Resumo: A parvovirose canina, uma das principais doenças infecto-contagiosas que acomete cães, é causada pelo Parvovírus canino-2 (CPV-2). Desde sua '" escrição importantes mutações ocorreram originando três tipos: CPV-2a e 2b, comumente detectados no Brasil, e o CPV-2c. Essas alterações antígênicas caracterizam o CPV como um dos principais modelos de evolução viral, sendo etectáveis com painéis de anticorpos monoclonais em técnicas simples como hemaglutinação e neutralização in vitro. A tecnologia de apresentação de :J oteínas em bacteriófagos (Phage display) tem diversas aplicações, dentre elas a apresentação de fragmentos recombinantes de anticorpos funcionais scFv), que podem ser produzidos em grande quantidade. Este trabalho utilizou Phage Display para expressar fragmentos scFv contra o CPV-2 , com uma etodologia descrita (Krebber, 1997). Após o cultivo e purificação do vírus, camundongos da linhagem High seleção IV A foram imunizados com o CPV-2 , sendo em seguida extraído RNA total do baço. A amplificação das cadeias leve e pesada, e sua ligação por SOE-PCR, permitiu a clonagem do scFv no fagomídeo pAK 100. Após a transformação da E.coli XL-1 blue, bacteriófagos 13 foram expressos apresentando o fragmento scFv. Três processos de seleção foram realizados, e após '0 Phage-ELlSA, um grupo de fagos foi selecionado. A partir deste um screening foi realizado por PCR sendo dois lones detectados. Após nova expressão de ambos uma nova reação de Phage-ELlSA foi realizada e demonstrou a especificidade destes clones com o CPV-2. Até o presente momento esta é a primeira descrição da técnica de Phage display apresentando fragmentos de anticorpo anti-CPV-2. / Abstract: Canine parvoviral disease, one of the most common infectious disorders of dogs, is caused by canine parvovirus (CPV-2). Several mutations have accurred since it was described in the late 1970s, originating three antigenic pes: CPV-2a and 2b, most commonly found in Brazil, and the CPV-2c. These tigenic differences characterize CPV-2 as an important model of virus evolution, and could be detected by monoclonal antibody panel in hemmaglutination and in vitro neutralization. Phage display has many a plications and have been used displaying functional antibodies fragments scFv) , which can be produced in large amount. The technology described here :: the expression of antibody recombinant fragments - scFv - against CPV-2, the methodology previously described (Krebber, 1997). After cultivation and purification of virus, High IV A mice were immunized with CPV-2, total RNA s extracted from spleen cells. Light and heavy chains were amplified, and en linked by SOE-PC R; and the product was cloned into a phagemid (pAK ). After the transformation on E. coli XL-1 blue, M13 bacteriophages were - ressed presenting the scFv fragment. Series of 3 rounds of panning was ied out, and after a Phage-ELlSA a group of phage was selected. A PCR - eening was conducted and two clones detected. After new expression a age-ELlSA was performed and demonstrated the specificity of these clones against the CPV-2. Until the moment this is the first description of the use of the :J age display, producing antibody fragments against CPV-2. - / Orientador: João Pessoa Araújo Junior / Coorientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Ramon Kaneno / Banca: Alice A. F. Alfieri / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Alexandre S. Borges / Doutor

Os vírus entéricos causam infecções que podem ocasionar uma alta morbidade e mortalidade em cães. A diarreia se destaca como o principal sinal clínico e a subsequente desidratação pode causar a morte do animal. O Carnivore protoparvovirus 1 (CPV-2), Canine mastadenovirus A tipo 1 (CAdV-1), o Canine coronavirus (CCoV), o Canine rotavirus (CRV) e o Canine distemper virus (CDV) são considerados os principais agentes que causam gastroenterite viral aguda em cães jovens. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença destas cinco espécies virais na população de cães do Brasil. Para isto, foram coletados 325 suabes retais de cães com ou sem diarreia, jovens (> 6 meses) e adultos (< 6 meses), com ou sem histórico de vacinação e de diversas regiões do Brasil. As amostras foram analisadas através da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou transcrição reversa seguida de PCR (RT-PCR) utilizando iniciadores específicos para cada um dos agentes virais. Resultaram 81% (264/325) das amostras positivas para um destes vírus, das quais 30,7% (100/325) foram positivas para o CPV-2, 25,5% (83/325) para o CDV, 17,2% (56/325) para o CCoV, 4,6% (15/325) para o CRV e 2,7% (9/ 325) para o CAdV-1. Algumas amostras apresentaram co-infecções, sendo que as espécies mais predominantemente encontradas em co-infecções foram o CDV e CPV-2 em 15,4% (50/325) e 15,0% (49/325), respectivamente, seguidos do CCoV em 10,1% (33/325,), CRV em 3,0% (10/325) e CAdV-1 em 1,5% (5/325) das amostras. A associação viral mais observada foi CDV e CPV-2 em 31/325 (9,5%) amostras positivas para ambos os vírus. Em conclusão, os resultados demonstram que CPV-2, CDV e CCoV são os principais vírus entéricos patogênicos que circularam no Brasil entre os anos de 2008 