Establishment and maintenance of the blood system relies on the cellular and spatial organization of bone marrow. In the BM niche, sinusoidal endothelial cells (SECs) are mainly located in the trabecular zone of the metaphysis area of long bones. SECs present a fenestrated structure characterized by high permeability, low shear rates, and oxygen pressure. The hypoxic environment surrounding SECs is needed for the movement and engraftment of hematopoietic cells, but it might also facilitate the homing of malignant cells. SECs’ adaptive response to hypoxia depends on the Hypoxia Inducible Factors (HIFs) promoting angiogenesis, hematopoiesis, and other processes. The upstream regulator of HIFs, the prolyl hydroxylase domain-2 (PHD2) is considered the key cellular oxygen sensor. Our group has shown the crucial regulatory effects that PHD2 has on different physiological and pathological settings. During steady state, PHD2 modulates proliferation and mobilization of hematopoietic progenitor cells (HSCPs), as well as bone metabolism. On the other hand, PHD2 is crucial for neutrophil motility affecting their extravasation during arthritis. We have also demonstrated that loss of PHD2 in different humans and mouse tumor cell lines, as well as in myeloid cells and T-lymphocytes where it impairs tumor development. Others have shown that heterozygous deletion of PHD2 in tumor ECs can reduce distant metastasis. Due to the intricate interplay between the different players of the PHD2/HIFs axis, as well as their effect on other signaling pathways, the positive or negative impact of the hypoxia pathways has been shown to be cell type and context dependent. In the present study, we analyzed the role of hypoxia pathway proteins, mainly PHD2, in ECs in the bone/BM niche, as well as its consequent influence on the environment during physiological and pathological scenarios. We have demonstrated that endothelial PHD2 has a profound intrinsic effect on vessel morphology and functionality, affecting the crucial communication between ECs and the bone/BM niche. Further, using different transgenic mouse lines, we have identified the BM endothelial cells (BM-ECs) PHD2/HIF-2α axis directly increasing leukocytosis via vascular cell adhesion protein 1 (VCAM-1) protein downregulation. Moreover, during steady state conditions we have discovered a novel regulatory effect that PHD2 exerts on VCAM-1 by increasing miR-126-3p transcription, a well-known inhibitor of VCAM-1 expression. Lastly, the PHD2/HIF-2/miR-126-3p/VCAM-1 axis not only influenced the myeloid cell intravasation towards circulation but also increased the extravasation and homing of metastatic breast carcinoma cells into the bone/BM tissue, increasing tumor burden throughout the bone. BM-ECs PHD2 offers a protective role against tumor homing cells in the bone/BM while serving as an important regulator in the communication between endothelium and BM niche. Concluding Remarks:  Loss of PHD2 in ECs generates profound changes in vessel function and in the hematopoietic compartment leading to increase myelopoiesis resulting in leukocytosis. The above-mentioned effect occurs in a HIF-2α-dependent manner.  PHD2/HIF-2α also transcribed in an increase of miR-126-3p expression leading to VCAM-1 downregulation. Process that resulted in increased leukocytes in circulation due to hematopoiesis dysregulation. The novel PHD2/HIF-2/miR-126-3p/VCAM-1 axis enhanced extravasation and homing of metastatic breast carcinoma cells into the bone/BM tissue, increasing tumor burden throughout the bone.:Introduction 8 The Endothelium 9 Endothelial barrier. 9 Leukocyte transendothelial migration. 11 Intracellular mechanism for activation of adhesion molecules. 12 Cellular migration in pathological conditions. 13 Tumor Dissemination: Metastasis. 14 Metastatic cascade. 15 The bone is a preferential site for malignant cells arrival. 16 Bone/BM physiology influences metastasis. 17 The endosteal niche. 18 The perivascular niche. 19 Hypoxia pathway proteins impact on metastasis. 20 Thesis Aims 23 Aim 1: Characterize the role of the hypoxia pathway proteins in bone vasculature and the impact on the niche. 24 Aim 2: Analyze the genetic changes that resulted from PHD2 deletion in BM-ECs and their impact on the cross-talk communication with the different BM-niches. 24 Aim 3: Investigate the impact of PHD2 and downstream regulators (HIF-1/2α) on vessel functionality. 25 Materials and Methods 26 Mice. 27 Histology: tissue processing and immunofluorescence staining 28 Bone tissue processing. 28 Staining of Bone cryosections. 28 Induced skin inflammatory model. 29 Staining of ears treated with PMA. 29 Vascular morphology quantification. 29 Microscopy 31 Antibodies used for immunofluorescence. 31 Bone analysis. 31 Bone µCT measurements and analysis 31 Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining 32 Blood and BM analysis. 32 Sysmex. 32 Flow cytometry. 32 BM cell extraction from bones. 32 BM cells staining. 33 Meso Scale Discovery (MSD) 35 Evans Blue assay. 35 BM soup ELISA. 35 RNAseq of CD31+ EMCN+ BM-ECs 36 BM-EC cell sorting for RNAseq. 36 RNA extraction and qPCRs 36 Tumor model. 36 Tumor breast carcinoma cells. 36 Tumor homing model. 37 Statistical analyses. 