Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-11-06T20:54:56Z No. of bitstreams: 1 IzaelDeSousaCosta_DISSERT.pdf: 1172471 bytes, checksum: 10b2fd67da0043eb1fc836fa80793180 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-11-20T22:08:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 IzaelDeSousaCosta_DISSERT.pdf: 1172471 bytes, checksum: 10b2fd67da0043eb1fc836fa80793180 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-20T22:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IzaelDeSousaCosta_DISSERT.pdf: 1172471 bytes, checksum: 10b2fd67da0043eb1fc836fa80793180 (MD5) Previous issue date: 2017-08-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior (CAPES) / A obesidade ? uma epidemia mundial que pode ocorrer por fatores gen?ticos, ambientais e metab?licos / hormonais. Entre os fatores hormonais, sabe-se que, em humanos ou animais, em estado de obesidade, esses apresentam respostas alteradas a determinados horm?nios quando comparados aos eutr?ficos. Por ser uma condi??o de causas multifatoriais, seu tratamento, ocorre por diversas maneiras; entre elas, vem sendo estudada a utiliza??o de inibidores de tripsina. Neste estudo foi avaliado o efeito do ITT como secretagogo de CCK e seu sinergismo sobre leptina em ratos Wistar com obesidade. Inicialmente, ratos Wistar foram classificados quando ao estado nutricional zoom?trico. O estudo foi conduzido com quatro grupos de ratos Wistar, divididos em tr?s grupos de animais com obesidade e um grupo com animais eutr?ficos (n total=20), sendo utilizadas as dietas comercial padr?o (Labina?) e experimental de alto ?ndice glic?mico e alta carga glic?mica (Dieta HGLI), a mesma utilizada para indu??o da obesidade. O ITT (25 mg / Kg de peso) e a Labina? foram utilizadas como tratamentos para dois dos grupos de animais com obesidade, durante dez dias. Aos grupos com obesidade foram administradas: Dieta padr?o mais ?gua (Obeso / Dieta padr?o); Dieta HGLI mais ?gua (Obeso / Dieta HGLI); Dieta HGLI mais ITT (Obeso / Dieta HGLI + ITT); enquanto aos animais eutr?ficos foi oferecida a dieta comercial Labina? (Eutr?fico / Dieta padr?o). Foram verificadas, ao longo desse per?odo, o efeito do ITT sobre o estado nutricional zoom?trico, as concentra??es plasm?ticas de CCK e leptina e a express?o de genes relacionados a CCK em intestino e do gene ob da leptina em gordura subcut?nea. Observou-se que todos os grupos mantiveram seus estados nutricionais de acordo com o ?ndice de Lee por?m os ratos que passaram pelo tratamento com o ITT foram os ?nicos a apresentar uma discreta redu??o desse ?ndice mas, sem signific?ncia estat?stica. O ITT n?o alterou a CCK plasm?tica, n?o tendo sido observadas diferen?as estat?sticas entre os valores de express?o relativa de mRNA para o receptor de CCK-2R e a enzima PCSK1. O tratamento com o ITT aumentou a express?o relativa de mRNA de CCK-1R, assim como ocorreu no grupo sem tratamento que consumia a dieta HGLI, no entanto foi diferente, estatisticamente, dos animais eutr?ficos (p = 0.028). Ademais, foi observado que 60% dos animais, tratados com o ITT, apresentaram concentra??es plasm?ticas de leptina abaixo de 0,1 ng/?L, enquanto aqueles tratados com dieta padr?o, apenas 20% se encontravam nessa condi??o. Tal fato n?o foi observado no grupo eutr?fico e com obesidade. Ainda, relacionado ao efeito do ITT, esse n?o foi capaz de reduzir a express?o relativa de mRNA do gene ob da leptina. O estudo com a express?o relativa de mRNA de genes relacionados ? produ??o de CCK em intestino de ratos com obesidade ? inovador e sugere-se que, ao constatar o efeito do ITT na redu??o das concentra??es plasm?ticas de leptina, neste estudo, o ITT melhore a a??o da CCK em animais com obesidade resultando em discreta melhora do estado de obesidade, independente do aumento plasm?tico da CCK. / Obesity is a worldwide epidemic that can occur due to genetic, environmental and metabolic / hormonal factors. Among the hormonal factors, it is seen that, humans or animals, in state of obesity, present altered responses to certain hormones when compared to eutrophic. Once obesity presents multifactorial causes, its treatment also occurs by several means, among which the use of trypsin inhibitors. This study evaluated the effect of a Tamarindus indica L. seed isolated Trypsin Inhibitor (TTI) as a CCK secretagogue and its synergism with leptin in obese Wistar rats. The study was conducted with obese and lean rats (n = 20). Three groups of obese rats were feed 10 days one of the following diets: Standard diet (Labina?) + water; High Glycemic Index and Load (HGLI) diet + water or HGLI diet + TTI. Lean animals were fed the Labina? for the 10 days. We evaluated nutritional status (zoometric measurements), plasma CCK and leptin, mRNA expression of intestinal CCK-related genes and the ob gene in subcutaneous adipose tissue. TTI treated animals had a slight reduction in the Lee index. TTI did not increase plasma CCK in obese animals and we found no significant effect of TTI in CCK-2R and PCSK1 gene expression. On the other hand, TTI treatment increased CCK-1R gene expression compared with the lean group (p = 0.028). Although TTI did not reduce the ob gene expression. Interestingly 60% of the TTI treated animals presented plasma concentrations below 0.1 ng / ?L, whereas those treated with standard diet, only 20% of the animals were in this condition. This was not observed in the lean and obese groups. Our study with relative mRNA expression of intestinal CCK-related genes in obese rats is a novel study and suggests that TTI by decreasing plasma leptin may improve CCK action in obese rats, since the expression of the CCK-1R gene in this group was higher when compared to lean rats, resulting in improvement of zoometric measurements, independently of plasma CCK increase.

