O presente estudo visa descrever a farmacocinética, o metabolismo e a excreção renal da doxorrubicina, uma antraciclina utilizada no tratamento do câncer de mama. A doxorrubicina é biotransformada a doxorrubicinol pelas enzimas carbonil redutase 1 e 3 e aldo-ceto redutase. Foram investigadas 12 pacientes portadoras de câncer de mama no primeiro ciclo de tratamento adjuvante ou neoadjuvante com doxorrubicina (60 mg/m2) administrada por infusão intravenosa durante 30 min. As amostras seriadas de sangue foram colhidas até 48 h após o início da infusão e a urina foi coletada em intervalos de 4 h por 48 h. Os métodos de análise da doxorrubicina e doxorrubicinol em urina e em plasma como concentração total e concentração livre foram desenvolvidos empregando LC-MS/MS. Os métodos não apresentaram efeito matriz ou efeito residual e mostraram-se lineares para ambos os analitos nos intervalos de 0,4-200 ng/mL para concentração total em plasma; 0,4-40 ng/mL para concentração livre em plasma e 20-8000 ng/mL de urina. Os parâmetros farmacocinéticos da doxorrubicina foram calculados com base nas curvas de concentração plasmática total versus tempo empregando o programa Phoenix® WinNonlin® por modelo tricompartimental com observação de meias-vidas de distribuição, de eliminação rápida e de eliminação terminal de 0,10; 2,55 e 40,87 h, respectivamente. A fração livre de doxorrubicina foi de 16,05% e de doxorrubicinol de 17,34%. A fração da dose de doxorrubicina recuperada na urina (0-48 h) foi de 2,35% para o fármaco inalterado e de 1,35% para o fármaco metabolizado a doxorrubicinol. Os valores médios de clearances na população do estudo foram de 58,07 L/h para o total, 1,45 L/h para o renal, 56,62 L/h para o hepático e 0,71 L/h para o clearance de formação do metabólito doxorrubicinol. Logo, os dados inferem que a eliminação da doxorrubicina é preponderantemente biliar. Os valores de clearance total não corrigidos em função do peso ou área superficial corpórea mostraram coeficiente de variação de 95,32%, enquanto para valores de clearance total corrigidos em função do peso ou da área superficial corpórea, foram obtidos valores similares, respectivamente, 88,74% e 89,84%. O estudo detalhado da farmacocinética da doxorrubicina e seu metabólito doxorrubicinol permitiu, pela primeira vez, o cálculo da razão de extração hepática (E=0,63) em humanos, classificando a doxorrubicina como um fármaco de extração hepática intermediária. / The aim of this study is to describe the pharmacokinetics, metabolism and renal excretion of doxorubicin, an anthracycline used in breast cancer treatment. Doxorubicin is metabolised to doxorrubicinol by carbonyl reductase 1 and 3, and aldo-keto reductase enzymes. Twelve breast cancer patients with indication of adjuvant or neoadjuvant treatment were assessed during the first cycle of doxorubicin administration (60 mg/m2, iv-infusion, 30 min). Serial blood samples were collected up to 48 hours after the start of iv-infusion; urine was collected in 4-hour intervals, during 48 h. Methods for simultaneous quantification of doxorubicin and doxorubicinol in urine, as well as total and unbound fraction in plasma were developed applying LC-MS/MS. Neither matrix effect or carryover effect were observed. The methods were linear for both analytes in the ranges of 0.4-200 ng/mL for total plasma concentration; 0.4-40 ng/mL for unbound fraction concentration in plasma and 20-8000 ng/mL urine. Doxorubicin pharmacokinetic parameters were calculated based on total plasma concentration versus time curves applying Phoenix® WinNonlin® software by tricompartmental model analysis. Distribution, fast elimination and slow elimination half-lives were observed to be 0.10, 2.55 and 40.87 h, respectively. Unbound fractions were 16.05% for doxorubicin and 17.34% for doxorubicinol. The fraction of doxorubicin dose recovered in urine (0-48 h) was 2.35% for the drug excreted unchanged and 1.35% for doxorubicinol. The clearance mean values for the assessed population were 58.07 L/h for total clearance, 1.45 L/h for renal clearance, 56.62 L/h for hepatic clearance and 0.71 L/h for doxorubicinol metabolite formation clearance. Thus, the data suggest that doxorubicin elimination is carried out mainly by biliary excretion. Initial total clearance values demonstrated 95.32% variation coefficient, while total clearance values corrected to weight or body surface area presented similar variation coefficients, respectively 88.74% and 89.84%. The detailed pharmacokinetics study of doxorubicin and its metabolite doxorubicinol made it possible to calculate, for the first time in humans, the hepatic extraction ratio (E = 0.63), categorising doxorubicin as an intermediate hepatic-extraction-ratio drug.

