Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Células iNKT restritas a CD1d são protetoras contra o desenvolvimento de melanoma murino, B16F10-Nex2, subcutaneamente em animais singênicos. Essa proteção pode ser deduzida pelo desenvolvimento acelerado do tumor em animais geneticamente deficientes na expressão de CD1d (CD1d-KO), com sobrevida significantemente menor do que a observada com animais WT submetidos ao mesmo desafio de células tumorais. CD1d é uma família de glicoproteínas relacionadas a MHC classe I, envolvidas na apresentação, principalmente em células dendríticas, de antígenos lipídicos para células iNKT. No presente trabalho focalizamos a identificação do lipídeo endógeno expresso em células de melanoma capaz de induzir uma resposta de vigilância imune baseada em células iNKT. Verificamos também a possibilidade de proteger animais contra o desenvolvimento tumoral utilizando células dendríticas primadas com o lipídeo endógeno. A extração dos componentes lipídicos de melanoma foi realizada a partir de tumores crescidos in vivo, evitando-se assim artefatos do cultivo celular in vitro. Foram testados três diferentes protocolos de extração (A, B e C), obtendo-se 14 frações diferentes que foram testadas na ativação do hibridoma DN32.D3, uma linhagem de células NKT murinas imortalizadas. A fração F3 do protocolo A (F3A) ativou o hibridoma DN32.D3 medido pela produção de IL-2. Para uma eficiente apresentação dos lipídeos dessa fração utilizamos com sucesso células dendríticas de medula óssea (BMDC) nos ensaios in vitro e in vivo, para apresentação de F3A e glicolipídeos ativadores de células NKT, agalactosilceramida (a-GalCer) e isoglobotrihexosilceramida (iGb3). Na tentativa de isolar o composto estimulatório presente em F3A de melanoma, essa fração foi analisada por HPTLC revelada com diversos reagentes específicos para resíduos de ácido siálico, açúcares neutros, fosfato e lipídeos totais. A fração também foi submetida a separações em colunas de sílica, ensaio de “immunostaining” quimioluminescente com lectina de Bandeiraea simplicifolia e análises em espectrometria de massa, onde foram identificados gangliosídeos como GM3 bem como glicoesfingolipídeos neutros como iGb3, Gb3, iGb4 e Gb4 por ESI-LIT-MS (electrosptray ionization-linear íon trap-mass spectrometry). Quando iGb3 foi incubado com BMDC e testado com células DN32D3 essas foram ativadas produzindo IL-2. GM3 consistentemente era um inibidor dessa ativação de células iNKT. Ensaios de citotoxicidade foram então realizados e verificamos que células de NKT estimuladas por BMDC incubadas com a-GalCer ou iGb3 circundavam as células tumorais B16F10-Nex2 visualizadas em microscopia de fluorescência e, em ensaio in vitro, as células NKT promoviam lise de até 40% das células tumorais B16F10-Nex2. Realizamos então ensaios in vivo, onde camundongos foram inoculados endovenosamente com células do melanoma murino e tratados ou não com células dendríticas primadas com a-GalCer ou iGb3. Ao excisarmos os pulmões dos animais, notamos que os grupos tratados com lipídeos ativadores de células NKT tinha cerca de 4 vezes menos nódulos pulmonares que o grupo não tratado. Nossos resultados mostram que o melanoma murino B16F10-Nex2 possui a molécula iGb3 e sua precursora iGb4, capaz de ativar células NKT conferindo a essas capacidade citotóxica in vitro contra o melanoma. Esse lipídeo (iGb3) também mostrou um efeito protetor contra metástases pulmonares oriundas do melanoma murino quando apresentado por células dendríticas utilizadas em protocolo de terapia celular. Esse é o primeiro trabalho mostrando que efetivamente um glicolipídeo endógeno ligante de CD1d é capaz de ativar células NKT com efeito protetor antitumoral, através de terapia celular com células dendríticas. Palavras chave: Melanoma B16F10-Nex2, células iNKT, glicoesfingolipídeos iGb3 e iGb4 GM3, células dendríticas, imuno vigilância. / CD1d-restricted iNKT cells are protective against the murine melanoma B16F10- Nex2 growing subcutaneously in syngeneic animals. This is inferred from the fast tumor growth in animals genetically deficient in CD1d (CD1d-KO), which showed a survival time significantly shorter than that of WT animals equally challenged with tumor cells. CD1d belongs to a family