e 2014, infectando mais frequentemente animais jovens. / Enteric viruses cause infections that lead to high morbidity and mortality. Diarrhea is the main clinical sign, whose subsequent dehydration can cause death of the animal. Carnivore protoparvovirus 1 (CPV-2), Canine mastadenovirus A (CAdV-1), Canine coronavirus (CCoV), Canine rotavirus (CRV) and Canine distemper virus (CDV) are considered the main agents that cause acute viral gastroenteritis in young dogs. The aim of this study was the detection of these five viral species in dogs from Brazil. Rectal swabs from 325 dogs, puppies (< six months old), adult dogs (> 6 months old), with or without a history of vaccination, were collected from various regions of the country. The samples were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) or reverse transcription following followed by PCR (RT-PCR) using oligonucleotides specific for each one of this virus. As result, 81% (264/325) of the samples were observed to be positive for at least one virus, 30,7% (100/325) were positive for CPV-2, 25,5% (83/325) for CDV, 17,2% (56/325) for CCoV, 4,6% (14/325) for CRV and 2,7% (9/325) for CAdV-1. Some samples showed co-infection, where the species most predominantly found were CDV and CPV-2 with 15,4% (50/325) and 15,0% (49/325), respectively, followed by CCoV with 10,1% (33/325,), CRV with 3,0% (10/325) and CAdV-1 1,5% (5/325). The most observed viral association was CDV and CPV-2, with 31/325 (9,5%) positive samples for both viruses. In conclusion, the results showed that CPV-2, CDV and CCoV are the main pathogenic enteric viruses that circulated in Brazil between the years 2008 and 2014, infecting more frequently puppies.

Vacinas inativadas de vírus inteiro (WIV) são amplamente utilizadas para o controle de influenza A em suínos (SIV) nos Estados Unidos e Europa e conferem proteção contra cepas homólogas à vacina reduzindo a doença clínica. Porém, a proteção da WIV pode ser limitada contra um desafio heterólogo. O aumento da doença respiratória associado à vacina (VAERD) foi descrito em suínos vacinados com uma WIV contendo uma cepa δ1-cluster-H1N2 e desafiado com uma cepa heteróloga contendo a mesma hemaglutinina, H1N1pdm09. Nesse contexto, os suínos apresentaram pneumonia severa com aumento das lesões pulmonares associado ao uso da WIV. No primeiro manuscrito foi avaliado se a formulação da WIV, o tempo entre o reforço vacinal e o desafio, e a idade de vacinação tinham impacto em VAERD. Suínos foram vacinados com duas vacinas bivalentes, WIV-δ1H1N2/H3N2 (MN08-TX98) ou WIV-δ1H1N2/H1N1pdm09 (MN08-CA09), administradas em duas doses com intervalo de três semanas, e desfiados com H1N1pdm09, três semanas após o reforço. Além disso, dois grupos foram vacinados com uma WIV-δ1H1N2 (MN08) e desafiados três ou seis semanas após o reforço. Em um estudo subsequente, dois grupos vacinados com uma WIV-δ1H1N2 com duas doses da vacina em diferentes idades: a primeira dose com 4 ou 9 semanas de idade e o reforço com 7 ou 12 semanas de idade. E um grupo vacinado com uma vacina viva atenuada de influenza (LAIV). Os animais foram desafiados com H1N1pdm09 às 15 semanas de idade. Com exceção dos grupos MN08-CA09, LAIV e controles, todos os grupos WIV apresentaram lesões pulmonares consistentes com VAERD. Nenhum grupo induziu anticorpos neutralizantes para o H1N1pdm09, exceto MN08-CA09. No entanto, grupos vacinados com a WIV-MN08 em diferentes idades induziram anticorpos IgG não-neutralizantes com reatividade cruzada com o H1N1pdm09 no soro e no pulmão, comparado com LAIV e controles. Esses dados sugerem que a idade da primeira dose da vacina, a formulação com a vacina bivalente MN08-TX98 e o desafio seis semanas após o reforço vacinal, não preveniram o desenvolvimento de VAERD. Em contraste, a vacinação com a LAIV demonstrou proteção até oito semanas após reforço. No segundo manuscrito foi avaliado o impacto dos adjuvantes na formulação da WIV no modelo de VAERD. Cinco grupos foram vacinados com WIV-δ1H1N2 formuladas com diferentes adjuvantes comerciais: óleo em água 1 (OW1), OW2, nano-emulsão (NE), gel polímero (GP) e partículas imuno-estimulantes aquosa (IMP). O protocolo vacinal/desafio foi utilizado com três semanas de intervalo entre as doses. Os grupos vacinados com WIV-OW apresentaram lesões macroscópicas nos pulmões consistentes com VAERD comparado com WIV-NE, WIV-GP e controles. Nenhum dos grupos induziu anticorpos neutralizantes contra o vírus do desafio (H1N1pdm09). Similarmente, os grupos WIV-OW, WIV-NE e WIV-GP induziram anticorpos não neutralizantes IgG de reatividade cruzada contra o H1N1pdm09 no soro e pulmão. Apesar dos anticorpos não neutralizantes com reatividade cruzada nos grupos WIV-NE e WIV-GP, não apresentaram lesões pulmonares tão severas como os grupos OW. Além disso, os adjuvantes tiveram um papel significativo na imunogenicidade da WIV e no desenvolvimento de VAERD. / Whole inactivated virus (WIV) vaccines reduce clinical disease against homologous influenza A virus (IAV) infection and are widely used in swine; however, WIV has been associated with vaccine-associated enhanced respiratory disease (VAERD) when challenged with heterologous IAV of the same