Le traitement des leucémies myéloïdes et lymphoblastiques aiguës a connu des avancées importantes dans la dernière décennie. Malgré ces progrès, le taux de rechutes reste élevé et le besoin médical est réel. Ces leucémies sont caractérisées par une expression aberrante d’antigènes qui peuvent provenir de protéines mutées, mais aussi de séquences rapportées comme non codantes. Les réponses contre ces néoantigènes tumoraux « cryptiques » demeurent non caractérisées. Afin de définir l’existence d’un répertoire varié de récepteurs des lymphocytes T (TCR) qui reconnaitraient ces néoantigènes, des cellules mononuclées du sang périphérique de patients sains sont isolées puis enrichies en cellules T CD8+ naïves. L’expansion et l’activation de ces cellules sont ensuite réalisées avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l’antigène d’intérêt puis triées à l’aide de multimères HLA-peptides spécifiques. L’ARN des cellules avec TCR spécifiques aux antigènes spécifiques des tumeurs (TSA) leucémiques est isolé afin de réaliser un séquençage du TCR-bêta. L’expansion cellulaire a été réalisée de façon suffisante pour effectuer le séquençage des cellules identifiées comme positives par le marquage avec dextramères. Une réponse T est obtenue pour 50% des néoantigènes testés avec une réactivité montrée par ELISpot et se traduisant par une sécrétion de cytokines inflammatoires. Des lymphocytes T spécifiques aux TSA d’intérêt sont donc présents dans le sang périphérique de donneurs sains. Le séquençage de ces cellules a permis d’identifier les clonotypes pour lesquels une réponse anti-leucémique forte est possible. Il serait intéressant d’utiliser ces clonotypes spécifiques aux tumeurs cryptiques dans le développement de nouveaux traitements d’immunothérapie adoptive. / The treatment of acute myeloid and lymphoblastic leukemia has seen significant advances in the past decade. Despite this progress, the relapse rate remains high and the medical need is real. These leukemias are characterized by an aberrant expression of antigens, some from mutated proteins but also from sequences of DNA that were reported as non-coding. Responses against these “cryptic” neoantigens remains uncharacterized. In order to verify whether a diverse repertoire of T cell receptors (TCR) does recognize these neoantigens, mononuclear cells from peripheral blood of healthy patients are isolated and enriched with naive CD8+ T cells. The expansion and activation of these cells are then carried out with autologous dendritic cells loaded with the antigen of interest and then sorted using HLA-peptide specific multimers. RNA from cells with TCR specific for leukemic tumor-specific antigens (TSA) is isolated in order to perform TCR-beta sequencing. Cell expansion was sufficient to perform the sequencing of cells identified as positive by staining with dextramers. A T-cell response is obtained for 50% of the neoantigens tested with reactivity shown by ELISpot and resulting in a secretion of inflammatory cytokines. T lymphocytes specific to the TSA of interest are therefore present in the peripheral blood of healthy donors. Sequencing of these cells made it possible to identify clonotypes for which a strong anti-leukemic response can be expected. It would be interesting to use these cryptic tumor-specific clonotypes in the development of new adoptive immunotherapy treatments.

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ. / High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.