of glycoproteins resembling MHC class I, involved in the presentation, chiefly in dendritic cells, of lipidic antigens to iNKT cells. In the present work we focus on the identification of an endogenous lipid component expressed in melanoma cells able to induce an immunosurveillance response based on iNKT. We also investigated the possibility of animal protection against tumor development by using dendritic cells primed with the endogenous lipid. The extraction of membrane lipid components was carried out from in vivo grown tumors, thus avoiding artifacts from the in vitro grown cultures. Three different extraction protocols were tested (A, B, C), and 14 different fractions were obtained and tested for the activation of hybridoma DN32.D3, a cell line of immortalized murine NKT cells. Fraction F3 of protocol A (F3A) activated hybridoma DN32.D3 to produce IL-2. For an efficient presentation of lipids from this fraction we successfully used bone marrow dendritic cells (BMDC) on in vitro and in vivo assays. F3A and NKT-cell activating glycolipids, agalactosylceramide (a-GalCer) and isoglobohexosylceramide (iGb3), were tested. In the attempt to isolate the stimulatory component present in the melanoma F3A fraction, HPTLC was used and revealed with several specific reagents for sialic acid residues, neutral sugars, phosphate and total lipids. The fraction was also separated in silica columns, immunostained with Bandeiraea simplicifolia BS-1 lectin and analyzed by mass spectrometry. Ganglioside GM3 and neutral glycosphingolipids iGb3, Gb3, iGb4 and Gb4 were identified by ESI-LIT-MS (electrospray ionization- linear ion trap- mass spectrometry). By incubation of iGb3 with BMDC and these with DN32.D3 cells, the latter were activated to produce IL-2. GM3 consistently inhibited the activation of iNKT cells. Cytotoxicity assays were then carried out, in which we found that NKT cells stimulated by BMDC, primed with a-GalCer or iGb3, encircled the B16F10-Nex2 tumor cells as visualized by fluorescent microscopy. NKT cells promoted lysis of up to 40% of tumor cells. In vivo tests showed that mice injected endovenously with murine melanoma cells and treated with dendritic cells primed with a-GalCer or iGb3, had lungs with 4-fold fewer nodules than an equally challenged but untreated group. The present results show that the murine melanoma B16F10-Nex2 expresses iGb3 and its precursor iGb4, being able to activate NKT cells and conferring them a cytotoxic activity in vitro against melanoma. Such lipid (iGb3) was also protective in vivo reducing the melanoma pulmonary metastases when presented by dendritic cells used in cellular therapy protocol. This is the fist work showing effectively that an endogenous CD1d-restricted glycolipid able to activate iNKT cells display a protective antitumor effect, using cellular therapy with dendritic cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Melanoma cutâneo ainda constitui a principal causa de morte por câncer de pele nos países desenvolvidos. A variabilidade do comportamento clínico dessa neoplasia tem sido apenas parcialmente explicada pelos aspectos clínicos e histológicos, e a identificação de variáveis biológicas pode vir a ser importante na determinação de grupos de risco específicos. Foram estudados 69 pacientes com melanoma cutâneo primário de diversos graus de gravidade, tratados entre 1990 e 2007, com o intuito de verificar aspectos clínicos e epidemiológicos, preparar Tissue microarray (TMA) para estudo dos melanomas cutâneos primários com espessura maior que 1,0 mm, avaliar por análise imuno-histoquímica a expressão das proteínas da apoptose celular Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas em nevos-controle e em melanomas primários com espessuras menores e maiores que 1mm, e correlacionar a expressão dessas proteínas da apoptose com a evolução de melanomas cutâneos primários. Os resultados ratificaram tanto dados epidemiológicos já publicados em relação a sexo, idade e local da lesão, quanto a correlação entre a evolução da doença e os índices de Breslow. A análise dos escores compostos relativos à expressão das proteínas da apoptose revelou que o perfil imuno-histoquímico dessas proteínas parece não ter significado prognóstico, uma vez que não