A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Foram investigados os efeitos do uso de dispositivos de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore peripúberes. Especificamente, como as diferenças na expressão de genes relativos à reprodução em duas áreas do hipotálamo. Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento): dispositivo de P4 sem estradiol (SP); dispositivo de P4 com estradiol (PE); sem dispositivo de P4 e sem estradiol (SS); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (SE). As novilhas foram alimentadas no cocho pós desmame até atingirem 295 ± 11 kg, com fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram abatidas e as porções de hipotálamo colhidas para processamento e armazenagem a -80 ºC. O RNA total do tecido hipotalâmico foi extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR). Foram formados pools de RNA para a realização de um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estradiol endógeno e das diferenças entre áreas do hipotálamo, realizado por sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. Foram encontrados genes diferencialmente expressos alterados pelos tratamentos e entre as áreas do hipotálamo relativos à obtenção da puberdade. / The understanding of the molecular mechanisms by which nutrition, genetics and hormonal treatments affect the beginning of puberty is of great importance for developing strategies aiming to reduce the age at first calving, and therefore increase the slaughter rate in Nellore cattle. The effects of progesterone device and of endogenous estradiol on the molecular mechanisms controlling the attainment of puberty in Nellore heifers were investigated. Specifically, the molecular pathways of progesterone and estradiol were studied in the hypothalamus. Thirty five non-pubertal heifers, between 13 and 14 months of age, were divided into four treatment (nine or eight per treatment): P4 device without estradiol (SP), P4 device with estradiol (PE), without P4 device and without estradiol (SS), and without P4 device and with estradiol (SE). The heifers were fed after weaning until reach 295 ± 11 Kg, with water access. At the end of the hormonal treatments all heifers were slaughtered and the hypothalamus areas were harvested, processed and then also stored at -80°C. Total RNA of hypothalamus were extracted, treated with DNase I and submitted to cDNA synthesis for gene expression quantification by real time PCR (qRT-PCR). RNA samples were pooling to realize a comprehensive study of the effects of progesterone administration and endogenous estrogen on attainment of puberty by next-generation sequencing (RNA-Seq), in order to identify possible candidate genes in the hypothalamus. Genes diffentially expressed between hypothalamic areas and affected by treatments were found.

As alterações nutricionais no período neonatal são capazes de comprometer o controle hipotalâmico da ingestão alimentar e o metabolismo do indivíduo em fases posteriores do desenvolvimento. Avaliamos as alterações decorrentes do modelo de programação nutricional neonatal em células gliais hipotalâmicas, devido ao seu importante papel na homeostase energética. Os astrócitos possuem função metabólica ativa, e por sua vez, fornecem substrato energético aos neurônios por meio das conexinas 30 (CX30) e 43 (CX43). A CX30, por sua vez, exerce função, também, na manutenção morfológica astrocitária, contribuindo na inserção astrocitária na fenda sináptica, portanto interferindo na neurotransmissão. A TCPTP (T-cell protein tyrosine phosphatase) proteína contra-reguladora da sinalização celular da leptina e a insulina participam nos mecanismos de resistência a esses hormônios e está presente em células da glia e possui ação moduladora na atividade de CX43. Sendo assim, a hipótese do presente trabalho é de que alterações em células da glia no hipotálamo participam nos efeitos da programação nutricional neonatal na modulação do balanço energético na vida juvenil e adulta. Para investigarmos essa hipótese, utilizamos o modelo de programação nutricional neonatal de alteração do tamanho da ninhada, sendo a quantidade de filhotes por lactante formada da seguinte maneira: 3 filhotes, ninhada pequena (SL), 10 filhotes, ninhada normal (NL) e de 16 filhotes, ninhada grande (LL). O peso corporal da ninhada foi verificado semanalmente até o desmame, realizado no 21º dia de vida (PN21). Após o desmame, o peso corporal foi verificado a cada cinco dias até o 60º dia de vida (PN60). A ingestão alimentar individual foi determinada entre o PN50 e PN60. Os animais SL apresentaram maior peso corporal (72,3 ± 2,08g) ao desmame, quando comparados aos grupos NL (57,2 ± 3,5g) e LL (36,3 ± 1,8g) e essa diferença entre os grupos foi mantida até o PN60. Observou-se, porém, que a ingestão alimentar dos animais adultos SL, não foi diferente do grupo NL. Todavia, os animais LL apresentaram um ganho de peso reduzido ao desmame, porém, esses animais alcançaram o ganho de peso corporal dos animais NL (NL: 165 ± 3,97g; LL: 145,4 ± 4,5g), a partir do PN35, fenômeno esse associado ao comportamento hiperfágico. No PN21, observou-se no grupo SL um aumento nas concentrações plasmáticas de leptina (6,4 ? 0,9ng/ml) e insulina (1,9 ? 0,15 ng/ml), quando comparado aos grupos NL (leptina: 3,8 ? 0,3ng/ml; insulina: 1,3 ? 0,2 ng/ml) e LL (leptina: 1,2 ? 0,1ng/ml; 9 insulina: 1,0 ? 0,1ng/ml). No PN60, ambos os grupos SL (leptina: 5,2 ? 1,15ng/ml; insulina: 2,5 ? 0,4ng/ml) e LL (leptina: 4,3 ? 0,5ng/ml; insulina: 3,4 ? 0,5ng/ml) apresentaram aumento nas concentrações plasmáticas de leptina e insulina, comparados ao grupo NL (leptina: 1,8 ? 0,4ng/ml; insulina: 1,2 ? 