Le carcinome séreux de haut grade (CSHG) est le sous-type histologique le plus courant du cancer de l'ovaire et demeure le cancer le plus meurtrier de l'appareil reproducteur féminin. Les récents progrès de l'immunothérapie contre le cancer ont mis en évidence un énorme potentiel thérapeutique pour les patientes confrontées à des besoins non satisfaits de soins de santé pour le traitement des CSHG. Une étape cruciale pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques consiste à identifier les antigènes spécifiques des tumeurs (TSA), c’est-à-dire des antigènes majeurs d'histocompatibilité de classe I présents à la surface des cellules cancéreuses mais absents des cellules normales. Ces TSA peuvent être reconnus par les cellules T et sont des éléments essentiels dans la conception de vaccins destinés à stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses. Les travaux menés dans le cadre de mon programme de doctorat ont porté sur l'identification et la caractérisation des TSAs dans les CSHG. Les premières études sur les TSAs ont été dirigées uniquement vers l’identification de TSAs dérivés de mutations dans les régions codantes, menant à l’identification d’antigènes très rares et privés dans les CSHG. Dans notre première étude, nous avons analysé 23 échantillons de cancer de l'ovaire en utilisant une approche protéogénomique nous permettant d'étudier à la fois les régions génomiques codantes et non codantes. Ce faisant, nous avons identifié un total de 103 TSAs, dont 91 qui ne portaient pas de mutations et dérivaient de séquences présumées non-codantes. Nous appelons ces antigènes « TSAs exprimés de manière aberrante (aeTSAs) » puisqu’ils sont exprimés de manière aberrante dans les échantillons de cancer mais absents dans les tissus normaux. Contrairement aux TSAs mutés, qui sont davantage patient- spécifiques, l’ARN codant pour les aeTSAs est exprimé par plusieurs patientes atteints d’un CSHG, celles-ci exprimant individuellement une médiane de 5 aeTSAs. De par leur nombre élevé et du fait que leur expression soit partagée dans une large population de patientes atteints de CSHG, les aeTSAs représentent des cibles intéressantes pour l'immunothérapie du cancer. En raison de leur origine principalement non codante, la nature et la régulation des aeTSAs sont peu connues. Notre seconde étude a donc porté sur la régulation de la biogenèse des aeTSAs. L’analyse de données de séquençage de l'ARN de CSHG en cellule unique a montré une expression enrichie et spécifique des gènes sources des aeTSAs dans les cellules cancéreuses. Grâce à une analyse transcriptomique plus poussée, nous avons identifié de nouveaux transcrits récurrents codant pour les aeTSAs et avons déterminé que ces transcrits sont largement surexprimés dans les CSHG. De plus, nous avons déterminé que les aeTSAs issus d'événements de traduction non canonique sont codés préférentiellement par des cadres de lecture ouverts courts et générés à partir de régions près de l'extrémité C-terminale. Finalement, nos analyses sur l'accessibilité de la chromatine et les modifications des histones supportent l’hypothèse que les transcrits codant pour les aeTSAs ont recourt à des promoteurs alternatifs, ce qui suggère un rôle important de l'épigénome du cancer dans la genèse du paysage antigénique. Nos travaux représentent la première analyse complète des antigènes provenant des régions codantes et non codantes dans les tumeurs ovariennes. Nous avons pu dresser une liste exhaustive de cibles thérapeutiques potentielles et mieux comprendre leur biogenèse. Nos travaux portant sur la découverte et la caractérisation des aeTSAs favoriseront la conception de nouvelles immunothérapies ciblant ces antigènes et ce qui sera bénéfique pour un plus grand nombre de patientes atteintes de CSHG. / High-grade serous carcinoma (HGSC) is the most common histologic subtype of ovarian cancer and the most lethal cancer in the female reproductive system. Recent advances in cancer immunotherapy have highlighted enormous therapeutical potential for patients facing unmet clinical needs in HGSC treatment. A crucial step for developing new therapeutic strategies is identifying targetable tumor-specific antigens (TSAs), namely the major histocompatibility class I antigens presented on the cancer cell surface but absent from normal cells. These TSAs can be recognized by T cells and are essential elements in designing vaccines to stimulate anti-cancer immune responses. The goal of my Ph.D. thesis was to identify and characterize TSAs in HGSC. In early studies of TSAs, most groups focused solely on TSAs derived from mutations in coding regions, which reported very rare and private antigens in HGSCs. In our first study, we used a proteogenomic workflow that enabled us to survey both coding and noncoding sequences to analyse 23 ovarian cancer samples. We uncovered 103 TSAs, 91 of which were not mutated and derived mainly from allegedly noncoding sequences. We call these antigens aberrantly expressed TSAs (aeTSAs), for their lack of expression in normal tissues while being aberrantly expressed in cancer samples. Unlike the mutated TSAs unique to individual tumors, the aeTSAs have shared RNA expression in HGSC tumors, with an estimated median presentation of five per patient. Because of their number and shared expression in a large population, we consider aeTSAs attractive targets for immunotherapy. Due to their primarily noncoding origin, little is known about the nature and regulation of aeTSAs. In our second study, we explored the biogenesis of the aeTSAs. HGSC single-cell RNA sequencing data showed a malignant cell-specific/enriched expression of aeTSA source genes. Further transcriptomic profiling identified novel recurrent transcripts coding for aeTSAs and revealed broad overexpression of aeTSA-coding transcripts in HGSC. Moreover, we showed that aeTSAs derived from noncanonical translation events are coded preferably by short open reading frames and generated from regions close to the C-terminus. Our analysis of chromatin accessibility and histone modifications support a differential promoter activity for aeTSA-coding transcripts, suggesting an important role of cancer epigenome in shaping the antigen landscape. Our work is the first comprehensive analysis of ovarian tumor antigens derived from both coding and noncoding regions. We reported an extensive list of potential therapeutic targets and provided insights into their biogenesis. Our work on discovering and characterizing shared TSAs shall promote the design of new antigen-targeting immunotherapy that benefits more HGSC patients.