COSTA, Helen Paula Silva da. Caracterização estrutural e cinética e ação antimicrobiana de uma albumina 2s com atividade inibitória de tripsina purificada da torta de Jatropha curcas L. 2016. 144 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2017-04-05T20:45:54Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_hpscosta.pdf: 5240795 bytes, checksum: b867535c4f21e417838f3fe11ec55fcc (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-04-05T21:25:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_hpscosta.pdf: 5240795 bytes, checksum: b867535c4f21e417838f3fe11ec55fcc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T21:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_hpscosta.pdf: 5240795 bytes, checksum: b867535c4f21e417838f3fe11ec55fcc (MD5) Previous issue date: 2016 / The number of diseases caused by antibiotic-resistant bacteria has increased, amongst them those occasioned by Staphylococcus aureus. In addition to bacterial infections, there are parasitic diseases, such as toxoplasmosis, caused by Toxoplasma gondii. Such scenarios support the search for new agents that are active against most pathogens. Recently a glycoprotein with trypsin inhibitory activity and action against human bacterial pathogens, named JcTI-I, was previously purified to homogeneity by our research group from Jatropha curcas cake. The goals of this present study were to proceed with the structural and kinetic characterization of JcTI-I and to assess its potential activity against human pathogenic bacteria, with emphasis on the mode of antibacterial action and activity against T. gondii. Mass spectrometry analysis showed that JcTI-I is a protein of 10,252 kDa composed of two polypeptide chains of 7,133 and 3,124 kDa, linked by disulfide bonds. Primary sequence data obtained by Edman degradation and mass spectrometry allowed to classify JcTI-I as a 2S albumin. In silico analysis permitted to identify the JcTI-I precursor-coding genes (Jcr4S00619.70) in the genome of J. curcas. The precursor (pro-albumin) contains a signal peptide of 39 amino acid residues at the N-terminus, eight conserved cysteine residues, multiple sites of glycosylation and one phosphorylation site. JcTI-I is mainly composed of α-helices (70%) stabilized by four disulfide bonds and disordered structures. In silico modelling and SAXS analysis suggest an extended structure with long tail and globular region for JcTI-I. Moreover, JcTI-I has high affinity for trypsin (Ki = 2 x 10-11 M), which is inhibited by a non-competitive mechanism, and maintained, at least partially, in the presence of dithiothreitol (0.1 M, 60 minutes). JcTI-I inhibited S. aureus and S. choleraesuis growth (MIC of 5 µg protein/mL), probably due to its physical interaction with the bacteria, which might have increased the cell surface permeability to this protein that, after internalization to intracellular environment, inactivated proteases and bound to DNA. It is possible that JcTI-I has caused bacterial DNA degradation due to its desoxirribonucleasica activity detected in vitro. Furthermore, JcTI-I was also toxic to T. gondii decreasing the numbers of infected Vero cells and intracellular tachyzoites. In addition, T. gondii treated with JcTI-I presented changes in their internal pelicular and cellular membranes and increased formation of cytoplasm vesicles. Importantly, JcTI-I did not show cytotoxicity to Vero cells, lysis of human red blood cells, and acute toxicity (lethality) to mice. The data demonstrate that JcTI-I has potential to be used as a new antimicrobial agent, adding value to J. curcas cake. / O número de doenças causadas por bactérias resistentes a antibióticos tem aumentado, dentre elas aquelas ocasionadas por Staphylococcus aureus. Além das infecções bacterianas, há aquelas oriundas da ação de protozoários, como a toxoplasmose, causada pelo Toxoplasma gondii. Tais fatos justificam a busca de novos agentes ativos contra patógenos causadores de infecções. Da torta de Jatropha curcas (Pinhão-manso), uma glicoproteína com atividade inibitória de tripsina e ação contra bactérias patogênicas ao homem, denominada JcTI-I, foi previamente isolada por nosso grupo de pesquisa. Os objetivos desse trabalho foram prosseguir com a caracterização estrutural e cinética do JcTI-I e avaliar sua atividade contra patógenos causadores de infecção no homem, com ênfase no modo de ação antibacteriana e atividade contra T. gondii. Espectrometria de massas revelou que JcTI-I é uma proteína de 10,252 kDa, formada por duas cadeias polipeptídicas de 7,133 e 3,124 kDa, unidas por ligações dissulfeto. Dados da sequência primária gerados por degradação de Edman e espectrometria de massas permitiram a classificação do JcTI-I como uma albumina 2S. Análises in silico possibilitaram a identificação de genes codificadores do precursor (Jcr4S00619.70) do JcTI-I no