Orientador: Giovanni Faria Silva / Coorientador: Marjorie de Assis Golim / Resumo: A hepatite C é uma doença infecciosa que torna-se crônica em cerca de 85% dos infectadosque poderão desenvolver cirrose e carcinoma hepato celular. O tratamento antiviral em muitosdos pacientes não é eficaz, principalmente quando estes portam o genótipo 1 e fibroseavançada, a resposta inflamatória também desempenha seu papel sobre a resposta virológicasustentada (RVS) durante o tratamento com Interferon Peguilado (PegIFN) associado aRibavirina (RBV). Nesse estudo nosso objetivo principal foi avaliar a influência da respostainflamatória através de células e citocinas/quimiocinas sobre a resposta virológica do pacienteem tratamento antiviral com terapia tripla. Incluimos pacientes com RNA VHC+, nuncatratados (naive), portadores do genótipo 1, ambos os sexos e com fibrose avançada F3 (n=6);F4 (n=21) candidatos ao tratamento em regime triplo. Os pacientes tiveram suas amostrascoletadas e analizadas nas semanas 0 e 12 do tratamento e os seguintes parâmetros foramanalisados: IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17A, TNF-α, IFN-γ, RANTES, MCP-1, MIG, IP-10, através de citometria de fluxo (método CBA). Foram incluídos 15 voluntários saudáveis(grupo controle) e 27 pacientes que foram separados em G1(RVS) e G2 (não RVS), a taxa deRVS foi de 63%. Os pacientes com hepatite C crônica tiveram os níveis circulantes de IP10,MCP-1, MIG, RANTES, IL-8 e IL-6 mais elevados quando comparados com voluntáriossaudáveis, quando comparados G1xG2 os níveis de RANTES (p=0,04... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

Orientador: Marilia de Freitas Calmon / Coorientador: Paula Rahal / Coorientador: Laura Sichero / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho-Mello / Banca: Enrique Mario Boccardo Pierulivo / Resumo: A Papilomatose Respiratória Recorrente (PRR) é uma doença caracterizada pela presença de tumores benignos no trato respiratório superior, sendo a laringe o sítio de lesão mais comum. Esta doença tem uma distribuição de idade bimodal, permitindo sua classificação em papilomatose juvenil ou adulta. O principal agente etiológico da PRR é o Papilomavírus Humano (HPV), um grupo de vírus de DNA, dos quais mais de 150 tipos já foram identificados. HPV-6 e HPV-11 são os tipos mais encontrados em PRR. Há poucos estudos sobre a distribuição das variantes moleculares de HPV de baixo risco. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi avaliar a variabilidade genética do gene E6 entre isolados de HPV-6 e HPV-11 detectados em amostras de papilomatose respiratória recorrente (PRR) obtidas em uma coorte de pacientes brasileiros. A fim de comparar as sequências de nucleotídeos identificados em nosso estudo com isolados previamente reportados provenientes de outras partes do mundo, e de diferentes sítios anatômicos (papilomatose de laringe, verrugas genitais, câncer cervical e esfregaço anal), foi realizada a análise filogenética para determinar as relações filogenéticas das variantes detectadas no Brasil com as variantes isoladas em outras regiões do mundo. A região codificante completa do gene E6 de 25 amostras foi clonada e sequenciada. Em 18 isolados foi detectado o DNA do HPV-6 (72%), e em 7 isolados o DNA do HPV-11 (28%). Um total de quatro variantes genômicas diferentes de HPV-6 e duas variantes genômicas de HPV-11 foram identificadas e nenhuma variante pode ser associada com o quadro clínico do paciente. Para a reconstrução filogenética foram utilizadas as sequências de E6 detectadas neste estudo adicionalmente às sequências anteriormente publicadas originárias da Eslovênia e da África do Sul. Devido ao pequeno... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Recurrent respiratory papillomatosis (RRP) is a disease characterized by benign neoplasms and can occur anywhere within the upper respiratory tract, but the most common lesion site is the larynx. This disease has a bimodal age distribution which forms the basis of its classification as juvenile or adult. The main etiological agent of RRP is Human Papillomavirus virus (HPV), a group of DNA virus with more than 150 identified types. HPV-6 and 11 are the most common types identified in RRP. There are few studies about the distribution of natural molecular variants of low-risk HPVs. So, the aim of this study was to evaluate the E6 early gene variability among HPV-6 and HPV-11 isolates detected in recurrent respiratory papillomatosis (RRP) samples obtained in a cohort of Brazilian patients. In order to compare nucleotide sequences identified in our study with previously reported sequences isolates from different anatomic sites (laryngeal papillomas, genital warts, cervical cancer and anal swabs) obtained from other parts of the world was performed phylogenetic analysis to determine the phylogenetic relationships of variants detected in Brazil with variants isolated in others regions of world. The complete coding region of the E6 gene of 25 samples were cloned and sequenced. HPV-6 DNA was detect in 18 isolates (72%) and HPV-11 DNA in 7 isolates (28%). A total of four different HPV-6 genomic variants and two HPV-11 genomic variants were identified and any variant could not be associated with the clinical outcome. Phylogenetic trees for both HPV types were reconstructed enclosing E6 sequences detected in our study in addition to formerly published sequences from Slovenia and South Africa. The small number of samples analyzed prevents the evaluation of the association between specific molecular variants and the... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Cintia Bittar Oliva / Coorientador: Ana Carolina Gomes Jardim / Banca: Ana Carolina Bernardes Terzian / Banca: Paola Jocelan Scarin Provazzi / Resumo: A Hepatite C, causada pelo vírus da Hepatite C (HCV), afeta cerca de 170 milhões de pessoas em todo o mundo. O HCV pertence à família Flaviviridae e gênero Hepacivirus, possuí genoma de RNA fita simples de polaridade positiva que codifica uma poliproteína posteriormente clivada por proteases virais e do hospedeiro, resultando em 10 proteínas virais. O tratamento atual, baseado na administração de Interferon e dos novos antivirais de ação direta, possuí um alto custo e a resposta virológica sustentada varia de acordo com o genótipo viral. Acridonas, um grupo de compostos extraído de fontes naturais, mostrou potencial ação antiviral contra o HCV, entretanto sua possível atividade antiviral foi pouco explorada em cultura de células. Dessa forma, esse estudo visou avaliar a influência de 14 acridonas sintéticas no ciclo replicativo do HCV. Os compostos foram triados utilizando a linhagem celular Huh 7.5 expressando estavelmente o replicon subgenômico SGR-JFH1-FEO. Células foram incubadas na presença e ausência de compostos por 72 horas. Viabilidade celular e níveis de replicação foram obtidos por ensaios de MTT e expressão de luciferase, respectivamente. A acridona Fac4 apresentou uma inibição de replicação de aproximadamente 90 % a 50 µM, com 100 % de viabilidade celular. O Fac4 foi selecionado para a realização dos experimentos seguintes. O efeito de Fac4 nas etapas de replicação e entrada viral foi avaliado em células Huh 7.5 infectadas com partículas virais de HCV JFH1 produzidas em laboratório (HCVcc). Fac4 inibiu a replicação do JFH1 em aproximadamente 70 %, enquanto que na etapa de entrada nenhum efeito foi observado. A expressão da proteína viral NS5A foi avaliada pelo ensaio de Western Blotting e não foi detectada na amostra tratada com Fac4, corroborando os resultados anteriores. Apesar desses resultados, nenhum efeito inibitório... / Abstract: Hepatitis C, caused by Hepatitis C Virus (HCV), affects about 170 million people worldwide. HCV belongs to Flaviviridae family and Hepacivirus genus, has a positive single stranded RNA genome that codifies a polyprotein, which is cleaved by host and viral proteases, resulting in 10 viral proteins. The current treatment, based on Interferon and the new Direct Acting Antivirals, has a high cost and variable response rates according to the virus genotype. Acridones, a group of compounds extracted from natural sources, showed potential antiviral actions against HCV, however their possible antiviral activity have been poorly explored in cell culture. Thus, this study aimed to evaluate the influence of a panel of 14 synthetic acridones on HCV life cycle. The compounds were screened using Huh 7.5 cell line expressing the HCV subgenomic replicon SGR-JFH1-FEO. Cells were incubated in the presence and absence of compounds for 72 hours. Cell viability and replication levels were accessed by MTT and luciferase assays, respectively. The Acridone Fac4 presented a replication inhibition of approximately 90 % at 50 µM and 100 % of cell viability and was selected for the follow-up experiments. The effect of Fac4 was evaluated in the replication and entry steps using Huh 7.5 cells infected with viral particles from JFH-1 strain produced in laboratory (HCVcc). Fac4 inhibited the replication of JFH-1 by approximately 70 %, while no effect was observed on virus entry. The expression of the viral protein NS5A was evaluated by Western Blotting assay and was undetectable in Fac4 treated sample, corroborating previous results. Despite these results, no inhibitory effect was observed against genotype 3 replication. Some acridones are known to intercalate in dsRNA molecules, which are replication intermediates, disrupting replication. We performed a dsRNA intercalation assay in order to test if this ... / Mestre