hemagglutinin subtype. Here, we evaluated the impact of age at vaccination and timing between vaccination and challenge on development of VAERD using a model with a human-like 1δ cluster swine MN08 H1N2 as the vaccine component and pandemic H1N1 (H1N1pdm09) virus as the challenge strain. Pigs were vaccinated with bivalent WIV vaccine containing H1N2-MN08/H3N2-TX98 or H1N2-MN08/H1N1pdm09-CA09. All groups were challenged with H1N1pdm09 at 3 weeks post-boost (wpb). In addition, a monovalent WIV MN08 H1N2 group was challenged at 6 wpb to determine if time post-vaccination played a role on VAERD. In a follow up study, we compared the time of first WIV vaccination (4 or 9 weeks of age) and the boost three weeks later (7 or 12 weeks of age) to determine if age at first vaccination or if 8 weeks duration between vaccination and challenge impacted VAERD. A live-attenuated influenza virus (LAIV) vaccine administered at 4 and 7 weeks of age was also included. Pigs from study 2 were challenged with H1N1pdm09 at 15 weeks of age. All mismatched WIV groups had significantly higher macroscopic and microscopic lung lesions compared with LAIV, bivalent MN08-CA09 and non-vaccinated challenge controls. These data suggest that the age of first vaccination or length of time between booster dose and subsequent challenge do not alter the development VAERD in WIV vaccinated pigs. In the second paper, we evaluated the impact of adjuvant in WIV vaccine on VAERD-affected pigs. Pigs were vaccinated with WIV containing swine MN08/H1N2 that were formulated with five different commercially available adjuvants: OW1, OW2, nano-emulsion (NE), gel polymer (GP), and aqueous immunostimulating particulate (IMP). Pigs were vaccinated with 2 doses, 3 weeks apart, by the intramuscular (WIV-OW1, -OW2, -NE, and -GP) or intranasal (WIV-IMP) routes. Non-vaccinated and challenged pigs (NV/C) and non-vaccinated, non-challenged pigs (NV/NC) were included as controls. Following challenge with H1N1pdm09, WIV-OW1 and WIV-OW2 groups had significantly higher percentages of macroscopic lung lesions consistent with VAERD compared to the NV/C controls, and in contrast to WIV-NE, WIV-GP and WIV-IMP. Prior to challenge, WIV-OW, NE and GP groups had the hemagglutination inhibition antibody (HI) titers to the vaccine strain compared with controls. The WIV-IMP group had HI mean titers below the positive cut-off, with no response to any immune parameter measured, so it could not be implicated or excluded in the VAERD model. None of the groups had cross-reactive HI antibodies against the H1N1pdm09. WIV-OW groups had significantly higher levels of IgG antibody in serum against homologous and heterologous virus; however, the WIV-NE and WIV-GP groups also had serum IgG antibody against both viruses, so presence of total virus IgG alone did not explain the different VAERD outcomes. Adjuvant played a significant role in WIV immunogenicity and in VAERD; however the mechanism requires further investigation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências de Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2012-10-24T14:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 264862.pdf: 673171 bytes, checksum: 465b6592bdc19192f21c5f94b4c96e32 (MD5) / As infecções pelo vírus da hepatite B (HBV) e pelo vírus da hepatite C (HCV) são problemas mundiais de saúde pública. Este trabalho objetivou estabelecer a prevalência dos marcadores de imunidade e infecção pelo HBV e de infecção pelo HCV em adolescentes do município de Blumenau, Santa Catarina, além de avaliar o conhecimento sobre as hepatites B e C e verificar a prática de atividades que aumentam o risco de infecção pelo HBV e HCV. Foi realizado um estudo com 393 adolescentes com idade entre 10 e 15 anos atendidos em Postos de Saúde do município de Blumenau. Os dados foram obtidos através da realização de testes sorológicos e aplicação de questionários. Dentre os participantes, 53,44% eram do sexo feminino e 46,56% do masculino. A soropositividade do anti-HCV foi de 0%, do HBsAg de 0,76%, do anti-HBc de 1,02% e do anti-HBs de 89,57%. Títulos de anti-HBs abaixo de 10 UI/L foram verificados em 50,38% dos participantes. A maioria dos adolescentes (83,21%) demonstrou conhecimento sobre a vacina preventiva contra a hepatite B. Pouco mais da metade dos participantes (55,47%) acreditam que a contaminação pelo HBV e HCV ocorra pelo contato com sangue ou secreções de uma pessoa infectada, e 23,48% desconhecem as formas de transmissão. Quase 40% dos adolescentes já estiveram internados em hospital, sendo que destes 5 (1,3% do total de participantes) receberam sangue por transfusão e 3,3% possuem body piercing e/ou tatuagem. O nível de conhecimento sobre as hepatites B e C na população estudada revelou a necessidade de intensificação das atividades educativas e a importância de uma política de educação em saúde voltada para os adolescentes. Hepatitis B virus and hepatitis C virus infections are global public health problems. This study aimed to establish the prevalence of HBV immunity and infection markers and HCV infection maker in adolescents of Blumenau, Santa Catarina, as well as to evaluate the knowledge on hepatitis B and C and verifying