Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Maria das Graças Machado Freire / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_CarlosHenriqueZanini_M.pdf: 3256360 bytes, checksum: 92dcd99d5853476244d7668b4ceb774b (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores : Everson Alves Miranda, Zivko L. Nikolov / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-01T15:51:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Azzoni_AdrianoRodrigues_D.pdf: 7397163 bytes, checksum: 205f126ad771bb30d977324c656157fe (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A expressão em plantas transgênicas é potencialmente uma das formas mais econômicas de produção em larga escala de peptídeos e proteínas de emprego farmacêutico. Dentre as vantagens estão a capacidade de estocagem da biomolécula por longo período em sementes, o baixo custo de produção e escalonamento (basta aumentar a área plantada) e o pequeno risco de contaminação por agentes patogênicos aos humanos. Contudo, existem poucos trabalhos visando a avaliar o potencial das plantas transgênicas do ponto de vista da recuperação e purificação de biomoléculas (RPB) em larga escala. Neste trabalho foi estudada a recuperação e purificação de aprotinina recombinante, um inibidor de proteases utilizado como fármaco, produzida em sementes de milho transgênico. Mais do que desenvolver metodologias de purificação de uma proteína específica, este trabalho objetivou contribuir com novos conhecimentos sobre a utilização da planta de milho como biorreator. Condições de extração visando a maximização da eficiência de extração da aprotinina recombinante e minimização da extração de impurezas foram estudas. Destes estudos, a condição de extração a pH 3,0 e força iônica de 200 mM foi a que se mostrou mais adequada. A aprotinina recombinante, juntamente com um inibidor de tripsina naturalmente encontrado em sementes de milho (inibidor de tripsina do milho - ITM) foi capturada do extrato aquoso da semente através do uso de cromatografia em resina de agarose com tripsina imobilizada. Duas diferentes rotas cromatográficas foram empregadas para a separação entre os inibidores e purificação final da aprotinina: cromatografia em resina agarose-IDA-Cu2+ e cromatografia em resina SP Sepharose. A confirmação da purificação da aprotinina recombinante foi realizada através de seqüenciamento N-terminal, SDS-PAGE e HPLC, sendo que este último método de análise indicou que purezas tão elevadas quanto 97% foram alcançadas. Uma vez que o ITM também foi purificado, o processo aqui estudado tem como vantagem a possibilidade de sua co-produção. Finalmente, os resultados deste trabalho vem corroborar com pesquisas anteriores que indicam o potencial do uso de plantas como biorreatores / Abstract: Expression in transgenic plants is potentially one of the most economical systems for large-scale production of valuable peptide and protein products. Advantages of the use of plants as bioreactors include the low cost of growing a large amount of biomass, easy scale-up (increase of plant acreage), natural storage organs (seeds and tubers), and the reduced risk on propagating human or animal pathogens. However, the downstream processing of recombinant proteins produced in plants has not been extensively studied. In this work, we studied the extraction and purification of recombinant aprotinin, a protease inhibitor used as a therapeutic compound, produced in transgenic com seed. More than just studing the recovery and purification of a recombinant protein, the aim of this work was to add new information about the use of transgenic com as bioreactor. Conditions for extraction from transgenic com meal that maximize aprotinin concentration and its fraction of the total soluble protein in the extract were determined as pH 3.0 and 200 mM NaCI. Aprotinin in this extract, together with a native com trypsin inhibitor (CTI) was captured using a trypsin-agarose column. These two inhibitors were separated by using two different approaches: immobilized metal ion affinity chromatography IMAC (agarose-IDA-Cu2+ resin) and cation-exchange chromatography (SP Sepharose resin). The high purity of the recombinant aprotinin was verified by SDSPAGE and N-terminal sequencing. Reverse phase HPLC analysis of the recombinant aprotinin purified by