0,1ng/ml). Quando avaliada a expressão do RNAm de Ptpn2, gene que codifica TCPTP, e a expressão dessa proteína no núcleo arqueado (ARC), observamos um aumento no PN21 no grupo SL e em ambos os grupos no PN60, quando comparados ao grupo NL. O grupo SL apresentou aumento na imunorreatividade para GFAP no PN21 e ambos os grupos apresentaram essa mesma resposta no PN60. O mesmo resultado foi observado na imunorreatividade para a molécula adaptadora ligante de cálcio inonizado-1 (IBA-1) no PN21 e PN60 nos grupos SL e LL. Houve colocalização da TCPTP com GFAP, porém não com IBA-1. A TCPTP possui ação demonstrada na modulação de CX43, ao investigá-la observou-se no PN21, um aumento na expressão do RNAm de Gja1, gene que codifica CX43, assim como na imunorreatividade para CX43 apenas no grupo SL. No PN21 e PN60 observou-se redução da expressão do RNAm de Gja6, gene que codifica CX30, em ambos os grupos SL e LL. Observou-se redução na imunorreatividade de CX30 em ambos os grupos, SL e LL no PN60. No PN21, a expressão do RNAm de Il1b aumentou no ARC em ambos os grupos SL e LL. No entanto, no PN60, apenas o grupo LL apresentou um aumento da expressão do RNAm de Il1b. Adicionalmente, no PN60 ambos os grupos SL e LL apresentaram um aumento na expressão do RNAm de Tnfa no ARC. Na análise morfológica das células da glia, no PN21, observou-se no grupo SL um aumento na imunorreatividade do soma da microglia e do astrócito, assim como, nos processos de extensão de ambas as células. No PN60 ambos os grupos apresentaram um aumento na imunorreatividade do soma e dos processos de extensão astrocitários, no entanto, apenas o grupo SL apresentou um aumento na imunorreatividade do soma microglial. Para analisarmos o efeito da leptina na morfologia dos astrócitos e a participação da TCPTP nesse processo, realizamos a cultura primária de astrócitos hipotalâmicos de ratos neonatos que foram estimulados com leptina [1000ng/ml], [5000ng/ml] e LPS [500ng/ml]. O LPS foi utilizado como controle positivo do protocolo. Observamos que os estímulos com leptina e LPS, aumentaram a expressão do RNAm de Ptpn2, a imunorreatividade para TCPTP e a área astrocitária. O tratamento com LPS foi capaz de promover um aumento na expressão do RNAm de Gja1 e o inverso foi observado na expressão de Gja6. Todavia, tanto o tratamento com leptina e LPS promoveu aumento na imunorreatividade para CX43 e o inverso observou-se na imunorreatividade para CX30. Para avaliarmos a participação da TCPTP nos efeitos da leptina na morfologia dos astrócitos, realizamos o silenciamento de seu gene, utilizando o siRNA Ptpn2. O silenciamento de Ptpn2 foi capaz de reverter os efeitos da leptina tanto na expressão gênica, na imunorreatividade assim como na morfologia astrocitária. O silenciamento de Ptpn2 reverteu também as respostas de redução de CX30 e o aumento de CX43 promovidas pelo LPS pela leptina. De maneira inédita esses dados sugerem a importância da TCPTP na modulação das conexinas nos efeitos da leptina e LPS na morfologia astrocitária hipotalâmica. Observamos que apenas o tratamento com LPS foi capaz de promover um aumento na expressão do RNAm de Ptpn1, e o silenciamento de Ptpn2 intensificou esse aumento da expressão de Ptpn1, demonstrando de forma inédita 10 que a TCPTP exerce ação contra regulatória sobre a PTP1B. Como esperado o estímulo dos astrócitos com LPS aumentou a expressão do RNAm de Il6, Il1b e Tnfa. Interessantemente, o silenciamento de Ptpn2 intensificou esse aumento da expressão do RNAm de Il6, Il1b e Tnfa, demonstrando desse modo que a TCPTP possui ação contra regulatória na secreção dessas citocinas. O conjunto de dados demonstra que a alteração nutricional neonatal é capaz de promover alterações no balanço energético na vida juvenil e adulta. Estas alterações estão associadas a modificações morfológicas das células da glia e ao aumento de citocinas inflamatórias, caracterizando um estado reativo glial. Adicionalmente, demonstramos em cultura primária de astrócitos hipotalâmicos que a leptina altera a morfologia destas células e pela primeira vez demonstramos, também, que a TCPTP modula esses efeitos da leptina, por meio de suas ações na conexina CX30. A CX30 participa na modulação da morfologia dos astrócitos e sua redução está associada ao aumento na área e nos processos de extensão destas células. Em conclusão, o presente estudo demonstra que alterações na disponibilidade nutricional na vida neonatal acarretam alterações no comportamento alimentar e no peso corporal na vida juvenil e adulta em ratos. Demonstramos, também, que tais alterações nutricionais neonatais estão associadas a alterações em células da glia. A leptina induz alterações morfológicas em astrócitos, sendo este efeito mediado pela TCPTP e sua regulação sobre a expressão da proteína CX30. O conjunto dos dados indica a importância das células não neuronais no controle central da homeostase energética em modelo de programação nutricional neonatal. / Nutritional changes in the neonatal period can affect the hypothalamic control of food intake and metabolism in later life. We evaluated the influence of the neonatal nutritional programming on hypothalamic glial cells, known to play an important role in the energy homeostasis. Astrocytes have active metabolic function and provide energy substrate for the neurons through connexin 43 (CX43). CX30 is important in the maintenance of astrocyte morphology, contributing to the insertion of its process into the synaptic cleft. The TCPTP (T-cell protein tyrosine phosphatase) is a counterregulator of cellular signaling of leptin and insulin, contributing to the molecular mechanisms of resistance to these hormones and it is expressed in glial and modulates CX43 activity. We hypothesized that alterations in the hypothalamic glial cells participate in the long-lasting effects on energy balance induced by