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Modulação da sinalização celular e do complexo de início de tradução como estratégias para o tratamento do carcinoma de células renais / Cell signaling and translation initiation complex modulation as strategies to the treatment of renal cell carcinoma

Costa, Luciano José Megale 21 November 2005 (has links)
Introdução: O carcinoma de células renais (CCR) representa uma causa crescente de mortalidade por câncer. Apesar da sua curabilidade em estádios iniciais, agentes citotóxicos e imunomodulatórios têm homogeneamente alcançado nenhum ou pouco benefício no tratamento do CCR avançado. Um melhor entendimento da biologia tumoral pode levar ao desenvolvimento de terapias mais eficientes e dirigidas aos mecanismos moleculares de manutenção do tumor. Sinalização aumentada através do receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR), sistema de quinases proteicas ativadas por mitógenos (MAPK) e via da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) assim como estimulação do complexo de início de tradução (CIT) foram caracterizados em linhagens celulares e amostras tumorais de CCR. Nós investigamos o efeito de um inibidor de EGFR (gefitinibe), de um inibidor de MAPK (UO126) e de um inibidor do CIT (rapamicina) nos intermediários de sinalização celular e nos elementos do CIT assim como no crescimento in vitro de linhagens celulares de CCR. Métodos: Linhagens celulares de CCR (PRC3, WT8, SKRC-02, SKRC-17, SKRC-39, SKRC-45, ACHN e KRCY) foram mantidas em condições ideais para a cultura de células de mamíferos e expostas a drogas e/ou inibidores nas concentrações e por períodos de tempo variáveis. A fosforilação de intermediários da sinalização celular foi determinada utilizando-se western blots. Nível de mRNA para genes de interesse foram determinados por qRT-PCR. Crescimento celular foi avaliado por método colorimétrico em diferentes concentrações de gefitinibe, UO126 e rapamicina, isoladamente ou em combinação. Resultados: UO126 levou a defosforilação não apenas de intermediários de MAPK como também de substratos do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) revelando sinalização cruzada entre essas vias. Nós identificamos ainda que ERK5 é a quinase potencialmente responsável por esta sinalização cruzada. No entanto, tratamento com UO126 não afetou o nível de mRNA para o substrato de mTOR 4EBP1. Gefitinibe foi capaz de bloquear a sinalização iniciada por EGF na via de PI3K em todas as linhagens wt-PTEN e de bloquear a sinalização através de ERK1/2 e ERK5 ao menos parcialmente em todas as linhagens celulares. Rapamicina mostrou-se um potente inibidor do crescimento na maioria das linhagens celulares de CCR e tal efeito foi freqüentemente amplificado com a combinação com UO126 ou gefitinibe.Conclusão: EGFR, MAPK e CIT são alvos promissores no tratamento do CCR / Background: Renal cell carcinoma (RCC) is an increasing cause of cancer mortality. Despite its curability in early stages, conventional cytotoxic and immunomodulatory agents have been homogeneous in providing minimal or no benefit in the treatment of advanced RCC. Better understanding of tumor cell biology may lead to development of more efficient targeted therapies. Signaling intensification through epithelial growth factor receptor (EGFR), mitogenactivated protein kinase (MAPK) pathway, Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway and overactivation of the translation initiation complex (TIC) has been previously characterized in RCC cell lines and tumor samples. We investigated the effect of an EGFR inhibitor (gefitinib) as well as a MAPK inhibitor (UO126) and a TIC inhibitor (rapamycin) in the intermediates of cell signaling, in the elements of TIC and in the in vitro growth of RCC cell lines. Methods: RCC cell lines (PRC3, WT8, SKRC-02, SKRC-17, SKRC-39, SKRC-45, ACHN and KRCY) were maintained on standard mammalian cells culture conditions and exposed to drugs and/or inhibitors in variable concentrations and for variable periods of time as required in each experiment. Phosphorylation status of signaling intermediates were determined using western blots. Levels of mRNA for genes of interest were determined by qRT-PCR. Cell growth was assessed by colorimetric method in control conditions or in different concentrations of gefitinib, UO126 or rapamycin, alone or in combination. Results: UO126 caused dephosphorylation not only of MAPK intermediates but also of mammalian target of rapamycin (mTOR) substrates revealing crosstalk between these pathways. We also identified ERK5 as a kinase potentially responsible for such cross talk. However, treatment with UO126 did not affect mRNA levels of the downstream target of mTOR 4EBP1. Gefitinib was able to block EGF signaling through PI3K in all wt- PTEN cell lines and the signaling through ERK1/2 and ERK5 at least partially in all cell lines. Rapamycin was found to be a potent growth inhibitor in most RCC cell lines and such effect was often increased by its combination with UO126 or gefitinib. Conclusion: EGFR, MAPK and CIT are promising targets for the treatment of RCC
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Imunodiagnóstico da infecção por Strongyloides stercoralis em pacientes candidatos a transplante / Immunodiagnosis of Strongyloides stercoralis infection in patients eligible for transplantation

Maiara Gottardi 14 October 2014 (has links)
A estrongiloidíase é uma infecção intestinal causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. A maioria dos casos evolui para um quadro crônico benigno; entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação, sobretudo em pacientes imunodeprimidos. Os métodos parasitológicos convencionais apresentam baixa sensibilidade e, com isso, os testes sorológicos podem representar uma boa alternativa para o diagnóstico dessa helmintíase. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as técnicas de RIFI, ELISA e WB para o diagnóstico da estrongiloidíase em pacientes candidatos a transplante. Para validação dos testes, foram utilizadas amostras de soros de pacientes imunocompetentes (positivos para S. stercoralis, positivos para outras parasitoses e negativos). Foram utilizadas amostras de fezes e soros de pacientes candidatos a transplante, a saber: 50 para transplante renal; 50 para transplante de fígado; 50 para transplante de medula óssea. As amostras fecais de todos os pacientes foram analisadas pelas técnicas de sedimentação espontânea, Rugai, e cultura em placa de ágar. Para a execução das técnicas sorológicas foram utilizadas como fonte de antígeno larvas filarioides de S. venezuelensis. Para a RIFI, os soros foram diluídos a 1:40 em tampão PBS-TM e o conjugado anti-IgG humano marcado com fluoresceína diluído 1:500 em PBS acrescido de 4% de azul de Evans, sendo realizada a leitura em microscópio de imunofluorescência, utilizando as objetivas de 20X e 40X. Para a técnica ELISA foram utilizadas placas poliestireno sensibilizadas com 10?g de antígeno (frações solúveis salina e alcalina), soro dos indivíduos diluídos a 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBS-TM) e conjugado (anti-IgG humana peroxidase) em PBS-TM. As amostras foram consideradas positivas quando o índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB, os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBS-TM. Dos 150 pacientes candidatos a transplante analisados, 9,3% (n=14) foram positivos pelas técnicas parasitológicas, sendo que a cultura em placa de ágar detectou 6,6% (n=10). Na RIFI a soropositividade para detecção da infecção por S. stercoralis foi de 16,6% (n=25), sendo, 22% transplante renal, 18% hepático e 10% medula óssea. Pela técnica ELISA a soropositividade foi de 11,3% (n=17), sendo 14% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 3% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 24,6% (n=37), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 50% hepático e 6% medula óssea, utilizando o antígeno salino. Pela técnica WB a soropositividade foi de 20,6% (n=31), sendo 18% nos pacientes candidatos a transplante renal, 32% hepático e 12% medula óssea, utilizando o antígeno alcalino, e 18,6% (n=28) sendo 10% nos pacientes candidatos a transplante renal, 14% hepático e 32% medula óssea, utilizando o antígeno salino. A utilização de técnicas imunodiagnósticas pode ser indicada na triagem de pacientes em fila de transplante, devendo-se levar em conta as limitações de reações sorológicas em pacientes imunodeprimidos / Strongyloidiasis is an intestinal infection caused by the nematode Strongyloides stercoralis. Most cases progress to a benign chronic condition; however hyperinfection and dissemination may occur, especially in immunocompromised patients. Conventional parasitological methods have low sensitivity and, thus, serological tests may be a good alternative for the diagnosis of this helminthiasis. The aim of this study was to evaluate RIFI, ELISA and WB techniques for the diagnosis of strongyloidiasis in patients candidates for transplants. In order to validate the tests samples of sera from immunocompetent patients (positive for S. stercoralis, positive for other parasitosis, and negatives) were used. Feces and sera samples of patients candidates for transplants were used as follows: 50 for renal transplant, 50 for liver transplant, 50 for bone marrow transplant. Fecal samples of all patients were analyzed by spontaneous sedimentation, Rugai and Agar plate culture techniques. Filarioid larvae of S. venezuelensis were used as source of antigen for serological tests. For RIFI, sera were diluted 1:40 in PBS-TM buffer and human anti-IgG conjugate labeled with fluorescein was diluted 1:500 in PBS with 4% Blue Evans, reading being performed in immunofluorescence microscope using 20X and 40X objectives. For ELISA technique polystyrene plates sensitized with 10?g of antigen (saline and alkaline soluble fractions), individual sera diluted at 1:200 in PBS 0.05% Tween 3% of milk (PBS-TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM were used. Samples were considered positive when ELISA index was higher than 1. For WB technique, sera were diluted in Tris-HCl 5% of milk (TM) and conjugate (human anti-IgG peroxidase) in PBS-TM. From 150 patients candidates for transplants analyzed 9.3% (n=14) were positive by parasitological techniques, agar plate culture detected 6.6% (n=10). In RIFI seropositivity for S. stercoralis infection detection was 16.6% (n=25) being 22% renal transplant, 18% hepatic and 10% for bone marrow. By ELISA technique seropositivity was 11.3% (n=17), being 14% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 3% bone marrow, using alkaline antigen and 24.6% (n=37), being 18% in patients candidates for renal transplant, 50% hepatic and 6% bone marrow, using saline antigen. By WB technique seropositivity was 20.6% (n=31), being 18% in patients candidates for renal transplant, 32% hepatic and 12% bone marrow, using alkaline antigen, and 18.6% (n=28) being 10% in patients candidates for renal transplant, 14% hepatic and 32% bone marrow, using saline antigen. Application of immunodiagnostic techniques could be indicated in screening of patients in transplant waiting list, however limitations of serological reactions in immunodepressed patients should be considered
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Modulação da sinalização celular e do complexo de início de tradução como estratégias para o tratamento do carcinoma de células renais / Cell signaling and translation initiation complex modulation as strategies to the treatment of renal cell carcinoma

Luciano José Megale Costa 21 November 2005 (has links)
Introdução: O carcinoma de células renais (CCR) representa uma causa crescente de mortalidade por câncer. Apesar da sua curabilidade em estádios iniciais, agentes citotóxicos e imunomodulatórios têm homogeneamente alcançado nenhum ou pouco benefício no tratamento do CCR avançado. Um melhor entendimento da biologia tumoral pode levar ao desenvolvimento de terapias mais eficientes e dirigidas aos mecanismos moleculares de manutenção do tumor. Sinalização aumentada através do receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR), sistema de quinases proteicas ativadas por mitógenos (MAPK) e via da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) assim como estimulação do complexo de início de tradução (CIT) foram caracterizados em linhagens celulares e amostras tumorais de CCR. Nós investigamos o efeito de um inibidor de EGFR (gefitinibe), de um inibidor de MAPK (UO126) e de um inibidor do CIT (rapamicina) nos intermediários de sinalização celular e nos elementos do CIT assim como no crescimento in vitro de linhagens celulares de CCR. Métodos: Linhagens celulares de CCR (PRC3, WT8, SKRC-02, SKRC-17, SKRC-39, SKRC-45, ACHN e KRCY) foram mantidas em condições ideais para a cultura de células de mamíferos e expostas a drogas e/ou inibidores nas concentrações e por períodos de tempo variáveis. A fosforilação de intermediários da sinalização celular foi determinada utilizando-se western blots. Nível de mRNA para genes de interesse foram determinados por qRT-PCR. Crescimento celular foi avaliado por método colorimétrico em diferentes concentrações de gefitinibe, UO126 e rapamicina, isoladamente ou em combinação. Resultados: UO126 levou a defosforilação não apenas de intermediários de MAPK como também de substratos do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) revelando sinalização cruzada entre essas vias. Nós identificamos ainda que ERK5 é a quinase