Orientador: Fátima Pereira de Souza / Banca: Alessandra Vidotto / Banca: Rogério de Moraes / Banca: Natália Bueno Leite Slade / Banca: Marcio José Tiera / Resumo: O Vírus Sincicial Respiratório Humano (hRSV) é o principal agente causador de doenças respiratórias agudas severas, como pneumonia e bronquiolite. Trata-se de um vírus da família Paramyxoviridae, com simetria helicoidal e envelope lipídico. Possui um genoma de RNA fita simples, não segmentado, com 10 genes codificantes. Um dos fatores que contribuem para o sucesso na replicação viral é a interação da proteína M2-1 com as proteínas P, M e com o RNA. Tal proteína age através da interação com RNA, e assim, participa efetivamente no processo de replicação viral, apresentando atividade anti-parada da replicação sendo ativa quando na forma tetramérica. Deste modo, o ligante que realizar interação com a M2-1 é um potencial candidato a prevenir as interações M2-1 com RNA e demais proteínas, impedindo deste modo o sucesso da replicação viral. Flovonoides são compostos naturais com várias atividades como antioxidante, anticancerígena, cardio protetora, antibacteriana e antiviral. Quercetina é um flavonoide que apresenta atividade antiviral, inibindo o complexo de replicação. Com a finalidade de investigar a interação de um potencial candidato a inibição da atividade da M2-1, clonamos, expressamos e purificamos a proteína M2-1 do hRSV e, determinamos sua característica físico-química de interação com quercetina em diferentes condições de temperatura. Para clonagem e expressão do gene M2-1 foram escolhidos o vetor pGEX-4T-1 e a bactéria Escherichia coli da linhagem BL21 Gold (DE3). A proteína expressa foi purificada em cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. As análises de composição de estrutura secundária e estabilidade térmica foram realizadas por espectroscopia de dicroísmo circular e, a interação com Quercetina com espectroscopia de fluorescência. Para o mapeamento da interação com a Quercetina foram realizadas docking molecular e dinâmica molecular. A proteína... / Abstract: Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is the major causative agent of acute respiratory infections such as pneumonia and bronchiolitis. This is a virus of the Paramyxoviridae family with helical symmetry and lipid envelope. It has a single strand RNA genome, not segmented, with 10 coding genes. One of the factors that contribute to success in viral replication is the interaction of M2-1 protein with P, M protein and RNA viral. Such protein acts through the interaction with RNA, hence, participating in the viral replication process, having anti-stop activity in the replication process and, the protein is active only as a tetramer. Thus, a ligand that interacts with M2-1 is a potential candidate to prevent interaction of M2-1 with other proteins, thereby preventing the success of viral replication. The aim of the research is to clone, express and purify the M2-1 protein of hRSV and then determine its physicochemical characteristics of the interaction with Quercetin in different temperatures to investigate the interaction of a potential candidate to inhibit the activity of the M2-1. The M2-1 gene was cloned in vector pGEX-4T-1 and expressed in Escherichia coli strain BL21 Gold (DE3). The expressed protein was purified on affinity chromatography molecular exclusion chromatography, thermal stability and secondary structure were analyzed by circular dicroism and the interaction with Quercetin was analyzed by fluorescence spectroscopy. To understand the interaction mechanism was performed molecular dynamics and molecular docking. The purified protein has 40% α-helix, 10% β-sheet, 19% turns and 31% random coils, being the melting temperature of 55,6°C. The titration of M2- 1 with Quercetin showed that it interacts in two points, on site 1 (the binding affinity is ~1,5x106 M -1 ) and stablishes an ionic interaction and, on site 2 (1,1x105 M -1 ) stablishes a hydrophobic interaction. One Quercetin molecule interacts on site 1 (formed by the ... / Doutor

Resumo: A infecção pelo vírus da Hepatite C (HCV) é considerada um grande problema de saúde pública, desde a sua descoberta em 1989. Entretanto a terapia mais utilizada atualmente, baseada no uso de Peginterferon, tem sucesso em aproximadamente 50% dos pacientes com o genótipo 1. Embora os mecanismos envolvidos nesta resistência viral ainda não sejam esclarecidos, sugere-se que fatores virais e do hospedeiro participam deste. A proteína não-estrutural 5A (NS5A) está envolvida em diversos processos celulares e é um componente essencial para o HCV. Entretanto, sua estrutura e função ainda não foram bem elucidadas. A partir destes fatos, os objetivos do presente estudo foram elaborar um modelo teórico da NS5A e investigar as propriedades estruturais e funcionais in silico. Foram analisadas 345 sequências da proteína NS5A do HCV de 23 pacientes infectados com o genótipo 1 ou 3. As composições de aminoácidos e de estrutura secundária demonstraram que há diferença entre os genótipos, podendo indicar que há diferenças nas interações proteína-proteína entre os genótipos, o que pode estar relacionado com a diferença da taxa de resistência ao tratamento. A análise funcional foi realizada com o ProtFun, que sugeriu que a NS5A estaria envolvida nas funções celulares de metabolismo intermediário central, tradução, crescimento, tranporte, ligação e hormônio. Estas funções variaram entre os domínios, suportando a hipótese de que a NS5A é uma proteína multifuncional. A análise pelo PROSITE indicou vários sítios de glicosilação, fosforilação e miristoilação, que são altamente conservados e podem ter função importante na estabilização da estrutura e função, sendo assim possíveis alvos de novos antivirais. Alguns deles estão em regiões relacionadas com a resposta ao tratamento. Outro... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) infects almost 3% of people worldwide and it is considered the main cause of liver chronic diseases and transplants. Until today, there is no effective vaccine and the current most used therapy, based on Peginterferon, is successful only in 50% of patients infected by genotype 1. Although the outcomes of this treatment resistance are unclear, it is suggested host and virus factors may participate in this mechanism. Non-structural 5A (NS5A) protein is involved in several cellular and virus processes and it is a critical component of HCV. However, its structure and function are still uncertain. Regarding these facts, the present study attachments were to elaborate a model of the NS5A protein and to investigate NS5A structural and functional features, using in silico tools. It was analyzed 345 sequences of HCV NS5A protein from 23 patients infected by genotypes 1 or 3. Residues and secondary structure composition of all sequences demonstrated that there are differences between genotypes. It may indicate that there are differences in interactions between genotypes, which could be related with the distinct average of treatment resistance. In addition, among those that varied between genotypes, there were amino acids in regions that studies suggested as related with virus persistence. Functional analysis was performed with ProtFun. It suggested that NS5A is involved with central intermediary metabolism, translation, growth, transport, ligation and hormone functions in the cell. These functions vary between the domains, strengthening the hypothesis that NS5A is a multifunctional protein. Prosite motif search indicated that there are many glicosilation, fosforilation and myristoilation sites, which are highly conserved and may play an important role in structural stabilization and... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Helen Andrade Arcuri / Banca: Fernanda Canduri / Banca: Carlos Alberto Montanari / Mestre

Respiratory syncytial virus is well recognized as the most important pathogen accounting for acute respiratory disease in infants and young children, mainly bronchiolitis and pneumonia. Two major antigenic subgroups, A and B, have been identified; however, there is a disagreement between the severity of the disease caused by them. This study investigated a possible association between RSV subgroups and severity of the cases. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction was used to characterize 128 RSV nasopharyngeal specimens from children less than five years old experiencing acute respiratory disease. It was possible to subgroup 64.1% samples in RSV A (64) and RSV B (18). Severity was measured by clinical evaluation associated with demographic factors. For RSV A-infected patients, 53.1% were hospitalized, whereas for RSV B it was 27.8%. Around 35.0% of the patients presented risk factors for severity. The hospitalization happened for 47.6% of RSV A patients and for 18.2% of RSV B, for children without risk factors. It was observed a trend for RSV B infection to be milder than RSV A. Even though RSV A infected patients were more likely to require hospitalization than those infected by RSV B, including cases without underlying condition and prematurity, the disease severity could not to be attributed to the RSV subgroups. / O vírus respiratório sincicial (VRS) é referido como o principal agente viral de doença respiratória aguda (DRA) em recém nascidos e lactentes, causando principalmente bronquiolite e pneumonia. Dois subgrupos antigênicos, A e B, são conhecidos, entretanto há divergências a respeito da gravidade da doença causada por esses subgrupos. Para tentar caracterizar 128 amostras de VRS obtidas de crianças menores de cinco anos de idade com DRA, foi utilizada a transcrição reversa da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR). Desta maneira, foram subgrupadas 64,1% (82/128) das amostras, sendo 64 VRS A e 18 VRS B. No período de estudo o VRS A predominou sobre o B e em quatro anos observou-se a cocirculação alternada de ambos, sendo o VRS B mais detectado em dois deles. O critério de gravidade foi definido com base nas informações clínicas e nos dados demográficos obtidos das crianças infectadas. Dentre os pacientes com infecção pelo VRS A, a taxa de hospitalização foi de 53,1% (34/64) e para o VRS B de 27,8% (5/18) (p=0,067; OR=2,947; RR=1,250; IC 95%=0,940-9,235; mediana de idade: 