37 Results 38 PHD2 Conditional Knockout from Endothelial Cell Compartment. 39 Further P2EC mice characterization. 41 Transgenic deletion of PHD2 showed slight developmental retardation. 41 Spleen size showed not to be affected by deletion endothelial PHD2. 41 P2EC mice displayed increased vessel leakiness. 42 Endothelial PHD2 deletion does not affect lung endothelial cells. 43 BM-ECs PHD2-HIF-2α axis modulates leukocytosis and vessel morphology. 44 HIF-2α modulates P2EC leukocytosis and thrombocytopenia. 44 BM-ECs PHD2 deficient mice hinder vessel morphology in a HIF-2α dependent manner. 44 Endothelial PHD2-deficient mice exhibit perturbed hematopoiesis. 45 P2EC mice early progenitor displayed reduced total cell number, but frequency remained unchanged. 46 P2EC mice favor differentiation of committed progenitors with a myeloid bias. 48 P2EC mice significantly reduced the numbers and frequency of megakaryocyte/erythroid progenitor’s linage. 48 PHD2-HIF-2α deletion restored normal hematopoiesis. 50 P2EC vascular functionality during pathological conditions. 53 Endothelial PHD2 modulates leukocyte migration during localized inflammation. 53 Endothelial PHD2 shapes bone/BM tumor homing. 55 Tumor homing in the bone: generation of an early metastatic model. 56 Early metastasis limitation. 58 Endothelial PHD2 modulates tumor colonization to the bone/BM. 59 Simultaneous deletion of PHD2 and HIF-1 in BM-ECs worsen tumor metastasis to bone. 61 Simultaneous deletion of PHD2 and HIF-2 in BM-ECs showed no differences in tumor homing. 62 Deep sequencing of PHD2 deficient BM-ECs. 63 BM EC from P2EC mice display enriched leukocyte migration gene signatures. 63 P2EC mice presented genetic dysfunction in the integrin-binding system. 64 P2EC steady-state VCAM-1 expression is HIF-2α dependent. 66 BM-ECs VCAM-1 + is regulated by PHD2 through HIF-2α. 66 PHD2-dependent downregulation of VCAM-1 does not affect VE-cadherin expression. 68 BM pro-inflammatory cytokines do not contribute to VCAM-1 lower expression. 69 During steady-state, loss of VCAM-1 increased frequency BM resident mature cells. 69 BM-ECs VCAM-1 deficient mice 71 VCAM1EC mice developed leukocytosis. 71 VCAM1EC does not exhibit significant changes in hematopoiesis. 73 P2EC vessel morphology is independent of downregulation of VCAM-1 74 VCAMEC mice showed increased tumor homing in the diaphysis. 75 PHD2-HIF-2 regulatory effect on VCAM-1 is modulated by mir-126-3p. 76 HIF-2α regulates mir-126 expression in PHD2 deficient BM-ECs. 77 BM-ECs PHD2 influence bone homeostasis. 78 Loss of BM-ECs PHD2 lead to increase Osteoclast numbers and activity. 79 Osteoclast differentiation and activity could be independent of OBs. 79 Loss of PHD2 in BM-ECs leads to osteoclastogenesis. 80 BM resident Tcell CD8+ could be Increasing Osteoclast Activation. 82 Discussion. 83 Mouse Model: Conditional Deletion of Endothelial PHD2. 85 Endothelial PHD2 Modulates Myelopoiesis. 86 BM-EC PHD2 regulates vessel morphology and functionality under steady-state independent of VCAM-1. 88 Endothelial VCAM-1 downregulation does not impaired neutrophil migration during inflammation. 88 BM-ECs PHD2 is a Gatekeeper of Tumor Homing in the Bone. 89 HIF-2α dependent Mir-126 activation leads to VCAM-1 downregulation 91 Endothelial PHD2 controls Osteoclastogenesis independent of BM RANKL. 94 References 96 List of Abbreviations 107 Summary 109 Zusammenfassung 111 Acknowledgements 113 Deklaration 114 Appendix 118 List of Figures. 118 List of tables 119 / Die Organisation und Aufrechterhaltung des Blutsystems hängt von der zellulären und räumlichen Organisation des Knochenmarks ab. In der BM-Nische befinden sich, hauptsächlich in der Trabekelzone des Metaphysenbereichs langer Knochen, die sinusoidale Endothelzellen (SECs). SECs weisen eine gefensterte Struktur auf, die von hoher Durchlässigkeit, geringer Scherrate und Sauerstoffdruck geprägt ist. Das hypoxische Milieu der SECs ist notwendig für Bewegung und Einwanderung der hämatopoetischen Zellen und könnte dies ebenso für bösartige Zellen begünstigen. Die Anpassung der SECs an Hypoxie hängt von den Hypoxia Inducible Factors (HIFs) ab. HIFs fördern die Angiogenese, die Hämatopoese und andere Prozesse. Die prolyl hydorxylase domain-2 (PHD2) ist der vorgeschaltete Regulator der HIFs und gilt als wichtigster zellulärer Sauerstoffsensor. Unsere Gruppe konnte zeigen welche zentralen regulatorischen Effekte die PHD2 auf verschiedene physiologische und pathophysiologische Mechanismen ausübt. Im Gleichgewichtszustand moduliert PHD2 Proliferation und Mobilisation der hämatopoetischen Vorläuferzellen (HSCPs) sowie den Knochenmetabolismus. Auf der einen Seite spielt PHD2 eine entscheidende Rolle bei der Motilität der Neutrophilen und beeinflusst daher die Extravasation bei Arthritis. Wir konnten außerdem zeigen, dass der Verlust von PHD2 in verschiedenen humanen und murinen Tumorzelllinien, sowie in myeloischen Zellen und T-Lymphozyten die Tumorentwicklung beeinträchtigt. In anderen Arbeiten wurde gezeigt, dass eine heterozygote PHD2-Deletion in Tumor-ECs eine Fernmetastasierung reduziert. In Anbetracht der komplizierten Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Komponenten der PHD2/HIF-Signalkaskade sowie deren Effekte auf andere Signalkaskaden, übt sich in