IMAC suggested a purity as greater as 97%. Since CTI was also purified, the recovery and purification process studied has the advantage of possible CTI coproduction. Finally, the work presented here introduces additional information on the recovery and purification of recombinant proteins produced in plants and corroborates with past research on the potential use of plants as bioreactors / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Odalys Garcia Cabrera, Goran Neshich / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T08:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_VanessadaSilveira_D.pdf: 9537452 bytes, checksum: 829f959a45ba9dc3fb47b19126255aca (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os inibidores de tripsina têm sido utilizados com sucesso para aumentar a resistência das plantas contra os insetos. No presente trabalho avaliamos a eficiência de um inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI) sobre o desenvolvimento de larvas de Diatraea saccharalis e Heliothis virescens, duas importantes pragas da cana-de-açúcar e tabaco, respectivamente. Para estes fins foram utilizadas diversas estratégias (i) purificação da proteína ILTI nativa a partir de sementes de I. laurina e sua utilização para suplementação de dieta artificial fornecida como alimento às larvas dos insetos em estudo. Isto com o intuito de avaliar os efeitos do inibidor no desenvolvimento destes indivíduos; (ii) obtenção da sequência de DNA do gene ilti, clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante assim como avaliação da sua atividade inibitória; (iii) obtenção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar e tabaco com o gene ilti obtido a partir do DNA genômico de I. laurina ou do gene ilti-s sintetizado quimicamente usando o uso de códons da cana-de-açúcar. A adição de 0,1% (p/p) de ILTI na dieta de D. saccharalis não alterou a sobrevivência larval, mas resultou em uma redução de 56% no peso das larvas. As larvas de H. virescens que foram alimentadas em uma dieta contendo 0,5% (p/p) de ILTI apresentaram uma redução de 84% no peso. Experimentos in vitro mostraram que ILTI não foi digerido pelas proteinases do intestino médio de ambas as espécies de larvas. Ensaios trípticos permitiram observar que não houve alteração nos níveis de tripsina no intestino médio de ambos os insetos. Entretanto, verificou-se uma redução de 55,3% na atividade tríptica das fezes de D. saccharalis e um aumento de 24,1% desta atividade nas fezes de H. virescens. A atividade da tripsina em ambas as espécies alimentadas com ILTI foi sensível ao inibidor, sugerindo que nenhuma nova proteinase resistente à ILTI foi induzida. Adicionalmente, a proteína recombinante reILTI produzida em Escherichia coli apresentou atividade inibitória similar à proteína nativa em testes de atividade anti-tríptica. Com isso, reILTI pode ser considerada como uma potencial ferramenta biotecnológica. Finalmente, larvas de D. saccharalis e H. virescens foram alimentadas com plantas transgênicas de cana-de-açúcar e tabaco - respectivamente - expressando os genes ilti e/ou ilti-s. Os resultados mostraram que os transgênicos foram capazes de interferir no metabolismo dos insetos-praga testados sugerindo que esta estratégia pode ser promissora na obtenção de plantas mais resistentes ao ataque de insetos / Abstract: Trypsin inhibitors have been successfully used to increase plant resistance against insects. In this work, we evaluated the efficiency of a trypsin inhibitor from Inga laurina (ILTI) on the development of Diatraea saccharalis and Heliothis virescens, two important pests of sugarcane and tobacco, respectively. For these purposes, several strategies were employed: (i) purification of the native protein ILTI from I. laurina seeds, and its use as a supplement in the artificial diet provided for the insect larvae. This purpose was performed in order to evaluate the effects of ILTI on the development of these individuals, (ii) elucidation of the DNA sequence of the ilti gene; cloning, expression and purification of the recombinant protein (reILTI) as well as evaluation of its inhibitory activity, (iii) production of transgenic plants of sugarcane and tobacco with the gene ilti from I. laurina genomic DNA or the gene ilti-s, which was chemically synthesized using the