houve diferenças de expressão entre pacientes com e sem doença disseminada. Não foram encontradas alterações na expressão das proteínas da apoptose estudadas que pudessem sugerir o seu envolvimento tanto na gênese quanto na progressão de melanoma primário. O perfil imuno-histoquímico com tendência pró-apoptótica parece indicar que outros fatores seriam responsáveis pelo crescimento e disseminação da neoplasia / Cutaneous melanoma still constitutes the main cause of skin cancer death in developed world. Clinical behavior variability of this neoplasia has been only partially explained by clinical and histological aspects, and identification of biological variables can be important for determining specific risk groups. Sixty nine (69) patients with mild to severe primary cutaneous melanoma treated in 1990-2007 were studied aiming at (a) verifying clinical epidemiological aspects, (b) generating a Tissue microarray (TMA) for characterizing proteins expression of cutaneous melanoma > 1.0 mm, (c) analyzing the immunohistochemical expression of the apoptosis proteins Bcl2, Bax, Bak, Apaf-1, Caspase 3, Caspase 9, Caspase 8, FasL e Fas in 10 control nevi and in primary melanomas with thickness 1mm, (d) and correlating these proteins expression with the disease prognosis. Results have ratified known epidemiological date on gender, age and lesion localization as well as the correlation between the disease prognosis and the Breslow\'s indexes. Analysis of the composite scores relating to apoptosis proteins has revealed that their immunohistochemical profile seems to be not significant for determining the disease prognosis, since no differences in proteins expression were found when compared patients with and without disease dissemination. Alterations in proteins expression suggesting their role in the genesis as well as in the prognosis of primary melanoma were not evidenced. Immunohistochemical profile with pro-apoptosis trend seems to indicate other factor as responsible for the neoplasia growth and dissemination

Melanoma is a pigmented tumor that originates from the melanocytes; pigmented cells present throughout the body, including skin and iris. The cutaneous form is the most common type, and it represents about 5% of the skin tumors diagnosed in Brazil. Although it does not have a high incidence, it represents about 80% to 85% of all skin tumor deaths. The second most frequent type of melanoma is ocular. It represents 5% of all melanoma cases and is a potentially lethal disease, especially when it causes metastasis. The main therapeutic approach for melanomas, in general, is surgery, with resection of the cutaneous lesion or enucleation in the case of ocular melanoma. Other techniques such as adjuvant immunotherapy, palliative chemotherapy, and radiotherapy are also used. However, they have low efficacy and several side effects. Photodynamic therapy is a therapeutic modality based on the interaction of light at specific wavelength and photosensitizer, in the presence of molecular oxygen, leading the cell to death. As melanoma is a pigmented cancer, it usually does not respond well to photodynamic therapy due to the high absorption of light on the surface of the tumor, making volumetric eradication impossible. This project investigated optical strategies for the diagnosis and treatment of melanoma. For the diagnosis, it was evaluated the fluorescence lifetime technique to differentiate melanoma and normal skin. A sensitivity of 99.4%, specificity of 97.4% and accuracy of 98.4% were achieved using linear discrimination analysis. For the cutaneous melanoma treatment, PDT combined to optical clearing agents (OCAs) was investigated. Vascular and cell-target photosensitizers were evaluated combined or not to OCAs. OCA improved PDT response in all pigmented tumors treated, but the best results were achieved when a dual-photosensitizer treatment combined to OCA was performed. The treatment of conjunctival melanoma was conducted using 2-photon excitation photodynamic therapy. The advantage of this technique is the use of infrared light, in a wavelength that melanin has a low absorption, improving the light penetration into the tumor. The tumor histology shows that apoptosis was induced only at the treatment site, with