Abhängigkeit des Zelltyps und des Kontexts ein positiver oder negativer Einfluss auf die Hypoxie-Signalwege aus. In der vorliegenden Studie haben wir die Rolle von Proteinen des Hypoxiewegs, hauptsächlich PHD2, in den ECs der Knochen-/BM-Nische sowie deren daraus resultierenden Einfluss auf die Umwelt in physiologischen und pathologischen Szenarien analysiert. Wir konnten zeigen, dass das endotheliale PHD2 einen tiefgreifenden intrinsischen Effekt auf die Gefäßmorphologie und Funktionalität besitzt und damit entscheidend die Kommunikation zwischen ECs und der Knochen-/BM-Nische beeinflusst. Weiterhin konnte unter Nutzung verschiedener transgener Muslinien identifiziert werden, dass die Knochenmarksendothelzellen (BM-ECs) PHD2/HIF-2α-Achse direkt die Myelopoese, durch eine Herabsetzung der vascular cell adhesion protein 1 (VCAM-1) -Expression, steigert. Darüber hinaus haben wir einen neuartigen regulatorischen Effekt der PHD2 auf das VCAM-1 entdeckt. Hierbei wird die Expression des VCAM-1 Inhibitors miR-126-3p gesteigert. Des Weiteren beeinflusst die PHD2/HIF-2/miR-126-3p/VCAM-1 Achse nicht nur die Intravasation der Myloidzellen in Richtung des Kreislaufs, sondern auch eine Steigerung der Extravastion und Einwanderung von metastasierenden Brustkarzinomzellen in die Knochen/BM-Gewebe und steigert somit die Tumorlast in den Knochen. In Anbetracht klinischer Versuche der Krebsbehandlung mit PHD2-Inhibitoren, bietet BM-ECs PHD2 einen schützenden Effekt gegen Tumorzelleinwanderung in die Knochen/BM, während es gleichzeitig als ein wichtiger Regulator in der Kommunikation zwischen Endothelium und der BM-Nische dient. Abschließende Bemerkungen: Der Verlust von PHD2 in ECs führt zu tiefgreifenden Veränderungen in der Gefäßfunktion und im hämatopoetischen Kompartiment, was zu einer verstärkten Myelopoese und damit zu Leukozytose führt. Die oben erwähnte Wirkung tritt in einer HIF-2α-abhängigen Weise auf. PHD2/HIF-2α führte auch zu einem Anstieg der miR-126-3p-Expression, was zu einer Herunterregulierung von VCAM-1 führte. Dieser Prozess führte zu einer erhöhten Anzahl von Leukozyten im Blutkreislauf aufgrund einer Dysregulation der Hämatopoese. Die neuartige PHD2/HIF-2/miR-126-3p/VCAM-1-Achse förderte die Extravasation und Ansiedlung von metastatischen Brustkrebszellen im Knochen/BM-Gewebe, wodurch die Tumorlast im gesamten Knochen erhöht wurde.:Introduction 8 The Endothelium 9 Endothelial barrier. 9 Leukocyte transendothelial migration. 11 Intracellular mechanism for activation of adhesion molecules. 12 Cellular migration in pathological conditions. 13 Tumor Dissemination: Metastasis. 14 Metastatic cascade. 15 The bone is a preferential site for malignant cells arrival. 16 Bone/BM physiology influences metastasis. 17 The endosteal niche. 18 The perivascular niche. 19 Hypoxia pathway proteins impact on metastasis. 20 Thesis Aims 23 Aim 1: Characterize the role of the hypoxia pathway proteins in bone vasculature and the impact on the niche. 24 Aim 2: Analyze the genetic changes that resulted from PHD2 deletion in BM-ECs and their impact on the cross-talk communication with the different BM-niches. 24 Aim 3: Investigate the impact of PHD2 and downstream regulators (HIF-1/2α) on vessel functionality. 25 Materials and Methods 26 Mice. 27 Histology: tissue processing and immunofluorescence staining 28 Bone tissue processing. 28 Staining of Bone cryosections. 28 Induced skin inflammatory model. 29 Staining of ears treated with PMA. 29 Vascular morphology quantification. 29 Microscopy 31 Antibodies used for immunofluorescence. 31 Bone analysis. 31 Bone µCT measurements and analysis 31 Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining 32 Blood and BM analysis. 32 Sysmex. 32 Flow cytometry. 32 BM cell extraction from bones. 32 BM cells staining. 33 Meso Scale Discovery (MSD) 35 Evans Blue assay. 35 BM soup ELISA. 35 RNAseq of CD31+ EMCN+ BM-ECs 36 BM-EC cell sorting for RNAseq. 36 RNA extraction and qPCRs 36 Tumor model. 36 Tumor breast carcinoma cells. 36 Tumor homing model. 37 Statistical analyses. 37 Results 38 PHD2 Conditional Knockout from Endothelial Cell Compartment. 39 Further P2EC mice characterization. 41 Transgenic deletion of PHD2 showed slight developmental retardation. 41 Spleen size showed not to be affected by deletion endothelial PHD2. 41 P2EC mice displayed increased vessel leakiness. 42 Endothelial PHD2 deletion does not affect lung endothelial cells. 43 BM-ECs PHD2-HIF-2α axis modulates leukocytosis and vessel morphology. 44 HIF-2α modulates P2EC leukocytosis and thrombocytopenia. 44 BM-ECs PHD2 deficient mice hinder vessel morphology in a HIF-2α dependent manner. 44 Endothelial PHD2-deficient mice exhibit perturbed hematopoiesis. 45 P2EC mice early progenitor displayed reduced total cell number, but frequency remained unchanged. 46 P2EC mice favor differentiation of committed progenitors with a myeloid bias. 48 P2EC mice significantly reduced the numbers and frequency of megakaryocyte/erythroid progenitor’s linage. 48 PHD2-HIF-2α deletion restored normal hematopoiesis. 50 P2EC vascular functionality during pathological conditions. 53 Endothelial PHD2 modulates leukocyte migration during localized inflammation. 53 Endothelial PHD2 shapes bone/BM tumor homing. 