A família Orchidaceae é a maior família entre as monocotiledôneas e representa uma das maiores famílias de plantas floríferas com um número estimado de cerca de 30 mil espécies. A complexidade taxonômica de um dos gêneros dentro dessa família, o Catasetum, tem despertado muito interesse por parte dos cultivadores e pesquisadores em Orchidaceae, especialmente devido aos novos táxons que estão sendo descobertos no gênero. Visando aprimorar a classificação de espécies do gênero, uma ferramenta a ser utilizada é a análise dos constituintes químicos do metabolismo dessas plantas, onde fica evidenciada a necessidade de estudos utilizando métodos analíticos mais sensíveis, rápidas e seletivas, como a análise metabolômica. A obtenção da impressão digital metabólica é a obtenção detalhada dos metabólitos do organismo sob determinada condição, produzindo um cromatograma que é característico daquela planta, como uma impressão digital. Através disso, é possível determinar diferenças metabólicas em amostras, por meio de ferramentas estatísticas. Para o refinamento dos dados, é necessário o uso de softwares específicos que extraem as informações úteis para as análises. Foram analisadas 42 espécies distintas do gênero Catasetum e algumas duplicatas, totalizando 51 amostras por GC-MS e UHPLC-MS(ESI-Orbitrap). As \"impressões digitais\" metabólicas foram processadas nos softwares MetAlignTM e MSClust, e as matrizes geradas foram analisadas por análise de componentes principais (PCA), análise de cluster hierárquico (HCA) e análise discriminante ortogonal por mínimos quadrados parciais (OPLS-DA). Os métodos utilizados para as análises tanto por GC-MS quanto por UHPLC-MS resultaram em dados satisfatórios para análise metabolômica, gerando 57 substâncias voláteis identificadas a partir da fragrância das flores, sendo acetato de nerila, sabineno, ?-mirceno, ?-pineno e ?-pineno as mais frequentes. Os resultados das análises metabolômicas apresentaram proximidade com a filogenia, principalmente em níveis mais específicos. Os grupos gerados pelas análises, de modo geral, foram coerentes quanto à semelhança metabólica entre as espécies que os compõem, sugerindo a possibilidade do uso de impressões digitais metabólicas como uma boa ferramenta para análise quimiotaxonômica / The Orchidaceae family is the largest family among monocotyledons and represents one of the largest families of flowering plants with an estimated 30,000 species. The taxonomic complexity of one of the genera within this family, the Catasetum, has aroused much interest from growers and researchers in Orchidaceae, especially due to the new taxa being discovered in the genus. Aiming to improve the classification of species of the genus, a tool to be used is the analysis of the chemical constituents of the metabolism of these plants, where it is evidenced the need for studies using analytical methodologies more sensitive, fast and effective, such as the metabolomics analysis. Obtaining the metabolic fingerprint is the detailed obtaining of the metabolites of the organism under certain condition, producing a chromatogram that is characteristic of that plant, like a fingerprint. Through this, it is possible to determine metabolic differences in samples, through statistical tools. For the refinement of the data, it is necessary to use specific softwares that extract the useful information from analyzes data. The information generated can be used with different applications. A total of 51 samples were analyzed by GC-MS and UHPLC-MS (ESI-Orbitrap), 42 different species of the genus Catasetum and some duplicates. Metabolic \"fingerprints\" were processed in the MetAlignTM and MSClust softwares, and the generated matrices were analyzed by Principal Component Analysis (PCA), hierarchical cluster analysis (HCA) and partial least squares orthogonal discriminant analysis (OPLS-DA). The methods used for analysis by both GC-MS and UHPLC-MS resulted in satisfactory data for metabolomics analysis, generating 57 volatile substances identified from the flower fragrance, being neryl acetate, sabinene, ?-myrcene, ?-pinene and ?-pinene the most frequent. The results of the metabolic analyzes showed proximity to the phylogeny, mainly in more specific levels. The groups generated by the analyzes, in general, were coherent regarding the metabolic similarity between the species that compose them, suggesting the possibility of the use of metabolic fingerprints as a good tool for chemotaxonomic analysis