2,1 e 3 meses, respectivamente). Das crianças infectadas pelo VRS A, 59,4% (38/64) eram <6 meses de idade, enquanto que para o VRS B esse percentual foi de 55,6% (10/18). Todavia, dentre os infectados pelo VRS B nenhum era <1 mês. Aproximadamente 35,0% (29/82) das crianças apresentaram doença de base e prematuridade. Quando se excluiu esses fatores de risco e procedeu à uma análise, observou-se uma taxa de hospitalização de 47,6% (20/42) e 18,2% (2/11), respectivamente para os casos de VRS A e B (p=0,097, OR=4,091; RR=1,281; IC 95%=0,788-21,249). Concluindo, não foi observada diferença estatística para gravidade clínica entre os subgrupos do VRS, mas apenas uma tendência de doença mais branda pelo VRS B. Embora pacientes infectados pelo VRS A tenham sido mais hospitalizados do que os infectados pelo VRS B, inclusive os casos sem doença de base e prematuridade, a gravidade da doença não pôde ser atribuída aos subgrupos do VRS. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O gênero Pestivirus, pertencente à família Flaviviridae, é constituído por espécies virais de importância na saúde animal no mundo todo, as quais podem afetar a economia dos países de forma impactante. São reconhecidas quatro espécies pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV): vírus da peste suína clássica (Classical Swine Fever Virus – CSFV), vírus da doença da fronteira (Border Disease Virus- BDV), vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (Bovine Viral Diarrhea Virus 1- BVDV-1) e 2 (BVDV-2). Algumas das espécies deste gênero- CSFV e BVDV- são de notificação obrigatória na Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), causando sanções econômicas importantes quando presentes. Recentemente, possíveis novas espécies vêm sendo caracterizadas, porém ainda não foram reconhecidas como espécies do gênero Pestivirus. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da diversidade genética de pestivírus no país, o presente trabalho descreve os genomas completos e a caracterização genômica e filogenética de uma cepa de BVDV-1 subtipo i e duas de vírus ‘HoBi’-like. Os genomas completos foram obtidos através de sequenciamento de nova geração; as anotações, predição da poliproteína viral e dos sítios de clivagem foram feitos através do software Geneious, e a análise filogenética foi realizada através do software MEGA 6. O BVDV-1 subtipo i foi pela primeira vez isolado no Brasil, sendo também a primeira descrição de genoma completo deste subtipo de BVDV. Também foi descrito o genoma completo de duas cepas de vírus ‘HoBi’-like isolados no Brasil, além da caracterização de outras cepas de ‘HoBi’-like disponíveis em bancos de dados. Os dados moleculares destes isolados foram comparados com aqueles das demais espécies do gênero Pestivirus, e estas informações deverão auxiliar na futura classificação deste como espécie. Os resultados apresentados na dissertação adicionam conhecimento sobre a diversidade genética de BVDV-1 no Brasil além de informações acerca do vírus ‘HoBi’-like, reforçando esta espécie ainda não reconhecida como um novo membro do gênero Pestivirus, os ‘HoBi’-like vírus. / The genus Pestivirus, within the family Flaviviridae, includes species that are important pathogens affecting animal health that can cause impacting losses in the economy worldwide. According to the International Committee on Taxonomy of Virus (ICTV), there are four recognized species in this genus: Classical swine fever virus (CSFV), Bovine Viral Diarrhea Virus1 and 2 (BVDV -1, BVDV-2), and Border disease virus (BDV). Some of the species within this genus - CSFV and BVDV- are notifiable to the World Organization for Animal Health (OIE), and can cause exportation barriers or sanctions. Other putative new species have been characterized recently, but remain officially unrecognized. In order to generate data about the genetic diversity of pestivirus in Brazil, this study describes complete genomes and the genomic and phylogenetic characterization of an isolate of BVDV-1i and two isolates of ‘HoBi’-like virus. Complete genomes were sequenced through Next Generation Sequencing; genome annotations, polyprotein prediction and identification of cleavage sites were performed with software Geneious, and phylogenetic analysis with software MEGA 6. BVDV-1 subtype i was found in Brazil for the first time, and this is the first complete genome ever characterized for this subtype. Two strains of ‘HoBi-like’ virus isolated in Brazil were also described and characterized together with other ‘HoBi’-like strains available in databases. The molecular data obtained for these isolates were compared to those of other Pestivirus species. These data can help in future classification of these ‘HoBi’-like strains as a new recognized species. The knowledge on genetic diversity and the characterization of pestiviruses can contribute with surveillance programs and with appropriate animal health measures to control these viral diseases.