sugarcane codon usage. The addition of 0.1% (w/w) ILTI in the diet of D. saccharalisdid not alter larval survival but resulted in a reduction of 56% in the weight of the larvae. The H. virescens larvae that were fed a diet containing 0.5% (w/w) ILTI showed an 84% decrease in weight. In vitro experiments showed that ILTI was not digested by the midgut proteinases of either species of larvae. Triptic assays allowed observe that there was no alteration in the trypsin levels in the midgut of either insect. However, there was a reduction of 55.3% in the triptic activity in the feces of D. saccharalis and an increase of 24.1% of this activity in the feces of H. virescens. The trypsin activity in both species fed with ILTI was sensitive to the inhibitor, suggesting that no novel proteinase resistant to ILTI was induced. Additionally, reILTI showed similar inhibitory activity to those of the native protein in the anti-tryptic assays. Therefore, reILTI can be considered a potential biotechnological tool. Finally, larvae of D. saccharalis and H. virescens were fed with transgenic sugarcane and tobacco plants, respectively. The results showed that transgenic plants were able to interfere with the metabolism of these insect pests, suggesting that this is a promising strategy for the production of plants that are more resistant to insect attack / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Serina endopeptidases de insetos, principalmente tripsinas e quimotripsinas, estão envolvidas na digestão inicial de proteínas. Genes codificadores para estas enzimas estão organizados em famílias multigênicas tendo expressão diferencial de acordo com a dieta do inseto, estando envolvidos no desenvolvimento de resistência a diferentes metabólitos secundários vegetais. Para uma melhor compreensão desta interação, fez-se necessário o isolamento destas enzimas para insetos de diferentes ordens, bem como a caracterização de suas especificidades por duas abordagens: (a) caracterização cinética dos subsítios componentes do sítio de ligação de tripsinas e quimotripsinas, utilizando diferentes substratos, modificadores químicos e inibidores e (b) estudos estruturais por modelagem molecular, clonagem, expressão e cristalização destas enzimas de insetos. Além disso, estudos evolutivos por análise de distância possibilitaram uma caracterização inicial da interação insetoplanta. Estas determinações permitiram verificar que tripsinas de insetos apresentam diferenças de especificidade tanto dentre as diferentes ordens de insetos quanto em relação às tripsinas de vertebrados, sendo que as tripsinas da ordem Lepidóptera apresentam troca de especificidade primária hidrolisando preferencialmente substratos P1 Lys. Foram também observadas diferenças de hidrofobicidade para os subsítios caracterizados sendo que estes apresentam hidrofobicidades crescentes segundo o grau de complexidade dos insetos na sua escala evolutiva. A troca de especificidade e o aumento da hidrofobicidade podem permitir a hidrólise dos inibidores vegetais protéicos. A análise das sequências de tripsinas de insetos por Neighbor Joining (NJ) compõe uma árvore de distâncias topologicamente semelhante à árvore de relações filogenéticas determinadas por morfologia. A sobreposição de estruturas pré -determinadas de tripsina complexada a diferentes inibidores permite a identificação de posições de interação enzima-inibidor que justificam a classificação em grupos distintos de enzimas sensíveis ou resistentes a presença de inibidores na dieta de insetos. Da mesma forma: a caracterização da especificidade das quimotripsinas de insetos permitiu a separação de grupos distintos de quimotripsinas. Estes grupos são sustentados pela substituição do resíduo 59 em insetos polífagos que alimentam-se de plantas que contêm cetonas naturais reativas. Estas caracterizações demonstram a importância de um estudo detalhado da especificidade de serina endopeptidases possibilitando o desenho de moléculas apropriadas para inibição destas e desenvolvimento de estratégias de controle de insetos. / Insect serine endopeptidases, mairily trypsin and chymotrypsin are involved in initial protein digestion. Genes that encode these proteins are members of complex multigene families and are differentially expressed according to insects diet , thus