55 Tumor homing in the bone: generation of an early metastatic model. 56 Early metastasis limitation. 58 Endothelial PHD2 modulates tumor colonization to the bone/BM. 59 Simultaneous deletion of PHD2 and HIF-1 in BM-ECs worsen tumor metastasis to bone. 61 Simultaneous deletion of PHD2 and HIF-2 in BM-ECs showed no differences in tumor homing. 62 Deep sequencing of PHD2 deficient BM-ECs. 63 BM EC from P2EC mice display enriched leukocyte migration gene signatures. 63 P2EC mice presented genetic dysfunction in the integrin-binding system. 64 P2EC steady-state VCAM-1 expression is HIF-2α dependent. 66 BM-ECs VCAM-1 + is regulated by PHD2 through HIF-2α. 66 PHD2-dependent downregulation of VCAM-1 does not affect VE-cadherin expression. 68 BM pro-inflammatory cytokines do not contribute to VCAM-1 lower expression. 69 During steady-state, loss of VCAM-1 increased frequency BM resident mature cells. 69 BM-ECs VCAM-1 deficient mice 71 VCAM1EC mice developed leukocytosis. 71 VCAM1EC does not exhibit significant changes in hematopoiesis. 73 P2EC vessel morphology is independent of downregulation of VCAM-1 74 VCAMEC mice showed increased tumor homing in the diaphysis. 75 PHD2-HIF-2 regulatory effect on VCAM-1 is modulated by mir-126-3p. 76 HIF-2α regulates mir-126 expression in PHD2 deficient BM-ECs. 77 BM-ECs PHD2 influence bone homeostasis. 78 Loss of BM-ECs PHD2 lead to increase Osteoclast numbers and activity. 79 Osteoclast differentiation and activity could be independent of OBs. 79 Loss of PHD2 in BM-ECs leads to osteoclastogenesis. 80 BM resident Tcell CD8+ could be Increasing Osteoclast Activation. 82 Discussion. 83 Mouse Model: Conditional Deletion of Endothelial PHD2. 85 Endothelial PHD2 Modulates Myelopoiesis. 86 BM-EC PHD2 regulates vessel morphology and functionality under steady-state independent of VCAM-1. 88 Endothelial VCAM-1 downregulation does not impaired neutrophil migration during inflammation. 88 BM-ECs PHD2 is a Gatekeeper of Tumor Homing in the Bone. 89 HIF-2α dependent Mir-126 activation leads to VCAM-1 downregulation 91 Endothelial PHD2 controls Osteoclastogenesis independent of BM RANKL. 94 References 96 List of Abbreviations 107 Summary 109 Zusammenfassung 111 Acknowledgements 113 Deklaration 114 Appendix 118 List of Figures. 118 List of tables 119

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Ein Schlüsselprozess in der Immunantwort ist die durch das proinflammatorische Zytokin Interferon-gamma (IFNg) induzierte transiente Akkumulation von neu synthetisierten defekten Proteinen, die durch Anknüpfen von Polymeren des Proteins Ubiquitin (Ub) post-translational modifiziert werden. Die Ubiquitinierung ist das Schlüsselsignal für den Abbau dieser Proteine. Die Abbauprodukte dienen unter anderem als Quelle für die Prozessierung von Antigenen. Um die frühe Immunantwort besser zu verstehen, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Identität und Charakteristika dieser neu synthetisierten Proteine, sowie die Topologie ihrer post-translationalen Modifizierung durch Ub untersucht. Dazu wurde die massenspektrometrischen Analyse ubiquitinierter Proteine weiterentwickelt, indem die experimentellen Konditionen auf deren Analyse optimiert wurden. Insbesondere konnte gezeigt werden, dass die kombinierte Verdauung der Ub-Konjugate mittels zweier Peptidasen die Identifizierung der Proteinpeptide und der Indikatorpeptide für Ubiquitinierungsstellen entscheidend verbessert. Es wurde demonstriert, dass eine selektive Isotopenmarkierung der neu synthetisierten Proteine möglich ist. Mit Hilfe dieser Methode gelang es, Veränderungen der Ub Modifikationen bezüglich der Topologie sowie quantitative Unterschiede der ubiquitinierten Proteine aus humanen HeLa-Zellen in An- und Abwesenheit von IFNg zu identifizieren. Nach Induktion durch IFNg wurden drei polyubiquitinierte, drei mono- oder polyubiquitinierte und 111 potentiell ubiquitinierte Proteine identifiziert. Diese Proteine zeigten, dass keine generelle Ubiquitinierungspräferenz für die durch IFNg verstärkt transkribierten Gene besteht. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern das Verständnis der frühen zellulären Immunantwort und tragen zum Verständnis von Krebs- und Autoimmunerkrankungen sowie chronischen Entzündungsprozessen bei. Möglicherweise bilden sie die Grundlage für die Weiterentwicklung entsprechender Therapien. / A key process within the immune response of organisms is the transient accumulation of newly synthesized defective proteins affected by the proinflammatory cytokine interferon-gamma(IFNg). These proteins are post-translationally modified by attachment of polymers of the protein ubiquitin (Ub), which represents the key signal for targeting them to degradation. The resulting peptides can serve as sources for antigen processing. In order to get an insight into the details of the cellular early immune response, the identity and characteristics of the newly synthesized proteins and the topology of their post-translational modification with Ub were investigated. An essential progress of the mass spectrometric approach was achieved by optimizing the experimental conditions with regard to the requirements of the analysis of the targeted proteins. In particular, it could be shown that a combined digestion