O relevante conceito de sustentabilidade dos dias atuais leva a população a pensar no tratamento dos recursos naturais e principalmente na qualidade e escassez da água. A grave problemática quanto à gestão dos resíduos urbanos no país, desde sua produção, coleta e disposição final são os desafios colocado aos municípios e a sociedade em geral. O uso cada vez mais abundante dos medicamentos farmacêuticos gera uma demanda de resíduos que acabam atingindo os leitos dos rios. Com avanço das tecnologias é possível monitorar e conhecer os resíduos que afetam indiretamente e diretamente as águas das bacias hidrográficas. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar uma metodologia analítica para a determinação dos resíduos de fármacos (ácido acetil salicílico, diclorofenaco de sódio, paracetamol, ibuprofeno e fenoprofeno) em águas utilizando a cromatografia líquida de ultra performance acoplada à espectrometria de massas tipo tandem (UPLC-MS/MS). Foram utilizadas duas fases moveis distintas. Para os fármacos paracetamol e diclofenaco foi utilizado como fase móvel água: metanol (1:1; V/V) com adição de ácido fórmico e a ionização de eletrospray em modo positivo; para os fármacos acetil salicílico, ibuprofeno e fenoprofeno foi utilizado água: metanol (1:1; v/v) com adição de acetato de amônio e a ionização de eletrospray em modo negativo. O desempenho do método foi avaliado quanto aos seguintes parâmetros: especificidade e seletividade, faixa de trabalho, linearidade; limite de detecção e limite de quantificação, exatidão, robustez e incerteza de medição. Os resultados obtidos comprovaram a adequabilidade do método ao propósito supracitado. Os valores obtidos para o limite de decisão (ccα) e capabilidade de detecção (ccβ) foram: paracetamol 0,21 e 0,34 μg L -1; diclofenaco 2,42 e 3,24 μg L -1 ; AAS 1,56 e 2,45 μg L -1; ibuprofeno 2,34 e 3,21 μg L -1 e fenoprofeno 1,89 e 2,33 μg L-1, respectivamente. A metodologia foi aplicada na caracterização de amostras de água superficial (bruta) e tratada proveniente de áreas de captação e de tratamento de água da bacia hidrográfica do Paraíba do Sul. Foram realizadas duas coletas distintas, setembro/ 2010 e novembro/ 2010, nos municípios de Guararema, São José dos Campos, Taubaté e Pindamonhangaba. Em 31,2 % das amostras, Cinco amostras de água bruta das 16 amostras analisadas, foram encontrados resíduos de paracetamol. Os resultados obtidos apresentaram-se em uma faixa de concentração de 0,10 a 0,50 μg L -1. / The relevant concept of sustainability of the present day leads people to think about the treatment of natural resources and particularly in the quanlity and scarcity of water. The serious problems regarding the management of municipal waste in the country, from production, collection and disposal are the challenges facing municipalities and society in general. The increasing use of pharmaceutical drugs most abundant generates a demand for waste that eventually reach the river beds. With advancement of technologies and know you can monitor the waste that directly and indirectly affect the waters of river basins. The objective of this study was to develop and validade analytical methods for residues of drugs (aspirin, sodium diclofenac, paracetamol, ibuprofen and fenoprofen) in water using ultra performance liquida chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). We used two different mobile phases. For the drugs paracetamol and diclofenac was used as mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of formic acid in positive electrospray ionization mode. For drugs acetyl salicylic acid, ibuprofen and fenoprofen was used mobile phase water:methanol (1:1, v/v) with addition of ammonium acetate and negative electrospray ionization mode. The performance of the method was evaluated on the following parameters: specificity and selectivity, working range, lineariry, limit of detection and limit of quantification, accuracy, ruggedness and uncertainty measurement. The result obtained proved the suitability of the method for fit purpose. The values obtained for the decision limit (ccα) and detection capability (ccβ) were 0.21 and 0.34 μg L-1, diclofenac 2.42 and 3.24 μgL-1, ASA 1.56 and 2.45 μgL-1, respectively. The methodology was applied in the characterization of samples of surface water (raw) and treated from catchment areas and water treatment basin of Paraíba do sul were two distinct collections, September/2011 and November 2010 in the municipalities of Guararema, São José dos Campos, Taubaté and Pindamonhangaba. In 32,2% of all samples, five samples of 16 raw water samples, residues were found for paracetamol. The results were presented in a concentration range from 0.10 to 0.50 μg L-1.

