Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-02T21:40:20Z No. of bitstreams: 1 RaphaelPaschoalSerquiz_DISSERT.pdf: 1610214 bytes, checksum: 8f23b4e10ee21479e603090f006e88c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-09T12:09:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RaphaelPaschoalSerquiz_DISSERT.pdf: 1610214 bytes, checksum: 8f23b4e10ee21479e603090f006e88c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-09T12:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaphaelPaschoalSerquiz_DISSERT.pdf: 1610214 bytes, checksum: 8f23b4e10ee21479e603090f006e88c4 (MD5) Previous issue date: 2017-10-25 / A hemostasia é o evento pelo qual os mamíferos bloqueiam a perda de volemias sanguíneas e promovem o reparo de lesões, e falhas por excessos contribuem para a propagação de fatores inflamatórios e trombóticos. As consequências da aterosclerose são exemplos de agravos desse tipo e a heparina (Hep) é um fármaco de escolha para esses tratamentos. Pacientes com carência de antitrombina têm resistência aos efeitos anticoagulantes da Hep, então pesquisas por novas moléculas homeostáticas que contribuam com os tratamentos clínicos são necessárias. Inibidores de proteinases vegetais têm sido eficazes em controlar processos biológicos, como coagulação e inflamação. O presente trabalho objetivou isolar um inibidor de tripsina da semente de Juquiri (JTI) verificando sua atividade contra serinoproteinases, e avaliar seus potenciais anticoagulante e anti-inflamatório. O inibidor foi isolado por cromatografia de afinidade e troca-iônica, apresentando duas principais bandas proteicas de 11,9 e 19,2 kDa estimadas por SDS-PAGE, e foi capaz de inibir tripsina e quimotripsina. Na coagulação, o JTI prolongou o tempo de tromboplastina parcial (APTT) em concentrações superiores à 2 µg/100 µL de plasma, sem prolongar o tempo de protrombina (PT). Associado à Hep, o JTI foi capaz de intensificar o efeito anticoagulante do fármaco em ambos os testes. Sem apresentar toxicidade contra eritrócitos humanos o JTI reduziu 40% das concentrações de elastase liberada por neutrófilos induzidos por PAF (fator ativador de plaquetas). O JTI em concentrações entre 20-80 µg/mL estimulou a produção de TNF por macrófagos RAW 264.7 em cultura sem provocar outros estímulos inflamatórios. Macrófagos ativados por LPS tiveram redução nas concentrações de NO, IL-6 e TNF quando tratados com JTI em concentrações entre 20-160 µg/mL. Estes dados apontam o JTI como promissor no tratamento de doenças trombóticas e inflamatórias, tendo sido eficaz como adjuvante da heparina e em promover a redução de estímulos inflamatórios de neutrófilos por vias provavelmente dependentes de MAPK, e em macrófagos por vias do fator de transcrição NF-κB. / Hemostasis is the event that mammals use to block the loss of blood and promote injury repair, and failure by overeating contributes to the spread of inflammatory and thrombotic factors. Atherosclerosis is an example of such diseases, and heparin (Hep) is a treatment drug. Patients with antithrombin deficiency have resistance to the anticoagulant effects of Hep, so researches for novel homeostatic molecules that contribute to clinical treatments are necessary. Plant protease inhibitors have been effective in controlling biological processes, such as coagulation and inflammation. The present work aimed isolate a trypsin inhibitor from the Juquiri (JTI) seed and evaluate its activity against serine proteases, and its anticoagulant and antiinflammatory potentials. JTI was isolated by affinity and ion exchange chromatography, presenting two major protein bands of 11.9 and 19.2 kDa on SDSPAGE, and was able to inhibit trypsin and chymotrypsin. In coagulation, JTI prolonged partial thromboplastin time (APTT) at concentrations greater than 2 μg/100 μL plasma, without prolonging prothrombin time (PT). Associated with Hep, JTI was able to enhance the anticoagulant effect of the drug in both tests. Without toxicity to human erythrocytes, JTI reduced 40% of elastase concentrations released by neutrophils