potencialmente responsável por esta sinalização cruzada. No entanto, tratamento com UO126 não afetou o nível de mRNA para o substrato de mTOR 4EBP1. Gefitinibe foi capaz de bloquear a sinalização iniciada por EGF na via de PI3K em todas as linhagens wt-PTEN e de bloquear a sinalização através de ERK1/2 e ERK5 ao menos parcialmente em todas as linhagens celulares. Rapamicina mostrou-se um potente inibidor do crescimento na maioria das linhagens celulares de CCR e tal efeito foi freqüentemente amplificado com a combinação com UO126 ou gefitinibe.Conclusão: EGFR, MAPK e CIT são alvos promissores no tratamento do CCR / Background: Renal cell carcinoma (RCC) is an increasing cause of cancer mortality. Despite its curability in early stages, conventional cytotoxic and immunomodulatory agents have been homogeneous in providing minimal or no benefit in the treatment of advanced RCC. Better understanding of tumor cell biology may lead to development of more efficient targeted therapies. Signaling intensification through epithelial growth factor receptor (EGFR), mitogenactivated protein kinase (MAPK) pathway, Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway and overactivation of the translation initiation complex (TIC) has been previously characterized in RCC cell lines and tumor samples. We investigated the effect of an EGFR inhibitor (gefitinib) as well as a MAPK inhibitor (UO126) and a TIC inhibitor (rapamycin) in the intermediates of cell signaling, in the elements of TIC and in the in vitro growth of RCC cell lines. Methods: RCC cell lines (PRC3, WT8, SKRC-02, SKRC-17, SKRC-39, SKRC-45, ACHN and KRCY) were maintained on standard mammalian cells culture conditions and exposed to drugs and/or inhibitors in variable concentrations and for variable periods of time as required in each experiment. Phosphorylation status of signaling intermediates were determined using western blots. Levels of mRNA for genes of interest were determined by qRT-PCR. Cell growth was assessed by colorimetric method in control conditions or in different concentrations of gefitinib, UO126 or rapamycin, alone or in combination. Results: UO126 caused dephosphorylation not only of MAPK intermediates but also of mammalian target of rapamycin (mTOR) substrates revealing crosstalk between these pathways. We also identified ERK5 as a kinase potentially responsible for such cross talk. However, treatment with UO126 did not affect mRNA levels of the downstream target of mTOR 4EBP1. Gefitinib was able to block EGF signaling through PI3K in all wt- PTEN cell lines and the signaling through ERK1/2 and ERK5 at least partially in all cell lines. Rapamycin was found to be a potent growth inhibitor in most RCC cell lines and such effect was often increased by its combination with UO126 or gefitinib. Conclusion: EGFR, MAPK and CIT are promising targets for the treatment of RCC
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Análise da expressão de proteínas envolvidas no manejo de cálcio cardíaco nos répteis píton (Python molurus), cascavel sul-americana (Crotalus durissus terrificus) e jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris) em jejum e nos períodos digestivo e pós-absortivo

Vasconcelos, Eliton da Silva 18 December 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6572.pdf: 3046018 bytes, checksum: a72ab59cf0526c45a9dee765c02c9f7c (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA), phospholamban (PLB) and the Na+-Ca2+ exchanger (NCX) proteins are essential for the cardiac calcium management and myocardial contractility in vertebrates. The increase in metabolic rate generated from mechanical and physiological process of digestion is known as specific dynamic action (SDA) and represents the energy cost of processing, digestion and absorption of food. In several groups of reptiles, feeding generates a rapid increase in rates of gas exchange, whose peak usually occurs one or two days after feeding, before suffering a slower decline and returning to preprandial values. Ingestion of large quantity of food demands a metabolic elevation and leads to indemnities related in ventricular mass and an increase in myocardial force contraction, avoiding an overload on the cardiovascular system. During the fasting, depletion of body mass occurs and it can also reach the heart muscle. To describe the importance and the changes in SERCA2, PLB and NCX proteins on the effects of feeding/digestion in reptiles broad-snouted caiman (Caiman latirostris), burmese phyton (Python molurus) and also by prolonged fasting in South-American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) Western blotting technique was used. We observed the homology existence between the proteins of reptiles in relation to mammals. The SDA increased expression of SERCA2 protein in three species of reptiles. The SDA can also have unduced the expression of an isoform and/or reduced phosphorylation at some active sites of SERCA2 in ventricular tissue of P. molurus. A direct relationship between the expression of SERCA2 with the PLB expression in C. durissus was observed. However in P. molurus and C. latirostris this relation does not exist. The three reptiles expressed the PLB with molecular mass of 50 kDa, whereas the mouse expressed 25 kDa. The vast evolutionary distance that separates mammals of reptiles may have caused the rise of isoforms between these groups, explaining this difference. The increased expression of NCX along with lower expression of SERCA2 and PLB in C. durissus in food group Fasting compared to the other two groups suggests a higher calcium mobilization in this feeding regime, which would be advantageous from the energy point of view. The expression of NCX with different molecular mass between the three species, a smaller number of consensus regions with the animals phylogenetically more distant and the great plasticity of NCX gene to form distinct proteins, suggest the expression of proteins isoforms with the reptiles studied in this research. / As proteínas Ca2+-ATPase do Retículo Sarcoplasmático (SERCA2), Fosfolambam (PLB) e o Trocador Na+/Ca2+ (NCX) são fundamentais para o manejo do cálcio e a contratilidade miocárdica nos vertebrados. A elevação da taxa metabólica gerada a partir dos processos mecânicos e fisiológicos da digestão é conhecida como "ação dinâmica específica" (SDA) e representa o custo energético do processamento, digestão e absorção dos alimentos. Em vários grupos de répteis, a alimentação gera um rápido aumento nas taxas de troca gasosa, cujo pico ocorre geralmente um dia ou dois após a alimentação, antes de sofrer um declínio mais lento e retornar aos valores pré-prandiais. A ingestão de grandes massas de alimento demanda uma elevação metabólica e leva a uma compensação na massa ventricular e um