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

[pt] O presente trabalho envolve a implementação e validação de metodologia analítica para determinação de resíduos de agrotóxicos em amostras de alimentos provenientes do Estado do Rio de Janeiro, cujos resultados servirão para um aumento de informações de um banco de dados sobre os mesmos, bem como para o aprimoramento do sistema nacional de saúde e promoção da saúde da população. Foram analisados os agrotóxicos das classes nitrogenados e piretróides. As amostras foram coletadas no CEASA da cidade do Rio de Janeiro, uma vez que este é o principal centro distribuidor de frutas e hortaliças da cidade. As culturas escolhidas para análise foram maçã, manga, morango, pepino e tomate de mesa. Após a otimização das condições cromatográficas, metodologia de extração e validação da metodologia pelos parâmetros de curva analítica e linearidade, seletividade (efeito matriz), repetibilidade, recuperação, homocedasticidade e limite de detecção do método, as amostras foram coletadas e analisadas no período de novembro de 2016 a fevereiro de 2017. A análise foi baseada no método QuEChERS e quantificação por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas tandem, no modo de Monitoramento de Múltiplas Reações. Obteve-se um método de curta duração, inferior a vinte minutos, capaz de quantificar 41 agrotóxicos com dois monitoramentos precursor-produto para cada um dos analitos, apresentando as seguintes vantagens: rápido, econômico, fácil, efetivo, robusto e seguro. O LDM variou de 1,34 a 10,22 ng g(-1). A concentração de agrotóxicos das amostras esteve abaixo desses valores para a maioria (78 porcento dos casos) dos 41 agrotóxicos analisados. Para as culturas de tomate e pepino, os agrotóxicos quantificados estiveram próximos aos seus respectivos limites de detecção. Para a manga, observaram-se alguns picos de maior concentração para o propargito e lambda-cialotrina. O primeiro de uso não autorizado pela ANVISA e o segundo, embora presente, abaixo do limite estabelecido por esta agência. As culturas de maçã e morango apresentaram a maior contaminação por agrotóxicos (38 e 44 porcento acima do LDM, respectivamente), muitos não autorizados pela ANVISA. Por ser um centro de grande distribuição de alimentos, a CEASA é suprida por diferentes fornecedores, sendo assim a variabilidade das fontes de alimentos coletados é muito grande e, portanto, a continuidade desta sistemática de avaliação torna-se necessária. / [en] The present work regards the implementation and validation of a method for analysis of pesticide residues in produce from the state of Rio de Janeiro for the improvement of the national health system. Pyrethroids and triazines class pesticides were analyzed for this research. The samples were collected at CEASA in the city of Rio de Janeiro, since it is the main fruit and vegetable distribution center in the city. The produce chosen for the analyses were apple, mango, strawberry, cucumber and tomato. After optimization of the chromatographic conditions, extraction methodology and evaluation of the parameters linearity, selectivity (matrix effect), repeatability, recovery, homocedasticity and limits of detection of the method, the samples were collected, from November 2016 to February 2017. The QuEChERS method was used for the extraction of pesticide residues and the PSA method was used for the purification of extracts, both in triplicates. The extracts were analyzed by gas chromatography with tandem mass spectrometry in Selected Reaction Monitoring mode (Multiple Reaction Monitoring). A short run method was achieved for the determination of 41 pesticides with two precursor-product for each analyte. The analitycal method showed several advantages - quick, cheap, easy, effective, rugged and safe. The detection limits were 1,34 ng/g and 10,22 ng/g. The majority of the pesticides analysed (78 per cent) were below this result. For tomato and cucumber, the only quantified compounds were close to their respective detection limits. For the analysis of mango pesticides, some peaks of higher concentration for propargite and lambda-cyhalothrin were observed. The first one is not authorized by ANVISA and the second, although present, was found below the limit established by this agency. The apple and strawberry crops showed the highest contamination by pesticides (38 and 444 per cent, respectively), many of which were not authorized by ANVISA. CEASA is a large food distribution center, so it is supplied by different distributers. The variability of the sources of food collected is very large. A more representative study on the quality of food would require a higher number of samples with a higher frequency of sampling.