the practice of activities that increase the risk of HBV and HCV infection. The study was conduced with 393 adolescents between 10 and 15 years, taken care in public health institutions of Blumenau. Data were obtained by means of serological tests and application of questionnaires. Of the participants, 53.4% were female and 46.6% were males. The seropositivity for anti-HCV was 0%, for HBsAg was 0.76%, for anti-HBc was 1.02% and for anti-HBs was 89.57%. Levels for anti-HBs below 10 IU/L were found in 50.38% of the participants. Most adolescents (83.21%) have knowledge of the preventive vaccine against hepatitis B. More than half of the participants (55.47%) believe that the contamination for HBV and HCV occurs by the contact with blood or secretions of an infected person, and 23.48% are unaware of the transmission forms. Almost 40% of adolescents have been admitted to hospital, of which 5 (1.3% of the total of participants) received blood transfusion and 3.3% have body piercing and/or tattooing. The level of knowledge on hepatitis B and C in the studied population shows the necessity for intensification of the educative activities and the importance of health education for adolescents.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Laura Sichero / Banca: Enrique Mário Boccardo Pierulivo / Banca: Márcia Guimarães da Silva / Banca: Alessandra Vidotto / Banca: Cíntia Bittar / Resumo: A papilomatose respiratória recorrente (PRR) é uma doença caracterizada pela formação de papilomas benignos no trato respiratório superior. A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é a principal causa da doença, principalmente os tipos 6 e 11, que são considerados de baixo risco oncogênico. A região promotora LCR (long control region) contêm elementos cis-reguladores para fatores transcricionais (FTs) celulares e virais que controlam a expressão gênica precoce e a replicação viral. Alterações nucleotídicas dentro da LCR podem sobrepor sítios de ligação de FTs e influenciar a afinidade de ligação, a atividade transcricional e o curso clínico das doenças associadas á infecções por HPV. Os objetivos deste trabalho foram caracterizar as variantes moleculares de HPV entre os indivíduos com diagnóstico de PRR e analisar o impacto da variabilidade nucleotídica da LCR sob a transcrição viral. O sequenciamento da LCR de amostras HPV-6 positivas revelou cinco variantes genômicas não descritas anteriormente. Por meio de análise computacional, observou-se que as alterações nucleotídicas detectadas sobrepõem potenciais sítios de ligação para alguns fatores de transcrição. A variante HPV-6vc foi a mais prevalente dentre as amostras analisadas (69,2%), sendo mais prevalente nos casos de papilomatose juvenil. Com relação à atividade transcricional, a variante HPV-6vc é mais ativa que a variante molecular HPV-6a. Além disso, observou-se que outras alterações observadas influenciaram na atividade transcricional que foi indiretamente medida por ensaios de luciferase. Vale ressaltar que este é o primeiro trabalho que descreve as diferenças de atividade do promotor entre variantes naturais de HPV-6. Esta pesquisa é de extrema relevância, pois fornece informações importantes sobre a função biológica de variabilidade genômica intratípica de HPV-6 / Abstract: Recurrent respiratory papillomatosis (RRP) is a disease characterized by the formation of benign papillomas in the upper respiratory tract. Human Papillomavirus infection (HPV) is the main cause of the disease, particularly types 6 and 11 which are considered low-risk oncogenic HPV. The promoter region LCR (Long Control Region) contains cis-regulatory elements for cellular and viral transcription factors (TF) that control viral early gene expression and replication. Nucleotide alterations within the LCR may overlap TFs elements and impact upon the binding affinity, the transcriptional activity and ultimately on the clinical outcome associated to HPV infections. Our aim was to characterize molecular variants of HPV among individuals diagnosed with RRP and to analyze the impact of LCR nucleotide divergence upon viral early transcription. LCR sequencing of the HPV-6 positive samples revealed five genomic variants not previously described. Through computational analysis, we found that nucleotide changes detected overlapps potential binding sites for several transcription factors. HPV-6vc-related variant was the most prevalent among the samples analyzed (69.2%) and more prevalent in cases of juvenile papillomatosis. Concerning transcriptional activity, HPV-6vc-related variant is more active than HPV-6a molecular variant. Further, we observed that other alterations observed strongly impacts transcriptional activity indirectly measured by luciferase assays. To our knowledge, this is the first report describing differences in promoter activity among naturally occurring variants of HPV-6. Research in this area is anticipated to provide important information concerning the biological significance of HPV-6 intratype genomic variability / Doutor