being involved with resistance to plant metabolites. Purification of trypsins from different insect orders and chymotrypsins, as well as, characterization of their specificity are essential to a better understanding of this interaction. Characterization relied on two approaches: (a) kinetic characterization of the binding subsities of trypsins and chymotrypsins using different substrates, chemical modification and inhibition assays and (b) study of protein structure by molecular modelling and cloning, expression and crystallization of these enzymes. Besides that, evolutionary studies performed through distance analysis, permitted the investigation of plantinsect interaction. These characterizations showed that insect trypsins, in terms of specificity, are quite different from vertebrate trypsins and among insect orders. Lepidopterans trypsins have a distinct primary specificity, since they hydrolyses preferentially P1 Lys substrates, and present a crescent subsite hydrophobicity, which is directly correlated with the evolutionary scale. Both, the specificity exchange and the crescent hydrophobicity can allow the hydrolysis of vegetal proteic inhibitors. The analysis of trypsin sequences in Neighbor-Joining (NJ) algorithm yield a distance tree that is coherent with morphological phylogenetic relationships. The superposition of predicted structures of trypsins-inhibitors complexes permits to observe amino acid residues of interaction between enzyme-inhibitor, which support the distinction of different groups between sensitive and insensitive trypsins to the presence of inhibitors on insect diet. Similarly, characterization of insect chymotrypsins according to their specificity allowed us to classify these enzymes into different groups. These groups are supported by residue 59 replacements in polyphagous insects, which feed on plants bearing natural reactive ketones. These studies show the irnportance of a detailed study of serine endopeptidases, which may help in the development of better insect control strategies.

Os objetivos do presente trabalho foram: i) aprimorar o procedimento alternativo de mediação por íons metálicos da alcoólise da ligação peptidil-resina com vistas à obtenção de ésteres metílicos de peptídeos protegidos (Nα-acil-peptídeo protegido-OMe) em condição reacional branda e com alta eficiência; ii) investigar a aplicabilidade do procedimento para a preparação de Nα-acil-peptídeo protegido-SR e de Nα-acil-aminoácido-OR; iii) verificar se os Nα-acil-peptídeo-OMe obtidos atuariam como doadores de acila em reações de formação de ligação peptídica catalisadas por lipases. Para tanto, na busca da melhor condição de metanólise e comparação com os procedimentos usuais de alcoólise de ligação peptidil-resina, foram usados: o fragmento 22-24 da colecistocinina-33 humana (tripeptídeo modelo), Ca2+, Zn+2, Co+2 e Cu+2 (mediadores), as resinas oxima de Kaiser (KOR), p-hidroximetilfenil acetamidometil, ácido p-hidroximetilbenzóico e álcool p-benziloxibenzil (suportes poliméricos), misturas de MeOH com DCM, DMSO, NMP, THF ou DMF (solventes) e 25, 37, 50 ou 60°C. A condição ótima encontrada [KOR, Ca+2 (1 eq./eq. de peptídeo), 50% MeOH/DMF, 50°C] foi empregada com sucesso na preparação do Nα--acil-heptapeptídeo protegido-OMe, fragmento do peptídeo quimiotático M de Vespa mandarinia. Variações dessa condição foram usadas com sucesso nas preparações dos Nα-acil-tripeptídeo protegido-S(CH2)2COOEt e Nα-acil-Ala-OR (R: Me; Bzl), pois eles foram gerados com boas qualidades e rendimentos similares ou superiores aos obtidos via procedimentos usuais. Após desproteção de cadeias laterais, os Nα-acil-tripeptídeo-OMe e Nα-acil-heptapeptídeo-OMe foram usados em reações de acoplamento com Gly-NH2 em presença de preparações lipásicas comerciais. Estes ensaios inéditos também foram bem sucedidos, pois após adequação das condições reacionais, os Nα-acil-tetrapeptídeo-NH2 e Nα-acil-octapeptídeo-NH2 foram obtidos com boas qualidades e rendimentos de 65% (1 h) e 55% (24 h), respectivamente. / The present work aimed to: i) improve the alternative procedure based on mediation by metal ions of peptide-resin linkage alcoholysis to obtain fully protected peptide methyl esters (Nα-acyl-protected peptide-OMe) under mild reaction condition and with high efficiency; ii) investigate