O refluxo vésico-ureteral (RVU) é uma das condições urológicas comumente diagnosticada entre crianças. Altos graus dessa condição podem causar cicatrização renal, insuficiência renal e hipertensão arterial. A uretrocistografia miccional é o método mais comumente utilizado para o diagnóstico, no entanto, esse procedimento envolve sedação, cateterismo vesical e expõe a criança a uma quantidade significativa de radiação. A investigação metabolômica pode fornecer novos entendimentos sobre a doença e visa a descoberta de metabólitos específicos associados a ela. Assim, existe um potencial considerável para a implementação de perfil metabólico em análises clínicas. Dessa forma, buscou-se estabelecer uma alternativa não invasiva para identificar crianças com o RVU através da metabolômica. Para a investigação metabolômica alvo um método por eletroforese capilar acoplada ao espectrômetro de massas (CE-MS) com analisador to tipo ion trap foi desenvolvido e validado para a determinação de 27 aminoácidos em urina. Os parâmetros experimentais relacionados às configurações da interface CE-MS, eletrólito (BGE) e espectrômetro de de massas (MS) foram otimizados, proporcionando uma boa separação dos 27 aminoácidos, incluindo os isômeros L-leucina, L-isoleucina e L-alloisoleucina, em menos de 30 min. O líquido auxiliar (SHL) foi composto de 0,5% (v/v) ácido fórmico em 60% (v/v) água/metanol à uma vazão de 5 µL min-1. O BGE consistiu de 0,80 mol L-1 de ácido fórmico e 15% (v/v) de metanol. Um procedimento de stacking por pH foi implementado para aumentar a detectabilidade (uma solução de NH4OH a 12,5% (v/v) foi injetada a 0,5 psi/9 s antes das amostras). O método foi validado de acordo com os protocolos FDA e ICH, exibindo parâmetros aceitáveis. A quantificação bem sucedida dos aminoácidos em amostras de urina de um estudo piloto do RVU foi alcançada. A avaliação estatística dos resultados mostrou que alguns dos aminoácidos avaliados podem carregar informações que possibilitam discriminar as amostras de urina entre os grupos teste e controle. Para a análise metabolômica global urinária, métodos por RPLC-MS e HILIC-MS foram otimizados. Cinco colunas com diferentes propriedades foram investigadas para RPLC e quatro colunas para HILIC; adicionalmente, foram investigados a influência dos aditivos e pH da fase móvel. As condições ótimas foram determinadas avaliando o formato de pico, a relação sinal-ruído, o tempo de retenção, o número de molecular features detectados e sua distribuição durante o gradiente de eluição. A melhor condição obtida para RPLC utiliza a coluna CSH C18 e fase móvel composta por 0,1% (v/v) ácido fórmico em água (A) e 0,1% (v/v) ácido fórmico em acetonitrila (B). Para HILIC, o melhor desempenho foi obtido com a coluna zwitteriônica ZIC-HILIC e fase móvel composta por 10 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (B) e 95% (v/v) acetonitrila e 5% 200 mmol L-1 acetato de amônio pH 6,8 (A). As amostras de urina dos grupos controle e teste foram submetidas à análise metabolômica global por RPLC-MS usando o método otimizado e por CESI-MS. Os resultados indicaram que diversas rotas metabólicas podem ter sido alteradas pelo RVU. Alteração dos níveis de carnitinas e acilcarnitinas, aminoácidos e derivados, purinas e outros foi observada. Ainda, a presença de acilcarnitinas na urina podem indicar danos mitocondriais e a diminuição de triptofano e aumento