A presente tese versa sobre estudos realizados visando a identificação de novos agentes virais em frangos comerciais. No primeiro capítulo, a identificação do girovírus aviário tipo 2 (AGV2) é reportada. Um genoma viral de 2383 nt foi amplificado a partir soros de frangos comerciais por amplificação randômica de DNA. A análise da sequência do produto amplificado, revelou que cerca de 40% das sequencias de nucleotídeos apresentavam similaridade com o genoma do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV). Dado o baixo grau de identidade com o CAV, o genoma identificado justificou a proposição de um novo tipo de vírus, dentro do gênero gyrovírus foi denominado “girovírus aviário tipo 2” (AGV2). O genoma do AGV2 tem organização semelhante a do CAV, com percentagens de similitude de aminoácidos nas regiões codificantes, correspondentes às proteínas virais VP1, VP2 e VP3 do CAV de 38,8%, 40,3% e 32,2%, respectivamente. A fim de analisar a amplitude da disseminação deste agente, foi realizado um estudo para identificar a ocorrência do AGV2 em granjas de frangos de outras regiões. Para atingir esse objetivo, uma PCR específica ao AGV2 foi desenvolvida para amplificar o DNA viral extraído de bulbos de penas da asa e órgãos de frangos. Essa técnica permitiu a detecção do AGV2 em aves de outros locais na Região Sul do Brasil. O DNA viral foi detectado em 90,7% (98/108) das amostras coletadas no estado do Rio Grande do Sul e 60,4% (29/48) das amostras do estado de Santa Catarina. Os mesmo primers da PCR foram adaptados para examinar tecidos de cérebro de galinhas da Holanda. Nessas amostras o DNA do AGV2 foi detectado em nove das 21 (42,9%) amostras de tecidos cerebrais em aves com lesões hemorrágicas. Essas descobertas fornecem evidências de que infecções de AGV2 são generalizadas e não se restringem a Região Sul do Brasil. Além disso, esses estudos permitiram a identificação de variantes do DNA genômico do AGV2. Análises filogenéticas demostraram que os genomas examinados poderiam ser divididos em três grupos, com base em diferenças nos genes das ORFs das proteínas VP2 e VP3. Em conclusão, a presente tese abrange estudos da identificação de um vírus aviário, até então desconhecido, denominado girovírus aviário tipo 2, que encontra-se amplamente distribuído. A associação deste agente com enfermidades em aves será tema de estudos que estão sendo realizados. / This thesis concerns studies carried out in search for new viral agents in commercial poultry flocks. In the first chapter, the identification of the genome of avian gyrovirus type 2 (AGV2), a new Gyrovirus, is reported. The viral genome the 2383-nucleotide sequence was amplified from sera of commercial broilers by random DNA amplification. Sequence analysis of the amplified product showed that the putative viral sequence had about 40% nucleotide similarity with the genome of its closest relative, chicken anemia virus (CAV). Such low degree of nucleotide similarity justified its classification as a new virus type within the genus, to which the name avian gyrovirus type 2. The amino acid similarity between the predicted viral proteins VP1, VP2 and VP3 of AGV2 and those of CAV was 38.8%, 40.3%, and 32.2%, respectively. In order to examine the amplitude of dissemination of this agent, it became necessary to carry out a search for AGV2 genomes in poultry flocks from other regions. To achieve such objective, an AGV2-specific PCR was designed to amplify viral DNA from nuclei acid extracted from poultry feather shafts. This allowed detection of AGV2 genomes in flocks from other locations in Southern Brazil. Viral DNA was detected in 98/108 (90.7%) of samples collected in the state of Rio Grande do Sul and 29/48 (60.4%) of the samples collected in the state of Santa Catarina. The same PCR primers were adapted to examine brain tissues of chickens from the Netherlands. In such samples, AGV2 DNA was detected in nine out of 21 (42.9%) brain tissue samples from birds with haemorragic lesions. These findings provided evidence that AGV2 infections are widespread and are not restricted to Southern Brazil. In addition, these studies allowed the identification of genomic variants of AGV2. Phylogenetic analyses demonstrated that such genomes could be divided into three clusters. In conclusion, this thesis encompasses studies on the identification of a previously unreported virus, named avian gyrovirus 2, which was later shown to be widely distributed. The relationship between this agent and disease in poultry will be subject of further studies which are being performed in continuation to this work.