genoma de J. curcas. O precursor (pró-albumina) contém um peptídeo sinal de 39 resíduos de aminoácidos na extremidade N-terminal, oito cisteínas conservadas, vários sítios de glicosilação e um sítio de fosforilação. JcTI-I é composto principalmente por α-hélices (70%), estabilizadas por quatro ligações dissulfeto, e estruturas não ordenadas. Modelagem in silico e análise por SAXS sugerem uma estrutura estendida, com longa cauda e região globular, para o JcTI-I. Essa proteína possui alta afinidade pela tripsina (Ki = 2 x 10-11M), inibindo sua ação proteolítica por mecanismo do tipo não competitivo, o qual é mantida, parcialmente, mesmo na presença do ditiotreitol (0,1 M, 60 minutos). Além disso, JcTI-I inibiu o crescimento das bactérias S. aureus e Salmonella enterica (MIC de 5 µg proteína/mL), provavelmente em decorrência de sua ligação à célula bacteriana, causando aumento da permeabilidade da superfície celular. Isso deve ter possibilitado o acesso do JcTI-I para o meio intracelular e a consequente inativação das proteases e ligação ao DNA bacterianos. É possível que JcTI-I tenha acarretado degradação do DNA bacteriano, dada à sua atividade desoxirribonucleásica detectada in vitro. JcTI-I também teve ação deletéria sobre T. gondii, causando redução nos números de células Vero infectadas com o parasita e de taquizoítos intracelulares. Adicionalmente, JcTI-I promoveu alterações nas membranas pelicular interna e plasmática do protozoário, além da formação de vesículas no seu citoplasma. Digno de nota nesse contexto, é que o JcTI-I não causou citotoxicidade para célula Vero, lise de hemácias humanas e toxicidade aguda (letalidade) em camundongos. Os dados demonstram o potencial de uso do JcTI-I como um novo agente antimicrobiano, agregando valor à torta de J. curcas.

DIAS, Lucas Pinheiro. Purificação e caracterização de um inibidor de tripsina das flores de Cassia fistula Linn. com atividade antimicrobiana. 2012. 83 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T13:34:23Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_lpdias.pdf: 2004862 bytes, checksum: cd42d65281498494806d7ca987015da7 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:29:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_lpdias.pdf: 2004862 bytes, checksum: cd42d65281498494806d7ca987015da7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:29:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_lpdias.pdf: 2004862 bytes, checksum: cd42d65281498494806d7ca987015da7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Plants synthesize proteins that have antimicrobial properties, which can be used to substitute chemical pesticides in agriculture and as new drugs for the control of bacterial infections in humans. Among the various plant structures, the flowers seem to be a promising source of active molecules against pathogens, particularly if considered its important physiological role, which should be preserved. Therefore, this experimental research aimed at the prospection of novel proteins with antimicrobial activity in wild flowers and to subsequent purification, biochemical characterization and evaluation of antimicrobial activity of a trypsin inhibitor present in flowers of Cassia fistula Linn (the golden shower tree). The total extract of C. fistula flowers was prepared in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5. This extract presented trypsin inhibitory activity (42.41 ± 0.35 IU/mgP) and papain (27.10 ± 0.23 IU/mgP), besides to the presence of peroxidase (20.0 ± 0.18 UAP/mgP) and chitinase (1.70 ± 0.21 ηkatal/mgP). On the other hand, the hemagglutinating, β-1,3-glucanase, protease and urease activities were not detected. The trypsin inhibitor of C. fistula, named CfTI, was purified by fractionating the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity (anidrotripsina-Sepharose-4B) and reverse phase (Vydac C-18TP 522) chromatographies. CfTI is a glycoprotein with an apparent molecular mass of 22.2 kDa, pI 5.0 and NH2-terminal sequence showing high similarity with Kunitz soybean trypsin inhibitor (SBTI). The inhibitor was not stable to heat, and loss 23.4% when incubated at 60 °C for 15 minutes. However, it proved to be stable to changes of pH. CfTI (100 µg/mL) slowed the growth of pathogenic fungi of agricultural importance, Colletotrichum lindemuthianum and Fusarium solani, and also presented antibacterial activity against the human pathogenic bacteria, Staphylococcus aureus and Enterobacter aerogenes. The results demonstrate the potential of the flowers as a source of diverse bioactive proteins, as the trypsin inhibitor present in C. fistula flowers, promoting its biotechnological potential application against fungi and bacteria of relevance to Agriculture and human health. / As plantas sintetizam proteínas que possuem propriedades antimicrobianas, podendo ser utilizadas em substituição aos defensivos químicos no campo e como fonte de novas drogas para o controle de infecções bacterianas em humanos. Dentre as diversas estruturas vegetais, órgãos reprodutivos como as flores parecem ser uma fonte promissora de tais moléculas ativas contra patógenos, particularmente se considerado o seu relevante papel fisiológico, o qual deve ser preservado. Nesse contexto, a presente pesquisa experimental teve como objetivos a prospecção de