do ácido quinurênico indicam uma alteração no metabolismo do triptofano. / Vesicoureteral reflux (VUR) is one of the most commonly urologic conditions diagnosed among children. A high degree of this condition can cause kidney scarring, kidney failure and high blood pressure. Voiding cystourethrography is the standard method for diagnosis; however, this procedure involves sedation, bladder catheterization and exposes the child to a significant amount of radiation. Metabolomics has provided new insights about the disease and aims to discover specific metabolites associated with it. Thus, there is a considerable potential for the implementation of metabolic profile in clinical analyses. Thus, we attempted to establish a noninvasive alternative to identify children with VUR through metabolomics approach. For target metabolomics, a CE-MS method was developed and validated for the separation and quantitative analysis of 27 amino acids in urine. Experimental parameters related to the CE-MS interface (based on co-axial sheath liquid, SHL), background electrolyte (BGE) and mass spectrometer (MS) settings were optimized providing a good separation of 27 amino acids, including the isomers L-leucine, L-isoleucine and L-alloisoleucine, in less than 30 min. The SHL was composed of 0.50% (v/v) formic acid in 60% (v/v) methanol-water delivered at a flow rate of 5 µL min-1. The BGE consisted of 0.80 mol L-1 formic acid and 15% (v/v) methanol. A pH stacking procedure was implemented to enhance sensitivity (a 12.5% (v/v) NH4OH solution was injected at 0.5 psi/9 s prior to samples). The proposed method was thoroughly validated according to FDA and ICH protocols exhibiting acceptable parameters. A successful quantification of amino acids in urine samples from the VUR cohort was achieved. The statistical evaluation of the results showed that some of the amino acids may carry information for the discrimination of the urine samples between the test and control groups. For untargeted metabolomics analysis, methods by RPLC-MS and HILIC-MS were optimized. Five columns with different properties were investigated for RPLC and four columns for HILIC; additionally, the influence of additives and pH of the mobile phase were investigated. The optimum conditions were determined assessing the peak shape, signal-to-noise ratio, retention time, number of molecular features detected and their distribution during the elution gradient. The best condition obtained for RPLC uses CSH C18 column and mobile phase composed by 0.1% (v/v) formic acid in water (A) and 0.1% (v/v) formic acid in acetonitrile (B). For HILIC, the best performance was obtained with the zwitterionic ZIC-HILIC column and mobile phase composed by 10 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (B) and 95% (v/v) acetonitrile and 5% (v/v) 200 mmol L-1 ammonium acetate pH 6.8 (A). Urine samples from the control and test groups were submitted to global metabolomics analysis by RPLC-MS using the optimized method and by CESI-MS. The results indicated that several metabolic pathways may have been altered by VUR. Changes of carnitine and acylcarnitine levels, amino acids and derivatives, purines and others was observed. Furthermore, the presence of acylcarnitines in the urine may indicate mitochondrial damage and the decrease of tryptophan and increase of the kynurenic acid indicate a change in the metabolism of tryptophan.