of Ub-conjugates with two peptidases leads to an improved detection of protein peptides and indicator peptides for ubiquitination sites. It was shown that a selective isotopic labeling of the newly synthesized proteins was possible. With this method, a decisive step forward was made in the understanding of changes of the Ub modifications with respect to the topology and in clarifying the quantitative differences between Ub-conjugates from IFNg treated and untreated human HeLa cells. Three IFNg induced polyubiquitinated proteins, three mono- or polyubiquitinated as well as 111 potential Ub-substrates could be identified. These proteins did not show any general ubiquitination preference for genes whose transcription is enhanced in presence of IFNg. The results obtained in this work help to broaden and refine the general picture of the early cellular immune response. They contribute to the knowledge on molecular processes of cancer, autoimmune diseases or chronic inflammation and, potentially, can give hints for the continued development of corresponding therapies.

Im Verlauf der Knochenbildung und Frakturheilung kommt es zu einem Zusammenwirken verschiedener Zell- und Gewebearten. Die beteiligten Zellen unterliegen dabei der Regulation von Wachstumsfaktoren (WF), Zytokinen und Hormonen, die den regelhaften Ablauf kontrollieren und steuernd in Proliferation und Differenzierung von Zellen und deren Matrixsynthese eingreifen. Neben einer optimalen Osteosynthese zur Frakturstabilisation stellt die biologische Beeinflussung der Knochenheilung ein großes Forschungsfeld dar. In Vorarbeiten wurde ein Applikationssystem entwickelt, das mittels einer biodegradierbaren Polymerbeschichtung auf Osteosynthesematerialien die lokale Applikation von WF in biologisch aktiver Form ermöglicht. In vivo wurde an Ratten- und Schweinemodellen erfolgreich die Stimulation der Knochenheilung durch lokal applizierte Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-ß1 und BMP-2 gezeigt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung zellulärer Prozesse während der beeinflussten und unbeeinflussten Knochenheilung sowie des Effektes der lokalen Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten Osteosyntheseplatten. Anhand histologischer und immunhistochemischer Untersuchungen, der in situ Hybridisierung an Knochenschnitten und der ELISA-Methode konnte ein früherer Reifungsbeginn des Kallus durch die Wachstumsfaktorenapplikation gezeigt werden, ohne dass es zu Veränderungen der physiologischen Gewebszusammensetzung und der endogenen Wachstumsfaktoren-Expression kam. Durch Zellkulturstudien an primären Osteoblasten und Osteoklasten wurde an isolierten Zelltypen die Wirkung der applizierten WF untersucht und ihr Effekt auf die Zelltypen dargestellt. Die Bildung ektoper Ossifikation im Weichgewebe durch die Wachstumsfaktoren wurde im Schafsmodell ausgeschlossen. Dies stellt einen wichtigen Sicherheitsaspekt beim Einsatz von Wachstumsfaktoren zur Stimulation der Knochenheilung dar. Die lokale Applikation der Wachstumsfaktoren von einer Plattenosteosynthese zur Osteotomiestabilsierung im Rattenmodell zeigte eine signifikante Verbesserung der biomechanischen Stabilität und der Kallusheilung 42 Tage nach Osteotomie Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse liefern Aufschluss zur Weiterentwicklung biologischer Einflussmöglichkeiten auf den Knochenstoffwechsel und die Rolle von WF während der Frakturheilung. / In the process of bone formation and healing, different cell- and tissue types are formed. The cells involved are regulated by growth factors (GF), cytokines and hormones, which control the healing and affect the proliferation and differentiation of cells and their matrix synthesis. Besides the use of the optimal osteosynthesis for fracture stabilization, the biological influence of the bone healing represents a large research field. In previous work an application system for local application of GF in biologically active form was developed. In vivo studies revealed a stimulating effect of locally applied IGF-I and TGF-ß1 in a rat and a pig model. Goal of this work was the investigation of cellular processes during the influenced and uninfluenced bone healing. A further aim was the transfer of the local application method to further stabilization systems (plate osteosynthesis). On the basis of the histology, the immunohistology, in situ hybridizing and ELISA methods an earlier beginning of maturing of the callus by the growth factors could be shown, without changes of the physiological callus composition and the endogenous growth factors expression. In further cell culture studies on primary osteoblasts and osteoclasts the effect of the applied growth factors was examined and their effect on the cell types analyzed. The avoidance of ectopic ossification, an important safety aspect with the use of growth factors to stimulate bone healing, was investigated in a sheep model. It was also possible to proof the efficacy of locally applied growth factors delivered extramedullary from plates. The results of these studies provide further explanations for the action of the used growth factors and are necessary for the ongoing development of the application of growth factors for a clinical use.