induced by platelet activating factor (PAF). JTI at concentrations between 20-80 μg/mL stimulated TNF production by macrophages (RAW 264.7) in culture without provoking other inflammatory stimuli. LPS-activated macrophages had a reduction in NO, IL-6 and TNF productions when treated with JTI at 20-160 μg/mL concentrations. These data point to JTI as promising in the treatment of thrombotic and inflammatory diseases and have been effective as heparin adjuvant and to promote the reduction of neutrophil inflammatory stimuli likely by MAPK-dependent pathways and in macrophages by NF-κB transcription factor pathways.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-17T15:38:30Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Renata Cristina da Penha França.pdf: 3945808 bytes, checksum: 4675019a8f00e532930096e155b2dc6f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T15:38:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Renata Cristina da Penha França.pdf: 3945808 bytes, checksum: 4675019a8f00e532930096e155b2dc6f (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / FACEPE / Com a diminuição dos estoques pesqueiros e a estagnação das capturas observada desde o final da década de 1980, a aquicultura converteu-se atualmente em uma atividade consolidada capaz de abastecer e suprir à incessante demanda por produtos pesqueiros e proteicos de alto valor nutricional por seu crescente aporte na produção mundial de pescados. O bijupirá (Rachycentron canadum), conhecido internacionalmente como cobia é uma espécie nativa da costa brasileira e tem sido apontada como excelente candidato para desenvolver a piscicultura marinha nacional. Visando um melhor conhecimento sobre as exigências nutricionais e a fisiologia digestiva desta espécie. O objetivo do presente trabalho foi realizar a caracterização bioquímica e molecular da tripsina presente nos cecos pilóricos do bijupirá (Rachycentron canadum), testar a compatibilidade da tripsina purificada com sabões em pó e a sua estabilidade através de ensaios in vitro na presença de agentes surfactantes e oxidantes e comparar as peptidases digestivas presentes entre espécimes selvagens e cultivados no início do processo de domesticação em Pernambuco. Peptidases presentes nos cecos pilóricos de bijupirás selvagens e cultivados (R. canadum) foram caracterizadas quanto as suas propriedades físico-químicas através de ensaios de pH, temperatura ótima, estabilidade térmica, SDS-PAGE, efeito de inibidores e zimogramas utilizando substratos específicos para tripsina e quimotripsina (BApNA e SApNA), respectivamente. A temperatura e o pH ótimos obtidos para a tripsina-símile dos animais selvagens e cultivados foram de 55 e 60°C e 8,0 e 10,0, respectivamente, enquanto que para quimotripsina-símile foram de 50 e 45°C e 9,5 e 8,0 respectivamente. A tripsina-símile dos bijupirás selvagens e cultivados foi fortemente inibida com a utilização de inibidores clássicos como o PMSF (inibidor de serino proteases), TLCK (inibidor clássico de tripsina) e benzamidina (inibidor clássico de tripsina). O mesmo padrão foi observado para a quimotripsina-símile utilizando o TPCK (inibidor clássico de quimotripsina). O perfil eletroforético dos animais selvagens e cultivados revelaram bandas que variaram entre 6 kDa e 195 kDa. As bandas caseinolíticas observadas no zimograma revelaram pequenas variações que podem ser indicativos do processo inicial de adaptação enzimática do bijupirá frente às novas condições de cultivos quando comparados aos animais selvagens. O processo de purificação da tripsina do bijupirá utilizando-se a cromatografia de afinidade por BPTI-sepharose demonstrou ser um método eficiente, com alta reprodutibilidade, rápido e viável que permitiu o isolamento da tripsina presente no ceco pilórico e apresentou pH ótimo de 8,5, temperatura ótima de 50ºC, estabilidade térmica até 55ºC, Km de 0,38mM, Kcat 3,14 s-1 e Kcat/Km 8.26 s-1 mM-1 utilizando BApNA (8mM) como substrato. Estas caracterísiticas físico-químicas e cinéticas foram semelhantes a outras tripsinas de peixes reportadas na literatura. A mesma apresentou-se estável na presença de agesntes oxidantes e surfactantes e compatível com sabões em pó comerciais e que pode ser empregada na indústria de detergentes como nova fonte alternativa de enzimas.