neonatal nutritional programming. For this purpose, we used the model of neonatal nutritional programming induced by changing the litter size, according to the number of offspring per dam: 3 offsprings, small litter (SL), 10 offsprings, normal litter (NL) and 16 offsprings, large litter (LL). The body weight of the litter was determined weekly until weaning on the 21st day of life (PN21). After weaning, body weight was determined every five days until the 60th day of life (PN60). Individual dietary intake was determined between PN50 and PN60. The SL animals presented higher body weight (72.3 ± 2.08g) at weaning, when compared with the NL (57.19 ± 3.49g) and LL (36.27 ± 1.79g) groups and the difference between these groups were maintained until the PN60. However, the food intake of adult SL animals was not different from the NL group. On the other hand, LL animals presented a reduced weight gain at weaning but they had a catch up of reaching the vody weight of NL animals (NL: 165 ± 3.97g; LL: 145.42 ± 4.55g) from PN35 on, and this response was associated with higher food inatke. At PN21, there was an increase in plasma leptin (6.41 ± 0.90 ng/ml) and insulin (1.97 ± 0.11ng/ml) concentrations in the SL group, when compared with the NL group (leptin: 3.79 ± 0,35ng/ml; insulin: 1.32 ± 0.21ng/ml) and LL (leptin: 1.23 ± 0.10ng/ml; insulin: 0.99 ± 0.10 ng/ml). At PN60, both SL (leptin: 5,26 ± 1.15ng/ml, insulin: 2,53 ± 0,36ng/ml) and LL (leptin: 4.30 ± 0.51ng/ml, insulin: 3.39 ± 0.47ng/ml) groups presented increased plasma leptin and insulin concentrations compared with the group NL (leptin: 1.79 ± 0.41ng/ml; insulin: 1.19 ± 0.09ng/ml). The mRNA expression of Ptpn2 mRNA, gene encoding TCPTP, and its protein in the arcuate nucleus (ARC) was increase at PN21 in the SL group and in both groups at PN60, compared with the NL group. The SL group showed an increased immunoreactivity for GFAP at PN21 and 12 both groups showed this increased response at PN60. Similar response was observed for ionized calcium binding adaptor molecule 1 (IBA-1) immunoreactivity at PN21 and PN60. There was an overlap of TCPTP with GFAP immunoreactivity, but not with IBA-1. At PN21 there was an increase in the mRNA expression of Gja1, gene coding for CX43, as well as in the immunoreactivity of CX43 in the SL group only. At PN21 and PN60, mRNA expression of the Gja6, gene encoding for CX30, was reduced in both SL and LL groups. However, at PN60 it was reduction of CX30 immunoreactivity in both groups, SL and LL. At PN21, Il1b mRNA expression was increased in the ARC in both SL and LL groups. However, at PN60, only the LL group showed an increased Il1b mRNA expression. Additionally, at PN60 both SL and LL groups showed an increase in the Tnfa mRNA expression in the ARC. In the morphological analysis of glia cells, at PN21, there was an increase in the immunoreactivity of the microglia and astrocyte in the SL group, as well as in the extension processes of both cells. At PN60, both groups showed an increase in the soma immunoreactivity and astrocytic processe extension, however, only the SL group showed an increase in the immunoreactivity of the microglial soma. To analyze the effect of leptin on astrocyte morphology and the participation of TCPTP in this process, we performed the primary culture of hypothalamic astrocytes from neonatal rats that were stimulated with leptin [1000ng/ml], [5000ng/ml] and LPS [500ng /ml]. The LPS was used as a positive control of the protocol. We observed that the leptin and LPS stimuli increased the Ptpn2 mRNA expression, the TCPTP immunoreactivity and the astrocyte area. The LPS treatment increased the Gja1 mRNA expression and the opposite was observed in the Gja6 expression. On the other hand, both treatment with leptin and LPS increased the immunoreactivity for CX43 and the opposite was observed for the CX30 immunoreactivity. In order to evaluate the participation of TCPTP in the effects of leptin on the astrocyte morphology, we performed the silencing of its gene using the siRNA Ptpn2. The silencing of Ptpn2 was able to reverse the effects of leptin and LPS on gene expression, immunoreactivity as well as astrocyte morphology. The silencing of Ptpn2 was able to revert the reduction of CX30 and the increase of CX43 immunoreactivity and the its gene expression promoted by LPS leptin. These data are the first to show the importance of TCPTP in the modulation of connexins on the leptin and LPS effects on the morphology of hypothalamic astrocytes. Additionally, only LPS treatment was able to promote an increase in the Ptpn1 mRNA expression and Ptpn2 silencing enhanced this increase in Ptpn1 mRNA expression.These data demonstrate an unprecedented way that Ptpn2 exerts regulatory action against Ptpn1. As expected, the stimulation with LPS increased the mRNA expression of the Il6, Il1b and Tnfa. The silencing of Ptpn2 amplified this effect of LPS on cytokine gene expression, demonstrating that TCPTP has a counterregulatory action on the secretion of IL6, IL1? and Tnf?. Taken together these data demonstrate that the neonatal nutritional changes are able to promote alterations in the energy balance in the juvenile and adult life. These effects are associated with morphological changes in glial cells and increase of inflammatory cytokines, characterizing a glial reactive state. Additionally, using primary cell culture, we demonstrated that leptin alters the morphology of hypothalamic astrocytes. We also demonstrate for the first time that TCPTP modulates these effects of 13 leptin, through its actions regulating the expression of CX30. The data shown indicate the importance of non-neuronal cells in the central control of energy homeostasis in a model of neonatal nutritional programming.