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Coorientador: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Flavio Augusto Vicente Seixas / Banca: Fernanda Canduri / Banca: Karina Alves de Toledo / Banca: Fernando Alves de Melo / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV) é a principal causa de infecções respiratórias agudas em crianças, como bronquiolite e pneumonia. Este Paramyxovirus tem um RNA de fita simples, com 10 genes que codificam 11 proteínas. Um fator importante que contribui para o sucesso da replicação do hRSV é a evasão do sistema imune, processo no qual a proteína não estrutural 1 (NS1) está envolvida. Esta proteína pode atuar por meio da inibição ou neutralização das etapas da cascata do interferon do tipo I, bem como, pelo silenciamento do complexo ribonucleoproteico do hRSV. O conhecimento da interação da proteína NS1 com ligantes é importante na busca de moléculas que possam interferir na função da proteína e consequentemente resultar na redução da replicação do hRSV dentre os quais os flavonóides têm sido descritos como sendo supressores eficazes da replicação viral. Os objetivos deste estudo incluíram a expressão e purificação da proteína NS1, a caracterização da estrutura secundária e estabilidade térmica por dicroísmo circular e a realização do estudo de interação entre NS1 e quercetina por espectroscopia de fluorescência. Foi realizada a purificação da proteína NS1 em resina de afinidade utilizando cromatógrafo líquido ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). As medidas de dicroísmo circular (CD) permitiram calcular a porcentagem de estruturas secundárias e a temperatura de melting da NS1. A partir das análises das titulações por fluorescência foram calculados a constante de Stern Volmer (Ksv), a constante de ligação (Kb) e o número de ligantes por sítio (n). Os resultados de CD mostraram que a composição da estrutura secundária de NS1 é de 75 % de alfa-hélice, 3% de folha-beta, 10% de voltas e 12% de outras estruturas e a temperatura de melting da NS1 é de cerca de 65°C. Os resultados de fluorescência mostraram que Ksv e Kb foram da ordem de 104 e 105-106M-1, ... / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major cause of acute respiratory infections in children, like bronchiolitis and pneumonia. This Paramyxovirus has a single strand RNA with 10 genes that codify 11 proteins. An important factor that contributes for the success hRSV replication is the immune system evasion, process wich Non-Structural Protein 1 (NS1) is involved. This protein can act by inhibiting or neutralizing steps of interferon type I pathway, as well as, by silencing the ribonucleoproteic complex of hRSV. The knowledge of NS1 protein interaction with ligands is important in the search for molecules that could interfere with protein function and hence result in a reduction of hRSV replication among them the flavonoids have been reported to be effective in suppressing viral replication. The aim of this study includes expression and purification of NS1 protein, characterization of its secondary structure and thermal stability through circular dicroism and perform fluorescence spectroscopy interaction study between NS1 and Quercetin. NS1 purification was performed using affinity resin coupled to a liquid cromatograph ÄKTA (GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES). Circular dicroism spectra and thermal denaturation were carried out to investigate NS1 secondary structure and stability. Through fluorescence spectroscopy titration results it has been calculated the Stern Volmer constant (Ksv), the binding (Kb) constant and number of ligands per site (n). CD analysis shown that secondary structure composition of NS1 is 75% alpha-helix; 3% beta-sheet; 10% turn and 12% others and, melting temperature of NS1 is around 65°C. Fluorescence results shown that Ksv and Kb were in order of 104 and 105-106M-1, respectively. Ksv dependence with temperature indicates that the interaction between NS1 and quercetin is dynamic. The results suggest that this interaction may potentially contribute to block the xiii protein function and thus quercetin may ... / Doutor

Esta tese compreende estudos sobre diagnóstico, caracterização antigênica e molecular de amostras do vírus da raiva e sobre o desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o vírus rábico. O primeiro capítulo descreve dois casos de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro trabalho do primeiro capítulo descreve a ocorrência de raiva em um canino no município de Tapes, leste do RS. Após a confirmação do diagnóstico, a amostra de vírus isolada foi submetida à caracterização antigênica e molecular. Tal amostra apresentava características compatíveis com amostras de vírus rábico isoladas de morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis. Portanto, o primeiro caso de raiva canina no RS após 19 anos, ocorreu devido a um contato incidental entre um morcego não hematófago e o canino infectado. Assim, o status de região livre de raiva urbana pode ser mantido no Estado. O segundo trabalho do primeiro capítulo descreve a primeira ocorrência no RS de raiva em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus. Neste caso, a amostra isolada apresentou características de amostras isoladas de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A