proteínas com ação antimicrobiana em flores silvestres e posterior purificação, caracterização bioquímica e avaliação da atividade antimicrobiana de um inibidor de tripsina presente em flores de Cassia fistula Linn. (Chuva-de-ouro). O extrato total das flores de C. fistula foi preparado em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5. Esse extrato apresentou atividade inibitória de tripsina (42,41 ± 0,35 UI/mgP) e de papaína (27,10 ± 0,23 UI/mgP), além de mostrar a presença de peroxidase (20,0 ± 0,18 UAP/mgP) e quitinase (1,70 ± 0,21 ηkatal/mgP), estando ausentes as atividades hemaglutinante, β-1,3-glucanásica, ureásica e proteásica. O inibidor de tripsina de C. fistula, denominado CfTI, foi purificado do extrato total por fracionamento com ácido tricloroacético (2,5%), seguido de cromatografias de afinidade (anidrotripsina-Sepharose-4B) e fase reversa (Vydac C-18TP 522). CfTI é uma glicoproteína com massa molecular aparente de 22,2 kDa, pI 5,0 e sequência NH2-terminal exibindo alta similaridade com o inibidor de tripsina da soja do tipo Kunitz (SBTI). O inibidor mostrou-se pouco estável ao calor, reduzindo sua atividade inibitória para 23,4% quando incubado a 60 °C, durante 15 minutos. No entanto, ele se mostrou bastante estável a variações no pH. CfTI (100 µg/mL) retardou o crescimento dos fungos fitopatogênicos de importância agrícola, Colletotrichum lindemuthianum e Fusarium solani, além de apresentar atividade antibacteriana frente às bactérias patogênicas ao homem, Staphylococcus aureus e Enterobacter aerogenes. Os resultados obtidos demonstram o potencial das flores como fonte diversificada de proteínas bioativas, evidenciando o inibidor de tripsina presente em flores de C. fistula, fomentando sua aplicação biotecnológica frente a fungos e bactérias de relevância para a Agricultura e Saúde.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-06T14:00:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 544282 bytes, checksum: 9c2728f9dca6f8677d4079eb568e787f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T14:00:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 544282 bytes, checksum: 9c2728f9dca6f8677d4079eb568e787f (MD5) Previous issue date: 2005-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesse trabalho foi avaliado o efeito do tratamento térmico em autoclave na qualidade protéica de farinhas integrais de soja, obtidas de uma linhagem contendo KTI e lectina (KTI+Lec+) e de uma isolinha isenta desses antinutrientes (KTI-Lec-). Para isso, foram avaliadas as composições centesimais dessas farinhas in natura assim como a inibição de tripsina, a atividade hemaglutinante, o índice de urease e a solubilidade protéica nas farinhas in natura e processadas termicamente. Realizou-se também um ensaio com ratos Wistar para a avaliação do ganho de peso, da digestibilidade verdadeira in vivo, do quociente de eficiência protéica (PER), do quociente de eficiência líquida protéica (NPR) e da utilização líquida protéica (NPU). O tratamento térmico foi efetivo na inativação de urease, lectina e inibidores de tripsina, sendo que 15 minutos de tratamento térmico foram suficientes para reduzir em mais de 90% o efeito desses compostos. Simultaneamente, as farinhas obtidas nesse tempo de processamento apresentaram um adequado valor de solubilidade protéica. Os resultados obtidos de PER, NPR e ganho de peso mostraram que o tratamento térmico melhorou igualmente a qualidade nutricional das duas farinhas, embora a farinha da isolinha KTI-Lec- tenha necessitado de um maior tempo de processamento térmico. Por outro lado, não foi observado um aumento significativo nos valores de NPU e de digestibilidade verdadeira in vivo para dietas contendo farinhas da linhagem de soja KTI-Lec-, embora os valores tenham sido estatisticamente iguais aos das dietas contendo farinha da linhagem de soja KTI+Lec+. / The effects of autoclaving in the protein quality of full-fat soybean flours prepared from a line having KTI and lectin (KTI+Lec+) and a isoline lacking these antinutritional factors (KTI-Lec-) were studied. Thus, it were measured the partial chemical composition of these raw soybean flours and the trypsin inhibition, hemagglutination activity, urease index and protein solubility of the raw and heated soybean flours. A biological assay was conducted with Wistar rats in order to determine some nutritional parameters like weight gain, in vivo true digestibility, protein efficiency ratio (PER), net protein ratio (NPR) and net protein utilization (NPU). The heat treatment was enough efficient in the urease, lectin and trypsin inhibitors inactivation, being 15 minutes sufficient to reduce more than 90% of these compounds. Simultaneously, the flours processed at that time had suitable protein solubility values. The results of PER, NPR and weight gain showed that the heat treatment equally improved the nutritional quality of both soybean flours, although that from the isoline (KTI-Lec-) required a longer autoclaving time. For the other side, was not achieved a significant rise on the NPU and in vivo true digestibility values to diets containing flours obtained from the soybean isoline. However these results were significantly the same to that obtained with diets containg soybean line KTI+Lec+. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:08:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 andre_veloso_ioc_dout_2015.pdf: 5077168 bytes, checksum: 9fce6d548bd0ac2fa5e83f9b028c4bf2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os dípteros Aedes aegypti, Anopheles albitarsis e Culex quinquefasciatus pertencem à família Culicidae e são considerados um problema de saúde pública quando atuam como vetores de parasitos e/ou arboviroses. O regime de alimentação de fêmeas dos mosquitos anautógenos influencia os processos que ocorrem no intestino e regula os genes envolvidos na reprodução. Além disso, apesar dos ciclos de vida dos parasitos veiculados por essas espécies de vetores serem distintos, todos eles são ingeridos durante a hematofagia e expostos ao ambiente do intestino médio (estômago) para em seguida atravessar o epitélio intestinal e chegarem ao tecido apropriado para seu desenvolvimento e/ou transmissão para um novo hospedeiro vertebrado. Neste trabalho, utilizamos uma abordagem proteômica para a identificação de proteínas totais, bem como ensaios em solução e enzimografia em gel copolimerizado com substrato para identificação de peptidases ativas presentes no intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis s.s sob regime de alimentação com açúcar. As técnicas de enzimografia também foram utilizadas aqui para a caracterização de peptidases ativas de intestinos de fêmeas de Ae. aegypti alimentadas com açúcar ou sangue. Foi observado que o intestino de fêmeas das três espécies alimentadas com açúcar apresenta um complexo perfil de peptidases ativas, do tipo tripsina, composto por bandas migrando nas regiões entre ~ 24 a 40 kDa e em regiões de alto peso molecular Atividades proteolíticas foram detectadas entre pH 3,5 \2013 10, revelando diferenças quantitativas e qualitativas entre os perfis proteolíticos das três espécies. Em fêmeas de Ae. aegypti, o regime de alimentação com açúcar ou sangue alterou o perfil de SPtrip ativas do intestino de forma qualitativa e quantitativa. Um total de oito tripsinas em Cx. quinquefasciatus e dez tripsinas em An. albitarsis, foram identificadas por SDS-PAGE acoplado a LC-MS/MS. Apesar dessas SPtrip identificadas apresentarem características comuns às tripsinas digestivas de invertebrados, foram observadas diferenças nas sequências de aminoácidos, como por exemplo, em regiões de especificidade ao substrato e de ativação do zimogênio. Foi observado que os genes codificadores para SPtrip possuem diferentes tamanhos e organização, tais como, diferenças no número de éxons/introns. Com relação à composição de proteínas totais solúveis do intestino de fêmeas de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis, análise por LC-MS/MS e bioinformática revelou a presença de proteínas envolvidas em processos fisiológicos importantes, como exopeptidaes, glicosidades, enzimas detoxificantes e proteínas relacionadas com a interação parasito/vetor Em Cx. quinquefasciatus, foram identificadas 1397 proteínas, distribuídas em 1090 grupos, representando um total de ~ 7,5% das proteínas codificadas pelo genoma dessa espécie. Em An. albitarsis foram identificadas 916 proteínas distribuídas em 748 grupos. As centenas de proteínas presentes no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, de ambas as espécies, foram classificadas segundo sua ontologia gênica e o papel de algumas famílias de proteínas historicamente importante em mosquitos foram discutidas. Finalmente, foi demonstrado que abordagem proteômica combinada à enzimografia e bioinformática é uma ferramenta que pode auxiliar na anotação funcional dos genes de tripsinas expressos no intestino de fêmeas alimentadas com açúcar, bem como auxilia no mapeamento do repertório de proteínas totais presentes no intestino de Cx. quinquefasciatus e An. albitarsis / Culex quinquefasciatus, Anopheles albitarsis and Aedes aegypti are hematophagous insect from the Culicidae family that feeds on the blood of humans, dogs, birds and livestock. These species transmit a wide variety of pathogens between humans and animals. The midgut environment is the first location of pathogen-vector interaction for blood-feeding mosquitoes and the expression of specific peptidases in the early stages of feeding could influence the outcome of the infection. Trypsin-like serine peptidases belong to a multi-gene family that can be expressed in different isoforms under distinct physiological conditions. However, the confident assignment of the trypsin genes that are expressed under each condition is still a challenge due to the large number of trypsin-coding genes in the Culicidae family and most likely because they are low abundance proteins. We used zymography for the biochemical characterization of the peptidase profile of the midgut from Cx. quinquefasciatus, An. albitarsis, and Ae. aegypti females fed on sugar. We also caracterized the peptidses profile of the midgut from Ae. aegypti fed on blood, during different moments after fedding. Protein samples were also submitted to SDS-PAGE followed by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) analysis for peptidase identification. The peptidases sequences were analyzed by bioinformatics tools to assess their distinct features. Zymography revealed that trypsin-like serine peptidases were responsible for the proteolytic activity in the midgut of females fed on