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3131_1.pdf: 596856 bytes, checksum: 6ecd36106eae78833584c1e83095f1fe (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é um dos peixes mais populares de criação no mundo, tem excelente adaptação e reprodução em ambientes lênticos e possui filé de alta qualidade. Além das peças limpas e comestíveis do pescado, há uma quantidade substancial de resíduos de peixe. Muitas vezes, esse remanescente de resíduos é despejado em rios, causando um desequilíbrio ambiental. Carcaças e vísceras de tilápia têm um alto valor protéico a ser usado na produção de alimentos para organismos aquáticos. A utilização de resíduos de pescado diminui o risco de poluição ambiental e gera receitas econômicas. Estudos mostraram que os resíduos podem ser usados na recuperação de compostos úteis, incluindo proteínas que têm atividade antimicrobiana. O presente trabalho relata a presença de inibidor de tripsina de tilápia no fígado, estômago e intestino, bem como a purificação do inibidor de tripsina O. niloticus (OnTI) e atividade antibacteriana do fígado, víscera de maior atividade inibidora de tripsina específica. As vísceras foram separadas e homogeneizadas com 0,15 M NaCl e os homogeneizados foram tratados com sulfato de amônio. Concentrações de proteínas das frações dos precipitados e sobrenadantes foram dosadas, aquecida a 80 ° C por 1 h, e avaliadas quanto à atividade do inibidor de tripsina. O precipitado da fração 20-40% de fígado (LF20-40) de alta atividade inibidora de tripsina específica foi utilizado para purificação do inibidor e em testes de atividade antibacteriana; sendo determinadas as concentrações inibitórias mínima (CIM) e bactericidas (CBM). Frações de sulfato de amônio de fígado e estômago apresentaram atividade do inibidor de tripsina superior às frações de intestino. O. niloticus inibidor de tripsina (OnTI) ligado à coluna Tripsina-Agarose foi eluído com 0,5 M KCl-HCl pH 2,0. OnTI apresentou atividade específica de 950 U / mg e duas bandas de proteínas em SDS-PAGE. A atividade antibacteriana sobre S. aureus foi detectada pela LF20-40 (MIC: 0,09 mg / mL; MBC: 0,76 mg / mL), a fração também foi capaz de inibir o crescimento de K. pneumoniae (MIC: 1,53 mg / mL), mas não apresentou atividade antibacteriana contra E. coli. Os resultados revelaram que o fígado e estômago de tilápia contem inibidor de tripsina. O efeito da preparação do fígado de tilápia sobre S. aureus e K. pneumoniae, indica que esta víscera, normalmente descartada como resíduo, é uma fonte potencial de agentes antibacterianos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4509_1.pdf: 1578575 bytes, checksum: 58efb4fad122a57c86f62e695d6666b1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / A tripsina-símile extraída do ceco pilórico de xaréu (Caranx hippos) foi purificada por um procedimento de três etapas: tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de gel-filtração em Sephadex G-75. Os efeitos de vários íons metálicos e inibidores de proteases na atividade digestiva da enzima in vitro foram determinados. As propriedades físico-químicas e cinéticas da tripsina foram estabelecidas. O pH e temperatura ótima de reação encontrada foram 8,0 e 50°C, respectivamente. Após 30 minutos de incubação a 50ºC, foi detectada uma perda de 20% da atividade tríptica. A constante de Michaelis Menten foi 1,21  0,38 mM usando benzoil-DL-arginina-pnitroanilida (BApNA) como substrato. Uma única banda (35,2 kDa) foi observada quando a amostra da enzima purificada foi aplicada em gel de eletroforese utilizando sulfato sódico de dodecila (SDS-PAGE, 12,5%). Atividade com substrato específico e inativação por inibidores de protease forneceram evidências adicionais que uma tripsina é responsável por esta atividade proteolítica. A tripsina de C. hippos apresentou sensibilidade a metais pesados. Utilizando soluções de íons na concentração de 1 mM, a tripsina foi inibida na ordem decrescente: Cd2+=Al3+>Zn2+>Cu2+>Pb2+>Hg2+. Menor efeito foi detectado com Co2+, K+, Li+, Ba2+, Mn2+, Mg2+e Ca2+. Contudo, a concentração tão baixa quanto 0,01 ppm (10 μg/mL) dos íons Zn2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+, Cd2+ e Al3+ foram suficientes para inibir 34%, 33%, 33%, 32%, 29% e 28%, da atividade proteolítica, respectivamente