the usefulness of the alternative procedure for preparing Nα-acyl-protected peptide-SR and Nα-acyl-amino acid-OR; iii) verify whether the resulting Nα-acyl-peptide-OMe would act as acyl donors in peptide bond formation catalyzed by lipases. Thus, in the search for the best methanolysis condition and comparison with the usual procedures for that, we used: fragment 22-24 of human cholecystokinin-33 (model tripeptide), Ca+2, Zn+2, Co+2 and Cu+2 (mediators), Kaiser oxime resin (KOR), p-hydroxymethylphenylacetamido methyl resin, p-hydroxymethylbenzoic acid resin and p-benzyloxy benzyl alcohol resin (polymeric supports), mixtures of MeOH and DCM, DMSO, NMP, THF or DMF (solvents) and 25, 37, 50 or 60°C. The optimal condition found [KOR, Ca+2 (1 eq./eq. of peptide), 50% MeOH/DMF, 50°C] was used successfully for preparing Nα-acyl-protected heptapeptide-OMe, fragment 1-7 of the chemotactic peptide M produced by Vespa mandarinia. Variations of this condition were employed successfully for preparing Nα-acyl-protected tripeptide-SR and Nα-acyl-Ala-OR (R: Me, Bzl): indeed, these compounds were obtained in good quality and with similar or superior yields than those provided by usual procedures. After side chain deprotections, the Nα-acyl-tripeptide and Nα-acyl-heptapeptide methyl esters obtained were used in coupling reactions with Gly-NH2 in the presence of commercial lipase preparations. Those pioneer reactions were also successful, since after optimizing the conditions, Nalfa-acyl-tetrapeptide-NH2 and Nα-acyl-octapeptide-NH2 were obtained in good qualities with yields of 65% (1 h) and 55% (24 h), respectively.

A nanociência e a nanotecnologia vêm abrindo inúmeros desenvolvimentos de dispositivos e sistemas em escala nanométrica, com novas organizações moleculares, propriedades e funções distintas. Nesse contexto, as nanopartículas magnéticas poliméricas são compósitos formados por materiais magnéticos com tamanhos de partículas entre 1 e 100 nm combinados com polímeros funcionais. São materiais bem conhecidos e têm sido amplamente estudados devido às suas aplicações em diversas áreas tecnológicas. Nas áreas biológica e médica, as aplicações incluem separação e imobilização de enzimas e proteínas, melhoria nas técnicas de imagem de ressonância magnética para diagnóstico e sistemas de liberação controlada de fármacos. Neste trabalho, proteínas foram imobilizadas na superfície de um biopolímero combinado com partículas superparamagnéticas de magnetita para formar o compósito magnético. Utilizou-se o biopolímero quitosana, reticulada e funcionalizada com glutaraldeído, aplicável em ensaios biológicos. Obtiveram-se 3 tipos de compósitos magnéticos, os quais foram nomeados QM1Glu, QM2NaGlu e QM3Glu. Foram caracterizados por difratometria de raios X, microscopia eletrônica de varredura, magnetometria de amostra vibrante, calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria e espectroscopia por infravermelho. Foram avaliados quanto à imobilização das proteínas albumina de soro bovino (SAB), colágeno e tripsina. A imobilização das proteínas no biopolímero ocorreu em 30 min de incubação. O compósito magnético de quitosana não funcionalizada (QM3) também foi avaliado. Para a tripsina verificou-se que QM3 apresentou maior potencial de imobilização do que QM3Glu. Após 30 dias, QM3-Trip e QM3Glu-Trip ainda apresentavam a tripsina ativada. Foram demonstradas a atividade e a cinética enzimática da QM3Glu-trip com o substrato BApNA. / Nanoscience and nanotechnology have opened up numerous developments of devices and systems on the nanometer scale, with new molecular organization, properties and functions. In this context, the polymeric magnetic nanoparticles are composites formed by magnetic materials with a particle size between 1 and 100 nm combined with functional polymers. They are well-known and have been widely studied because of its applications in various technology areas. Applications on the biological and medical areas include separation and immobilization of enzymes and proteins, improved techniques of magnetic resonance imaging and diagnostic systems for controlled drug delivery. In this work, proteins were immobilized on the surface of a biopolymer combined with superparamagnetic particles of magnetite. The biopolymer chitosan was used, cross-linked