Les trois proto-oncogènes RAS, soit HRAS, KRAS et NRAS (H/K/NRAS), sont les gènes les plus fréquemment mutés dans les cancers humains. Les énormes défis liés au ciblage thérapeutique des RAS soulignent la nécessité d’approfondir notre compréhension de la biologie de ces protéines et de trouver des stratégies alternatives pour traiter les cancers qu’elles induisent. Les petites GTPases RAS sont des régulateurs fondamentaux du développement et se lient à des protéines effectrices distinctes pour transmettre des signaux afin de réguler diverses voies de signalisation intracellulaires. Les effecteurs de RAS sont définis par un domaine de liaison à RAS (RBD) qui reconnaît la conformation active de RAS liée au GTP et active les voies de signalisation en aval. Par exemple, les effecteurs RAF et PI3K régulent les voies de signalisation MAPK et PI3K-AKT, respectivement, pour contrôler la prolifération, la survie et la tumorigenése. Alors que RASSF5 dirige RAS vers la voie Hippo, suppresseur de tumeur, mais cela reste moins bien compris. Il est intéressant de noter que la famille des domaines d'association à RAS (RASSF) comprend 10 effecteurs RAS supposés en aval, chacun comprenant un RBD, mais seul le RASSF5 se lie à H/K/NRAS. Les RASSF sont des suppresseurs de tumeurs connus et comptent parmi les protéines les plus fréquemment régulées à la baisse dans les cancers. La superfamille des petites GTPases RAS compte chez l’humain environ 160 protéines regroupées en cinq sous-familles : RAS, RHO, RAN, RAB et ARF. Alors que H/K/NRAS sont les mieux caractérisées et ont été au centre de la recherche sur le cancer, les fonctions cellulaires, la régulation et les protéines effectrices de nombreuses autres GTPases de la superfamille RAS restent obscures. Ma recherche doctorale visait donc à étudier le rôle des effecteurs de RASSF en cartographiant les interactions de BRAF et de quatre protéines de RASSF avec 83 GTPases appartenant aux sous-familles RAS, RHO et ARF et à utiliser ces connaissances pour démêler l'interaction complexe entre les GTPases et les effecteurs. Nous avons abordé des questions clés sur la spécificité des RBD envers les GTPases et avons révélé et validé 39 interactions RASSF-GTPase. Nous avons constaté qu'alors que BRAF démontre une spécificité restreinte pour les H/K/NRAS classiques, RASSF fait preuve de plasticité dans ses interactions avec les GTPases. RASSF5 interagit avec 10 GTPases distinctes de la sous-famille RAS (H/K/NRAS, RAP2B/2C, RRAS1/2, MRAS et RIT1/2) qui favorisent la croissance. La présence d’un complexe RASSF5-GTPase à la membrane plasmique redistribue la protéine YAP dans le cytosol et active la signalisation Hippo. Nous avons également montré que l'interaction de RASSF5 avec les kinases MST est essentielle pour l'activation de la voie Hippo médiée par le complexe RASSF5-GTPase. Nous avons également révélé que RASSF3, RASSF4 et RASSF8 lient les GTPases de la sous-famille RAS inhibitrices de croissance. RASSF8 subit une séparation de type liquide-liquide et réside avec YAP dans des gouttelettes non-membranaires. De plus, l'expression des partenaires GTPase de RASSF8 redistribue les condensats de RASSF8 et YAP de grandes structures périnucléaires. YAP et la voie Hippo entraînent une résistance aux inhibiteurs de RAS dans les cancers induits par RAS. Ainsi, nos découvertes sur l'association de RASSF5 et RASSF8 avec la voie Hippo pourraient aider à élucider les liens manquants entre les signalisations RAS et Hippo. Nous avons également identifié RASSF3 comme le premier effecteur canonique de MIRO1/2, des GTPases mitochondriales essentielles pour le fonctionnement et l'homéostasie des mitochondries. L'interaction de RASSF3 avec MIRO dans les mitochondries entraîne un effondrement du réseau mitochondrial. Pour comprendre la dynamique du réseau des GTPases, nous développons un outil de GTPase piégée inductible par la rapamycine. Ainsi, le piège qui garde la