identificação de vírus rábico em um morcego frugívoro, com tal perfil, não representa fato novo na história recente da raiva, mas a descrição deste caso ilustra que a raiva em morcegos frugívoros no RS apresenta características semelhantes à raiva em morcegos frugívoros de outras regiões do Brasil e sugere que o mesmo foi contaminado devido ao contato com morcegos hematófagos. Com o objetivo de permitir o monitoramento sorológico da raiva em morcegos e a identificar novos potenciais reservatórios do vírus, no segundo capítulo desta tese é reportado o desenvolvimento de dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra raiva. O primeiro teste desenvolvido é a inibição da imunoperoxidase (“immunoperoxidase inhibition assay”; IIA), que foi testada frente a 422 amostras de soros humanos. A IIA foi muito eficiente, tendo demonstrado uma acurácia de 97.63%. Esta técnica provavelmente poderá ser utilizada para detecção de anticorpos contra raiva em outras espécies, embora no presente estudo tenha sido avaliada apenas com soros humanos. Com o objetivo de pesquisar anticorpos contra raiva em diferentes espécies animais utilizando pequenos volumes de soro foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático do tipo “sandwich” (“sandwich enzyme linked immunosorbent assay”; S-ELISA). O S-ELISA foi inicialmente comparado com um teste padrão FAVN (Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test) e a seguir empregado na pesquisa de anticorpos em soros de diferentes espécies, incluindo morcegos, sagüis, raposas, felinos silvestres, guaxinis, quatis, bovinos, camundongos e humanos. Os resultados mostraram que o S-ELISA foi eficiente na detecção de anticorpos contra o vírus da raiva em diferentes espécies, com uma acurácia de 87,5%. A caracterização de amostras de vírus rábico em situações epidemiológicas específicas, assim como o desenvolvimento de testes sorológicos a fim de identificar anticorpos em distintas espécies e identificar novos possíveis reservatórios para raiva, contribuirão para o maior conhecimento da biologia da raiva na natureza, particularmente em nosso Estado, possibilitando assim a tomada de medidas de controle mais adequadas. / This thesis describes studies about diagnosis, antigenic and molecular characterization of rabies vírus strains and about serological assays development for antibodies against rabies virus detection. The first chapter describes two cases of rabies in State of Rio Grande do Sul (RS). This first work of the first chapter on this thesis, describes the canine rabies in Municipality of Tapes, east of RS. After the diagnosis confirmation, the rabies virus strain was submitted to antigenic and molecular characterization. The sample shown similar characteritics with rabies vírus isolates from insectivorous bats Tadarida brasiliensis. Thus, the first canine rabies in RS after 19 years occurred by an incidental contact between the contamined canine and a non-haematophagous bat. In view of that, the status of urban rabies free of the area should not be compromised. The second work of first chapter describes the first occurrence in RS of rabies in frugivorous bats Artibeus lituratus. In this case, the isolated sample shown characteristics similar to characteristics from haematophagous bats Desmodus rotundus. The rabies virus identification in a frugivorous bat with this profile, does not represent a new fact in the recent history of rabies, but the description of this case illustrates that the rabies in frugivorous bats in RS has similar characteristics to rabies in frugivorous bats in other regions of Brazil and suggests that it was contamined due to contact with haematophagous bats. With the purpose to allow the serological monitoring of rabies in bats and identify new potential reservoirs of the virus, in the second chapter of this thesis is reported the development of two serological tests for detection of antibodies against rabies. The first developed assay is the immunoperoxidase inhibition assay (IIA), that was tested with 422 sera from humans. The IIA was very efficient, with 97.63% of accuracy. This assay probably can be used to antibodies detection against rabies in other species, in despite of the present study, it was tested only with sera from humans. With the aim to research rabies antibodies in different animal species with small volume of serum, was developed the sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA). The S-ELISA was initially compared with the gold standard test Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test and after used to search antibodies in sera from different species including bats, marmosets, foxes, wild felines, raccoons, coatis, bovines, mices and humans. The S-ELISA was efficient to detect antibodies in different species with 87.5% of accuracy. The characterization of rabies virus strains in specific epidemiological situations as well as the serological assays development to identify antibodies in distinct species and identify new potential rabies reservoirs for rabies, contribute to greater understanding of the biology of rabies in nature, particularly in our State, allowing the taking of appropriate control measures.

