFeSODB2, a partir de análise de acoplamento estatístico (SCA). Em seguida, mutantes serão construídos, expressos, purificados e cristalizados. A estrutura tridimensional dos mutantes será resolvida por cristalografia e sua atividade enzimática determinada, bem como a acomodação estrutural dos metais por Resonância Paramagnética Eletrônica. Nossa hipótese de trabalho é que através de SCA é possível elencar resíduos de aminoácidos candidatos para mutagênese sítio-dirigida para desenhar novas SODs, com características intermediárias de ligação por Fe/Mn, como possibilidade de interconversão de especificidade, caminhando na história evolutiva dessas moléculas. / Superoxide dismutases (SODs) are metalloenzymes that convert the superoxide anion in molecular oxygen (O2) and hydrogen peroxide (H2O2). The metal in the catalytic center of such enzymes is directly related to their catalysis mechanisms and tridimensional structures. Evolutionarily, FeSOD and MnSOD may have evolved from a common ancestor, because both proteins have homologous primary sequences and superposable crystallographic structures. However, at the catalytic level, both proteins diverged sufficiently to prevent interchange of their metallic centers, which would generate non-functional enzymes, indicating that these proteins have high metal specificity. The objective of this research project is to identify structural determinants of Fe/MnSODs necessary to metal specificity. We intend to use statistical coupling analysis (SCA) to select amino acid residues for site-directed mutagenesis in TrMnSOD e TbFeSODB2. Mutant genes will be constructed and their proteins expressed, purified and crystallized. The tridimensional structure of such mutants will be solved by X-ray crystallography and their enzymatic activities determined, as well as their electron paramagnetic resonance spectra. We hypothesize that SCA is useful to identify amino acid candidates for site-directed mutagenesis to design new SODs with intermediated Fe/Mn specificity, and even metal specificity interconversion, by studying the evolutionary history of these proteins.

Não consta resumo na publicação. / The gene encoding actin in the cellulolytic filamentus fungus Trichoderma reesei has been isolated and sequenced. The nucleotide sequence reveals that the gene is composed of 6 exons separated by 5 introns within the coding region. The positions of the introns were predicted by comparison of sequence homology to the genes coding for actin with known amino acid sequence and by identification of splice-site signal sequences. The actin protein of Trichoderma reesei shows extensive homology to the actins of other fungi E. nidulans, 95% , T. lanuginosus, 92% and S. pombae. The T. reesei actin promoter has a CT-rich region, CAAT and GC. There is no obvious TATA sequence in the T. reesei actin promoter. The absence of TATA-like sequence were also observed in anothers genes of T. reesei. An important aspect in molecular biology of filamentous fungi is the analysis, under a specific metabolic events, of the mechanism(s) regulating the expression of constitutive and induced genes. The filamentous fungus Trichoderma reesei is considered to be one of the most efficient producer of cellulase, and it serves as a model system for enzymatic cellulose hydrolysis. Expression of the cellulase genes are stringently regulated by the carbon source. Growth on cellulose results in induction of the cellulase transcripts, whereas glucose strongly represses their expression. The availability of a constitutive expressed genes of T. reesei provides not only important information regarding the molecular biology of the fungi, but also is essential for a better understanding of the mechanism(s) controlling the expression of the cellulase transcripts. Under inductive process of the of the major cellulase transcript (cbh1) and its repression by glucose, actin mRNA is constitutively expressed. The present results should be useful for further structural and functional analysis of the elements involved in inductive and constitutive expression of cellulase and actin transcripts.