aumento na força de contração do miocárdio, evitando uma sobrecarga no sistema cardiovascular. Durante o jejum ocorre depleção da estrutura corpórea podendo também atingir o músculo cardíaco. Para descrever a importância e as mudanças nas proteínas SERCA2, PLB e NCX diante os efeitos da alimentação/digestão nos répteis cascavel sul-americana (Crotalus durissus terrificus), na píton (Python molurus) e também do jejum prolongado no jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris), utilizada a técnica molecular Western blotting. Observou-se a existência de homologia entre as proteínas dos répteis com relação aos mamíferos. A SDA levou a uma maior expressão da proteína SERCA2 nas três espécies de répteis. A SDA também pode ter induzido a expressão de uma isoforma e/ou uma menor fosforilação em alguns sítios ativos da SERCA2 no tecido ventricular de P. molurus. Uma relação direta entre a expressão da SERCA2 com a expressão do PLB foi verificada somente em C. durissus, não havendo tal relação em P. molurus e C. latirostris. As três espécies de répteis expressaram o PLB com mesma massa molecular, de 50 kDa, e diferente da do rato, que é de 25 kDa. A grande distância evolutiva que separa os répteis dos mamíferos pode ter ocasionado o surgimento de isoformas entre esses grupos, explicando tal diferença. O aumento da expressão do NCX em C. latirostris do grupo alimentar Digestão sugere uma maior mobilização do cálcio e um maior inotropismo de forma frequência-específica através dessa proteína. A maior expressão do NCX juntamente com a menor expressão da SERCA2 e do PLB em C. durissus no grupo alimentar Jejum em relação aos outros dois grupos alimentares sugere uma maior mobilização do cálcio pelo NCX nesse regime de alimentação, o que seria vantajoso do ponto de vista energético. A expressão do NCX com diferentes massas moleculares entre as três espécies estudadas, um menor número de regiões conservadas em animais filogeneticamente mais distantes, e a grande plasticidade do gene da proteína NCX em formar proteínas distintas, sugere a expressão de proteínas isoformas nos répteis estudados.
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O papel dos micros RNAs 143 e 145 e seus genes alvo na etiopatogenia da hiperplasia prostática benigna / The role of micro RNAs 143 and 145 and their target genes in the etiopathogenesis of benign prostatic hyperplasia

Nayara Izabel Viana 04 December 2012 (has links)
Introdução: A hiperplasia prostática benigna (HPB) é apontada como um dos mais comuns problemas de saúde associado ao envelhecimento dos homens. A incidência da doença começa a aumentar a partir dos 40 anos de idade, e se torna frequente em cerca de 50% dos homens com 50 anos e em quase 90% dos homens após a oitava década. A etiopatogenia da HPB ainda não foi totalmente elucidada, mas sabe-se que alguns fatores aumentam os riscos de aparecimento do problema. Seu melhor entendimento contribuiria substancialmente para o estabelecimento de um consenso terapêutico para a doença. Nesse sentido, os marcadores moleculares têm sido pesquisados na tentativa de auxiliar ou mesmo suplantar a eficiência dos métodos tradicionais. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNA regulatórios (19-25 nucleotídeos), não codificadores que possuem um papel fundamental no controle da expressão gênica. Essas pequenas moléculas estão envolvidas em vários processos celulares fisiológicos e patológicos. Alguns estudos demonstraram que os miRNAs 143 e 145 têm papel fundamental na diferenciação e proliferação celular da musculatura lisa. A ação de miRNAs na HPB ainda foi pouco explorada. Objetivos: Analisar a expressão do miR-143 e de seus genes e proteínas alvo ERK5 e KRAS e do miR-145 e dos seus genes e proteínas alvo MAP3K3 e MAP4K4, em pacientes portadores de HPB e comparar os perfis de expressão destes com parâmetros clínicos dos pacientes. Material e Métodos: Para análise dos miRNAs e dos seus genes alvo, foram estudados 44 pacientes diagnosticados com HPB submetidos à ressecção transuretral da próstata ou prostatectomia aberta. A análise da expressão foi realizada pela técnica de RT-PCR quantitativo. O grupo controle foi composto de tecido prostático normal de dois pacientes jovens doadores de órgãos. A análise proteica foi feita a partir de 38 pacientes, pela técnica de Western Blotting. Resultados: Os miRNA 143 e 145, apresentaram superexpressão em 62,5% e 73,8% dos casos, respectivamente. O gene ERK5 apresentou subexpressão de 59,4%, evidenciando um possível controle negativo por parte do miR-143. O gene MAP4K4 apresentou subexpressão na totalidade das amostras estudadas, demonstrando um possível controle por parte do miR-145. Os genes KRAS e MAP3K3 apresentaram superexpressão de 79,4% e 61,5% das amostras, respectivamente. De acordo com a expressão proteica, encontramos perfis semelhantes aos da expressão gênica. Foi encontrada maior expressão das proteínas KRAS e MAP3K3. Considerando a expressão gênica e proteica comparadas aos parâmetros clínicos, somente a proteína ERK5 apresentou significância (p=0,019), estando mais presente em pacientes com próstatas > 60 gramas. Conclusão: A superexpressão dos miRNAs 143 e 145 encontrada neste estudo pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB alterando a homeostase do tecido fibromuscular principalmente, controlando proliferação e diferenciação. A superexpressão gênica e a forte expressão proteica de KRAS também pode estar envolvida na etiopatogenia da HPB, já que esta molécula quando ativada é responsável pelo estímulo de vias que resultam na proliferação, sobrevivência, motilidade celular e tráfego intracelular. A superexpressão do MAP3K3 pode estar sendo responsável pela angiogênese que ocorre em HPB. A subexpressão de MAP4K4, neste caso possivelmente controlada por miR-145, pode estar deixando de regular negativamente mTOR, gerando uma proliferação celular irregular responsável pela HPB. A detecção das proteínas em níveis semelhantes aos que foram encontrados na expressão gênica reforça estas hipóteses. / Introduction: Benign prostatic hyperplasia (BPH) is one of the most common male health problems associated with aging. The incidence of disease starts to increase after 40 years, and compromises half of men in the fifths and almost 90% over 80 years. The pathogenesis of BPH has not been fully elucidated, but it is known that some factors increase the risk of occurrence of the problem. A better understanding of BPH pathogenesis would substantially contribute to the establishment of a therapeutic consensus for the disease. Thus, molecular markers have been investigated attempting to help or even overcome the efficiency of traditional methods. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding regulatory RNA (19-25 nucleotides) that plays a key role in gene expression control. These small molecules are involved in various physiological and pathological cellular processes. Some studies have shown that miRNAs 143 and 145 play a fundamental role in cellular differentiation and proliferation of smooth muscles. The action of miRNAs in BPH has been poorly explored. Objectives: Analyze the expression of miR-143 and its target genes and proteins ERK5 and KRAS and miR-145 and its target genes and proteins MAP3K3 and MAP4K4, in patients with BPH and compare their expression profiles with clinical parameters of patients. Material and Methods: For analysis of miRNAs and its target genes, we studied 44 patients diagnosed with BPH undergoing transurethral resection of the prostate or open prostatectomy. The expression analysis was performed by quantitative RT-PCR. Control group consisted of normal prostate tissue from two young patients organ donors. Protein analysis was done from of 38 patients using Western Blotting technique. Results: miR-143 and 145 presented overexpression in 62.5% and 73.8% of cases, respectively. The ERK5 gene demonstrated underexpression in 59.4%, indicating a possible control by the miR-143. MAP4K4 gene showed underexpression in 100% of samples and could be under a potential control by the miR-145. KRAS and MAP3K3 genes revealed overexpression of 79.4% and 61.5% of cases, respectively. According protein expression, to find similar profiles of gene expression. We found an increased expression of the proteins MAP3K3 and KRAS. Considering the gene expression and protein compared to clinical parameters, only the protein ERK5 showed significance (p = 0.019), being more present in patients with prostates > 60 grams. Conclusions: Overexpression of miRNAs 143 and 145 found in this work may be involved in the pathogenesis of BPH mainly by changing the fibromuscular tissue homeostasis, controlling proliferation and differentiation. Overexpression of KRAS may also be involved in the pathogenesis of BPH, since this molecule when activated can trigger cell proliferation, survival, intracellular trafficking and motility. Overexpression of MAP3K3 can be responsible for BPH angiogenesis. The MAP4K4 underexpression, in this case possibly controlled by miR-145 overexpression, could inhibit mTOR pathway, leading to irregular cell proliferation responsible for disease. Detection of proteins at similar levels to those found in gene expression reinforce our hypothesis.
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"Efeito modulatório da nicotina sobre a neurotransmissão em núcleos encefálicos responsáveis pelo controle cardiovascular em ratos geneticamente hipertensos e normotensos" / "Nicotine modulatory effects on neurotransmiter systems in the cardiovascular brain areas of spontaneously hypertensive and normotensive rats"

Merari de Fatima Ramires Ferrari 25 May 2006 (has links)
As ações cardiovasculares decorrentes do tabagismo devem-se principalmente à nicotina. O alcalóide exerce suas funções quando na corrente sangüínea, mas também atravessa a barreira hemato-encefálica onde pode participar da regulação de sistemas de neurotransmissão importantes para o controle central da pressão arterial e, eventualmente, desenvolvimento da hipertensão. Portanto, o abuso à nicotina pode ser especialmente relevante para indivíduos com predisposição genética à hipertensão. Desta forma, os objetivos do presente trabalho foram o de estudar os sistemas de neurotransmissão em núcleos encefálicos envolvidos no controle cardiovascular após tratamento crônico periférico com nicotina, assim como avaliar a influência da nicotina sobre o desenvolvimento da hipertensão essencial em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e compará-los a ratos normotensos (WKY). Para isso, utilizaram-se técnicas como a imunohistoquímica, análise da ligação de receptores, hibridização in situ, cultura de células neuronais e gliais, PCR em tempo Real e Western Blotting. Nossos resultados demonstraram que o tratamento crônico com nicotina não só antecipou o desenvolvimento como também intensificou a hipertensão nos animais SHR. Os ratos WKY não tiveram a pressão arterial alterada. De modo geral, o efeito do alcalóide sobre os sistemas catecolaminérgico e do neuropeptídeo Y não parece ter relação com a antecipação e a intensificação da hipertensão nos ratos SHR. O sistema glutamatérgico está, pelo menos em parte, relacionado à antecipação e intensificação da hipertensão em ratos SHR após exposição crônica à nicotina. O tratamento com nicotina gerou evidências de que o alcalóide interage com o sistema angiotensinérgico a fim de promover a hipertensão em ratos SHR. Por fim, os resultados apresentados aqui indicam que a nicotina modula diferentes sistemas de neurotransmissão, os quais podem estar envolvidos na antecipação e intensificação da hipertensão em ratos SHR submetidos ao tratamento com nicotina. / Nicotine is one of the most important agents for cardiovascular diseases in tobacco smoking. This alkaloid acts in the blood stream, but it also crosses the blood-brain-barrier and participate in the regulation of pivotal neurotransmitter systems for the blood pressure control and, eventually, for hypertension development. In this context, nicotine abuse could be very relevant to individuals carrying genetic factors to hypertension. The objectives of the present work were to study neurotransmitter system in brain cardiovascular areas involved in the control of blood pressure after chronic peripheral nicotine exposure, as well as to evaluate nicotine influence on essential hypertension development in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive rats (WKY). By means of immunohistochemistry, binding, in situ hybridization, neuron and glial culture, real time PCR and Western Blotting, we have demonstrated that chronic treatment with nicotine not only anticipated but also intensified hypertension on SHR. WKY rats did not showed any change on blood pressure. We observed no evidences of the involvement of neuropeptide Y and catecolamines systems in the development of hypertension after nicotine treatment. However, it seems that the glutamatergic system is, at least in part, responsible for the hypertension development after chronic nicotine exposure. To study the angiotensinergic system we cultivated neuron and glial cells from SHR and WKY rats and treated them with nicotine. The responses of this system agree with the hypothesis that nicotine interacts with angiotensin to promote hypertension only in the hypertensive strain. In conclusion, results presented herein support the hypothesis that nicotine modulates neurotransmitter systems that might have relevant functions in the development and intensification of hypertension in SHR.
