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Estudo histopatológico e molecular de embriões de Gallus gallus domesticus (Linnaeus, 1758) infectados com o vírus da Febre Amarela 17DDManso, Pedro Paulo de Abreu January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A vacina contra febre amarela é produzida a partir da inoculação do vírus atenuado 17DD em ovos embrionados de galinha. Esta vacina é extremamente eficaz e segura, gerando imunidade que pode perdurar por até trinta e cinco anos. Embora a replicação deste vírus em embriões de galinha seja utilizada desde 1937, pouco se sabe sobre os aspectos da infecção nestes embriões, especialmente que órgãos, tecidos e células são responsáveis pela replicação viral. Nesse trabalho, analisamos embriões de galinha (Gallus gallus) infectados pelo vírus da FA 17DD em diferentes tempos de infecção (24, 48, 72 e 96 horas) conforme as condições empregadas na produção de vacina na Fiocruz. Identificamos o vírus da Febre Amarela através de imunofluorescência em diferentes tecidos, correlacionamos a presença deste agente infeccioso às pequenas reações histopatológicas observadas nos tecidos, validamos essa detecção pela confirmação do material genético viral e seu sequenciamento, e confirmamos que este vírus replica na região onde foi identificado pela presença detecção de seu intermediário replicativo. Nesse sentido observamos que as alterações histopatológicas que ocorrem nos embriões de galinha infectados pelo vírus FA 17DD se apresenta branda e sistêmica ao longo do tempo analisado. Nossos dados apontam que as primeiras células a manifestar a infecção são mioblastos com aspecto mesenquimal que puderam ser observados no coração e no músculo esquelético a partir de 48 horas de infecção
Após 72 horas, o vírus FA 17DD replica em células do músculo esquelético, cardiomiócitos, células da glia e neurônios, no epitélio tubular renal, parênquima pulmonar e fibroblastos. Nossos dados permitem sugerir o tecido muscular esquelético como um local privilegiado na produção das partículas virais. Após 96 horas a infecção se torna mais intensa no sistema nervoso e se mantém nos mesmos níveis nos demais tecidos já infectados. O conjunto de dados gerados nesse trabalho contribui para elucidar aspectos importantes sobre a patologia da febre amarela em embriões de galinha, e evidenciar os tecidos e células responsáveis pela produção do vírus FA 17DD nestes embriões. Estes dados podem ser úteis na compreensão e formulação de novas estratégias de produção da vacina, além de impactar no desenvolvimento de estratégias baseadas no uso do vírus FA 17DD como plataforma de produção para outras vacinas / Yellow fever vaccine is produced from the inoculation of attenuated virus YF 17DD in embryonated chicken eggs. This vaccine is extremely effective and safe, generating immunity that can persist across up to thirty-five years. Although replication of this virus in chicken embryos is used since 1937, little is known about aspects of infection in these embryos, especially that organs, tissues and cells are responsible for viral replication. In this study we analyzed chicken embryos (Gallus gallus) infected in vaccine production (Biomanguinhos) with YF 17DD virus in different times post infection (24, 48, 72 and 96 hours). Here it was possible to detect the Yellow Fever Virus by immunofluorescence, to correlate this presence with tiny tissue reactions, to validate it by genomic RNA detection and to sequence it in the same studied area, confirming that this virus is replicated in these regions by the replicative intermediate detection. In this thesis the histopathological changes that occur in chicken embryos infected by YF 17DD virus during the production of yellow fever vaccine were observed in a kinetic way. We observed that the infection in these embryos presented itself mild and systemic. Our data show that the first cells which express infection are myoblasts with mesenchymal shape that could be observed in the heart and skeletal muscle at 48 hours of infection. After 72 hours the yellow fever virus 17DD replicates mainly in skeletal muscle cells, cardiomyocytes, glial cells and neurons, but also in the renal tubular epithelium, lung parenchyma and fibroblasts. Our findings suggested skeletal muscle tissue as a main place in the production of viral particles. After 96 hours the infection becomes more intense in the nervous system and is maintained at the same levels in other tissues already infected. The data generated in this study contributes to elucidate important aspects of the yellow fever pathology in chicken embryos, and elucidate the tissues and cells responsible for YF 17DD virus production in this model. Our data may be helpful in the understanding and design new strategies of vaccine production, and impact in development of strategies based on the use of the virus YF 17DD as a platform for other vaccines production.