A crescente demanda por energia e a necessidade de promover o desenvolvimento sustentável colocam em foco os combustíveis renováveis. Dentro de biocombustíveis, os 2G ou segunda geração, têm como objetivo a utilização da energia contida na biomassa vegetal. Muitos microorganismos são capazes de excretar enzimas que quebram a lignocelulose, o principal componente das paredes celulares da planta, em açúcares fermentáveis. Os objetivos deste trabalho foram selecionar fungos filamentosos que produzem enzimas que degradam a biomassa e otimizar suas condições de cultivo. Quatro isolados e duas linhagems padrão foram testadas para a produção de celulases e identificadas pelo sequencimaneto da região ITS (Internal Transcribed Spacer). Após a caracterização inicial, três linhagens foram selecionadas e testadas em diferentes fontes de nitrogênio e carbono, e agentes tamponantes, visando o cultivo ótimo para cada delas. As condições ideais foram escolhidas com base em critérios de atividade enzimática, proteínas totais liberadas e pH. Após o estabelecimento das condições ótimas, os sobrenadantes das culturas foram liofilizados e o teor de proteínas determinado. O mesmo extrato foi testado quanto à FPA (Filter Paper Activity), atividades de β-glicosidase e xilanases, e quanto sua capacidade hidrolitica na biomassa pré-tratada. As linhagens selecionadas foram identificadas como Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) e a linhagem padrão Trichoderma reesei QM9414. A melhor combinação de fontes de nitrogênio foi a razão 4:3:3; 5:3:2 e 6:3:1 (sulfato de amónio, ureia e extrato de levedura) para F88, F811 e T. reesei, respectivamente. O ácido cítrico foi selecionado como agente tamponante para F88 e T. reesei, e PIPES para F811. Bagaço pré-tratado por explosão a vapor (BPT), como fonte de carbono, foi o melhor para induzir a produção de celulases e xilanases por F88 e F811, enquanto, Solka-Floc® foi a melhor para T. reesei. As atividades de β-glicosidase e xilanase foram maiores em F811 do que para T. reesei. No entanto, para FPA, T. reesei apresentou o melhor rendimento. Nos ensaios de hidrólise, as conversões de glicana e xilana foram semelhantes para ambas as linhagens, mesmo havendo acúmulo de celobiose no ensaio de T. reesei. Comparando os dados obtidos para ambas linhagens, uma selvagem e outra que é considerada referência industrial, F811 se mostrou promissor para a produção de enzimas hidrolíticas e como consequência, a habilidade em transformar a biomassa em açúcares fermentáveis. / The increasing demand for energy and the necessity to promote sustainable development has focused on renewable fuels. Within the available biofuels, 2G or second generation, has the aim of releasing the energy contained in plant biomass. Many microorganisms are able to secret enzymes capable of breaking down lignocellulose, the main component of plant cell walls, into fermentable sugars. The objectives of this project was to select filamentous fungi that produce enzymes that degrade biomass and optimize the growth conditions for them. Four isolates and two standards strains were tested for the production of cellulases and identified by ITS (Internal Transcribed Spacer) sequencing. After initial characterization, three strains were selected and tested in different sources of nitrogen and carbon, and buffering agents for optimal growth. The ideal conditions were chosen based on the criteria of enzymatic activity, total proteins released and pH. After the ideal condition for each strain were established, cell free extracts from each culture were lyophilized and the total protein content determined. This extract was tested for FPA (Filter Paper Activity), β- glucosidase and xylanase activity and the hydrolysis assays were carried out using pretreated biomass. The selected strains were identified as Phanerochaete chrysosporium (F88), Aspergillus brasiliensis (F811) and the standard strain Trichoderma reesei QM9414. The best combination of nitrogen sources was the ratio 4:3:3; 5:3:2 and 6:3:1 (ammonium sulfate, urea and yeast extract) for F88, F811 and T. reesei, respectively. Citric acid was selected as buffering agent for F88 and T. reesei, and PIPES for F811. Steam exploded bagasse, as a carbon source, was the best to induce the cellulase and xylanase production for F88 e F811, while, Solka-floc® was better for T. reesei. The activities of β-glucosidase and xylanase were higher for F811 than for T. reesei. However, for FPA, T. reesei showed the best yield. In the hydrolysis assays, conversions of glucan and xylan were similar for both strains, even though there was an accumulation of celobiose in the T. reesei\'s assay. Comparing the data obteined for both strains, a wild type and an industrial reference, F811 showed as a promising strain to produce hydrolytic enzymes and as consequence, break down biomass into fermentable sugars.

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon

The soil-borne, rhizosphere-competent, filamentous fungus Trichoderma virens is a well-known biocontrol agent able to control pathogenic fungi through the production of antibiotics, the induction of systemic resistance in host plants, or by directly parasitizing the competing fungus. Competition for iron is another means by which Trichoderma can hinder competing microorganisms, and siderophores are a means by which microorganisms obtain iron. In silico analysis of the T. virens genome suggested that two genes putatively encoding extracellular siderophore-producing nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) were present. In this study, a disruption was created in one of the genes, TvNPS6, to create a mutant unable to produce the NRPS TvNps6 (DeltaTvnps6). Previously, a mutant (DeltaTvsidD) had been generated with a disruption in the second gene (TvSIDD) encoding an NRPS thought to be involved in siderophore biosynthesis. A double mutant (DeltaDeltaTvsidDTvnps6) was generated by transformation of a DeltaTvsidD strain with a vector targeting disruption of TvNPS6. This resulted in transformants disrupted within both the putative siderophore-producing NRPSs. Thus, three mutants were available for analysis of the role of these genes in the ecology of T. virens. Transformants were confirmed by PCR and Southern blotting analysis. Phenotypic characterization of the mutants included both HPLC analysis of siderophore production, growth on agar and in liquid media, conidiation, germination in the presence of hydrogen peroxide, biocontrol against Pythium ultimum, in vitro confrontation against Rhizoctonia solani and growth with iron chelators to determine the contribution of reductive iron assimilation (RIA) compared to that of siderophores. The HPLC analysis demonstrated that T. virens Gv 29-8 (wild-type) produced a single siderophore peak when grown in an iron-depleted medium. This peak was not present in the DeltaTvnps6 and DeltaDeltaTvsidDTvnps6 mutants but was apparent with the DeltaTvsidD mutants. From the HPLC analysis, T. virens evidently produces a coprogen-type siderophore. Few differences were observed in the other phenotypic tests, though hydrogen peroxide showed some small inhibitory effects towards the DeltaTvnps6 mutants. The addition of chelators, which inhibit RIA, exerted some negative effects on all strains growing under iron-limited media, particularly the DeltaTvnps6 and DeltaDeltaTvsidDTvnps6 strains. This study demonstrated that although T. virens has two genes putatively encoding siderophore producing NRPSs, only the TvNPS6 gene was required for extracellular siderophore production. The greater sensitivity of the mutants towards the iron chelators suggests that unlike other other fungi studied, Trichoderma virens utilizes RIA, rather than siderophore production, as the primary means by which the fungus obtains iron in an iron-limited environment.