sugar or blood diet. In addition, we observed that the profile is influenced by the blood ingestion. After fractionation in SDS-PAGE, eight and ten trypsin-like serine peptidases were identified by LC-MS/MS in Cx. quinquefasciatus and An. albitarsis, respectively. Peptidases from Cx. quinquefasciatus were also analysed with bioinformatic tools revealing that they have structural features typical of invertebrate digestive trypsin peptidases but exhibited singularities at the protein sequence level such as: the presence of different amino acids at the autocatalytic motif and substrate binding regions as well as different number of disulfide bounds. Data mining revealed a group of trypsin-like serine peptidases that are specific to C. quinquefasciatus when compared to the culicids genomes sequenced so far. We demonstrated that proteomics approaches combined with bioinformatics tools and zymographic analysis can lead to the functional annotation of trypsin-like serine peptidases coding genes and aid in the understanding of the complexity of peptidase expression in mosquitoes. / 2016-10-11

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the relationship between the digestive enzyme activity and the centesimal composition of the contents of the gastrointestinal tract and food habits of four teleost two food habits in summer and winter. Two omnivorous species Pimelodus maculatus and R. quelen and two detritivorous species Hypostomus commersoni and Loricariichthys anus were chosen. Fish were collected with the aid of the trawl during March and July 2013 in São Gonçalo channel, Pelotas - RS. The digestive tract was divided into stomach, anterior and posterior intestine. Stomach was assayed the activity of pepsin and the two portions of the intestine were assayed the activities of trypsin, chymotrypsin and lipase. The protein and lipid content of the contents of each portion of the digestive tract was determined. Digestive enzyme activity is not related to the feeding habits and the centesimal composition of the contents of the gastrointestinal tract. Detritivorous species showed higher activity of alkaline proteases, which may be an adaptation to better utilize the low protein content found in the gastrointestinal tract of these species. / O objetivo desse estudo foi avaliar a relação entre a atividade enzimática digestiva e a composição centesimal do conteúdo do trato gastrintestinal e hábitos alimentares de quatro teleósteos de dois hábitos alimentares no verão e no inverno. Foram escolhidas duas espécies onívoras Rhamdia quelen e Pimelodus maculatus e duas espécies detritívoras Hypostomus commersoni e Loricariichthys anus. Os peixes foram coletados com o auxílio de rede de arrasto nos meses de março e julho de 2013, no canal São Gonçalo, Pelotas RS. O trato digestório foi dividido em estômago, intestino anterior e posterior. No estômago foi ensaiada a atividade da pepsina e nas duas porções do intestino foram ensaiadas as atividades da tripsina, quimotripsina e lipase. Foi determinado o teor proteico e lipídico do conteúdo de cada porção do trato digestório. A atividade enzimática digestiva não está relacionada com o hábito alimentar e a composição centesimal do conteúdo do trato gastrintestinal. Espécies detritívoras apresentaram maior atividade das proteases alcalinas, o que pode ser uma adaptação para utilizar melhor o baixo teor proteico encontrado no conteúdo gastrintestinal dessas espécies.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-28Bitstream added on 2015-04-09T12:47:39Z : No. of bitstreams: 1 000817707.pdf: 784315 bytes, checksum: 7b270c28b49a7aab4fb0d82140c6c370 (MD5) / A lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis Hübner e a lagarta-militar Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) são duas das principais pragas desfolhadoras da cultura da soja. Entre os métodos disponíveis para seu controle destaca-se o uso de genótipos que apresentam moderada e alta resistência a insetos. No entanto, diversos fatores, inerentes à planta ou ao inseto, podem influenciar a expressão da resistência nas plantas. Desse modo, esse trabalho teve o objetivo de avaliar possíveis fatores que possam influenciar a expressão da resistência em soja, testando-se as hipóteses de que flavonoides, nutrientes, enzimas oxidativas, compostos fenólicos, proteínas e inibidores de proteinase possam ser alguns dos mecanismos responsáveis pela resistência à lagarta-da-soja e lagarta-militar. Três experimentos foram realizados a fim de elucidar essas questões. O primeiro experimento avaliou a influência dos seguintes fatores na expressão de antixenose nos genótipos resistente IAC 100 e suscetível BRSGO 8360 a ambas as espécies de insetos em testes de preferência alimentar com e sem chance de escolha: uma lagarta versus duas lagartas por disco foliar; uso de lagartas sem interrução de alimentação versus com suspensão de alimentação por três horas antes do ensaio; disco foliar versus folíolo inteiro; parte superior versus parte inferior da planta; e estádio vegetativo versus estádio reprodutivo. O segundo experimento avaliou a influência da parte superior versus inferior da planta e de plantas em estádio vegetativo versus plantas em estádio reprodutivo na expressão de antibiose a A. gemmatalis e S. frugiperda nos genótipos resistente PI 