GTPase surexprimée inactive peut être libérée et la GTPase activée de manière conditionnelle en utilisant le traitement à la rapamycine. Cet outil sera utile pour élucider le rôle précis de chaque GTPase dans la régulation des effecteurs en aval in cellulo. Par conséquent, cette étude révèle la nature complexe des interactions entre GTPases et effecteurs et met en lumière l'importance biologique des protéines RASSF. / The three RAS proto-oncogenes, namely HRAS, KRAS and NRAS (H/K/NRAS) are the most frequently mutated genes in human cancers. H/K/NRAS small GTPases are fundamental regulators of development and bind distinct effector proteins to transmit signals to diverse cellular pathways. RAS effectors are defined by a RAS-binding domain (RBD) which recognizes the GTP-bound activated conformation of RAS and activates downstream signalling pathways. For example, RAF and PI3K effectors regulate the MAPK and PI3K-AKT signalling pathways, respectively, to control proliferation, survival and tumorigenesis. Whereas RASSF5 directs RAS to the tumour suppressor Hippo pathway but this remains less understood. Interestingly, the RAS Association domain family (RASSF) comprises 10 purported downstream RAS effectors, each of which comprises an RBD, but only RASSF5 binds to H/K/NRAS. RASSF are known tumour suppressors and are among the most frequently downregulated proteins in cancers. There are approximately 160 proteins in the human RAS superfamily that are clustered into five subfamilies: RAS, RHO, RAN, RAB and ARF. While H/K/NRAS are the best-characterized and have been a principal focus of cancer research, cellular functions, regulation and effectors for many other GTPases of the RAS superfamily remain recondite. My doctoral research therefore aimed to investigate the role of RASSF effectors by mapping the interactions of BRAF and four RASSF proteins with 83 GTPases belonging to the RAS, RHO and ARF subfamilies and use this knowledge to unravel the complex interplay between GTPase and effectors. I uncovered 39 RASSF–GTPase interactions and addressed key questions on RBD specificity towards GTPases. I found that while BRAF demonstrates restricted specificity for classical H/K/NRAS, RASSF shows plasticity in its interaction with GTPases. RASSF5 interacts with 10 distinct growth-promoting GTPases of the RAS subfamily (H/K/NRAS, RAP2B/2C, RRAS1/2, MRAS and RIT1/2). RASSF5–GTPase complex at the plasma membrane redistributes YAP to the cytosol and activates Hippo signalling. I also showed that RASSF5 interaction with MST hippo kinases is essential for RASSF5–GTPase complex-mediated activation of the Hippo pathway. I further revealed that RASSF3, RASSF4 and RASSF8 bind distinct growth-inhibiting RAS subfamily GTPases. RASSF8 undergoes liquid-liquid phase separation and resides in membraneless, phase-separated YAP condensates. Further, the expression of GTPase partners of RASSF8 redistributes RASSF8 and YAP condensates to large peri-nuclear structures. These findings show several GTPase–RASSF complexes play a role in Hippo signalling which may serve as potential therapeutic targets for RAS- or YAP-driven cancers. I also identified RASSF3 as the first canonical effector of MIRO1/2, mitochondrial GTPases that are essential for mitochondrial functions and homeostasis. RASSF3 interaction with MIRO at the mitochondria results in a collapse of the mitochondrial network. To understand the dynamics of the GTPase network, I am further developing a rapamycin-inducible trapped GTPase (RITG) tool, wherein a GTPase can be overexpressed while remaining occluded, and can be conditionally released or activated. This tool can be useful in elucidating the role of GTPases in the regulation of downstream effectors in cellulo. Overall, this study reveals the complex nature of GTPase–effector interactions and uncovers the biological significance of RASSF proteins.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.