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Diagn?stico da infec??o por Cystoisospora felis (Wenyon, 1923) Frenkel, 1977 (Apicomplexa: Cystoisosporinae) pelo "Western Blotting" em animais de produ??o: bovinos / Diagnosis of Cystoisospora felis (Wenyon, 1923) Frenkel, 1977 (Apicomplexa: Cystoisosporinae) infection by Western Blotting in farm animals: bovines

MEIRELES, Gisele Santos de 27 February 2013 (has links)
Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-10-24T18:46:15Z No. of bitstreams: 1 2013 - Gisele Santos de Meireles.pdf: 16741114 bytes, checksum: 1d4b03cbd2287a0984257f70efb149da (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-24T18:46:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013 - Gisele Santos de Meireles.pdf: 16741114 bytes, checksum: 1d4b03cbd2287a0984257f70efb149da (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CAPES / FAPERJ / This study aimed to determine from the protein profile of oocysts of Cystoisospora felis recovered from the sequential use of various purification techniques adapted for specific use in sporulated oocysts of C. felis. With the aid of SDS-PAGE 12% resulted in identification of 25 groups of protein: 266, 240, 186, 165, 140, 119, 112, 105, 98, 90, 78, 55, 47, 42, 37, 35, 30, 27-28, 25, 22, 19, 18, 16, 14 kDa belonging to the structure of sporulated oocysts and sporozoites of C. felis. Based on this results and heterologous bovine serum anti-C. felis was possible to determine polypeptides dominant relevant to diagnostic immunoassay technique with "Western Blotting", these being immunodominant bands: P208, P138, P113, p106, p62, p56, p51, p48, p44, p38, p36, and p33 p27. In order to avoid misdiagnosis from cross-reactivity a positive control serum anti-C. felis was compared to with positive serum anti-Toxoplasma and Neospora in order to exclude the common protein bands, probably markers of gender and group to identify cattle infected naturally or experimentally with C. felis. As showed, the following specific antigenic protein units: p 206-208, P137-139, p112- 113, p104-107, p27-28 are responsible for determining the animal tested positive or not for Cystoisospora felis. Of the analysis of the variables could be observed that the presence of felines related to the handling, size and type of milking properties facilitates dispersion C. felis. / Este trabalho teve por objetivo, diagnosticar a infec??o por Cystoisospora felis em bovinos atrav?s do Western Blotting, apartir de oocistos obtidos com o uso sequencial de v?rias t?cnicas de purifica??o adaptadas para o uso em oocistos esporulados de C. felis. Com o aux?lio do SDS-PAGE a 12 % resultou na identifica??o de 25 grupos proteicos de: 266; 240; 186; 165; 140; 119, 112, 105, 98, 90, 78, 55, 47, 42, 37, 35, 30, 27-28, 25, 22, 19, 18, 16, 14 KDa, pertencentes a estrutura dos oocistos esporulados e esporozoitas de C. felis. Com base nesse resultado e em soro de bovino heter?logo anti-C. felis foi poss?vel determinar os polipept?deos dominantes relevantes ? t?cnica de diagn?stico imunoenzimatico com ?Western Blotting?, sendo estas, as bandas imunodominantes: p208, p138, p113, p106, p62, p56, p51, p48, p44, p38, p36, p33 e p27. A fim de evitar o diagn?stico equivocado a partir de rea??es cruzadas foi feita a compara??o do soro controle positivo anti-C. felis com o soro positivo anti-Toxoplasma e Neospora com o intuito de excluir as bandas proteicas comuns, prov?veis marcadoras de g?nero e grupo para identifica??o de bovinos infectados de maneira natural ou experimental com C. felis. Sendo evidenciadas, as seguintes unidades proteicas antig?nicas espec?ficas: p 206-208, p137-139, p112-113, p104-107, p27-28 respons?veis por determinar a positividade dos animais testados para C. felis. A partir das an?lises das vari?veis foi poss?vel observar que a presen?a de felinos associados, ao manejo, tipo de ordenha e tamanho das propriedades facilita a dispers?o de C. felis.