and functionalized with glutaraldehyde, applicable to the biological assays. Three types of magnetic composites were obtained, which were called QM1Glu, QM2NaGlu and QM3Glu. They were characterized by X-ray diffraction, scanning electron microscopy, vibrating sample magnetometry, differential scanning calorimetry, thermogravimetry and infrared spectroscopy. They were evaluated concerning the immobilization of the proteins bovine serum albumin (BSA), collagen and trypsin. The study showed that the immobilization of proteins on the biopolymer occurred in 30 min of incubation. The magnetic composite of nonfunctionalized chitosan (QM3) was also evaluated. For trypsin, it was found that the immobilization potential of QM3 was higher than that observed for QM3Glu. After 30 days, the trypsin of the QM3-Trip and QM3Glu-Trip was still with activity. The activity and the enzyme kinetics of the QM3Glu-Trip with the substrate BApNA were demonstrated.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-02-20T11:52:01Z No. of bitstreams: 1 Renata Cristina da Penha Franca.pdf: 1679353 bytes, checksum: 9703d2a013a1d783ae4e0d394ef6d0f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-20T11:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Cristina da Penha Franca.pdf: 1679353 bytes, checksum: 9703d2a013a1d783ae4e0d394ef6d0f9 (MD5) Previous issue date: 2007-05-08 / Tisbe biminiensis is a potential live prey for many species of aquatic animals since its nutritional value is better than those found in other feed organisms commonly used in crustacean and fish larvivultures. Live food seems to be a source of exogenous enzymes which eases food digestion of fish and crustacean early life stages. The aim of this work was to study alkaline proteases from the harpacticoida copepod Tisbe biminiensis by evaluating the effects of pH, temperature and specific inhibitors on the proteolytic activity. Proteases were also studied by SDS-PAGE and zymograms. Crude extract from T. biminiensis showed a total proteolytic activity of 0.39 mU/mg of protein and tryptic activity of 2.33 mU/mg. Optima pH and temperature were 9.0 and 55oC, respectively. The enzymes were thermostable at temperature ranging from 25 to 50oC. The enzymatic activity was strongly inhibited by the trypsin specific inhibitors TLCK (100%), SBTI (100%) and benzamidine (91%).However, EDTA, PMSF and b mercaptoethanol caused only a slight inhibition (35, 35 and 7%, respectively). The results show that alkaline proteases are present on crude extract of Tisbe biminiensis. The highest effects of trypsin inhibitors on enzyme activity suggest that this enzyme plays an important role in protein digestion. T. biminiensis is an important source of live prey to fish and crustacean larvae in nature and partially replace others live food commonly used in aquaculture because they contribute with both exogenous enzymes for the digestion processes and other nutrients required during development of aquatic animals and contribute to development of aquaculture. / Os copépodos harpacticóides são microcrustáceos que servem como alimento vivo preferencial na natureza para diversas espécies de larvas de organismos aquáticos sendo nutricionalmente superiores quando comparados a outros alimentos vivos comumente utilizados nas larviculturas. O alimento vivo é uma importante fonte de enzimas exógenas que contribui para o processo digestivo dessas larvas que por não estarem com o sistema digestivo completamente formado, dependem das enzimas provenientes do alimento vivo para um melhor aproveitamento dos ingredientes da dieta,apresentando consequentemente melhores desempenhos na taxa de crescimento e sobrevivência. Este trabalho teve como objetivo caracterizar as proteases alcalinas do copépodo harpacticóide Tisbe biminiensis através de parâmetros cinéticos e físico-químicos como: pH e temperatura ótima, efeito de inibidores, estabilidade térmica, além da caracterização eletroforética por SDS-PAGE e zimograma. O extrato bruto do T. biminiensis apresentou uma atividade proteolítica total de 0,39 U/mg de proteínas sendo a atividade tríptica de 2,33 U/mg. A atividade enzimática apresentou uma temperatura ótima de 55ºC e pH ótimo de 9,0 e mostrou-se estável termicamente no intervalo de 25 a 50ºC. A atividade enzimática foi fortemente inibida por inibidores específicos de tripsina, TLCK (100±1%), SBTI (100±2%), benzamidina (91±10%), e não houve inibição significativa com os inibidores: EDTA (35±1%), PMSF (35±1%), b- mercaptoetanol (7±11%). Estes resultados demonstraram que a principal protease alcalina presente no extrato bruto do T. biminiensis foi a tripsina, exercendo importante papel na digestão protéica destes animais e este copépodo pode contribuir como fonte de enzimas exógenas para o processo digestivo nas larvas de organismos aquáticos.