A capacidade dos vírus em inibir a resposta imune inata é uma condição que os permite manterem-se na natureza. O vírus parainfluenza 5 (PIV5), por exemplo, expressa a proteína V, a qual é descrita como uma inibidora da sinalização de interferon (IFN), assim antagonizando seu efeito antiviral. O objetivo deste trabalho foi estudar os efeitos do bloqueio do receptor de IFN-I no crescimento de herpesvírus bovino tipos 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) in vitro e elucidar as relações entre a replicação viral e a resposta de IFN-I pela célula infectada. Para isso, foi modificada uma linhagem celular de bovinos (CRIB) que expressa de forma permanente a proteína V do PIV5. Esta linhagem celular foi denominada CRIB/V. Foram, então, realizados ensaios de penetração, tamanhos de placas virais e curvas de crescimento usando as amostras de BoHV-1 e BoHV-5 em células CRIB e CRIB/V. A análise com BoHV-1 não mostrou diferenças significativas nas cinéticas de penetração e crescimento. Entretanto os tamanhos de placa foram maiores em CRIB/V do que em CRIB. Para o BoHV-5, a penetração foi um pouco mais rápida em CRIB/V. Mesmo que os títulos finais não tenham sido diferentes nas duas células, o BoHV-5 alcançou títulos mais altos em CRIB/V do que em CRIB em períodos iniciais da curva de crescimento em CRIB/V em comparação a CRIB. Além disso, a média do tamanho de placa para BoHV-5 foi maior em CRIB/V do que nas células CRIB. Diferentemente das observações com BoHV-1, nossos resultados sugerem que o bloqueio do receptor de IFN-I pela proteína V facilitou a penetração, liberação e disseminação célula-célula do BoHV-5 nas células bovinas, suprimindo uma resposta antiviral, pelo menos, durante os estágios iniciais da infecção. / The ability of viruses to inhibit innate immune responses dictates a possibility to maintain in nature. For instance, Parainfluenza virus 5 (PIV5) expresses the V protein, which is described to inhibit type I interferon (IFN-I) signaling , then, antagonizing its antiviral effects. The aim of this work was to study the effect of blocking the IFN-I receptor signaling by this V protein on the growth properties of bovine herpesviruses types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) in vitro. A plasmid expressing the V protein of PIV5 was transfected into CRIB cells. We performed penetration kinetics, measured viral plaque sizes and determined one step growth curves using BoHV-1 and BoHV-5 strains in both CRIB and CRIB/V cells. The analysis on BoHV-1 showed no significant difference in penetration and growth kinetics. However the BoHV-5 viral plaques were bigger in CRIB/V than CRIB. The penetration of BoHV-5 in CRIB/V cells was slightly faster than in CRIB cells. Even though the final titers did not differ in both cells, BoHV-5 reached higher titers in CRIB/V than in CRIB at earlier time points of its growth. Moreover, the mean plaque size caused by BoHV-5 in CRIB/V cells was spectacularly bigger in CRIB/V than in CRIB cells. Unlike the observations with BoHV-1, our results suggest that blocking the signaling via the IFN-I receptor by the V protein facilitated penetration, release and cell-to-cell spread of BoHV-5 in bovine cells, counteracting an antiviral response, at least, during the early stages of infection.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) são importantes patógenos que podem afetar os tratos respiratório e genital e o sistema nervoso central de bovinos. Visando iniciar um estudo sobre a distribuição destes vírus em sêmen de bovinos no Brasil, foi realizada a detecção de BoHV-1 e 5 em amostras de sêmen através de duas reações em cadeia da polimerase do tipo nested (nPCRs) espécie-específicas. Foram testadas 53 amostras de sêmen fresco e 23 amostras de sêmen em palheta coletados de touros de dois estados brasileiros. DNA de BoHV-5 foi detectado em todas as amostras e 34 dessas também foram positivas para BoHV-1. Em cinco amostras de sêmen fresco e em 13 amostras de sêmen em palheta foi possível isolar BoHV-1 e/ou BoHV-5 infeccioso. Demonstramos, assim, que ambos os tipos virais foram detectados em amostras de sêmen de bovinos