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Mecanismo de transdução de sinal na próstata de cão : avaliação nas vias da p-ERK1/2 e da CYR61 /

Oliveira, Kellen de Sousa. January 2009 (has links)
Resumo: O aumento da glândula prostática canina com o envelhecimento pode ser decorrente de uma proliferação excessiva do estroma e epitélio acinar, uma diminuição na taxa de apoptose, entre outros. Esses processos celulares são mediados por hormônios, fatores de crescimento e proteínas, dentre elas podemos citar as proteínas CYR61 e p-ERK1/2 e os fatores de crescimento EGF, TGF- e EGFr. Próstatas originadas de 29 cães, com pesos variando entre 6 a 40 kg, foram retiradas, lavadas e pesadas e o volume medido, os valores variaram em 3,8 a 130 g e 2,4 a 90 cm3 respectivamente. Dos fragmentos avaliados 55,17% apresentaram diagnóstico de HPB-ep e 5,75% apresentaram diagnóstico normal. Exames de IHQ foram realizados e para a proteína CYR61 houve uma forte imunorreatividade nas FML, MLA e núcleo das células epiteliais dos fragmentos avaliados. Houve diferenças estatísticas entre grupos de HPB quanto a fração da área de marcação, no exame de W.B. a proteína teve como peso molecular médio 37,72 kDa. Quanto ao EGF houve uma predominância de marcação na FML e núcleo das células epiteliais, os pesos moleculares médio deste fator de crescimento foi de 47,03 e 41,65 kDa nos fragmentos prostáticos avaliados. O TGF- teve imunorreatividade nas FML e citoplasma das células epiteliais, e no exame de W.B. houve 2 bandas de pesos moleculares médios de 52,23 e 38,88 kDa. O receptor de membrana EGFr apresentou imunorreatividade nas FML e núcleo das células epiteliais, no W.B. houve apenas uma banda visível de peso molecular médio de 48,49 kDa. A proteína p-ERK1/2 esteve predominante nas FML e núcleo das células e no W.B. apresentou 3 bandas de pesos moleculares médios de 42,61; 39,56 e 37,26 kDa. Houve correlação positiva entre as proteínas e os fatores de crescimento. / Abstract: The canine prostate gland enlargement also aging could be resulting of excessive stroma and acinar epithelium proliferation, reduced apoptosis, among other. These cellular mechanisms are mediated by hormones, growth factors and proteins, like the proteins CYR61 and p-ERK1/2 and the growth factors EGF, TGF- e EGFr. Prostate from 29 dogs, weighing 6 to 40 kg, were collected, washed, wheighed and volume was measured, with average from 3,8 to 130 g and 2,4 to 90 cm3 respectively. Approximately 55,17% of samples were diagnosed with HPB-ep and 5,75% were normal. IHQ exams were accomplished and high CYR61 immunoreactivity in SMF, ASM and epithelial cells nucleus was observed. There were statistical differences between BHP groups related to immunoreactivity area, by means of W. B. and the mean molecular weight was 37,72 kDa. By analyzing EGF, immunoreactivity in SMF epithelial cells nucleus was prevalent, the mean molecular weights was 47,03 41,65 kDa. TGF- presented immunoreactivity in SMF and epithelial cells cytoplasm and W.B. showed two bands with mean weight 52,23 and 38,88 kDa. The EGFr membrane receptor presented immunoreactivity in SMF and epithelial cells nucleus, W.B. showed only one visible band with mean molecular weight 48,49 kDa. The p-ERK1/2 protein was prevalent in SMF and cell nucleus, W.B. showed three bands with mean molecular weights 42, 61; 39,56 and 37,26 kDa. There was positive correlation between proteins and growth factors. / Orientador: Gilson Hélio Toniollo / Coorientadora: Renée Laufer Amorin / Coorientador: José Félix Pérez Gutiérrez / Banca: Rosangela Zacarias Machado / Banca: Mirela Tinucci Costa / Banca: Eugênio Gonçalves de Araújo / Banca: Sebastião Roberto Taboga / Doutor
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Mecanismo de transdução de sinal na próstata de cão: avaliação nas vias da p-ERK1/2 e da CYR61

Oliveira, Kellen de Sousa [UNESP] 06 February 2009 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-06Bitstream added on 2014-06-13T19:24:33Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_ks_dr_jabo.pdf: 9693100 bytes, checksum: cbce02641faf86a0db97373d5c457eff (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O aumento da glândula prostática canina com o envelhecimento pode ser decorrente de uma proliferação excessiva do estroma e epitélio acinar, uma diminuição na taxa de apoptose, entre outros. Esses processos celulares são mediados por hormônios, fatores de crescimento e proteínas, dentre elas podemos citar as proteínas CYR61 e p-ERK1/2 e os fatores de crescimento EGF, TGF- e EGFr. Próstatas originadas de 29 cães, com pesos variando entre 6 a 40 kg, foram retiradas, lavadas e pesadas e o volume medido, os valores variaram em 3,8 a 130 g e 2,4 a 90 cm3 respectivamente. Dos fragmentos avaliados 55,17% apresentaram diagnóstico de HPB-ep e 5,75% apresentaram diagnóstico normal. Exames de IHQ foram realizados e para a proteína CYR61 houve uma forte imunorreatividade nas FML, MLA e núcleo das células epiteliais dos fragmentos avaliados. Houve diferenças estatísticas entre grupos de HPB quanto a fração da área de marcação, no exame de W.B. a proteína teve como peso molecular médio 37,72 kDa. Quanto ao EGF houve uma predominância de marcação na FML e núcleo das células epiteliais, os pesos moleculares médio deste fator de crescimento foi de 47,03 e 41,65 kDa nos fragmentos prostáticos avaliados. O TGF- teve imunorreatividade nas FML e citoplasma das células epiteliais, e no exame de W.B. houve 2 bandas de pesos moleculares médios de 52,23 e 38,88 kDa. O receptor de membrana EGFr apresentou imunorreatividade nas FML e núcleo das células epiteliais, no W.B. houve apenas uma banda visível de peso molecular médio de 48,49 kDa. A proteína p-ERK1/2 esteve predominante nas FML e núcleo das células e no W.B. apresentou 3 bandas de pesos moleculares médios de 42,61; 39,56 e 37,26 kDa. Houve correlação positiva entre as proteínas e os fatores de crescimento. / The canine prostate gland enlargement also aging could be resulting of excessive stroma and acinar epithelium proliferation, reduced apoptosis, among other. These cellular mechanisms are mediated by hormones, growth factors and proteins, like the proteins CYR61 and p-ERK1/2 and the growth factors EGF, TGF- e EGFr. Prostate from 29 dogs, weighing 6 to 40 kg, were collected, washed, wheighed and volume was measured, with average from 3,8 to 130 g and 2,4 to 90 cm3 respectively. Approximately 55,17% of samples were diagnosed with HPB-ep and 5,75% were normal. IHQ exams were accomplished and high CYR61 immunoreactivity in SMF, ASM and epithelial cells nucleus was observed. There were statistical differences between BHP groups related to immunoreactivity area, by means of W. B. and the mean molecular weight was 37,72 kDa. By analyzing EGF, immunoreactivity in SMF epithelial cells nucleus was prevalent, the mean molecular weights was 47,03 41,65 kDa. TGF- presented immunoreactivity in SMF and epithelial cells cytoplasm and W.B. showed two bands with mean weight 52,23 and 38,88 kDa. The EGFr membrane receptor presented immunoreactivity in SMF and epithelial cells nucleus, W.B. showed only one visible band with mean molecular weight 48,49 kDa. The p-ERK1/2 protein was prevalent in SMF and cell nucleus, W.B. showed three bands with mean molecular weights 42, 61; 39,56 and 37,26 kDa. There was positive correlation between proteins and growth factors.