La protéine tyrosine kinase c-Src est surexprimée et activée dans de nombreux cancers. De manière remarquable, Src est activé dans plus de 80% des adénocarcinomes coliques où il joue un rôle dans la carcinogenèse et la progression vers un phénotype métastatique. c-Src et son homologue viral v-Src activent un grand nombre de voies cellulaires permettant à la tumeur de proliférer, de résister à la mort cellulaire et d’acquérir des capacités accrues de migration et d’angiogenèse. Au cours de ma thèse nous avons mis en évidence un mécanisme inattendu d’échappement à l’apoptose de fibroblastes murins surexprimant de manière stable v-Src et de plusieurs lignées tumorales humaines (coliques en particulier) présentant une activité c-Src dérégulée. Nous avons montré que Src stimule la dégradation protéasomedépendantede la protéine Bik, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, connu pour être un suppresseur de tumeurs. Cette régulation post-traductionnelle du niveau d’expression de Bik est à l’origine d’une forte résistance de la voie mitochondriale de l’apoptose. L’inhibition de l’activité kinase de Src ou le blocage de la dégradation de Bik par le protéasome permettent de restaurer des concentrations normales de la protéine Bik dans les cellules transformées et de les restaurer efficacement l’apoptose. En revanche, l’inhibition des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 par l’ABT-737 semble moins efficace. Par ailleurs, nous avons également contribué à mettre en évidence le rôle anti-migratoire et anti-invasif du lithium sur des cellules transformées par Src. Le mécanisme moléculaire mis en jeu implique l’activation redox des protéines tyrosine phosphatases cellulaires. Enfin, nous avons participé à l’étude de peptides mimant les hélices centrales d’insertion de Bax, Bcl-xL et Bid, représentant les trois sous-groupes de protéines de la famille Bcl-2. Nous avons comparé leur comportement vis-à-vis d’une monocouche lipidique mimant la membrane mitochondriale externe ainsi que leur capacité à perméabiliser des mitochondries isolées. Nos résultats nous ont permis de proposer que les fragments centraux d’insertion membranaire des protéines Bcl-2 seraient directement impliqués dans la divergence fonctionnelle des différents sous groupes qui composent la famille / C-Src tyrosine kinase is overexpressed and activated in a number of cancers. Remarkably, Src is deregulated in more than 80% of colorectal adenocarcinoma, playing a role in carcinogenesis and progression toward a metastatic phenotype. c-Src and v-Src activate a large number of intracellular pathways which allow the tumor to proliferate, to evade the cell death machinery and to acquired enhanced migratory and angiogenic abilities. During my PhD, we discovered an unknown mechanism to evade apoptosis developed by murine fibroblasts stably overexpressing v-Src and by some human tumor cell lines with c-Srcb deregulation. We have shown that Src stimulate the proteasomal degradation of the Bik protein, a proapoptotic member of the Bcl-2 family proteins known to act as a tumor suppressor. This post-translationnal regulation of the Bik protein expression level leads to a strong resistance of the mitochondrial pathway of apoptosis. Inhibition of the Src kinase activity or of the Bik proteasome-dependent degradation restore normal levels of the Bik protein and efficiently resensitize these cells to apoptosis. Inhibition of the antiapoptotic Bcl-2 proteins by ABT737 seems to be less efficient in these cells. We also contribute to show that lithium suppresses motility and invasivity of v-Src transformed cells. The molecular mechanism involve a redox activation of the protein tyrosine phosphatases. Finally, we compared the membrane behavior and the ability to permeabilize mitochondria of synthetic peptides derived from the central helical hairpin of Bax,Bcl-xL and Bid. We showed that these structurally analogous domains have distinct membrane behavior which could account for the functional divergence between the Bcl-2 family members

L'objet de cette thèse est d'étudier le comportement en temps long de solutions d'équations d'évolution non locales ainsi que la limite singulière d'équations et de systèmes d'équations aux dérivées partielles, où intervient un petit paramètre epsilon. Au Chapitre 1, nous considérons une équation de réaction-diffusion non locale avec conservation au cours du temps de l'intégrale en espace de la solution; cette équation a été initialement proposée par Rubinstein et Sternberg pour modéliser la séparation de phase dans un mélange binaire. Le problème de Neumann associé possède une fonctionnelle de Lyapunov, c'est-à-dire une fonctionnelle qui décroit selon les orbites. Après avoir prouvé que la solution est confinée dans une région invariante, nous étudions son comportement en temps long. Nous nous appuyons sur une inégalité de Lojasiewicz pour montrer qu'elle converge vers une solution stationnaire quand t tend vers l'infini. Nous évaluons également le taux de la convergence et calculons précisément la solution stationnaire limite en dimension un d'espace. Le Chapitre 2 est consacré à l'étude de l'équation différentielle non