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Herpesvírus e pestivírus em rebanhos bubalinos do Rio Grande do Sul / Herpesvirus and pestiviruses in buffalo herds in the Rio Grande do SulScheffer, Camila Mengue January 2013 (has links)
Os herpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) e o vírus da diarreia viral bovina (BVDV), são causas importantes de prejuízos sanitários e econômicos na bovinocultura. Estes agentes têm sido eventualmente detectados em búfalos (Bubalus bubalis) embora o papel desses vírus na biologia dessa espécie seja ainda desconhecido. A produção de búfalos vem se desenvolvendo expressivamente no Brasil, onde esses animais são mantidos frequentemente próximos ou associados à criação de bovinos. Como parte inicial de um projeto mais amplo sobre infecções por BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e BVDV em búfalos, o presente estudo objetivou analisar a presença de anticorpos neutralizantes e genomas virais em amostras de soros bubalinos coletados em rebanhos do Estado do Rio Grande do Sul. Foram examinados 339 soros de animais maiores de 12 meses, de ambos os sexos, de diferentes raças e tipo de exploração. Os animais não eram vacinados para quaisquer vírus de interesse na pesquisa e se apresentavam sem alterações clinicamente aparentes na ocasião da coleta. Para a detecção de anticorpos neutralizantes, as amostras de soro foram examinadas através do teste de soroneutralização (SN) frente a diferentes amostras de herpesvírus: BoHV-1.1 (amostra LA) , BoHV-5b (amostra A663) e BuHV-1 (amostra b6). Cento e oito destas amostras foram examinadas adicionalmente frente ao BoHV-1.1 (amostra EVI123/98) e BoHV-1.2a (amostra SV265/96), para permitir uma avaliação da sensibilidade da SN utilizando como vírus de desafio todas as variantes disponíveis de BoHV-1 e BoHV-5. A sensibilidade da SN foi menor quando considerados os resultados obtidos com cada um dos vírus separadamente. Quando os resultados positivos frente a amostra LA, SV265/96 e A663 foram somados, a prova se apresentou mais sensível. Apesar disso, a SN não permitiu a identificação dos vírus que efetivamente haviam infectado os animais, devido ao elevado grau de reatividade cruzada. Para a verificação da circulação de pestivírus, foram realizados testes de SN utilizando a amostra “Oregon C24V” de BVDV-1 como vírus de desafio. Das 176 amostras analisadas, 19 (10,8 %) apresentaram anticorpos neutralizantes reagentes com o vírus utilizado. Paralelamente, para a detecção de genomas de pestivírus, foi desenvolvida uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) capaz de detectar os três tipos conhecidos de BVDV (1, 2 e 3) e otimizada para o exame das amostras de soros bubalinos. Cinco amostras (2,8 %) continham genomas virais, sugerindo a ocorrência de prováveis infecções persistentes nos animais, semelhante ao que ocorre em bovinos. Os resultados obtidos evidenciam a circulação de herpesvírus e pestivírus nas populações bubalinas analisadas. Mais estudos são necessários para definir quais os agentes efetivamente causadores de infecções nesta espécie animal. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 5 (BoHV-5) and bovine viral diarrhoea virus (BVDV) are major causes of sanitary and economic losses in cattle. These agents have been eventually detected in water buffaloes (Bubalus bubalis), although their role in host species biology is unknown. Buffalo production has had significant increase in Brazil, where these animals are often kept close to or in association with cattle. As part of a wider project on infections with BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 and BVDV in buffaloes, the present study aimed to examine the occurrence of neutralizing antibodies in buffaloes serum samples collected in farms from Rio Grande do Sul State. Three hundred and thirty nine serum samples were collected from animals with ages above 12 months, of both genders, of different races and under different management practices. The animals were not vaccinated for any virus studied in the present study and were all clinically healthy at the time of sample collection. For neutralizing antibodies detection, serum samples were tested in serum neutralization (SN) tests against different herpesviruses: BoHV-1.1 (strain LA), BoHV-5b (strain A663) e BuHV-1 (strain b6). One hundred and eight of theses samples were additionally examined with BoHV-1.1 (strain EVI123/98) and BoHV-1.2 (strain SV265/96), to compare SN sensitivity using all available variants of BoHV-1 and BoHV-5 as challenge viruses. The SN sensitivity was lower when results obtained with each virus were considered separately. Sensitivity was maximum when the positive results against strain LA, SV265/96 and A663 were added. Despite this, the SN did not allow the identification of the virus which had actually infected animals, in view of the high degree of antibody cross-reactivity. In order to assess the circulation of pestiviruses, SN tests were carried out using the sample "Oregon C24V" of BVDV-1 as challenge virus. Out of the 176 analyzed samples, 19 (10.8 %) presented neutralizing antibodies to pestivirus. At the same time, for the detection of genomes of pestiviruses, was developed a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) able to detect the three known types of BVDV (1, 2 and 3) and optimized for examining bubaline sera. Five samples (2.8 %) contained viral genomes, suggesting the occurrence of persistent infections in animals, analogous to what occurs in cattle. The results obtained confirm circulation of herpesvírus and pestiviruses in examined buffalo populations. Further studies are needed to define which of these viruses effectively infect this animal species.