227687 e suscetível IGRA RA 626 RR. Além disso, foram avaliadas as concentrações de nutrientes e flavonoides como possíveis mecanismos responsáveis pela resistência em soja. Os macronutrientes quantificados nas folhas dos genótipos de soja provenientes dos respectivos tratamentos ... / The velvetbean caterpillar Anticarsia gemmatalis Hübner and the fall armyworm Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) are two of the major defoliating pests of soybeans. Among the methods available for their control, the use of genotypes possessing moderate and high resistance stands out. However, numerous factors, inherent to the plant or to the insect, may influence the expression of resistance in plants. Thus, this work aimed to evaluate potential factors influencing the expression of resistance in soybeans, and we tested the hypotheses that flavonoids, nutrients, oxidative enzymes, phenolics, proteins, and proteinase inhibitors may be some of the mechanisms responsible for resistance to the velvetbean caterpillar and fall armyworm. Three experiments were performed in order to elucidate these issues. The first experiment evaluated the influence of the following factors on the expression of antixenosis in the resistant genotype IAC 100 and susceptible genotype BRSGO 8360 to both insects in free-choice and no-choice feeding assays: one larva versus two larvae per leaf disc; use of non-starved larvae versus larvae starved for three hours prior to the assay; leaf disc versus entire leaflet; upper part versus lower part of plants; vegetative growth stage versus reproductive stage. The second experiment assessed the influence of the upper part versus lower part of the plant, and plants at vegetative growth stage versus reproductive stage on the expression of antibiosis to A. gemmatalis and S. frugiperda in the resistant genotype PI 227687 and susceptible genotype IGRA RA 626 RR. In addition, the concentration of nutrients and flavonoids were evaluated as potentital mechanisms responsible for resistance in soybeans. The macronutrientes quantified in the leaves of the soybean genotypes from the respective treatments were N, P, K, Ca, Mg, and S; the quantified micronutrients were B, Cu, Fe, Mn, and Zn; among the flavonoids, we quantified ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-27Bitstream added on 2014-06-13T18:57:25Z : No. of bitstreams: 1 kamimura_ba_me_jabo.pdf: 571110 bytes, checksum: 2197cdd1ac84693fe362265668301183 (MD5) / A imunização passiva de cabritos ocorre por meio da ingestão do colostro, rico em imunoglobulinas (Igs), que são absorvidas nas primeiras horas de vida do animal. A incorporação de inibidores de tripsina ao colostro pode impedir a proteólise das Igs e possibilitar aumento do potencial de desenvolvimento do sistema imune do animal, principalmente quando o colostro apresentar baixa concentração desta proteína. O objetivo deste estudo foi avaliar a transferência de imunidade passiva em cabritos alimentados com colostro caprino adicionado de “leite” de soja contendo inibidores de tripsina ativos. O “leite” de soja foi preparado conforme recomendação da Embrapa, e submetido ao aquecimento a 80°C por 15 min. O colostro foi aquecido a 56°C por 60 min. e obtido de cabras com parições concentradas no período da tarde, sendo a primeira ordenha realizada às 8 horas do dia seguinte, e a segunda 24 horas após. Foram utilizados 25 cabritos recém-nascidos da raça Saanen alimentados com colostro caprino de primeira (T1) e segunda (T2) ordenha, e com 10% (T3), 20% (T4) e 30% (T5) de “leite” de soja em substituição ao colostro caprino de segunda ordenha. As amostras de sangue foram colhidas por venopunção da jugular (1, 12, 24, 36 e 48 h após o nascimento), sendo a primeira colheita realizada antes do fornecimento do colostro. As análises bioquímicas evidenciaram a importância da ingestão do colostro de primeira ordenha que apresentou valores elevados para proteína total (PT) de 8,48 g.dL-1, gamaglutamiltransferase (GGT) de 1.321 U.L-1, fosfatase alcalina (ALP) de 189 U.L-1 e fósforo de 43,9 mg.dL-1. A atividade dos inibidores de tripsina variou de 1.058 (T2) a 2.329 UTI.mg-1 (T5). Os resultados das análises bioquímicas séricas mostraram que os tratamentos não influenciaram as concentrações dos mesmos, porém houve aumento nas atividades... / Passive immunization of kids occurs through ingestion of colostrum rich in immunoglobulins (Igs) that are absorbed in the first hours of the animal’s life. Incorporation of trypsin inhibitors in colostrum can prevent proteolysis of Igs and improves potential development of animal’s immune system, especially when the colostrum has low Ig concentration. Therefore the aim of this study was to evaluate the effect of goat colostrum added soymilk containing active trypsin inhibitors in the transference of passive immunity in goat kids. The soymilk was prepared as recommended by Embrapa and heated to 80°C for 15 minutes. The goat colostrum was heated to 56°C for 60 minutes, obtained from goats with concentrated calving in the afternoon; the first milk was performed at 8 am of next day, and the second milk 24 hours later. The study used 25 Saanen goat kids fed with goat colostrum of first milk (T1), goat colostrum of second milk (T2), goat colostrum of second milk plus 10% of soymilk (T3), goat colostrum