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Polimorfismo por Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) em metacestódeos de Taenia solium provenientes de diferentes áreas geográficas do Brasil e a reatividade de anticorpos IgG séricos de pacientes com neurocisticercose frente aos isolados obtidos

Barcelos, Ivanildes Solange da Costa 07 April 2006 (has links)
Neurocysticercosis (NC) is a polymorphic disease and the immune response in human carrier is heterogenic. In this study, 35 primers were used for amplifications by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) of Taenia solium metacestodes, from five different geographic areas in Brazil: 1) Distrito Federal (DF), Center West; 2) Barreiras (BA), Northeast and Southeast; 3) Hydro Basin of the Mosquito River (North of Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) and 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Metacestodes saline crude extracts of four populations (DF, BA, RM-MG e SP) were used for the detection of specific IgG antibodies by ELISA and Western Blotting (WB). A total of 157 serum samples of three groups, (G1): 49 NC patients; (G2): 68 patients with other helminthiasis: hydatidosis (10), taeniasis (20), strongyloidiasis (20), schistosomiasis (10) and hymenolepiasis (8); and (G3): 40 healthy individuals; were analyzed by ELISA. From these, the 98 serum samples were assayed by WB; G1 (49), G2 (39) and G3 (10). The genetic distances, in disagreement percentage, between the metacestode populations were calculated from of 15 RAPD markers and showed 49.5% (DF), 48% (BA), 38.5% (UBMG) and 28% (RM-MG and SP) of genetic distances. Six primers identified polymorphic fragments and the primers 26 (GGGTTTGGCA) and 29 (TCGCCAGCCA) allowed a better differentiation of populations. The fragments of 1000, 500 and 326 pb (pairs of bases) in the UB-MG and of 600 and 244 pb in RM-MG were amplified by primer 26. The fragments generated by primer 29 were 500, 800 and 1191 pb, 300 and 1377 pb, 1000 pb and 244 and 434 pb in SP, UB-MG, DF and BA populations, respectively. In G1, the positivity by ELISA was: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) and 67% (SP). The DF extract was more antigenic than others (p=0.02). In WB, the 64-68 kDa antigens were recognized in all extracts, exclusively, in serum samples from active NC patients (p=0.001). Variation in banding pattern was detected between the extracts (p<0.05). In G2, the serum samples of hydatidosis patients presented from 70 to 90% positivity by ELISA in antigenic extracts (p<0.05); however, the bands recognition pattern in WB was different from that presented in G1 samples. The 77 kDa band was significantly identified in hydatidosis samples (p=0.0001). In conclusion, the T. solium populations analyzed showed genetic variability and antigenic differences. / A neurocisticercose (NC) constitui doença polimórfica, apresentando heterogeneidade da resposta imune no hospedeiro humano. Nesse estudo, o teste Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) foi utilizado com 35 primers na detecção de polimorfismo em metacestódeos de Taenia solium provenientes de cinco áreas geográficas distintas do Brasil: 1) Distrito Federal (DF), região Centro-Oeste; 2) Barreiras (BA), região nordeste e da região sudeste: 3) Bacia Hidrográfica do Rio Mosquito (norte de Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) e 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Os extratos salinos totais de metacestódeos de quatro populações (DF, BA, RM-MG e SP) foram utilizados na detecção de anticorpos IgG específicos pelo ELISA e Western Blotting (WB). As 157 amostras de soro de três grupos (G) de indivíduos: G1: 49 pacientes com NC; G2: 68 pacientes com outras helmintíases, sendo hidatidose (10), teníase (20), estrongiloidíase (20), esquistossomose (10) e himenolepíase (8) e G3: 40 indivíduos saudáveis (controles); foram analisadas pelo ELISA. Foram ensaiadas 98 amostras de soro: G1 (49), G2 (39) e G3 (10) pelo WB. As distâncias genéticas, por porcentagem de desacordo, foram de 49,5% (DF), 48% (BA), 38,5% (UB-MG) e 28% (RM-MG e SP) nas populações de metacestódeos, calculadas a partir de 15 marcadores de RAPD. Seis primers geraram fragmentos polimórficos nos isolados analisados, sendo que os primers 26 (GGGTTTGGCA) e 29 (TCGCCAGCCA) permitiram melhor diferenciação entre as populações, o primer 26 gerou os fragmentos de 1000, 500 e 326 pb (pares de bases) na amostra de UB-MG, e de 600 e 244 pb em RM-MG. O 29 gerou fragmentos em quatro das populações analisadas, sendo 500, 800 e 1191 pb em SP, 300 e 1377 pb em UBMG, 1000 pb no DF e 244 e 434 pb na BA. No G1, as freqüências de positividade no ELISA, foram: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) e 67% (SP), sendo o extrato do DF mais antigênico que os demais (p = 0,02). No WB, o peptídeo de 64-68 kDa foi reconhecido em todos os extratos, exclusivamente, em amostras de pacientes com NC ativa (p=0,001). Detectou-se variação no padrão de reconhecimento de bandas entre os extratos (p<0,05). No G2, as amostras de soro de pacientes com hidatidose apresentaram de 70 a 90% de positividade no ELISA frente aos extratos analisados (p<0,05); porém, o padrão de reconhecimento de bandas no WB diferiu do apresentado pelas amostras do G1, sendo que a banda de 77 kDa foi significativamente identificada pelas amostras de pacientes com hidatidose (p=0,0001). Concluiu-se que as populações de T. solium analisadas nesse estudo, apresentaram variabilidade genética e diferenças de antigenicidade. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

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