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Caracterização genômica de bvdv-1 subtipo i e vírus ‘HoBi’- like detectados no BrasilMósena, Ana Cristina Sbaraini January 2017 (has links)
O gênero Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, é constituído por espécies virais de importância na saúde animal no mundo todo, as quais podem afetar a economia dos países de forma impactante. São reconhecidas quatro espécies pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV): vírus da peste suína clássica (Classical Swine Fever Virus – CSFV), vírus da doença da fronteira (Border Disease Virus- BDV), vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (Bovine Viral Diarrhea Virus 1- BVDV-1) e 2 (BVDV-2). Algumas das espécies deste gênero- CSFV e BVDV- são de notificação obrigatória na Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), causando sanções econômicas importantes quando presentes. Recentemente, possíveis novas espécies vêm sendo caracterizadas, porém ainda não foram reconhecidas como espécies do gênero Pestivirus. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da diversidade genética de pestivírus no país, o presente trabalho descreve os genomas completos e a caracterização genômica e filogenética de uma cepa de BVDV-1 subtipo i e duas de vírus ‘HoBi’-like. Os genomas completos foram obtidos através de sequenciamento de nova geração; as anotações, predição da poliproteína viral e dos sítios de clivagem foram feitos através do software Geneious, e a análise filogenética foi realizada através do software MEGA 6. O BVDV-1 subtipo i foi pela primeira vez isolado no Brasil, sendo também a primeira descrição de genoma completo deste subtipo de BVDV. Também foi descrito o genoma completo de duas cepas de vírus ‘HoBi’-like isolados no Brasil, além da caracterização de outras cepas de ‘HoBi’-like disponíveis em bancos de dados. Os dados moleculares destes isolados foram comparados com aqueles das demais espécies do gênero Pestivirus, e estas informações deverão auxiliar na futura classificação deste como espécie. Os resultados apresentados na dissertação adicionam conhecimento sobre a diversidade genética de BVDV-1 no Brasil além de informações acerca do vírus ‘HoBi’-like, reforçando esta espécie ainda não reconhecida como um novo membro do gênero Pestivirus, os ‘HoBi’-like vírus. / The genus Pestivirus, within the family Flaviviridae, includes species that are important pathogens affecting animal health that can cause impacting losses in the economy worldwide. According to the International Committee on Taxonomy of Virus (ICTV), there are four recognized species in this genus: Classical swine fever virus (CSFV), Bovine Viral Diarrhea Virus1 and 2 (BVDV -1, BVDV-2), and Border disease virus (BDV). Some of the species within this genus - CSFV and BVDV- are notifiable to the World Organization for Animal Health (OIE), and can cause exportation barriers or sanctions. Other putative new species have been characterized recently, but remain officially unrecognized. In order to generate data about the genetic diversity of pestivirus in Brazil, this study describes complete genomes and the genomic and phylogenetic characterization of an isolate of BVDV-1i and two isolates of ‘HoBi’-like virus. Complete genomes were sequenced through Next Generation Sequencing; genome annotations, polyprotein prediction and identification of cleavage sites were performed with software Geneious, and phylogenetic analysis with software MEGA 6. BVDV-1 subtype i was found in Brazil for the first time, and this is the first complete genome ever characterized for this subtype. Two strains of ‘HoBi-like’ virus isolated in Brazil were also described and characterized together with other ‘HoBi’-like strains available in databases. The molecular data obtained for these isolates were compared to those of other Pestivirus species. These data can help in future classification of these ‘HoBi’-like strains as a new recognized species. The knowledge on genetic diversity and the characterization of pestiviruses can contribute with surveillance programs and with appropriate animal health measures to control these viral diseases.