Die chronisch ischämische Herzkrankheit und der Myokardinfarkt (MI) sind die häufigsten Gründe für schwere Krankheit und vorzeitigen Tod in den entwickelten Ländern. Langfristig kommt es als Folge des Infarktes zur Kollateralgefäßbildung und zur Entwicklung einer kompensatorischen Herzhypertrophie. Eine Vielzahl von adaptativen Veränderungen in diesem Prozess konnte identifiziert werden. Wir konnten zeigen, dass in der akuten Phase nach MI Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit des Myokards erhöht waren. Die Expression der Hitzeschockproteine (HSP) 25 und 72 war verstärkt und korrelierte mit der Relaxationsgeschwindigkeit. In der chronischen Phase nach MI entwickelte sich eine signifikante Herzhypertrophie, die mit verminderter Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit einherging. Für die verlangsamte Relaxation war die verminderte Aktivität der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums (SERCA) als entscheidender Faktor anzusehen. Bei transgener Überexpression von Renin / Angiotensinogen ist die Relaxationsgeschwindigkeit des Myokards war wie auch nach MI durch geringere SERCA- Protein Expression vermindert. Die Empfindlichkeit der kontraktilen Funktion gegenüber Sauerstoffmangel und Reoxygenierung war nach MI gegenüber dem Kontrollmyokard geringer. Dafür konnten die verstärkte Expression der antioxidativ wirksamen HSPs und die erhöhte Aktivität der Glutathionperoxidase und der Superoxiddismutase, eine Verschiebung des Kreatinkinase (CK)- Isoenzymmusters und eine verminderte SERCA- Aktivität verantwortlich gemacht werden. Die Repolarisation der Aktionspotentiale der Kardiomyozyten war nach MI gegenüber den Kontrolltieren signifikant verlangsamt. Bereits eine 10-fach geringere artifizielle Dehnung des Gewebes führte nach MI im Vergleich zu Kontrolltieren zum Auftreten von Nachdepolarisationen und Extra-Aktionspotentialen. Ausschließlich in MI ließ sich durch die artifizielle Dehnung Vorhofflimmern auslösen, d.h. nach Myokardinfarkt war der mechano- elektrische Feedback Mechanismus empfindlicher. Die dehnungsinduzierten Veränderungen konnten durch Gadolinium unterdrückt werden, was auf eine Beteiligung von dehnungsaktivierten Ionenkanälen an den beobachteten Phänomenen schließen ließ. Auch kardiale Fibroblasten zeigten nach MI signifikante Änderungen ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften, was zur Arrhythmieentstehung beitragen kann. Mittels molekularer Analysen konnten wir zeigen, dass der unter Sauerstoffmangel stabilisierte Transkriptionsfaktor Hif-1alpha in der Lage ist, den Promoter des Wilms' Tumor Suppressor Gens 1 (WT1) direkt transkriptionell zu aktivieren. Das führte zu verstärkter Expression von WT1 in den Herzen nach Myokardinfarkt, und zu verstärkter Expression von WT1 in Herz und Niere bei systemischer normobarer Hypoxie. Die WT1 Expression im Herzen nach MI ließ sich in den Koronargefäßen lokalisieren. Koexpression mit Proliferations- und Vaskulogenesemarkern ließ vermuten, dass WT1 nach MI eine wichtige Rolle für die Neovaskulogenese spielt. Die gewonnenen Ergebnisse tragen zum Verständnis der pathophysiologischen Veränderungen bei kardialer Hypertrophie nach Myokardinfarkt bei und eröffnen möglicherweise langfristig neue therapeutische Ansätze. / Chronic ischemic heart disease and myocardial infarction are the most common causes for morbidity and mortality in industrialized countries. A survived myocardial infarction (MI) results in a long run in collateral formation and the development of cardiac hypertrophy. A variety of adaptive responses in this process had been identified. We could show that in the acute phase after Mi in rats, contraction- and relaxation rates of the myocardium are increased. The higher relaxation rate correlates to an increased expression of heat shock proteins. In the chronic phase after MI, with the development of cardiac hypertrophy, contraction and relaxation rates decrease. The decrease in the relaxation rate could be attributed to a reduced activity of the Ca- ATPase of the sarcoplasmic reticulum (SERCA2). Transgenic overexpression of renin / angiotensinogen also resulted in a reduced SERCA2 expression and, consequently, lower relaxation rate. The susceptibility of contractile function to hypoxia - reoxygenation was reduced after MI compared to sham operated control animals. The lower susceptibility to hypoxia - reoxygenation could