Em machos, tanto o envelhecimento quanto a obesidade induzida por dieta hiperlipídica (DHL) apresentam defeitos na ação insulínica, no entanto há carência de informações sobre fêmeas. Avaliamos a sensibilidade à insulina, tolerância à glicose, o padrão estral e a expressão de proteínas da via insulínica em hipotálamo e músculo de fêmeas C57BL6. Camundongos com 10 meses de vida e com 4 meses alimentados com DHL apresentaram aumento de coxins gordurosos, resistência à insulina e intolerância à glicose em relação a seus controles. A DHL induziu redução no número de corpos lúteos, precedido de alteração do padrão estral; aumento da expressão do IR e PI3K no hipotálamo e de PI3K/AKT1 e IL-6 em músculo gastrocnêmio. No hipotálamo dos animais com 10 meses foi detectada redução na expressão do IR e TNF alpha. Confirmamos a associação entre obesidade, resistência à insulina e intolerância a glicose induzidas por dieta hiperlipídica e envelhecimento em fêmeas. Além disso, nestes modelos foi detectada modificação na expressão do IR hipotalâmico de modo distinto. / In males, aging and obesity induced by high-fat diet (HFD) show defects in insulin action, but there is a lack of information about females. We evaluated the insulin sensitivity, glucose tolerance, estrous cycle and proteins expression of the intracellular insulin pathway in the hypothalamus and skeletal muscle of female C57BL6. Ten month-old mice and 4 mo HFD fed mice had increased fat pads, insulin resistance and glucose intolerance. The HFD fed group showed impaired estrous cycle pattern followed by reduced number of corpora lutea. There were also, increased IR and PI3K protein levels in the hypothalamus and increased PI3K/AKT1 and IL-6 proteins in skeletal muscle. In hypothalamus of 10 month-old mice there was a decreased IR and TNF alpha proteins level. Thus, our data confirm the association between obesity, insulin resistance and glucose intolerance induced by HFD and aging in female mice. Moreover, there were distinct change proteins in expression of the hypothalamic IR in both animal models.

Orientador: Lício Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T13:42:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_LucasFranciscoRibeirodo_D.pdf: 2796257 bytes, checksum: 15ca1e9976cd62582cd7aac7715e861c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Em modelos experimentais de obesidade induzida por dieta rica em gordura há desenvolvimento de resistência hipotalâmica à leptina decorrente da ativação de uma resposta inflamatória específica no hipotálamo. Estudos recentes revelaram que além da indução da inflamação, a dieta rica em gordura ativa também vias de sinalização apoptóticas que culminam com a morte de neurônios em regiões hipotalâmicas envolvidas com o controle da fome e do gasto energético. Acredita-se que a perda de sub-populações específicas de neurônios no hipotálamo acarrete em dano dos mecanismos de controle do balanço entre consumo calórico e gasto energético, resultando no desenvolvimento ou perpetuação da obesidade. A composição de ácidos graxos da dieta tem papel central na resposta inflamatória hipotalâmica, sendo os ácidos graxos saturados de cadeia longa os mais lesivos. Por outro lado, em outras regiões do cérebro, alguns ácidos graxos insaturados podem desempenhar papel anti-inflamatório e induzir reparo funcional através da neurogênese. Neste trabalho, nós avaliamos os efeitos dos ácidos graxos poliinsaturados ?-linolênico (ALA C18:3-n3), e docosaexaenoico (DHA 22:6-n3) sobre a indução de neurogênese no hipotálamo de animais com obesidade induzida por dieta rica em gordura (HFD). Nossos resultados mostram que ácidos graxos ômega-3 administrados tanto na dieta ou diretamente no cérebro, são capazes de modular a neurogênese no hipotálamo de camundongos obesos, favorecendo a proliferação de neurônios anorexigênicos POMC, mas sem redução da ingestão alimentar. Embora esses animais não comam menos, eles se movimentam mais e exibem um discreto aumento do gasto energético. A suplementação com ômega-3 em HFD reduz a inflamação e a apoptose no hipotálamo, além de melhorar o metabolismo glicêmico e proteger os animais do ganho de peso. Aparentemente, os neurônios recém-formados surgem a partir da proliferação de células com características de células progenitoras, presentes na parede do terceiro ventrículo. Nesse processo, o receptor de ácidos graxos livres, GPR40, e o fator neurotrófico derivado do cérebro, BDNF, desempenham papel fundamental, mas a participação dessas proteínas em tais eventos parece ser dependente do estado nutricional e metabólico do animal / Abstract: In experimental models of high-fat diet (HFD)-induced obesity there is a development of hypothalamic leptin resistance due to the activation of a specific inflammatory responsein the hypothalamus. Recent studies have revealed that besides the induction of inflammation, a fat-rich diet can also activate apoptotic signaling pathways that culminate in neuronal death in hypothalamic areas responsible for the control of feeding and energy expenditure. It is believed that the loss of specific hypothalamic neuronal subpopulations deteriorates mechanisms involved in the control of caloric intake and energy expenditure, resulting in the development and perpetuation of obesity. The fatty acid composition of diet, particularly the saturated fatty acid content, can modulate immune activity in the hypothalamus, inducing an inflammatory response. However, in other regions of the brain, some unsaturated fatty acids can acts as anti-inflammatory agents and induce functional repair through neurogenesis. In this study we evaluated the effects of polyunsaturated fatty acids ?