locale que l'on obtient en négligeant le terme de diffusion dans l'équation d'Allen-Cahn non locale étudiée au Chapitre 1. Sans le terme de diffusion, la solution ne peut pas être plus régulière que la fonction initiale. C'est la raison pour laquelle on ne peut pas appliquer la méthode du Chapitre 1 pour l'étude du comportement en temps long de la solution. Nous présentons une nouvelle méthode basée sur la théorie des réarrangements et sur l'étude du profil de la solution. Nous montrons que la solution est stable pour les temps grands et présentons une caractérisation détaillée de sa limite asymptotique quand t tend vers l'infini. Plus précisément, la fonction limite est une fonction en escalier, qui prend au plus deux valeurs, qui coïncident avec les points stables d'une équation différentielle associée. Nous montrons aussi par un contre-exemple non trivial que, quand une hypothèse sur la fonction initiale n'est pas satisfaite, la fonction limite peut prendre trois valeurs, qui correspondent aux points instable et stables de l'équation différentielle associée. Nous étudions au Chapitre 3 une équation différentielle ordinaire non locale qui a éte proposée par M. Nagayama. Une difficulté essentielle est que le dénominateur dans le terme de réaction non local peut s'annuler. Nous appliquons un théorème de point fixe lié a une application contractante pour démontrer que le problème à valeur initiale correspondant possède une solution unique qui reste connée dans un ensemble invariant. Ce problème possède une fonctionnelle de Lyapunov, qui est un ingrédient essentiel pour démontrer que la solution converge vers une solution stationnaire constante par morceaux quand t tend vers l'infini. Au Chapitre 4, nous considérons un modèle d'interface diffuse pour la croissance de tumeurs, où intervient une équation d'ordre quatre de type Cahn Hilliard. Après avoir introduit un modèle de champ de phase associé, on étudie formellement la limite singulière de la solution quand le coefficient du terme de réaction tend vers l'infini. Plus précisément, nous montrons que la solution converge vers la solution d'un problème à frontière libre. AMS subject classifications. 35K57, 35K50, 35K20, 35R35, 35R37, 35B40, 35B25. / The aim of this thesis is to study the large time behavior of solutions of nonlocal evolution equations and to also study the singular limit of equations and systems of parabolic partial differential equations involving a small parameter epsilon. In Chapter 1, we consider a nonlocal reaction-diffusion equation with mass conservation, which was originally proposed by Rubinstein and Sternberg as a model for phase separation in a binary mixture. The corresponding Neumann problem possesses a Lyapunov functional, namely a functional which decreases in time along solution orbits. After having proved that the solution is conned in an invariant region, we study its large time behavior and apply a Lojasiewicz inequality to show that it converges to a stationary solution as t tends to infinity. We also evaluate the rate of convergence and precisely compute the limiting stationary solution in one space dimension. Chapter 2 is devoted to the study of a nonlocal evolution equation which one obtains by neglecting the diffusion term in the nonlocal Allen-Cahn equation studied in Chapter 1. Without the diffusion term, the solution can not be expected to be more regular than the initial function. Moreover, because of the absence of the diusion term, the method of Chapter 1 can not be applied to study the large time behavior of the solution. We present a new method based up on rearrangement theory and the study of the solution profile. We show that the solution stabilizes for large times and give a detailed characterization of its asymptotic limit as t tends to infinity. More precisely, it turns out that the limiting function is a step function, which takes at most two values, which are stable points of a corresponding ordinary dierential equation. We also show by means of a nontrivial counterexample that, when a certain hypothesis on the initial function does not hold, the limiting function may take three values. One of them is the unstable point and the two others are the stable points of the ordinary dierential equation. We study in Chapter 3 a nonlocal ordinary dierential equation which has been proposed by M. Nagayama. The nonlocal term involves a denominator which may vanish. We apply a contraction fixed point theorem to prove the existence of a unique solution which stays confined in an invariant region. We also show that the corresponding initial value problem possesses a Lyapunov functional and prove that the solution stabilizes for large times to a step function, which takes at most two values. In Chapter 4, we consider a diffuse-interface tumor-growth model which involves a fourth order Cahn-Hilliard type equation. Introducing a related phase-field model, we formally study the singular limit of the solution as the reaction coecient tends to infinity. More precisely, we show that the solution converges to the solution of a moving boundary problem. AMS subject classifications. 35K57, 35K50, 35K20, 35R35, 35R37, 35B40, 35B25.