be attributed to an increased expression of heat shock proteins, higher activities of the antioxidant enzymes glutathionperoxidase and superoxiddismutase, shifts in the isoenzyme distribution of the creatine kinase, and a reduced SERCA2 activity. Repolarization of cardiomyocyte action potentials was found to be delayed after MI. A 10-fold lower artificial stretch of the tissue after MI than after sham operation caused afterdepolarizations and extra action potentials. Higher artificial stretch caused atrial fibrillation only after MI suggesting an intensified mechano-electrical feedback mechanism after MI. Stretch- induced electrical abnormalities could be suppressed by gadolinium suggesting the involvement of stretch-activated ion channels in the electrical abnormalities. Also electrophysiological properties of cardiac fibroblasts were significantly altered after MI, which may contribute to the increased risk for arrhythmia after infarction. Furthermore, we could show that the Hif-1alpha transcription factor, which is stabilized under hypoxic conditions is capable to directly activate the Wilms'' tumor suppressor 1 (WT1) transcriptionally. This leads to an increased expression of WT1 in the heart after MI and in heart and kidneys after systemic hypoxia. After MI, WT1 is expressed mainly in coronary vessels. Co-expression of WT1 with markers of proliferation and vasculogenesis suggests a role of WT1 in neovasculogenesis. These findings contribute to our understanding of pathophysiological alterations in the development of cardiac hypertrophy after MI and may contribute to the development of new therapeutic approaches.

Im Rahmen dieser Arbeit wird ein physikalisches Modell für weichelastische EVA-Schaumstoffe entwickelt, das das mechanische Verformungsverhalten (Spannungs-Verformungs-Kurve) bei der Interaktion zwischen Sportler und Sportgerät am Beispiel eines Laufschuhs anwendungsgerecht – d.h. bei hoher Verformung und Belastungsgeschwindigkeit – kennzeichnet. Im Stand der Technik werden als Einflussfaktoren auf das mechanische Verformungsverhalten von Weichschäumen die Parameter Schaumdichte, Zellgröße bzw. Zelldurchmesser, Schaumhärte und Verformungsgeschwindigkeit ermittelt. Diese werden für die vorliegenden vier Versuchsmaterialien analysiert, wobei die letzten zwei Parameter im Modell Berücksichtigung finden. Das Modell setzt sich aus einem Matrix- und einem Gasphasenanteil zusammen. Der Matrixphasenanteil wird experimentell bei der jeweiligen Verformungsgeschwindigkeit bestimmt, wohingegen der Gasphasenanteil der in den Zellen komprimierten Luft auf einem physikalischen Zusammenhang beruht und anhand der gemessenen Schaumhärte und des Atmosphärendrucks bei der jeweiligen Verformung berechnet wird. Die Voraussetzungen für die Verwendung des Modells, zu denen inkompressible Matrixphase, Geschlossenzelligkeit und keine Querausdehnung des Schaums zählen, werden vorab umfangreich geprüft. Zusammenfassend lässt sich aussagen, dass das gewählte Modell eine gute Übereinstimmung mit den experimentell bestimmten Ergebnissen erzielt. Dies wird anhand der Mittelwertes der Differenz von experimentell ermittelten zu modellierten Daten bestimmt, für den ein Wert von 7 % berechnet wird. / The purpose of this doctoral thesis is developing a physical model for flexible foam materials (e.g. ethylene/vinyl acetate foam) characterizing the mechanical deformation behavior (stress-strain-curve) at the interaction between athlete and sports equipment (e.g. running footwear) during high deformation and high loading rate. Previous studies described various parameters influencing the mechanical deformation behavior of flexible foams: foam density, cell size / cell diameter, foam hardness and loading rate. These parameters are being analyzed for the four present foams whereof the last two parameters were considered in the model. The model consists of a matrix phase measured experimentally at required loading rate multiplied with a correction factor and a gas phase of the air compressed in the foam cells which is calculated by atmospheric pressure and foam hardness. The requirements (incompressible matrix phase, closed cells and zero Poisson ratio) for using the model are verified first of all. In conclusion, the developed model presents a good accordance with the experimental data calculated by a mean difference between experimental and modeled data of 7 %.