A nanociência e a nanotecnologia vêm abrindo inúmeros desenvolvimentos de dispositivos e sistemas em escala nanométrica, com novas organizações moleculares, propriedades e funções distintas. Nesse contexto, as nanopartículas magnéticas poliméricas são compósitos formados por materiais magnéticos com tamanhos de partículas entre 1 e 100 nm combinados com polímeros funcionais. São materiais bem conhecidos e têm sido amplamente estudados devido às suas aplicações em diversas áreas tecnológicas. Nas áreas biológica e médica, as aplicações incluem separação e imobilização de enzimas e proteínas, melhoria nas técnicas de imagem de ressonância magnética para diagnóstico e sistemas de liberação controlada de fármacos. Neste trabalho, proteínas foram imobilizadas na superfície de um biopolímero combinado com partículas superparamagnéticas de magnetita para formar o compósito magnético. Utilizou-se o biopolímero quitosana, reticulada e funcionalizada com glutaraldeído, aplicável em ensaios biológicos. Obtiveram-se 3 tipos de compósitos magnéticos, os quais foram nomeados QM1Glu, QM2NaGlu e QM3Glu. Foram caracterizados por difratometria de raios X, microscopia eletrônica de varredura, magnetometria de amostra vibrante, calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria e espectroscopia por infravermelho. Foram avaliados quanto à imobilização das proteínas albumina de soro bovino (SAB), colágeno e tripsina. A imobilização das proteínas no biopolímero ocorreu em 30 min de incubação. O compósito magnético de quitosana não funcionalizada (QM3) também foi avaliado. Para a tripsina verificou-se que QM3 apresentou maior potencial de imobilização do que QM3Glu. Após 30 dias, QM3-Trip e QM3Glu-Trip ainda apresentavam a tripsina ativada. Foram demonstradas a atividade e a cinética enzimática da QM3Glu-trip com o substrato BApNA. / Nanoscience and nanotechnology have opened up numerous developments of devices and systems on the nanometer scale, with new molecular organization, properties and functions. In this context, the polymeric magnetic nanoparticles are composites formed by magnetic materials with a particle size between 1 and 100 nm combined with functional polymers. They are well-known and have been widely studied because of its applications in various technology areas. Applications on the biological and medical areas include separation and immobilization of enzymes and proteins, improved techniques of magnetic resonance imaging and diagnostic systems for controlled drug delivery. In this work, proteins were immobilized on the surface of a biopolymer combined with superparamagnetic particles of magnetite. The biopolymer chitosan was used, cross-linked and functionalized with glutaraldehyde, applicable to the biological assays. Three types of magnetic composites were obtained, which were called QM1Glu, QM2NaGlu and QM3Glu. They were characterized by X-ray diffraction, scanning electron microscopy, vibrating sample magnetometry, differential scanning calorimetry, thermogravimetry and infrared spectroscopy. They were evaluated concerning the immobilization of the proteins bovine serum albumin (BSA), collagen and trypsin. The study showed that the immobilization of proteins on the biopolymer occurred in 30 min of incubation. The magnetic composite of nonfunctionalized chitosan (QM3) was also evaluated. For trypsin, it was found that the immobilization potential of QM3 was higher than that observed for QM3Glu. After 30 days, the trypsin of the QM3-Trip and QM3Glu-Trip was still with activity. The activity and the enzyme kinetics of the QM3Glu-Trip with the substrate BApNA were demonstrated.