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Le métabolisme énergétique est le principal facteur déterminant de la viabilité cellulaire. Les maladies présentent de nombreuses anomalies métaboliques et énergétiques. En effet, les cellules altérées proviennent de procédés exergoniques et émettent de la chaleur vers leur environnement proche. De nombreux processus irréversibles peuvent se produire en modifiant le taux de production d'entropie. Ce niveau représente une quantité thermodynamique qui mesure ces processus irréversibles. Le niveau d'entropie est augmenté par plusieurs anomalies métaboliques et thermodynamiques dans les tumeurs cérébrales, les processus inflammatoires et les maladies neurodégénératives. Les travaux de recherche de cette thèse ont démontré et mis en évidence l'existence d'une diaphonie entre la voie canonique WNT/beta-caténine et le PPAR gamma qui joue un rôle majeur dans la reprogrammation du métabolisme de l'énergie cellulaire entre la phosphorylation oxydative, la glycolyse aérobie et la glycolyse anaérobie, dont le point d'équilibre de cette diaphonie entre ces voies moléculaires varie selon les maladies. Ces maladies sont des structures dissipatives, qui échangent de l'énergie ou de la matière avec leur environnement. Ce sont des systèmes ouverts, loin de l'équilibre thermodynamique qui opèrent sous un régime non linéaire évoluant vers des états non stationnaires. La thermodynamique loin de l'équilibre est une notion axée sur les rythmes circadiens. En effet, les rythmes circadiens participent directement à la régulation de cette diaphonie étudiée. Celle-ci représente une cible innovante dans le cadre l'imagerie moléculaire pour le diagnostic positif et différentiel de ces maladies. / Energy metabolism is the primary determinant of cellular viability. Diseases are the sites of numerous metabolic and energetic production abnormalities. Indeed, the altered cells are derived from exergonic processes and emit heat that flows to the surrounding environment. Many irreversible processes can occur through changing the rate of entropy production. This rate represents a thermodynamic quantity that measures these irreversible processes. Entropy rate is increased by several metabolic and thermodynamics abnormalities in brain tumors, inflammatory processes and neurodegenerative diseases. The research works of this thesis have demonstrated and highlighted the existence of a crosstalk between canonical WNT/beta-catenin pathway and PPAR gamma which plays a major role in the reprogramming of cellular energy metabolism between oxidative phosphorylation, aerobic glycolysis and anaerobic glycolysis, of which the equilibrium point of crosstalk between these molecular pathways varies according to tumor, inflammatory and neurodegenerative diseases. These diseases are dissipative structures, that exchange energy or matter with their environment. They are open systems, far-from the thermodynamic equilibrium that operate under non-linear regime evolving to non-stationary states. Far-from-equilibrium thermodynamics are notions driven by circadian rhythms. Indeed, circadian rhythms directly participate in regulating the crosstalk of the studied molecular pathways. This crosstalk represents an innovative therapeutic target, and molecular data usable for molecular imaging in both positive and differential diagnosis of these diseases.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.