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4875_1.pdf: 358311 bytes, checksum: cfada42988282675ba62ef4d948688d0 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Uma enzima do tipo tripsina foi parcialmente purificada do intestino e cecos pilóricos do saramunete (Pseudupeneus maculatus). Para isto foi utilizado um método simples de quatro etapas (tratamento térmico, precipitação por sulfato de amônio, diálise e cromatografia em gel de filtração Sephadex G-75). As enzimas do intestino e cecos pilóricos tiveram os coeficientes de purificação de 96 vezes e 57.7 vezes purificadas, respectivamente, de acordo com esses procedimentos, e os rendimentos foram de 68.1% e 26.1%, respectivamente. As proteínas coletadas da cromatografia em gel de filtração Sephadex G-75 apresentaram uma única banda em SDS-PAGE, com um peso molecular de 24.5 kDa e foram hábeis para hidrolisar caseína. Ambas as enzimas apresentaram um pH ótimo idêntico de 9.0 e temperatura ótima de 55oC. Perderam metade de sua atividade quando incubadas nesta temperatura por 30 min. O Km para as enzimas do intestino e dos cecos pilóricos foram 3.23 ± 0.04 mM (n =7) e 1.86 ± 0.26 mM (n = 8), respectivamente. Esta diferença estatisticamente significativa no Km foi a única discrepância entre as enzimas em estudo. Finalmente, essas atividades enzimáticas foram inibidas pelos seguintes íons em ordem decrescente: Al3+>Zn2+>Hg2+=Cu2+> Cd2+. Os efeitos do Ca2+, Mg2+ , Mn2+, Ba2+, K+1, Li+1 e Co2+ foram estatisticamente significantes entre as enzimas do intestino e cecos pilóricos

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9639_1.pdf: 2959564 bytes, checksum: c8360ee63b22e54ee20baf9b0c416dc9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Peptidases dos cecos pilóricos de bijupirás selvagens e cultivados (Rachycentron canadum) foram caracterizados utilizando substratos específicos de tripsina e quimotripsina, inibidores e íons metálicos. Além disso, o perfil protéico foi determinado empregando SDS-PAGE e zimogramas. Para tanto pH ótimo e temperatura dos bijupirás selvagens e cultivados foi 7,0-10,0 e 40-60 ° C para a tripsina, como 7,0-9,5 e 40-55 ° C para quimotripsina. A tripsina e quimotripsina foram estáveis por 30 min a 50 ° C. O perfil eletroforetíco e zimograma foram similares para bijupirás selvagens e cultivados com faixas que variam de 195 kDa a 6 kDa. A atividade da enzima (BApNA como substrato) foi fortemente inibida por benzamidina e TLCK, sintéticos inibidores de tripsina, onde, como, a atividade de quimotripsina (SApNA como substrato) foi ligeiramente inibido por um inibidor de quimotripsina específico (TPCK). O uso de substratos e inibidores específicos sugerem a presença de tripsina e quimotripsina no cecos pilóricos de ambos animais selvagens e cultivados (Rachycentron canadum). Além disso, observou-se que os zimogramas dos animais selvagens e cultivados foram semelhantes, sugerindo que peptidases digestiva não foram influenciadas pela dieta artificial empregada e nem pela gestão de cultivo