-linolenic (ALA C18:3-n3) and docosahexaenoic (DHA 22:6-n3) on the induction of hypothalamic neurogenesis in HFD-induced obese animals. Our results show that omega-3 fatty acids administered either in the diet or directly into the brain are able to modulate neurogenesis in the hypothalamus of obese mice, leading to the proliferation of anorexigenic POMC neurons. This effect is not accompanied by changes in food intake, but increase unstimulated physical activity resulting in a discrete increase in energy expenditure. In addition, omega-3 supplemented HFD reduces inflammation and apoptosis in the hypothalamus, improve glucose metabolism and protect the mice against body mass gain. Apparently, these newly formed neurons arise from progenitor cell proliferation present in the wall of the third ventricle. In this process, free fatty acid receptor, GPR40, and brain-derived neurotrophic factor, BDNF, play a key role; however, the involvement of these proteins in such events appears to be dependent on the nutritional and metabolic status of the animal / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientador: Nelci Fenalti Höehr / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_MarcellaOmenadeOliveira_M.pdf: 1239210 bytes, checksum: 7fe6d12625990e91b719a6a57de600c9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A obesidade é uma doença crônica, multifacetada e de genética complexa que, associada às suas co-morbidades, conduz a um aumento no risco de mortalidade. Essa patologia provém do balanço energético positivo entre a ingestão e gasto calórico, e é um dos principais componentes da síndrome metabólica. A preocupação com a incidência dessa doença influenciou o consumo de produtos com adição de adoçantes que, sem a devida orientação nutricional, podem não suprir adequadamente as necessidades energéticas e, ao invés de prevenir ou regredir a obesidade, podem contribuir para o aparecimento da mesma. Explorando a hipótese de que a resistência à ação central da insulina pode ser o elo entre a obesidade e demais condições clínicas, este estudo investiga os efeitos da adição, na dieta de ratos, da sacarose e dos edulcorantes: ciclamato e sacarina, na via de sinalização hipotalâmica da insulina, e sua possível influência em aspectos fisiológicos, tais como volume de ingestão, ganho de peso, taxa de desaparecimento da insulina (Kitt) e peso do tecido adiposo epididimal; bem como em aspectos moleculares, verificando a expressão de proteínas da via de sinalização de insulina, tais como IR, IRS 1 e Akt. Foram analisados dados obtidos a partir do tratamento de ratos Wistar machos divididos em quatro grupos, tendo sido cada grupo submetido, por quarenta dias, a uma das seguintes dietas: somente ração (controle), ração com adição de sacarose em solução aquosa a 30%, ração com adição de sacarina associada a ciclamato de sódio em solução aquosa a 30%, e ração com adição de sacarina em solução aquosa a 30%. Para avaliação da ingestão espontânea em doze horas, os animais foram submetidos à estereotaxia do ventrículo cerebral para possibilitar a injeção, de forma aguda, de insulina em quantidades pré-determinadas. O estudo mostrou que os animais submetidos às dietas estudadas apresentaram maior ganho de peso e no volume de ingestão e uma redução na sensibilidade à ação periférica da insulina em relação ao grupo tratado com sacarose. Também se verificou que os grupos tratados com dietas acrescidas de edulcorantes tiveram uma expressão reduzida das proteínas da via de sinalização da insulina, quando comparados ao grupo controle, indicando um risco aumentado de desenvolvimento de resistência central à ação da insulina nesses animais. Assim, concluímos que a adição desses edulcorantes à dieta de ratos supõe-se refletir em menor ação do hormônio, nesses animais, em tecidos periféricos / Abstract: Obesity is a chronic, multifaceted and genetically complex disease which, associated to its co-morbidities, leads to an increased risk of mortality. This disease is a major component of the Metabolic Syndrome and comes from the positive energy balance between caloric intake and expenditure. Concern about the incidence of this disease influenced the consumption of products with the addition of sweeteners that, without proper nutritional guidance, may not adequately supply the energy needs and, instead of preventing or reversing the obesity, may contribute to the appearance of the same. Exploring the hypothesis that Resistance to Insulin may be the link between obesity and other medical conditions, this study investigates the effects of the addition, in the diet of rats, of sucrose and the sweeteners: cyclamate and saccharin, on the signaling pathway of hypothalamic insulin, and also its effects on physiological aspects, such as intake volume, weight gain, insulin decay rate (Kitt) and epididymal adipose tissue weight; as well as on molecular aspects, verifying the expression of proteins related to the insulin signaling pathway, such as IR, IRS 1 and Akt. We analyzed data obtained from the treatment of male Wistar rats divided into four groups, each group having been subjected for forty days of one of the following diets: ration only (control group), ration with addition of sucrose in aqueous solution at 30%, ration with addition of associated saccharin and sodium cyclamate in aqueous solution at 30%, and ration with the addition of saccharin in aqueous solution at 30%. To assess the spontaneous intake volume in twelve hours, animals underwent cannulation of the cerebral ventricle to enable the injection, acutely, of insulin in predetermined amounts. The study indicated that animals fed with the diets studied showed greater weight gains, higher intake volume and a reduction in peripheral sensitivity to insulin action compared to the group treated with sucrose. We also found that groups treated with ration containing sweeteners had a reduced expression of proteins of the insulin signaling pathway when compared to the control group, indicating an increased risk of developing resistance to the central action of insulin in these animals.Thus, we conclude that the addition of sweeteners to the diet of rats it is assumed to reflect on a reduced action of this hormone in the peripheral tissues of these animals / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Patrícia de Oliveira Prada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T14:40:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Penteado_Erica_M.pdf: 2591549 bytes, checksum: 18851851d9a1a75cb2bd1ef2c4f7cb86 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O topiramato (TPM) é utilizado atualmente no tratamento da epilepsia e da enxaqueca por ser antagonista do receptor AMPA/KA e por aumentar o receptor de GABA, desencadeando a estabilização dos canais de sódio e cálcio. O efeito colateral mais conhecido dessa droga é a perda de peso, o aumento do gasto energético e da termogênese. Os hormônios anorexigênicos insulina e leptina regulam a atividade de populações distintas de neurônios que controlam o balanço energético via