O vírus da cinomose canina (CDV) é classificado no gênero Morbillivirus da família Paramyxoviridae e é o agente etiológico de uma das mais importantes doenças virais de canídeos domésticos. A cinomose ocorre em todo o mundo e produz alta mortalidade em populações imunologicamente naïve. Apesar de encontrar-se bem controlada pela vacinação, casos de cinomose ocorrem esporadicamente tanto em cães vacinados quanto em não vacinados. Uma das causas suspeitas desta falha vacinal é a grande variabilidade genética entre cepas de CDV. O objetivo deste trabalho foi detectar e analisar a variabilidade genética do CDV circulante no País. Foram coletados 386 suabes retais de cães em diversas regiões do Brasil, dos quais se detectaram 155 positivos através de uma RT-nested-PCR de um fragmento do gene do nucleocapsídeo. Destes, 23 foram selecionados para amplificação parcial do gene da hemaglutinina, sequenciamento e análise filogenética. A grande maioria das sequências obtidas agrupou no genótipo América do Sul-I, que inclui isolados da Argentina e do Uruguai, com exceção de uma amostra similar à cepa vacinal Rockborn. A análise filogenética sugere a presença de pelo menos sete subgenótipos do genótipo América do Sul-I circulando neste continente. O grupo América do Sul-II é formado somente por isolados da Argentina. Além disso, propõe-se que este grupo e os clados Rockborn-like e Europa Selvagem sejam denominados subgenótipos dentro de um genótipo único. / Canine distemper virus (CDV) is classified in the genus Morbillivirus within the family Paramyxoviridae and is the etiologic agent of one of the most important viral diseases of domestic Canidea. It occurs worldwide and produces high mortality in immunologically naïve populations. Despite being well controlled by vaccination, cases of canine distemper occur sporadically in vaccinated and unvaccinated dogs. One of the suspected causes of this vaccine failure is the great genetic variability between strains of CDV. The objective of this study was to detect and analyze the genetic variability of CDV circulating in our country. Rectal swabs were collected from 386 dogs in various regions of Brazil, of which 155 were found positive by a nested RT-PCR of a fragment of the nucleocapsid gene. Of these, 23 were selected for partial amplification of the hemagglutinin gene, sequencing and phylogenetic analysis. The vast majority of sequences obtained grouped in genotype South America-I, which includes isolates from Argentina and Uruguay, with the exception of a sample similar to the vaccine strain Rockborn. Phylogenetic analysis suggests the presence of at least seven subgenotypes belonging to South America-I genotype, circulating in this continent. The group South America-II consists only of isolates from Argentina. Furthermore, it is proposed that this group and clades Rockborn-like and Europe Wildlife are denominated subgenotypes within a single genotype.