Cancer cells display characteristic traits acquired in a step-wise manner during carcinogenesis. Some of these traits are autonomous growth, induction of angiogenesis, invasion and metastasis. In this thesis, the focus is on one of the latest stages of tumor progression, tumor invasion. Tumor invasion emerges from the combined effect of tumor cell-cell and cell-microenvironment interactions, which can be studied with the help of mathematical analysis. Cellular automata (CA) can be viewed as simple models of self-organizing complex systems in which collective behavior can emerge out of an ensemble of many interacting "simple" components. In particular, we focus on an important class of CA, the so-called lattice-gas cellular automata (LGCA). In contrast to traditional CA, LGCA provide a straightforward and intuitive implementation of particle transport and interactions. Additionally, the structure of LGCA facilitates the mathematical analysis of their behavior. Here, the principal tools of mathematical analysis of LGCA are the mean-field approximation and the corresponding Lattice Boltzmann equation. The main objective of this thesis is to investigate important aspects of tumor invasion, under the microscope of mathematical modeling and analysis: Impact of the tumor environment: We introduce a LGCA as a microscopic model of tumor cell migration together with a mathematical description of different tumor environments. We study the impact of the various tumor environments (such as extracellular matrix) on tumor cell migration by estimating the tumor cell dispersion speed for a given environment. Effect of tumor cell proliferation and migration: We study the effect of tumor cell proliferation and migration on the tumor’s invasive behavior by developing a simplified LGCA model of tumor growth. In particular, we derive the corresponding macroscopic dynamics and we calculate the tumor’s invasion speed in terms of tumor cell proliferation and migration rates. Moreover, we calculate the width of the invasive zone, where the majority of mitotic activity is concentrated, and it is found to be proportional to the invasion speed. Mechanisms of tumor invasion emergence: We investigate the mechanisms for the emergence of tumor invasion in the course of cancer progression. We conclude that the response of a microscopic intracellular mechanism (migration/proliferation dichotomy) to oxygen shortage, i.e. hypoxia, maybe responsible for the transition from a benign (proliferative) to a malignant (invasive) tumor. Computing in vivo tumor invasion: Finally, we propose an evolutionary algorithm that estimates the parameters of a tumor growth LGCA model based on time-series of patient medical data (in particular Magnetic Resonance and Diffusion Tensor Imaging data). These parameters may allow to reproduce clinically relevant tumor growth scenarios for a specific patient, providing a prediction of the tumor growth at a later time stage. / Krebszellen zeigen charakteristische Merkmale, die sie in einem schrittweisen Vorgang während der Karzinogenese erworben haben. Einige dieser Merkmale sind autonomes Wachstum, die Induktion von Angiogenese, Invasion und Metastasis. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Tumorinvasion, einer der letzten Phasen der Tumorprogression. Die Tumorinvasion ensteht aus der kombinierten Wirkung von den Wechselwirkungen Tumorzelle-Zelle und Zelle-Mikroumgebung, die mit die Hilfe von mathematischer Analyse untersucht werden können. Zelluläre Automaten (CA) können als einfache Modelle von selbst-organisierenden komplexen Systemen betrachtet werden, in denen kollektives Verhalten aus einer Kombination von vielen interagierenden "einfachen" Komponenten entstehen kann. Insbesondere konzentrieren wir uns auf eine wichtige CA-Klasse, die sogenannten Zelluläre Gitter-Gas Automaten (LGCA). Im Gegensatz zu traditionellen CA bieten LGCA eine einfache und intuitive Umsetzung der Teilchen und Wechselwirkungen. Zusätzlich erleichtert die Struktur der LGCA die mathematische Analyse ihres Verhaltens. Die wichtigsten Werkzeuge der mathematischen Analyse der LGCA sind hier die Mean-field Approximation und die entsprechende Lattice - Boltzmann - Gleichung. Das wichtigste Ziel dieser Arbeit ist es, wichtige Aspekte der Tumorinvasion unter dem Mikroskop der mathematischen Modellierung und Analyse zu erforschen: Auswirkungen der Tumorumgebung: Wir stellen einen LGCA als mikroskopisches Modell der Tumorzellen-Migration in Verbindung mit einer mathematischen Beschreibung der verschiedenen Tumorumgebungen vor. Wir untersuchen die Auswirkungen der verschiedenen Tumorumgebungen (z. B. extrazellulären Matrix) auf die Migration von Tumorzellen dürch Schätzung der Tumorzellen-Dispersionsgeschwindigkeit in einem gegebenen Umfeld. Wirkung von Tumor-Zellenproliferation und Migration: Wir untersuchen die Wirkung von Tumorzellenproliferation und Migration auf das invasive Verhalten der Tumorzellen durch die Entwicklung eines vereinfachten LGCA Tumorwachstumsmodells. Wir leiten die entsprechende makroskopische Dynamik und berechnen die Tumorinvasionsgeschwindigkeit im Hinblick auf die Tumorzellenproliferation- und Migrationswerte. Darüber hinaus berechnen wir die Breite der invasiven Zone, wo die Mehrheit der mitotischer Aktivität konzentriert ist, und es wird festgestellt, dass diese proportional zu den Invasionsgeschwindigkeit ist. Mechanismen der Tumorinvasion Entstehung: Wir untersuchen Mechanismen, die für die Entstehung von Tumorinvasion im Verlauf des Krebs zuständig sind. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Reaktion eines mikroskopischen intrazellulären Mechanismus (Migration/Proliferation Dichotomie) zu Sauerstoffmangel, d.h. Hypoxie, möglicheweise für den Übergang von einem gutartigen (proliferative) zu einer bösartigen (invasive) Tumor verantwortlich ist. Berechnung der in-vivo Tumorinvasion: Schließlich schlagen wir einen evolutionären Algorithmus vor, der die Parameter eines LGCA Modells von Tumorwachstum auf der Grundlage von medizinischen Daten des Patienten für mehrere Zeitpunkte (insbesondere die Magnet-Resonanz-und Diffusion Tensor Imaging Daten) ermöglicht. Diese Parameter erlauben Szenarien für einen klinisch relevanten Tumorwachstum für einen bestimmten Patienten zu reproduzieren, die eine Vorhersage des Tumorwachstums zu einem späteren Zeitpunkt möglich machen.