L’ovoproduit est une matrice biologique complexe, constituée de protéines, lipoprotéines, lipides et de nombreux micronutriments (vitamines, minéraux, etc.). Cependant, une fois cassé et homogénéisé l'ovoproduit entier liquide perd une bonne part de ses propriétés de conservation, devenant ainsi pour certaines bactéries un excellent milieu de croissance. Ce développement bactérien non maîtrisé provoque en plus des risques sanitaires, des altérations biochimiques modifiant fortement les qualités organoleptiques de l’ovoproduit. On se propose dans cette thèse d’étudier les mécanismes biochimiques impliqués par des approches de métabolomique combinées (profilage métabolique par GC-MS et prise d’empreinte métabolique par GC-MS et RMN). Cette approche permettra de décrire et de comprendre de façon intégrée certains mécanismes jusqu’alors peu ou pas caractérisés et d'identifier in fine des marqueurs précoces de ces altérations microbiologiques. / Egg products are complexes biological matrix constituted of proteins, lipoproteins, lipids and many micronutrient (vitamins, mineral, etc…). However, once broken and mixed, the liquid egg product looses a great deal of its keeping properties, thus becoming an excellent growth media for many bacteria. This uncontrolled bacterial development induces, beside the involved health risks, biochemical alterations which modify the product’s organoleptic qualities. This manuscript aims to study the involved biochemical mechanisms using combined metabolomics approaches (Metabolic profiling by GC-MS and metabolic fingerprinting by GC-MS and NMR). This approach will allow the description and understanding of certain mechanisms which characterization was previously absent or limited. It will also allow the identification of early prediction biomarkers of these biological alterations.

Malgré les progrès évidents sur la compréhension de la carcinogénèse, l’incidence des cancers est toujours en augmentation. C’est pourquoi les besoins en nouveaux traitements sont importants. Notre travail de thèse a porté sur l’évaluation pharmacologique d’une nouvelle molécule anticancéreuse, l’OTX015. Cette petite molécule de synthèse a la propriété d’inhiber les protéines bromodomaines (famille des BET) qui jouent un rôle clé dans les mécanismes épigénétiques et dont la dérégulation favorise l’apparition de cancers en particulier des hémopathies malignes. Des études précliniques in vitro sur plusieurs lignées cellulaires d’hémopathies malignes et in vivo sur des souris xénogreffées ont permis de mettre en évidence les propriétés antitumorales de l’OTX015. Une méthode de dosage des concentrations plasmatiques d’OTX015 par UPLC-MS/MS a été développée et validée afin d’évaluer sa pharmacocinétique chez les patients inclus dans un protocole d’escalade de doses de phase I. Dans un premier temps, la PK de l’OTX015 a été modélisée par une approche de population et dans un second temps un modèle PK-PD a été construit pour pouvoir évaluer le profil de la tolérance (nombreuses thrombopénies) de cette nouvelle molécule. / Despite obvious progress in carcinogenesis understanding, the incidence of cancer is still increasing. Therefore, the need of new treatments remains important. Our thesis focused on the pharmacological evaluation of a new anticancer drug, OTX015. This small synthetic molecule inhibits the bromodomain proteins (BET) that play a key role in epigenetic mechanisms. Downregulation of BRDs promotes cancer occurrence including hematological malignancies. Preclinical evidences obtained from in vitro and in vivo studies in xenograft mice, suggest that OTX015 has antitumor properties. An ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection method was developed and validated in order to measure OTX015 plasma concentrations. Its pharmacokinetics in patients enrolled in a phase I dose-escalation study was then evaluated. The OTX015 PK parameters were estimated by a population approach and PK-PD modeling was developed in order to evaluate the tolerance and safety (thrombocytopenia) of this new drug.