brasileiros, destacando a importância de se monitorar a presença desses agentes em sêmen de touros, para reduzir o risco de transmissão dessas viroses. Além disso, com o objetivo de contribuir com o controle destas infecções no território brasileiro, nesse estudo também se propôs a construção de um vírus recombinante com deleção do gene UL49.5, que codifica uma proteína de evasão imune, a partir de uma amostra de BoHV-5 gE-, gI- e US9-. Para isso, foi construído um cassete de deleção contendo o gene UL49.5 mutado que foi co-transfectado com DNA viral em células eucarióticas de bovinos. Até o momento não foi possível isolar vírus recombinantes, entretanto, vários parâmetros de transfecção foram aqui otimizados, o que facilitará a futura obtenção deste recombinante. / Bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) are important pathogens of the respiratory and genital tract of cattle and may also affect the central nervous system. Aiming begin the study of the distribution of these viruses in semen of Brazilian bulls, it was performed here the detection of BoHV-1 and 5 in semen samples by two species-specific nested polymerase chain reactions (nPCRs). Fifty three fresh semen samples and 23 frozen semen samples from two Brazilian states were tested. DNA of BoHV-5 was detected in all samples and 34 of these were positive for BoHV-1 as well. In addition, in 5 fresh semen samples and 13 frozen semen samples infectious BoHV-1 and /or BoHV-5 was isolated. Thus, we demonstrated that both viruses are detected in Brazilian semen samples, highlighting the importance of search for these agents in bull semen to reduce the risk of transmitting these viruses. Moreover, in order to contribute with control of these infections in Brazilian territory, this study also aims to make a recombinant virus with a deletion in the UL49.5 gene, which codes for an immune evasion protein, in a BoHV-5 gE-, gI- and US9- sample. To achieve this, a deletion cassette with a mutated UL49.5 gene was built and co-transfected with viral DNA in eukaryotic bovine cells. Hitherto no recombinant virus was isolated; however, many transfection parameters were optimized, favoring the achievement of the recombinant.

O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) está amplamente disseminado no rebanho bovino brasileiro. Visando aprofundar o conhecimento sobre a patogenicidade para o trato respiratório de amostras dos subtipos deste vírus mais freqüentemente encontrados no Brasil (BHV-1.1 e BHV-1.a), isolados autóctones oriundos de casos de doença respiratória foram inoculados em bovinos suscetíveis. As amostras de ambos os subtipos foram capazes de induzir doença respiratória após inoculação pela via intranasal, em intensidade que variou de moderada a grave, independentemente do subtipo de vírus inoculado. Foi ainda caracterizada a resposta imune humoral induzida por tais amostras quanto ao perfil de classes e subclasses de imunoglobulinas, sendo esta igualmente indistinguível com relação aos vírus inoculados. O perfil de classes de imunoglobulinas apresentadas pelos animais permitiu a determinação do status da infecção nos animais inoculados através da análise da resposta sorológica. Na segunda etapa deste trabalho foram testadas as propriedades vacinais de um vírus recombinante, do qual foi deletada a glicoproteína E (gE; 265gE-), gerado a partir de uma amostra brasileira de BHV-1.2a. Experimentos de inoculação do recombinante 265gE- em animais suscetíveis e o desafio destes animais com a amostra parental virulenta demonstraram a segurança e eficácia desta amostra na prevenção de sinais clínicos da infecção pelo BHV-1. Posteriormente, o recombinante 265gE- foi inoculado em vacas em diferentes estágios da gestação. Não foram observadas quaisquer anormalidades nestas gestações e as 22 vacas vacinadas deram à luz a animais saudáveis. Conclui-se que o recombinante é imunogênico e capaz de conferir significativa proteção frente ao desafio com a amostra parental virulenta do vírus. O recombinante também não causou enfermidade nas vacas inoculadas nem tampouco aos fetos quando inoculado em diferentes estágios da gestação.