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Avaliação do tratamento experimental de cães naturalmente infectados com vírus da cinomose com ribavirina, prednisona e DMSO através da RT-PCRMangia, Simone Henriques [UNESP] 16 December 2011 (has links) (PDF)
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mangia_sh_dr_botfmvz.pdf: 2850666 bytes, checksum: 528a2aed184daa57fac613045bf43182 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O estudo objetivou identificar efeitos do tratamento com ribavirina, prednisona e DMSO na cinomose; identificar a presença viral no sangue, medula óssea e líquor antes e após o tratamento, os efeitos colaterais dos fármacos experimentais e associações. Foram utilizados 60 cães apresentando sinais neurológicos da cinomose com evolução de dez dias. Animais foram internados para tratamento de suporte; avaliados diariamente e submetidos ao hemograma e dosagens bioquímicas. Os grupos 1 e 2 foram tratados com ribavirina associada ao DMSO; os grupos 3 e 4 foram tratados com DMSO e prednisona e os grupos 5 e 6 foram tratados com ribavirina e prednisona, ribavirina, prednisona e DMSO. Os animais foram anestesiados e colhidos líquor, medula óssea e sangue, antes e após o tratamento e realizada a RTPCR das amostras; as negativas foram analisadas pela técnica de hn-PCR. O vírus foi encontrado em 95% das amostras de sangue, 90% de medula óssea e 53,3% de líquor pré-tratamento. O efeito adverso da ribavirina quando associada com a prednisona foi anemia. A prednisona na dose imunossupressora causou aumento da dosagem de proteína e diminuição da celularidade liquórica, leucocitose. Já a dose antinflamatória causou diminuição de proteína no líquor. Baseado nos índices de sobrevida e melhora clínica, o tratamento mais efetivo foi o G2 (80%); seguido do G1, G5 e G3 (70%); o G6 (60%); o G4 com o pior índice (30%). Pós-tratamento, a frequência viral foi 97,7% no sangue, 86,4% na medula óssea e 27,3% no líquor / The present study aims at the identification of ribavirin, prednisone and DMSO’s treatment effects in dogs with canine distemper, at the identification of the viral presence in the blood, bone marrow and cerebrospinal fluid (CSF) before and after the treatment and also at the identification of side effects of the experimental drugs and its combinations. Sixty dogs presenting canine distemper with neurological signs about ten days evolution were observed. The animals were hospitalized for the support treatment, assessed on daily basis and subjected to blood cells count and biochemical analysis. Groups 1 and 2 were treated with ribavirin and its combination with DMSO; Groups 3 and 4 treated with prednisone and DMSO, Group 5 treated with ribavirin and prednisone, while Group 6 with ribavirin, prednisone and DMSO. The animals were anesthetized for the cerebrospinal fluid, bone marrow and blood samples collection before and after the treatment, then the RT-PCR of the samples was proceeded. The negative were analysed according to the hn-PCR technique. The canine distemper virus were found in 95% of blood samples, 90% of bone marrow and 53,3% of CSF before the treatment. The adverse effect of ribavirin and its association with prednisone was anemia. Prednisone, at its immunosuppressive dose, led to the increase of protein and decrease of cellularity in CSF, and increase of leukocytes blood count. The antiinflammatory dose led to the CSF protein concentration’s decrease. Considering the survival and clinical improvement rates, the most successful treatment was the one applied to the G2 (80%); followed by G1 (70%); G5 (70%) and G3 (70%); G6 (60%); and the lowest rate G4 (30%). After the treatment, the virus frequency was 97,7% in the blood, 86,4% in the bone marrow and 27,3% in the CSF
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Clonagem e expressão de fragmentos funcionais(scFv) de anticorpo contra o Parvovírus canino-2 com a técnica da Phage displayBatista, Thiago Neves [UNESP] 02 February 2008 (has links) (PDF)
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batista_tn_dr_botfmvz_prot.pdf: 1218510 bytes, checksum: 40011e3f4a7d38b02ece0fb1208465c5 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A parvovirose canina, uma das principais doenças infecto-contagiosas que acomete cães, é causada pelo Parvovírus canino-2 (CPV-2). Desde sua ' escrição importantes mutações ocorreram originando três tipos: CPV-2a e 2b, comumente detectados no Brasil, e o CPV-2c. Essas alterações antígênicas caracterizam o CPV como um dos principais modelos de evolução viral, sendo etectáveis com painéis de anticorpos monoclonais em técnicas simples como hemaglutinação e neutralização in vitro. A tecnologia de apresentação de :J oteínas em bacteriófagos (Phage display) tem diversas aplicações, dentre elas a apresentação de fragmentos recombinantes de anticorpos funcionais scFv), que podem ser produzidos em grande quantidade. Este trabalho utilizou Phage Display para expressar fragmentos scFv contra o CPV-2 , com uma etodologia descrita (Krebber, 1997). Após o cultivo e purificação do vírus, camundongos da linhagem High seleção IV A foram imunizados com o CPV-2 , sendo em seguida extraído RNA total do baço. A amplificação das cadeias leve e pesada, e sua ligação por SOE-PCR, permitiu a clonagem do scFv no fagomídeo pAK 100. Após a transformação da E.coli XL-1 blue, bacteriófagos 13 foram expressos apresentando o fragmento scFv. Três processos de seleção foram realizados, e após '0 Phage-ELlSA, um grupo de fagos foi selecionado. A partir deste um screening foi realizado por PCR sendo dois lones detectados. Após