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29 / O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada. / Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-12T22:11:47Z No. of bitstreams: 1 ERICA RENATA NOGUEIRA SÁ CAETANO - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2016..pdf: 2506925 bytes, checksum: 2aee1b855d59914fe68902bb6ec5b3fe (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T22:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ERICA RENATA NOGUEIRA SÁ CAETANO - DISSERTAÇÃO PPGCNBio 2016..pdf: 2506925 bytes, checksum: 2aee1b855d59914fe68902bb6ec5b3fe (MD5) Previous issue date: 2016-07-14 / CNPq / Miraculina é uma glicoproteína que possui uma incrível propriedade de converter o sabor amargo em doce. Como a miraculina não apresenta sabor algum e tem um baixo teor calórico, esta proteína pode ser usada como adoçantes direcionados para pacientes com doenças relacionadas ao consumo excessivo de açúcar. Estudos comprovaram que membros da família de proteínas miraculinas também possuem atividade de inibidor de tripsina do tipo Kunitz, atuando como agentes naturais de defesa da planta contra pragas e predadores. Diante disso, proteínas do tipo miraculina são de grande relevância para aplicações biotecnológicas. Esse estudo teve como objetivo geral realizar a caracterização estrutural e funcional comparativa de duas miraculinas de Citrus sinensis, por meio de modelagem e docking molecular. Modelos 3D foram gerados e validados para as miraculinas CsMir1 e CsMir4, tripsina de Acryrthosiphon pisum e para os receptores de sabor doce mT1R2 e T1R3 de Mus musculus. Modelos homodiméricos foram gerados para CsMir1 e CsMir4 e modelo heterodimérico foi gerado para mT1R2-T1R3. Estudos da atividade de inibidor de tripsina foram feitos para CsMir1 e CsMir4 por interação com tripsina. Para analisar a atividade de modificação de sabor doce, foi realizada a interação das miraculinas com o receptor mT1R2-T1R3. Como resultados, os modelos dos monômeros e dímeros criados foram considerados bons modelos, válidos e confiáveis, com representações muito próximas das estruturas nativas dessas proteínas. A miraculina CsMir1, na forma monomérica ligou-se a tripsina de A. pisum e na sua forma dimérica ligou-se ao receptor heterodimérico mT1R2-T1R3 através do domínio ATD da subunidade T1R2, entretanto o potencial para as atividades de inibição de proteases e de indução ou inibição a modificação de sabor amargo/azedo em doce é menor do que para a CsMir4. A miraculina CsMir4, na sua forma monomérica ligou-se a tripsina de A. pisum, possivelmente apresentando atividade de inibição de proteases. CsMir4, na sua forma dimérica, ligou-se ao receptor heterodimérico mT1R2-T1R3, através do domínio ATD da subunidade T1R2, potencialmente apresentando atividade de indução ou inibição a modificação de sabor amargo/azedo em doce em M. musculus. / Miraculins are glycoproteins that displays a remarkable property in bitter to sweet taste conversion. As miraculin does not have any taste and has a low calorie, this protein can be used as sweeteners targeted to patients with diseases related to excessive sugar consumption. Studies have shown that members of miraculins protein family also display inhibitor activity against the Kunitz trypsin, acting as natural agents of plant defense against pests and predators. In this context, miraculin proteins are of great relevance for biotechnological applications. The aim of this research was to characterize structurally and functionally two miraculins of Citrus sinensis using in silico tools. Tridimensional models were built and validated for CsMir1 and CsMir4 miraculins, Acryrthosiphon pisum trypsin and for Mus musculus mT1R2-T1R3 receptor. Homodimeric and hetrodimeric models were generated for miraculins (CsMir1, CsMir4) and mT1R2-T1R3, respectively. Molecular docking simulations were performed to investigate the trypsin inhibitory activity and taste conversion activity of CsMir1 and CsMir4. The results showed that the predicted models were reliable and presented good quality parameters. The monomeric CsMir1 miraculin bound to A. pisum trypsin, while its dimeric form bound to ATD domain of the mT1R2-T1R3, although its potential as trypsin inhibitor and bitter/sweet taste modifier were minor than that presented by its homologous CsMir4. The dimeric form of CsMir4 bound to mT1R2-T1R3 receptor in the ATD domain, which strongly suggests bitter/sweet taste modifier activity in M. musculus.