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T14:55:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_M.pdf: 3471105 bytes, checksum: aa20d26751e5da61ad13b4f683a3fafe (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulina / Abstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extract / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2015-09-25T12:21:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Patricia de Lima Martins.pdf: 1012001 bytes, checksum: ab70117935599ee610a03aabf8bc94dd (MD5) Previous issue date: 2013-03-19 / Peanut (Arachis hypogaea L.) is an oilseed very expressive worldwide, due to commercial value of its oil. In Brazil, crop is grown in all regions, in order to attend in natura and food markets. The post-harvest is serious problem that affect the final output of the crop, which in inappropriate conditions, lead to occurrence of pests in stored grains. Some legumes contain protease inhibitors (PI) in their seeds that act directly in defense against grain pests, causing damage in nutrient absorption and further death. The objective of this study was to detect the presence of trypsin inhibitors in peanut genotypes and to study the potential inhibition against digestive enzymes in Alphitobius diaperinus and other agricultural pests. PI detection was carried out in 10 peanut genotypes belonging to Improvement Program at Embrapa Algodão (Campina Grande, PB, Brazil). Total proteins from seeds were extracted in each accession, quantified, fractionated with ammonium sulfate, and submitted thermal stability and pH tests, for further assays. All peanut genotypes showed PI in seed-protein extracts, however the highest inhibition rate for digestive enzymes of A. diaperinus was found in L7 BRS 151, which also reduced the number of larvae, in bioassay. The CNPA AM 280 showed the highest inhibition rate in both assays, bovine trypsin and intestinal homogenate of A. diaperinus. This genotype was also highly stable in different pH and temperature assays and inhibited the intestinal serine proteases from Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor and Tribolium castaneum, in 16%, 42% and 82% respectively. The results obtained in this study are quite relevant due to contribute with the reduction of grain losses in post-harvest, considering that genotypes investigated here have interesting traits for further use as genetic resources with resistance to pests. / O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma oleaginosa expressiva no cenário mundial, devido ao valor comercial de seu óleo. No Brasil, é cultivado em todas as regiões, para atender aos mercados in natura e de alimentos. Um dos problemas detectado na lavoura é na fase de pós-colheita, que, em condições inapropriadas levam a ocorrência de pragas nos grãos armazenados. Sabe-se, contudo, que algumas leguminosas detêm em suas sementes os inibidores de proteases (IP) que atuam na defesa direta contra pragas de grãos, provocando prejuízos na absorção de nutrientes e até mesmo a sua morte. Objetivou-se com este trabalho detectar a presença de inibidores de tripsina em genótipos de amendoim e estudar o potencial de inibição contra as enzimas digestivas de Alphitobius diaperinus e outros insetos de interesse agronômico. Para tanto, procedeu-se a detecção de IPs em 10 genótipos de amendoim pertencentes ao Programa de Melhoramento da Embrapa Algodão. As proteínas totais de sementes de cada acesso foram extraídas, quantificadas, fracionadas com sulfato de amônio, e submetidas a testes de estabilidade térmica e de pH, para posteriores ensaios in vitro e bioensaios. Os resultados obtidos evidenciaram a presença de inibidores de tripsina nos extratos proteicos das sementes de amendoim dos dez genótipos, contudo o BRS 151 L7 apresentou a maior inibição in vitro para as enzimas do trato digestivo do A. diaperinus e o menor número de larvas no bioensaio. A F3 do genótipo CNPA 280 AM apresentou o maior percentual de inibição tanto nos ensaios com tripsina bovina como no homogenato intestinal de A. diaperinus, e foi altamente estável nos ensaios com diferentes pHs e temperaturas. Destacou-se ainda por inibir em 16%, 42% e 82% as tripsinas intestinais de Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor e Tribolium castaneum, respectivamente. Os resultados obtidos nesta pesquisa são bastante relevantes para contribuir com a redução de perdas de grãos no período de pós-colheita, tendo em vista que os genótipos investigados possuem características interessantes para posterior uso como recurso genético com fonte de resistência a insetos-praga.