nova expressão de ambos uma nova reação de Phage-ELlSA foi realizada e demonstrou a especificidade destes clones com o CPV-2. Até o presente momento esta é a primeira descrição da técnica de Phage display apresentando fragmentos de anticorpo anti-CPV-2. / Canine parvoviral disease, one of the most common infectious disorders of dogs, is caused by canine parvovirus (CPV-2). Several mutations have accurred since it was described in the late 1970s, originating three antigenic pes: CPV-2a and 2b, most commonly found in Brazil, and the CPV-2c. These tigenic differences characterize CPV-2 as an important model of virus evolution, and could be detected by monoclonal antibody panel in hemmaglutination and in vitro neutralization. Phage display has many a plications and have been used displaying functional antibodies fragments scFv) , which can be produced in large amount. The technology described here
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Estudo das interações entre proteína NS1 do hRSV e flavonóides utilizando métodos biofísicosGomes, Deriane Elias [UNESP] 28 March 2014 (has links) (PDF)
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000811761_20160401.pdf: 128977 bytes, checksum: dea2a8e871c9982dfbafa4187b62fa02 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-04-01T11:49:30Z: 000811761_20160401.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-04-01T11:50:31Z : No. of bitstreams: 1
000811761.pdf: 785012 bytes, checksum: d2639de3af3e75addc7def7c6e77f5fb (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV) é a principal causa de infecções respiratórias agudas em crianças, como bronquiolite e pneumonia. Este Paramyxovirus tem um RNA de fita simples, com 10 genes que codificam 11 proteínas. Um fator importante que contribui para o sucesso da replicação do hRSV é a evasão do sistema imune, processo no qual a proteína não estrutural 1 (NS1) está envolvida. Esta proteína pode atuar por meio da inibição ou neutralização das etapas da cascata do interferon do tipo I, bem como, pelo silenciamento do complexo ribonucleoproteico do hRSV. O conhecimento da interação da proteína NS1 com ligantes é importante na busca de moléculas que possam interferir na função da proteína e consequentemente resultar na redução da replicação do hRSV dentre os quais os flavonóides têm sido descritos como sendo supressores eficazes da replicação viral. Os objetivos deste estudo incluíram a expressão e purificação da proteína NS1, a caracterização da estrutura secundária e estabilidade térmica por dicroísmo circular e a realização do estudo de interação entre NS1 e quercetina por espectroscopia de fluorescência. Foi realizada a purificação da proteína NS1 em resina de afinidade utilizando cromatógrafo líquido ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). As medidas de dicroísmo circular (CD) permitiram calcular a porcentagem de estruturas secundárias e a temperatura de melting da NS1. A partir das análises das titulações por fluorescência foram calculados a constante de Stern Volmer (Ksv), a constante de ligação (Kb) e o número de ligantes por sítio (n). Os resultados de CD mostraram que a composição da estrutura secundária de NS1 é de 75 % de alfa-hélice, 3% de folha-beta, 10% de voltas e 12% de outras estruturas e a temperatura de melting da NS1 é de cerca de 65°C. Os resultados de fluorescência mostraram que Ksv e Kb foram da ordem de 104 e 105-106M-1, ... / Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major cause of acute respiratory infections in children, like bronchiolitis and pneumonia. This Paramyxovirus has a single strand RNA with 10 genes that codify 11 proteins. An important factor that contributes for the success hRSV replication is the immune system evasion, process wich Non-Structural Protein 1 (NS1) is involved. This protein can act by inhibiting or neutralizing steps of interferon type I pathway, as well as, by silencing the ribonucleoproteic complex of hRSV. The knowledge of NS1 protein interaction with ligands is important in the search for molecules that could interfere with protein function and hence result in a reduction of hRSV replication among them the flavonoids have been reported to be effective in suppressing viral replication. The aim of this study includes expression and purification of NS1 protein, characterization of its secondary structure and thermal stability through circular dicroism and perform fluorescence spectroscopy interaction study between NS1 and Quercetin. NS1 purification was performed using affinity resin coupled to a liquid cromatograph ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). Circular dicroism spectra and thermal denaturation were carried out to investigate NS1 secondary structure and stability. Through fluorescence spectroscopy titration results it has been calculated the Stern Volmer constant (Ksv), the binding (Kb) constant and number of ligands per site (n). CD analysis shown that secondary structure composition of NS1 is 75% alpha-helix; 3% beta-sheet; 10% turn and 12% others and, melting temperature of NS1 is around 65°C. Fluorescence results shown that Ksv and Kb were in order of 104 and 105-106M-1, respectively. Ksv dependence with temperature indicates that the interaction between NS1 and quercetin is dynamic. The results suggest that this interaction may potentially contribute to block the xiii protein function and thus quercetin may ... / FAPESP: 2010/50211-0
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Pirossequenciamento de alta cobertura da região hipervariável 1 do Vírus da Hepatite C / Hepatitis C Virus Quasispecies Analysis Using Ultra-Deep PyrosequencingYamasaki, Lílian Hiromi Tomonari [UNESP] 30 April 2014 (has links) (PDF)