L’évaluation des risques environnementaux et sanitaires liés à la présence de résidus de médicaments dans l’environnement, représente un enjeu majeur en particulier au regard de la gestion du cycle des usages de l’eau. Les effluents des établissements de soins représentent une source non négligeable de pollution et justifient le développement de techniques spécifiques de mesures des émissions de résidus de médicaments dans leurs eaux usées. Dans le cadre de ces développements de méthode, l'échantillonnage représente une des difficultés majeures car la matrice brute des eaux en sortie des hôpitaux est très chargée en matières organiques, les débits sont extrêmement variables, les sites de prélèvement sont difficiles d'accès et il existe une forte variabilité des dispensations des traitements jour/nuit et semaine/week-ends. Les échantillonneurs intégratifs apparus récemment, offrent une alternative intéressante aux stratégies d’échantillonnage existantes, permettant d'effectuer un suivi moyenné sur de longues périodes d'observation associé à une simplicité d'usage et une réduction des coûts. Ce travail porte sur l’étude de l’applicabilité des échantillonneurs intégratifs POCIS (Polar Organic Chemical Integrative Sampler) au dosage des résidus de médicaments dans les effluents hospitaliers. Ce dispositif a principalement été utilisé dans les eaux de surface et les effluents de STEP et son application dans les eaux usées reste rare. 6 molécules déjà identifiées comme représentatives des grandes familles de médicaments utilisés à l'hôpital (Aténolol, Prednisolone, Méthylprednisolone, Sulfaméthoxazole, Ofloxacine, Kétoprofène) ont été retenues.Les cinétiques d’adsorption des molécules sur les POCIS ont été suivies en laboratoire en condition de maitrise des paramètres les plus influents : température, vitesse de l’eau, charge en matière organique, colmatage…Ce calibrage a pour but de déterminer le coefficient d’échantillonnage Rs (L/j) spécifique à chaque molécule et nécessaire au calcul de la concentration dans le milieu d’exposition du POCIS. Nous avons observé une augmentation des Rs quand la vitesse de l'eau augmente ou quand la température augmente. Dans les eaux usées, la valeur de Rs est plus faible et la durée de la phase linéaire est réduite comparée à l'eau du robinet. Pour ce type d'application, la période d'exposition ne devra pas dépasser 4 à 5 jours en raison du colmatage des membranes et d'une teneur élevée en particules organiques dissoutes. Après calibrage dans l’eau du robinet et dans l’eau usée, les POCIS ont été exposés in situ dans un effluent hospitalier pour mesurer les concentrations en 6 molécules ciblées. Cinq ont pu être quantifiées et les concentrations calculées à partir des extraits des POCIS sont concordantes avec celles obtenues par prélèvement direct d’un échantillon moyenné d’eaux usées. Le facteur limitant réside dans les difficultés d’accès au site et la présence de solides dans le collecteur d'eaux usées. Ce travail ouvre des perspectives quant à l'application des POCIS pour les effluents hospitaliers et pourra à terme contribuer à l'acquisition de données pour une meilleure surveillance des rejets. / The assessment of the environmental and public health risks due to pharmaceutical residues, is a main issue particularly in the light of water cycle management and water resources. Hospitals are supposed to be a main source of pollution and the assessment of their contribution to the overall pharmaceutical pollution is necessary. Monitoring the pharmaceutical loads in hospital sewage is a great challenge because of the difficulties which have to be overcome to obtain representative samples: high organic content and suspended solids, wastewater flow variations, difficult access to sampling sites, variations of pharmaceutical release throughout the day resulting from hospital activities. An interesting alternative way is to use passive samplers, which allow for the measurement of Time Weighted Average (TWA) concentrations, overcoming many shortcomings of the spot sampling techniques. The aim of this work is to evaluate the applicability of POCIS for the monitoring of pharmaceuticals in hospital wastewater. This tool is mainly used for surface water or WWTP effluent and its application for wastewater sampling remains scarce. This study was conducted on six compounds already selected as representative of some of the main class of pharmaceuticals used at the hospital (Atenolol, Prednisolone, Methylprednisolone, Sulfamethoxazole, Ofloxacin, Ketoprofen). POCIS were calibrated for the analytes of interest in tap water and wastewater in laboratory conditions close to relevant environmental conditions (temperature, flow velocity, fouling). Sampling rates (Rs) were determined and we observed a significant increase with flow velocity and temperature. Whatever the compound, the Rs value was lower in wastewater and the linear phase of uptake was shorter than in tap water. A five-day period was defined as the optimal duration for POCIS exposition in wastewater.POCIS were then deployed in a hospital sewage pipe during four days and the estimated water concentrations were close to those measured in twenty-four hour composite samples, carried out with an autosampler.This work gives encouraging results for the deployment of POCIS in wastewater that could be a useful tool for pharmaceutical pollution management.

Práce se věnuje řízení projektů a možnosti praktického využití softwarového produktu MS Project jako podpory řízení.