Os herpesvírus bovinos tipo 1 (BoHV-1) e tipo 5 (BoHV-5) e o vírus da diarreia viral bovina (BVDV), são causas importantes de prejuízos sanitários e econômicos na bovinocultura. Estes agentes têm sido eventualmente detectados em búfalos (Bubalus bubalis) embora o papel desses vírus na biologia dessa espécie seja ainda desconhecido. A produção de búfalos vem se desenvolvendo expressivamente no Brasil, onde esses animais são mantidos frequentemente próximos ou associados à criação de bovinos. Como parte inicial de um projeto mais amplo sobre infecções por BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 e BVDV em búfalos, o presente estudo objetivou analisar a presença de anticorpos neutralizantes e genomas virais em amostras de soros bubalinos coletados em rebanhos do Estado do Rio Grande do Sul. Foram examinados 339 soros de animais maiores de 12 meses, de ambos os sexos, de diferentes raças e tipo de exploração. Os animais não eram vacinados para quaisquer vírus de interesse na pesquisa e se apresentavam sem alterações clinicamente aparentes na ocasião da coleta. Para a detecção de anticorpos neutralizantes, as amostras de soro foram examinadas através do teste de soroneutralização (SN) frente a diferentes amostras de herpesvírus: BoHV-1.1 (amostra LA) , BoHV-5b (amostra A663) e BuHV-1 (amostra b6). Cento e oito destas amostras foram examinadas adicionalmente frente ao BoHV-1.1 (amostra EVI123/98) e BoHV-1.2a (amostra SV265/96), para permitir uma avaliação da sensibilidade da SN utilizando como vírus de desafio todas as variantes disponíveis de BoHV-1 e BoHV-5. A sensibilidade da SN foi menor quando considerados os resultados obtidos com cada um dos vírus separadamente. Quando os resultados positivos frente a amostra LA, SV265/96 e A663 foram somados, a prova se apresentou mais sensível. Apesar disso, a SN não permitiu a identificação dos vírus que efetivamente haviam infectado os animais, devido ao elevado grau de reatividade cruzada. Para a verificação da circulação de pestivírus, foram realizados testes de SN utilizando a amostra “Oregon C24V” de BVDV-1 como vírus de desafio. Das 176 amostras analisadas, 19 (10,8 %) apresentaram anticorpos neutralizantes reagentes com o vírus utilizado. Paralelamente, para a detecção de genomas de pestivírus, foi desenvolvida uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) capaz de detectar os três tipos conhecidos de BVDV (1, 2 e 3) e otimizada para o exame das amostras de soros bubalinos. Cinco amostras (2,8 %) continham genomas virais, sugerindo a ocorrência de prováveis infecções persistentes nos animais, semelhante ao que ocorre em bovinos. Os resultados obtidos evidenciam a circulação de herpesvírus e pestivírus nas populações bubalinas analisadas. Mais estudos são necessários para definir quais os agentes efetivamente causadores de infecções nesta espécie animal. / Bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1), 5 (BoHV-5) and bovine viral diarrhoea virus (BVDV) are major causes of sanitary and economic losses in cattle. These agents have been eventually detected in water buffaloes (Bubalus bubalis), although their role in host species biology is unknown. Buffalo production has had significant increase in Brazil, where these animals are often kept close to or in association with cattle. As part of a wider project on infections with BoHV-1, BoHV-5, BuHV-1 and BVDV in buffaloes, the present study aimed to examine the occurrence of neutralizing antibodies in buffaloes serum samples collected in farms from Rio Grande do Sul State. Three hundred and thirty nine serum samples were collected from animals with ages above 12 months, of both genders, of different races and under different management practices. The animals were not vaccinated for any virus studied in the present study and were all clinically healthy at the time of sample collection. For neutralizing antibodies detection, serum samples were tested in serum neutralization (SN) tests against different herpesviruses: BoHV-1.1 (strain LA), BoHV-5b (strain A663) e BuHV-1 (strain b6). One hundred and eight of theses samples were additionally examined with BoHV-1.1 (strain EVI123/98) and BoHV-1.2 (strain SV265/96), to compare SN sensitivity using all available variants of BoHV-1 and BoHV-5 as challenge viruses. The SN sensitivity was lower when results obtained with each virus were considered separately. Sensitivity was maximum when the positive results against strain LA, SV265/96 and A663 were added. Despite this, the SN did not allow the identification of the virus which had actually infected animals, in view of the high degree of antibody cross-reactivity. In order to assess the circulation of pestiviruses, SN tests were carried out using the sample "Oregon C24V" of BVDV-1 as challenge virus. Out of the 176 analyzed samples, 19 (10.8 %) presented neutralizing antibodies to pestivirus. At the same time, for the detection of genomes of pestiviruses, was developed a quantitative polymerase chain reaction (qPCR) able to detect the three known types of BVDV (1, 2 and 3) and optimized for examining bubaline sera. Five samples (2.8 %) contained viral genomes, suggesting the occurrence of persistent infections in animals, analogous to what occurs in cattle. The results obtained confirm circulation of herpesvírus and pestiviruses in examined buffalo populations. Further studies are needed to define which of these viruses effectively infect this animal species.