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000808994.pdf: 1388656 bytes, checksum: ff666b142c12af73f1f96183ae305879 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Embora novos medicamentos de ação direta anti-HCV tenham sido recentemente aprovados no mercado, com exceção do genótipo 1, a terapia mais utilizada ainda é baseada em Interferon (IFN) e Ribavirina. Desta forma, o genótipo 3 é o que apresenta mais baixa taxa de sucesso no tratamento, no atual cenário. Um dos fatores determinantes do insucesso deste tratamento no paciente é a variabilidade viral. O HCV apresenta alta taxa de mutação durante a replicação, implicando na produção de variantes intra-hospedeiro, denominadas quasispecies. A região hipervariável 1 (HVR1) da proteína do envelope é uma região de alta variabilidade do genoma viral. A detecção das quasispecies minoritárias pode ser realizada de forma confiável e eficiente por pirossequenciamento de alta cobertura (UPDS), técnica capaz de detectar variantes presentes em frequência <1% na população. Com base neste contexto, foram determinados quasispecies da HVR1-HCV de 14 pacientes infectados com o genótipo 3 do vírus, utilizando a técnica de UPDS. No total, 64.400 sequencias da HVR1 foram obtidas de amostras pré-tratamento. Destas, 27.398 sequências de alta qualidade foram filtradas e corrigidas. Valores de distância genética e entropia de Shannon não foram correlacionados a resposta ao tratamento. Estas sequências foram posteriormente submetidas a construção de redes median-joining e análise Bayesiana de estrutura populacional (BAPS). A análise identificou amostras com diferentes estruturas, desde altamente conservadas (apenas uma população de quasispecies) até altamente estratificadas (6 subpopulações). Este resultado foi condizente com a estrutura das redes median-joining. Várias mutações ao longo da HVR1 do mesmo paciente e algumas repetiram em pacientes do mesmo grupo de resposta. Quanto a avaliação de análise das sequências de aminoácidos, embora haja grande variação quanto a sequência e propriedades físico-químicas, pode-se ... / Hepatitis C is a major public health problem. New HCV antiviral drugs were released on market on 2010; however, excluding for genotype 1, the most used therapy used currently is still based on Interferon (IFN) and Ribavirin. Nowadays, genotype 3 is the one with the highest rate of treatment failure. Viral genome variability is one of the factors that lead in therapy failure. HCV presents a high mutability during replication course, implicating in arising of intra-host variants called quasispecies. The hypervariable region 1 (HVR1) from envelope protein presents as quasispecies and may be related to IFN therapy resistance. Resistant quasispecies may not represent majority of variants population in the host, therefore, in these cases traditional sequencing techniques are unable to detect. For detection of minority quasispecies, ultra-deep pyrosequencing (UPDS) is a reliable and efficient tool, being able to detect even variants with frequency <1% in the population. Regarding this issue, we determined HVR1 quasispecies from 14 patients infected with HCV genotype 3 using the UPDS approach. In total, 64,400 HVR1 sequences were obtained from pre-therapy sample. From these sequences, 27,398 ones with high quality were filtered. Genetic distance and Shannon entropy values were not related to therapy outcome. These sequences were analyzed using median-joining networks and Bayesian population structural analysis. These analysis identified samples with different structures, from high conserved (one sub-population) to high stratified ones (6 sub-populations). Networks analysis also confirmed this result. Mutations exclusive for a type of response of therapy were identified along HVR1. Amino acid sequences indicated that this region presents conserved structure, even if sequence and physical and chemicals properties seem flexible. Especially in turns and coils positions, this conservation seems notable. Potential epitopes positions are concentrated ...
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Análise da variabilidade genética e expressão de HPV em papilomatose de laringeBonfim, Caroline Measso do [UNESP] 07 March 2014 (has links) (PDF)
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000811503_20160307.pdf: 224941 bytes, checksum: 0f2f860ed1d045cc0cf630d167f85703 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-07T11:06:09Z: 000811503_20160307.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T11:07:03Z : No. of bitstreams: 1
000811503.pdf: 508154 bytes, checksum: 8b96a194847aef41b3eb5e7279600c50 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A papilomatose respiratória recorrente (PRR) é uma doença caracterizada pela formação de papilomas benignos no trato respiratório superior. A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é a principal causa da doença, principalmente os tipos 6 e 11, que são considerados de baixo risco oncogênico. A região promotora LCR (long control region) contêm elementos cis-reguladores para fatores transcricionais (FTs) celulares e virais que controlam a expressão gênica precoce e a replicação viral. Alterações nucleotídicas dentro da LCR podem sobrepor sítios de ligação de FTs e influenciar a afinidade de ligação, a atividade transcricional e o curso clínico das doenças associadas á infecções por HPV. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar as variantes moleculares de HPV entre os indivíduos com diagnóstico de PRR e analisar o impacto da variabilidade nucleotídica da LCR sob a transcrição viral. O sequenciamento da LCR de amostras HPV-6 positivas revelou cinco variantes genômicas não descritas anteriormente. Por meio de análise computacional, observou-se que as alterações nucleotídicas detectadas sobrepõem potenciais sítios de ligação para alguns fatores de transcrição. A variante HPV-6vc foi a mais prevalente dentre as amostras analisadas (69,2%), sendo mais prevalente nos casos de papilomatose juvenil. Com relação à atividade transcricional, a variante HPV-6vc é mais ativa que a variante molecular HPV-6a. Além disso, observou-se que outras alterações observadas influenciaram na atividade transcricional que foi indiretamente medida por ensaios de luciferase. Vale ressaltar que este é o primeiro trabalho que descreve as diferenças de atividade do promotor entre variantes naturais de HPV-6. Esta pesquisa é de extrema relevância, pois fornece informações importantes sobre a função biológica de variabilidade genômica intratípica de HPV-6 / Recurrent respiratory papillomatosis (RRP) is a disease characterized by the formation of benign papillomas in the upper respiratory tract. Human Papillomavirus infection (HPV) is the main cause of the disease, particularly types 6 and 11 which are considered low-risk oncogenic HPV. The promoter region LCR (Long Control Region) contains cis-regulatory elements for cellular and viral transcription factors (TF) that control viral early gene expression and replication. Nucleotide alterations within the LCR may overlap TFs elements and impact upon the binding affinity, the transcriptional activity and ultimately on the clinical outcome associated to HPV infections. Our aim was to characterize molecular variants of HPV among individuals diagnosed with RRP and to analyze the impact of LCR nucleotide divergence upon viral early transcription. LCR sequencing of the HPV-6 positive samples revealed five genomic variants not previously described. Through computational analysis, we found that nucleotide changes detected overlapps potential binding sites for several transcription factors. HPV-6vc-related variant was the most prevalent among the samples analyzed (69.2%) and more prevalent in cases of juvenile papillomatosis. Concerning transcriptional activity, HPV-6vc-related variant is more active than HPV-6a molecular variant. Further, we observed that other alterations observed strongly impacts transcriptional activity indirectly measured by luciferase assays. To our knowledge, this is the first report describing differences in promoter activity among naturally occurring variants of HPV-6. Research in this area is anticipated to provide important information concerning the biological significance of HPV-6 intratype genomic variability
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Inibição do vírus da hepatite C utilizando siRNAs direcionados para o genoma viral e proteínas celulares HspsBraga, Ana Cláudia Silva [UNESP] 23 August 2013 (has links) (PDF)
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000723028_20150823.pdf: 1028906 bytes, checksum: 197bceaec267086e9658eb5a35574fe1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-24T10:46:34Z: 000723028_20150823.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-24T10:47:09Z : No. of bitstreams: 1
000723028.pdf: 1485800 bytes, checksum: aaac9adf54c11e7df2321502f879e475 (MD5) / A hepatite C é consequência da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas. Estudos têm demonstrado interações entre proteínas virais e do hospedeiro durante o ciclo de replicação do HCV e estas interações podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas terapias contra a hepatite C. As proteínas de choque térmico (Hsp) são proteínas celulares que interagem com proteínas do HCV e a inibição destas proteínas poderiam reduzir a replicação viral. Neste estudo, as proteínas celulares Hsp90 e Hsp27 foram inibidas por siRNA isoladamente ou em combinação com a inibição das regiões virais 5'UTR, NS3 e NS5A. Foi utilizada uma cultura celular estável Huh7 expressando um replicon subgenomico do HCV e todas as moléculas de siRNA dirigidas ao genoma do vírus mostraram eficiência na redução da replicação viral. A melhor resposta foi obtida pelo siRNA 5'UTR, que apresentou bons resultados também nos estudos à longo prazo. A inibição da proteína celular Hsp27 aumentou os níveis de replicação do vírus, entretanto a supressão de Hsp90 mostrou redução da replicação viral e a utilização desta molécula juntamente com a molécula de siRNA dirigida para 5'UTR mostraram uma diminuição de mais de 90% da replicação viral. Entretanto a inibição prolongada de Hsp90 levou à morte celular, evidenciando o importante papel desta proteína na sobrevivência das células. Portanto o presente trabalho sugere que a terapia combinada de siRNAs pode ser uma alternativa eficiente no combate à hepatite C em pacientes com HCC uma vez que a inibição de Hsp90 atua tanto na supressão tumoral quanto na replicação do HCV / Hepatitis C is a consequence of infection by hepatitis C virus (HCV) and it is estimated that approximately 150 million people are chronically infected worldwide. Several studies have demonstrated interactions between viral and host proteins during the HCV replication cycle and these interactions might be used for development of new therapies against hepatitis C. The heat shock proteins (Hsp) are cellular proteins that interact with proteins of HCV and inhibition of these proteins could reduce viral replication. In this study, cellular proteins Hsp90 and Hsp27 