of second milk plus 20% of soymilk (T4) and goat colostrum of second milk plus 30% of soymilk (T5). Blood samples were collected by jugular venipuncture (1, 12, 24, 36 and 48 hours after birth), the first sample was collected before the first feeding of colostrum. Biochemical analysis indicated the importance of colostrum of first milk with high values for total protein (TP) of 8.48 g.dL-1, gamma glutamyl transferase (GGT) 1,321 U.L-1, alkaline phosphatase (ALP) 189 U.L-1 and phosphorus 43.9 mg.dL-1. The activity of trypsin inhibitors ranged from 1,058 (T2) to 2,329 UTI.mg-1 (T5). Results of serum biochemical analyzes did not differ among treatments, but GGT and ALP activities, and IgG concentration increased 12 hours postpartum and after feeding of colostrum. The results indicate that soymilk is an important alternative source to incorporate active trypsin inhibitors that improve... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-29T14:03:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 583707 bytes, checksum: 20b2945972e80b046a9b7dfe20017e5c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T14:03:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 583707 bytes, checksum: 20b2945972e80b046a9b7dfe20017e5c (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A defesa das plantas contra os insetos são processos complexos que envolvem a ativação ou repressão de diferentes vias de sinalização, permitindo assim a sobre- expressão de genes alvo com propriedades de defesa. O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre a resposta defensiva de Coffea arabica mediante as vias das lipoxigenases e polifenoloxidases e o processo de herbivoria de Leucoptera coffeella. Foi realizado um experimento com dois tratamentos: 1) plantas de café infestadas e 2) plantas não infestadas com bicho–mineiro. Cada tratamento foi composto por 10 repetições e avaliou-se a atividade das lipoxigenases e polifenoloxidases; e a produção de inibidores de proteases no cafeeiro. Em L. coffeella a atividade de tripsina-like foi verificada usando os substratos L-BApNA e L-TAME e a quimotripsina-like foi determinada com BTpNA e ATEE. As cisteíno-proteases deste inseto foi obtida utilizando L-BApNA e proteases totais usando azocaseína como substrato. Todas as atividades enzimáticas foram determinadas por espectrofotometria. Houve um aumento nas atividades enzimáticas das plantas infestadas em relação as não infestadas nas vias estudas (lipoxigenase: F= 29,4; p= 0,00022 e polifenoloxidases: F= 8,41; p= 0,00022) e na produção de inibidores de proteases (F= 9,64; p= 0,0022). A partir das análises de correlação de Pearson, observou-se que a quimotripsina-like e os inibidores de proteases apresentaram uma relação inversa (r= -0,82; p= 0,03). Já a tripsina-like teve correlação direta com as atividades das lipoxigenases (r= 0,6; p= 0,03) e polifenoloxidases (r= 0,82; p= 0,03). Diante do exposto, nas larvas de L. coffeella existe atividade tanto serino como cisteíno-proteases, mas a atividade serino-proteases é a mais expressada no intestino destes insetos. A produção de inibidores de proteases e as atividades de lipoxigenases e polifenoloxidases nas plantas de C. arabica são aumentadas na presença de L. coffeella, o que indica a possível participação destas vias no processo de defesa da planta. Palavras chaves: inibidores, tripsina, bicho-mineiro. / The plant defense against insects is complex processes that involve the activation or repression of different signaling pathways, thus allowing over-expression of target genes with defense properties. The aim of this study was to determine the relationship between the defensive response of Coffea arabica through the lipoxygenases and polyphenol pathways and herbivory process Leucoptera coffeella. It conducted an experiment with two treatments: 1) infested coffee plants and 2) plants not infested with leaf miner-of-coffee. Each treatment consisted of 10 repetitions and evaluated the lipoxygenase and polyphenol activity; and the protease inhibitors production in coffee. In L. coffeella the trypsin-like activity was checked using the L-BApNA and L-TAME substrates and chymotrypsin-like was determined using BTpNA and ATEE. The cysteine proteases activity was obtained using L-BApNA and total protease using azocasein as substrate. All enzyme activities were determined by spectrophotometry. There was an increase in the activities of infested plants over non-infested in the studied routes (lipoxygenase: F = 29.4, p = 0.00022 and polyphenol: F = 8.41, p = 0.00022) and production of inhibitors proteases (F = 9.64; p = 0.0022). From the Pearson correlation analysis, it was observed that the chymotrypsin-like and proteases inhibitors showed an inverse relationship (r = -0.82; p = 0.03). Already trypsin-like had direct correlation with the activities of lipoxygenase (r = 0.6; p = 0.03) and polyphenol (r = 0.82; p = 0.03). Given the above, in the larvaes L. coffeella there is activity both serine and cysteine proteases, but the serine-protease activity is who characterized the intestine of these insects. The protease inhibitors production and lipoxygenase and polyphenol activities in C. arabica plants come up increased in the presence of L. coffeella, indicating a possible role of these pathways in plant defense process. / Sem lattes