no damage to the surrounding tissue. Additionally, a single TPE-PDT session could treat the entire tumor. / O melanoma é um tumor pigmentado que surge dos melanócitos, células pigmentadas presentes em todo o corpo, incluindo a pele e a íris. A forma cutânea é a mais comum e representa cerca de 5% dos tumores cutâneos diagnosticados no Brasil. Embora não tenha uma alta incidência, representa cerca de 80% a 85% de todas as mortes por tumor de pele. O segundo tipo de melanoma mais frequente é o ocular. Representa 5% de todos os casos de melanoma e é uma doença potencialmente letal, especialmente em casos de metástase. A principal abordagem terapêutica para melanomas, em geral, é a cirurgia, com ressecção da lesão cutânea ou enucleação no caso do melanoma ocular. Outras técnicas, como imunoterapia adjuvante, quimioterapia paliativa e radioterapia também são usadas, porém, apresentam baixa eficiência e muitos efeitos colaterais. A terapia fotodinâmica é uma modalidade terapêutica baseada na interação da luz em um comprimento de onda específico e um fotossensibilizador, na presença de oxigênio molecular, levando a célula à morte. Como o melanoma é um câncer pigmentado, geralmente não responde bem à terapia fotodinâmica devido à alta absorção de luz na superfície do tumor, impossibilitando a erradicação volumétrica. Este projeto investigou estratégias ópticas para o diagnóstico e tratamento do melanoma. Para o diagnóstico, foi avaliada a técnica de tempo de vida de fluorescência para distinguir melanoma de pele normal. Utilizando análise de discriminação linear, obteve-se uma sensibilidade de 99,4%, especificidade de 97,4% e precisão de 98,4%. Para o tratamento de melanoma cutâneo, a PDT combinada com clareadores ópticos (OCAs) foi investigada. Um fotossensibilizador que tem como alvo vaso sanguíneo e um fotossensibilizador de alvo celular foram avaliados combinados ou não com OCAs. OCAs são soluções hiperosmóticas que desidratam o tecido, diminuindo o espalhamento da luz e melhorando a penetração de luz em profundidade. OCA melhorou a resposta de PDT em todos os tumores melanóticos tratados, mas os melhores resultados foram obtidos quando a PDT foi realizada com a combinação dos fotossensibilizadores e clareador óptico em uma única sessão. O tratamento do melanoma conjuntival foi realizado utilizando a terapia fotodinâmica por excitação de 2 fótons (TPE-PDT). A vantagem desta técnica é o uso de luz na região do infravermelho, em um comprimento de onda que melanina tem baixa absorção, melhorando a penetração de luz no tumor. A histologia do tumor mostrou que a apoptose foi induzida apenas no local do tratamento, sem danos no tecido adjacente. Além disso, uma única sessão de TPE-PDT foi capaz de tratar todo o tumor.

INTRODUÇÃO: O melanoma primário da cavidade oral é uma neoplasia agressiva, rara e originada a partir da proliferação de melanócitos malignos da mucosa. Ele representa aproximadamente de 0,2 a 8% de todos os melanomas. Estudos recentes apontam algumas vias moleculares tem sido encontradas por estarem envolvidas na patogenia dos melanomas. Dentre essas vias destaca-se a via proliferativa da MAPK (mitogen activated protein kinase), esta cascata de sinalização está envolvida no controle do crescimento celular, proliferação e migração, e tem sido relacionada com um papel importante no desenvolvimento e progressão do melanoma cutâneo. OBJETIVOS: Analisar a expressão proteica e mutação pontual dos componentes da via MAPK e correlacionar com os dados clínicos-histológicos. MATERIAL E MÉTODOS: Através da imunoistoquímica avaliar a expressão proteica dos anticorpos RAS; BRAF; MEK1; MEK2; ERK1 e ERK2 em 35 casos de melanomas orais organizados em matriz (TMA: Tissue Microarray) e através de pirosequenciamento avaliar a mutação pontual dos genes BRAF; NRAS; KRAS em 14 casos de melanomas orais. RESULTADOS: Idade dos pacientes entre 9 e 91 anos, sem predileção por sexo, 75% caucasianos, 71,42% acometeram o palato, 80% com aspecto histológico grau III. A análise da expressão proteica foi: RAS (28,57%); BRAF (82,85%); MEK1 (0%); MEK2 (51,43%); ERK1 (20%)e ERK2 (74,28%). Na análise molecular observamos mutações para BRAF (9/14 casos) e NRAS (2/14 casos). CONCLUSÃO: Todos os aspectos da via MAPK necessita de