ativação da via IR/PI3K/Akt e OBR/JAK2/STAT3 respectivamente. Entretanto, desconhece-se se o efeito do TPM na perda de peso é decorrente de alterações da ação insulínica ou de leptina no hipotálamo. Assim, o objetivo do estudo é investigar se o tratamento com essa droga altera a sinalização da insulina e da leptina em hipotálamo de camundongos alimentados com dieta hiperlipídica (DH) ou ração padrão. Camundongos Swiss obesos ou com dieta padrão foram submetidos à cirurgia estereotáxica para inserção de cânula no ventrículo lateral. Após uma semana de recuperação, as cânulas foram testadas, e os animais foram tratados com 110mg/kg/dia de TPM, via gavagem, por sete dias, tendo sua ingestão alimentar e peso corpóreo monitorados diariamente. Observou-se que os animais em DH, tratados com TPM, possuem um menor ganho de peso e de ingestão alimentar do que seus controles, tratados com veículo. Não houve, porém, diferença quanto ao ganho de peso e ingestão alimentar dos animais tratados com a droga não obesos. Observou-se um aumento da termogênese nos animais obesos tratados com TPM pelo aumento da expressão da proteína UCP1, proteína desacopladora mitocondrial do tecido adiposo marrom, e também pelo aumento do consumo de O2 e produção de CO2, marcadores de termogênese. A nível molecular, os animais obesos apresentaram redução da fosforilação do receptor de insulina, IRS-1 e Akt induzidos por insulina e redução da fosforilação de OBR/JAK2/STAT3 induzida por leptina em hipotálamo. Entretanto, o tratamento com TPM reverteu este efeito, sugerindo que o tratamento com a droga induz uma melhora da ação/sinalização insulínica e de leptina no hipotálamo de camundongos obesos. Dessa maneira, sugere-se que o tratamento com TPM, pelo menos a curto prazo, melhora da ação e sinalização da insulina e leptina em hipotálamo, podendo ser um dos mecanismos pelos quais ocorre redução da ingestão alimentar e aumento do gasto energético nesses animais. Essa alteração de ingestão e de termogênese pode contribuir para a redução da adiposidade de camundongos obesos tratados com topiramato. Assim, essa droga parece ter um potencial terapêutico no tratamento da obesidade e da resistência à insulina / Abstract: Topiramate (TPM) is an anticonvulsant drug used for the treatment of epilepsy and prophylaxis of migraine. Weight loss is a frequently side effect reported in patients and animal models treated with TPM. In animal models topiramate may increase levels of hypothalamic corticotropic-releasing hormone (CRH), which is an anorexigenic neuropeptide and may decrease food intake. Some studies showed that topiramate may decrease energy storage, and thus increase energy expenditure and thermogenesis. However, the mechanisms by which TPM reduces body weight are not completely known so far. The hypothalamus is acknowledged as an important regulator of whole-body energy homeostasis by integrating nutrient and hormones signals from central and peripheral inputs. Anorexigenic hormones such as insulin and leptin regulate the activity of distinct neuron populations that control energy balance via IR/PI3K/Akt/Foxo1 pathway or OBR/JAK2/STAT3 pathway respectively. However, if topiramate alters hypothalamic insulin or leptin sensitivity is not known. Thus, in the present study, we asked whether topiramate treatment alters energy balance by altering insulin and leptin action/signaling in the hypothalamus from control and diet-induced obesity (DIO) mice. Our data provide evidence that short treatment with topiramate improves hypothalamic insulin and leptin signaling and action in obese mice. The improvement of hypothalamic insulin and leptin may reduce food ingestion and increase energy expenditure by increases in CRH and TRH mRNA expression. The lower food intake and higher energy expenditure induced by topiramate treatment may reduce obesity in mice on high fat feeding and may be an alternative therapy for obese treatment / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: José Barreto Campello Carvalheira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T11:00:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Katashima_CarlosKiyoshi_M.pdf: 6242705 bytes, checksum: 14f5c6a197ed1c006f1c1b224511fe54 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O hipotálamo é uma região do sistema nervoso central que angaria informações do status nutricional e governa a liberação de múltiplos sinais metabólicos, tais como insulina e leptina para manutenção da homeostase energética. Entretanto, o aumento da prevalência de obesidade vem se revelando como um dos importantes fenômenos clínico-epidemiológicos da atualidade. Fatores como o hábito alimentar e o estilo de vida sedentário desempenham papel relevante na patogênese desta doença: Observação: O resumo, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The hypothalamus is a region of the central nervous system which raises and nutritional status information governing the release of multiple metabolic signals, such as leptin and insulin for maintenance of energy homeostasis. However, the increased prevalence of obesity is becoming one of the important clinical-epidemiological phenomena today. Factors such as eating habits and sedentary lifestyles play an important role in the pathogenesis of this disease ...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Considerable evidence supports the claim that a hyperactive sympathetic nervous system (SNS) is involved in most cases of human hypertension, and therefore a more thorough understanding of the central regulation of the SNS may help elucidate novel therapeutic options. The PVN is a key region in SNS regulation of blood pressure (BP) and heart rate (HR). Stimulation of the parvocellular PVN neurons has been shown to enhance sympathetic outflow and thereby increase BP. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a modulator of neuronal activity is upregulated in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) in response to several hypertensive stimuli such as stress and hyperosmolarity, and previous studies from our lab demonstrated that both acute injections or chronic overexpression of BDNF in the PVN elevate SNS activity and BP. However, the BDNF-mediated hypertensive mechanisms are not completely understood. PVN neurons are under tonic inhibition from NTS catecholaminergic projections under baseline condition as indicated by significant BP increase after selective lesioning of NTS NE-ergic neurons. In addition, BDNF has been shown to alter NE-ergic signaling in multiple brain regions raising the possibility that BDNF may increase SNS activity and BP by interfering with NE-ergic inhibition of PVN sympathoregulatory neurons. Therefore, we tested the hypothesis that BDNF increases SNS activity and BP in part by disabling inhibitory actions of NTS catecholaminergic projections to the PVN by altering the expression of adrenergic receptors and NET in the PVN. First, blood pressure was recorded using radiotelemetry in male Sprague-Dawley rats following bilateral microinjections of adeno-associated viral vectors expressing green fluorescent protein (GFP) or myc-tagged BDNF in the PVN and microinjections of phosphate saline buffer (PBS) or Anti-Dopaine Beta Hydroxylase (DBH)-conjugated saporin (DSAP), a catecholaminergic neuron-specific neurotoxin, into the NTS. Blood pressure was monitored both during resting conditions and during acute stress tests. A second group of rats received bilateral microinjections of adeno-associated viral vectors expressing GFP or myc-tagged BDNF in the PVN, and were sacrificed after 5 weeks. PVN and NTS samples were then selectively isolated using a brain punch tool, and expression of TH, DBH, 1a, 1b, 2a, 1, 2 receptors, and norepinephrine transporter (NET) was analyzed using quantitative RT-PCR. Our results show that BDNF overexpression in the PVN leads to increased expression of catecholamine synthesizing enzymes in the NTS. In addition, both BDNF overexpression in the PVN, and DSAP lesioning in the NTS increased MAP compared to control rats. However, combined treatment with BDNF and DSAP failed to have any additional hypertensive effects suggesting that BDNF treatment may abolish the inhibitory effect of NTS catecholaminergic projections. Lesioning the NTS catecholaminergic neurons didn’t appear to have a significant effect on mean arterial pressure response to the stress tests, although DSAP treatment appeared to decrease the initial heart rate response to acute stress, and this effect was most pronounced in GFP rats. These results indicate that BDNF overexpression in the PVN desensitizes sympathoregulatory neurons to inhibitory NTS catecholaminergic projections during baseline conditions.

Il est désormais clairement établi que la vélocité de croissance dans les premiers mois de la vie influence le risque d’apparition de maladies métaboliques, telles que l’obésité à l’âge adulte. L’un des mécanismes sous-jacents à cette programmation néonatale pourrait mettre en jeu des perturbations de l’environnement hormonal périnatal pendant des périodes critiques du développement. Cette hypothèse repose sur des travaux réalisés au laboratoire montrant que pendant le développement postnatal, des hormones telles que la ghréline et la leptine peuvent influencer le développement des circuits neuronaux impliqués dans la régulation de la prise alimentaire à l’âge adulte. Dans ce contexte, l’objectif général de ce travail de thèse a été de définir les médiateurs hormonaux par lesquels l’environnement nutritionnel périnatal peut influencer le développement de maladies métaboliques à l’âge adulte. Une attention particulière a été portée à la contribution de la ghréline et de la leptine.Pour induire une surnutrition postnatale, nous avons utilisé un modèle murin de surnutrition postnatale induit par la réduction de la taille de portées. Au troisième jour de vie post-natale, les portées ont été réduites à 3 petits (SL) pour induire une suralimentation et les portées contrôles ont conservé 7 petits. Comparées aux souris NL, les souris SL présentent un gain de poids rapide pendant la lactation, et présentent un surpoids à l'âge adulte même sous régime de nourriture standard. A l’âge adulte, les souris SL ont une adiposité et une glycémie à jeun plus élevée. Sous régime « obésogène » les souris SL présentent également une prise de poids et de graisse plus importante que les souris NL. La première partie de ces travaux a été dédiée à l’étude de la nutrition périnatale sur le développement du système ghrélinergique. Les souris SL présentent des taux réduits de ghréline total et active pedant la troisième semaine de vie post-natale. Ces diminutions des taux de ghréline sont associées à une diminution de l’expression de ghreline dans l'estomac. La normalisation de la ghrélinémie ne parvient pas à restaurer un phénotype métabolique normale chez les souris SL ce qui suggère que les souriceaux SL présenteraient une résistance a la ghréline. En accord avec cette hypothèse, les souriceaux SL présente une atténuation de la réponse centrale suite à l’injection périphérique de ghréline. Les mécanismes sous-jacents à cette résistance à la ghréline semblent mettre en jeu un défaut de transport de l’hormone via les tanycytes de l’éminence médiane. La seconde partie de mon travail de thèse a consisté à étudier l’importance de la leptine dans la programmation nutritionnelle. Etant connu que les souris SL présent des taux anormalement élevés de leptine pendant la deuxième semaine de vie postnatale, nous avons émis l’hypothèse que le blocage partiel de la leptine chez les souris SL pourrait avoir des effets bénéfiques sur le métabolisme de ces souris. Les animaux injectés néonatalement avec l’antagoniste de la leptine ne présentent pas de différences de poids par rapport aux animaux contrôles. En revanche, l’injection de l’antagoniste de la leptine chez les souriceaux SL induit une amélioration de leur masse grasse et une normalisation de leur glycémie. Cette amélioration du phénotype métabolique des souris SL est associée à un rétablissement de la sensibilité centrale à l’hormone leptine.Ainsi, les travaux réalisés au cours de ce doctorat confortent l’importance de l’environnement hormonal périnatal, en particulier de la ghéline et de la leptine, dans la programmation nutritionnelle. / Rapid weight gain after birth is associated with increased risk of metabolic disease in adulthood. This metabolic malprogramming may be mediated by endocrine disturbances during critical periods of development. Several hormones that act on hypothalamic feeding circuits in adulthood to regulate energy homeostasis, such as leptin and ghrelin, are also involved in the postnatal development of these circuits. Previous studies have shown