were inhibited by siRNA targeting the mRNA of these proteins in combination with siRNA to viral 5'UTR region, NS3 and NS5A. We used a stable cell line expressing HCV subgenomic replicon and all siRNA molecules targeting the viral genome showed effectiveness in reducing viral replication. The best response was achieved by siRNA 5'UTR, which showed good results on long term studies. The inhibition of cellular protein Hsp27 increased virus replication, but knockdown of Hsp90 showed reduced viral replication. Use of this molecule together with the siRNA molecule directed to 5'UTR showed a decrease of more than 90% viral replication. However, the prolonged inhibition of Hsp90 led to cell death, demonstrating the important role of this protein in cell survival. Finally this work suggests that the combination therapy of siRNAs can be an effective alternative to treat hepatitis C in patients with HCC since reduction of Hsp90 expression if effective on tumor suppression and in HCV replication
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Avaliação in vitro do efeito da cafeína na inibição do vírus da Hepatite CBatista, Mariana Nogueira [UNESP] 04 August 2014 (has links) (PDF)
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000791002_20160804.pdf: 831737 bytes, checksum: 6d599cf0a39dfb64c011d1df5972e520 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-05T12:20:23Z: 000791002_20160804.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-05T12:20:58Z : No. of bitstreams: 1
000791002.pdf: 2689653 bytes, checksum: be72cf076309570a9dea496746ea9be2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A hepatite C é a inflamação do fígado decorrente da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), frequentemente evolui para quadros crônicos, sendo considerada mundialmente a maior causa de cirrose e carcinoma hepatocelular. O tratamento padrão com PEG-IFN e ribavirina não é efetivo contra alguns genótipos do HCV, possui alto custo e efeitos colaterais severos. Portanto, novos tratamentos vêm sendo buscados. A cafeína vem sendo associada a um efeito benéfico sobre várias doenças hepáticas incluindo a melhora da bioquímica anormal do fígado, cirrose e carcinoma hepatocelular. A cafeína atua diretamente desacelerando a progressão da fibrose, além de melhorar a função de vias celulares hepáticas, dentre elas vias utilizadas durante o ciclo replicativo do HCV. Embora a cafeína tenha demonstrado efetividade no controle de doenças hepáticas e interação direta com vias celulares utilizadas pelo HCV, não há na literatura correlação direta entre o efeito da cafeína e as etapas do ciclo replicativo do HCV. Assim, o presente estudo propôs estabelecer a relação direta entre a cafeína e sua capacidade inibitória sobre as diferentes etapas do ciclo replicativo completo do HCV. Para esse estudo foram utilizados o replicon subgenômico SGR-JFH-FEO, os replicons completos FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi e JFH-1 e a linhagem celular Huh-7.5. A expressão viral foi avaliada por ensaios de Luciferase, Western Blotting, Imunofluorescencia indireta e qPCR. A cafeína demonstrou inibição da replicação viral em todos os níveis avaliados, apresentando IC50 de 0.7263 mM e atingindo em concentrações seguras, inibição máxima da replicação de HCVcc em torno de 79 %. A cafeína demonstrou ainda inibição de 30 % sobre a entrada quando aplicada em conjunto ao sobrenadante infeccioso. Entretanto, essa inibição dobra quando há a exposição das partículas à cafeína previamente à introdução em cultura de células, ... / Hepatitis C is the liver inflammation arising from hepatitis C virus (HCV) infection, often evolves to chronic conditions and has been considered the major world cause of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Standard treatment using PEG-IFN and ribavirin is not effective against some HCV genotypes, besides that it has high cost and severe side-effects. Therefore, new treatments have been sought. Caffeine has been found to have beneficial effect in several liver disorders, including the improvement of abnormal liver biochemistry, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Caffeine acts directly by delaying fibrosis, beyond improving the function of liver cellular pathways and interfering with pathways used by the HCV replication cycle. Although, the caffeine showed positive effects for liver disorders and a direct interaction with cell pathways used by HCV, there is no evidence of a direct correlation between caffeine and HCV replication cycle. Thus, the current study proposed to establish the direct relationship between caffeine and different steps of HCV replication cycle. To this study, it was used the subgenomic replicon SGR-JFH-FEO, the full-length replicons FL-J6/JFH-5′C19Rluc2AUbi and JFH-1; and Huh-7.5 cell line. The viral expression was evaluated by Luciferase, Western blotting, Indirect immunofluorescence and qPCR. The caffeine demonstrated to be able to inhibit viral replication on different stages of viral replication, demonstrating an IC50 value of 0.7263 mM and reaching on safe concentrations, HCVcc maximal replication inhibition around 79 %. Caffeine demonstrated also 30 % of inhibition on viral entry on host cells when tested in combination with infectious supernatant. Moreover, this inhibition increased two fold when particles were exposed to caffeine before introduction on cell culture, possibly, indicating an interaction between caffeine and viral proteins. On the other hand, there is no influence of caffeine on viral ...
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