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_LaysCordeiro_M.pdf: 5932501 bytes, checksum: 2972555d649882421e88bba9ccd5dfea (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Bioquimica / Mestra em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Rahoma Sadeg Mohamed, Pedro de Alcantara Pessoa Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Watanabe_ErikaOhta_M.pdf: 2988962 bytes, checksum: bf4098211fb214faf6ddf984cf711041 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A precipitação induzida pela adição de sais é um processo freqüentemente utilizado na purificação de proteínas em solução aquosa. Após a separação da proteína, o sal presente no precipitado deve ser removido e a solução remanescente necessita de tratamento para que os eletrólitos sejam recuperados e reutilizados no processo, para reduzir o custo e evitar a contaminação do meio ambiente. A precipitação com uso de sais voláteis pode ser uma alternativa a este tipo de processo pois, por elevação de temperatura ou abaixamento de pressão, o eletrólito passa para a forma gasosa e pode ser reutilizado sem purificação adicional. Neste trabalho foi estudada a precipitação de tripsina suina a 4°C utilizando-se o sal volátil carbamato de amônio ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO), preparado a partir de carbonato de amônio e hidróxido de amônio de modo que a razão entre as quantidades totais de nitrogênio e carbono (RNlc) fosse. igual a 2,0. A solubilidade da tripsina foi determinada experimentalmente: as concentrações de proteína das fases sobrenadante e precipitado foram obtidas por absorção a 280 nm e confinadas por liofilização. Balanços de massa foram verificados, bem como o tempo necessário para que o equihbrio fosse atingido. Por ser a tripsina uma enzima proteolítica, que apresenta problemas específicos de autólise em seu pH ótimo igual a 8,0, e devido ao caráter básico do sal carbamato de amônio, ensaios de atividade enzimática e avaliação do nível de autólise foram efetuados. Os estudos realizados demonstram que o carbamato de amônio é capaz de induzir a precipitação por "salting-out" da tripsina, e que o acréscimo de amônia ao sistema reduz a efetividade da precipitação. Da análise do balanço de massa observou-se que a concentração inicial de proteína não afeta sua solubilidade, e que o estado de equilibrio é atingido após 1 h. Comparando-se os resultados de atividade total recuperada da tripsina precipitada com o sal volátil e com sulfato de amônio verificou-se a diminuição na atividade da proteína precipitada com carbamato de amônio. Este comportamento é devido provavelmente a um efeito desnaturante do carbamato de amônio, conforme observado por meio de eletroforese SDS-PAGE. Estudos para a remoção do sal volátil da solução de tripsina no processo de precipitação por "salting-out" foram realizados, de modo a demonstrar que a utilização do sal para a precipitação em larga escala é factível / Abstract: Salt-induced precipitation is an extensively used method to purify proteins in aqueous solution. Once precipitation is carried out, additionaI separation steps are necessary both to remove the salt ITomthe precipitate, which is often accomplished by dialysis, and to treat the remaining aqueous phase to recover biomolecules still in solution and to prepare the solution for final disposal or recycling. This post-precipitation treatment can be very costly. The use of volatile electrolytes, which can be removed ITomthe solution by temperature increase or pressure decrease, can be an economically attractive alternative for the precipitation process by conventionaI salts. In this work, the precipitation of suine trypsin at 4°C with the volatile salt ammonium carbamate ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO) was investigated. The solubility curve of trypsin was determined by .measuring absorbance at 280 nm of precipitate and supernatant phases, and con:firmed by lyophilization. Mass balance was verified as well as the time necessary to reach the equihDrium.Once trypsin is a proteolitic enzyme presenting autolysis problems at pH equal to 8,0, which is close to the pH of ammonium carbamate solutions, the activity recovery and autolysis leveI in the process were investigated. Experimental results showed that ammonium carbamate is able to induce the trypsin precipitation by salting-out. Mass balance indicated tOOtthe solubility of trypsin is independent of the inicial protein concentration and the equihDriumis reached afier 1 hour. Comparative results of the total activity recovered of the trypsin precipitated with ammonium carbamate and ammonium sulfate showed a decrease of 20% in the activity of the protein precipitated with ammonium carbamate. These results can bé related to denaturing effect of ammonium carbamate as suggested by SDS-PAGE ana1ysis.Volatile salt remova! in the protein solution afier the salting out precipitation was studied to demonstrate the feasibilityofthis precipitation technique / Mestrado / Engenharia de Processos / Mestre em Engenharia Química