that leptin promotes the growth of axons from the arcuate nucleus of the hypothalamus(ARH), whereas ghrelin inhibits arcuate axon growth. The aim of this thesis was to study whether accelerated growth during early postnatal life is associated with alterations in the ghrelin and leptin systems during postnatal development. Our general objective was also to examine the relative contribution of ghrelin and leptin in the metabolic malprogramming associated with neonatal overnutrition. To manipulate nutrient intake specifically during postnatal (pre-weaning) life, we manipulated litter size on postnatal day 3 by randomly distributing pups among mothers such that small litters (overfed) had 3 pups and normal litters (normal fed) had 7 pups. SL pups gained substantially more weight than NL pups during lactation, and remained overweight throughout adulthood on a standard chow diet. Adult SL mice displayed increased adiposity and and elevated fasting glucose levels. Adult SL mice also gained more weight and fat when exposed to an obesogenic diet. During postnatal development, SL pups displayed reduced total and active circulating ghrelin levels compared to NL pups, particularly during the third week postnatal week. This was associated with decreased stomach expression of ghrelin in the third postnatal week. Normalization of hypoghrelinemia in overnourished pups is relatively ineffective in ameliorating metabolic outcomes, suggesting that SL pups may present ghrelin resistance. Consistent with this idea, pups raised in small litters displayed an impaired central response to peripheral ghrelin. The mechanisms underlying this ghrelin resistance include diminished ghrelin transport into the brain.In addition to marked changes in ghrelin levels, neonatally overnourished pups also display a marked increase in circulating leptin levels during early postnatal life. To investigate whether these abnormally high levels in circulating leptin levels might be causally involved in the central leptin resistance and metabolic programming, we used a competitive leptin antagonist to partially block leptin action in SL and NL mice between P6 and 16, i.e. when when endogenous leptin levels are high in SL mice. Neonatal injection of the leptin antagonist had no effect on postnatal growth or adult body weight. However, SL pups treated with the leptin antagonist displayed a marked reduction in adult fat mass and normalized glucose tolerance and insulin sensitivity. Previous studies reported that SL exhibit early central leptin resistance. Remarkably, pretreatment with leptin antagonist significantly increased leptin-induced pSTAT3 levels in the ARH of SL pups, suggesting that neonatal leptin antagonism may normalize metabolic programming in neonatally overnourished mice by enhancing central leptin sensitivity. Together our data show that early postnatal nutrition influence the pattern of secretion of metabolic hormones and their ability to act on hypothalamic regions involved in appetite regulation. These hormonal alterations may contribute to the metabolic defects observed in subject exposed to overnutrition during early life.

Pronounced seasonal adaptations in physiology and behaviour are exhibited by mammals living in polar and temperate habitats. These include the development of a winter coat, altered fat reserves, reproductive quiescence and food hoarding. Maintaining constant body temperature (Tb) during winter is energetically very costly, and so many small mammals periodically abandon homeothermy in favour of heterothermy. The two principal heterothermic strategies are daily torpor and seasonal hibernation, in which bouts of profound hypothermia range from a few hours to several days (respectively). It is now clear that hypothalamic thyroid hormone (TH) regulation, and specifically the availability of the active metabolite triiodothyronine (T3), is a critical regulator of seasonal reproductive cycles in many species including birds and mammals. The impact of this signal as a switch for seasonal changes in physiology has been highlighted by the demonstration that blockade of this pathway prevents seasonal adaption in hamsters. Peripheral TH signalling is also a principle regulator of metabolic rate in mammals. Despite these findings nothing is yet known about the involvement of central (hypothalamic) and peripheral TH cycles in the expression of torpor and hibernation. Within this thesis, the role of TH dynamics both in the brain and peripheral circulation is examined within three models of heterothermia: the Siberian (Phodopus sungorus) and European (Cricetus cricetus) hamsters, which employ daily torpor and hibernation, respectively, and the laboratory mouse (Mus Musculus) which exhibits torpor in response to metabolic stress such as food restriction. To delineate TH regulation and signalling in the context of both seasonal and acute physiological responses, the expression of genes involved in thyroid hormones conversion (e.g. Deiodinase type II (Dio2) and type III (Dio3) and transport (e.g. Monocarboxylate transporter 8, Mct8) within the ependymal layer of the ventral 3rd ventricle have been detailed across seasonal (long (LD) and short day (SD)) photoperiods, and during normothermic and hypothermic conditions. Furthermore, TH concentrations have been directly measured within the hypothalami of P. sungorus and C. cricetus, and TH responsive genes (e.g. Hairless (Hr) and Thyrotropin releasing hormone (TRH) to determine the potential impact of regional T3 signalling. As expected, Dio2 and Dio3 expression in P. sungorus exhibited a strong seasonal cycle indicative of elevated T3 production during SD (reduced Dio2 and elevated Dio3). Unexpectedly, total T3 measures from hypothalamic extracts revealed no significant alteration either seasonally or during torpor/hibernation in hamsters. However, Hr expression in the ependymal layer and TRH expression in the paraventricular nucleus (PVN) suggests low T3 concentrations during SD are localised to specific regions and does not encompass the whole hypothalamus per se. In addition, altered serum TH concentrations implicate seasonal and torpor associated dynamics that may play a role in seasonal adaptation and hypothermia. Finally, data from transgenic mice strongly implicate the melatonin-related receptor (GPR50) in leptin signalling and aberrant thermogenesis in mice.