outras elucidações em melanomas de áreas foto-protegidas e melanomas de mucosa e comparando diferentes populações. Entretanto, os resultados deste presente estudo apontam importante alterações na cascata RAS-RAF-MEK-ERK e estes são indicadores de prognóstico ruim em melanomas primários da mucosa oral, independente da exposição solar / BACKGROUND: Primary melanoma of the oral cavity is an aggressive and rare neoplasm and originated from the proliferation of malignant melanocytes of the mucosa. It represents approximately 0.2 to 8% of all melanomas. Recent studies indicate some molecular pathways have been found to be involved in the pathogenesis of melanomas. Among these means there is a proliferative MAPK pathway (\"mitogen activated protein kinase\"), this signaling pathway is involved in controlling cell growth, proliferation and migration, and it has been associated with a role in the development and progression of melanoma skin. OBJECTIVES: To analyze protein expression and mutation of components of the MAPK pathway and to correlate with the clinical, histological data. MATERIALS AND METHODS: Using immunohistochemistry to evaluate the protein expression of RAS, BRAF, MEK1, MEK2, ERK1 and ERK2 antibodies in 35 cases of oral melanomas organized array (TMA: Tissue Microarray) and using pyrosequencing to assess the mutation of the BRAF, NRAS, KRAS in 14 cases of oral melanomas. RESULTS: Age of patients between 9 and 91 years, regardless of gender, 75% Caucasian, 71.42% in palate, 80% with histologic grade III. Analysis of protein expression was: RAS (28.57%); BRAF (82.85%); MEK1 (0%), MEK2 (51.43%); ERK1 (20%) and ERK2 (74.28%). Molecular analysis we found BRAF mutations (9/14 cases) and NRAS (2/14 cases). CONCLUSION: All aspects of the MAPK pathway requires further elucidation in melanomas of photo-protected areas and mucosal melanomas and comparing different populations. However, the results of this study indicate important changes in the cascade RAS-RAF-MEK-ERK and these are indicators of poor prognosis in primary melanomas of the oral mucosa, regardless of sun exposure

INTRODUÇÃO: O melanoma lentiginoso acral (MLA) é um subtipo pouco frequente do melanoma cutâneo que geralmente apresenta evolução desfavorável e agressiva. Os mecanismos patogenéticos relacionados a essa evolução clínica não são totalmente conhecidos. Atualmente, estudos da literatura enfocam os mecanismos de evasão imunológica relacionados ao microambiente do melanoma, uma vez que os mesmos podem inibir a resposta imune antitumoral permitindo a progressão da doença. A expressão do Antígeno Leucocitário Humano G (HLA-G) e da Interleucina 10 (IL-10) e os macrófagos M2 (MM2) do microambiente tumoral são estratégias de evasão imune desenvolvidas por algumas neoplasias. Esses fatores, entretanto, não têm sido estudados especificamente no MLA. OBJETIVOS: Com o propósito de verificar se a expressão tumoral do HLA-G, IL-10 e a população de MM2 no microambiente tumoral estão relacionados com as características histopatológicas preditivas de pior comportamento biológico do melanoma e o evento de metástase, fez-se a comparação desses marcadores e de MM2 entre grupos de MLA e de melanoma extensivo superficial (MES). MÉTODOS: A casuística estudada compreendeu 67 espécimes de MLAs e 67 de MESs. Os tumores foram classificados de acordo com sua espessura, ulceração, presença de mitoses e associação com metástases. Fez-se a demonstração da expressão do HLA-G, IL-10 e de MM2 (CD163+ e CD206+) por técnica de imuno-histoquímica. A expressão (fração de área tumoral imunomarcada) do HLA-G e IL-10, assim como o número de MM2 por unidade de área do microambiente intra e peritumoral foram comparados entre os grupos de tumores classificados como acima mencionado, utilizando-se os testes de Kruskal-Wallis e Wilcoxon. Verificou-se a correlação entre os marcadores HLA-G e IL-10 e entre CD163 e CD206 pelo teste de correlação de Pearson. Fez-se um modelo de regressão logística binária no qual foram incluídas incialmente todas as variáveis do estudo e sua interação com o evento presença de metástase. RESULTADOS: A expressão do HLA-G e IL-10 tumoral, assim como o número de MM2 da região intra e peritumoral dos espécimes de MLA foi maior que nos de MES (p < 0,05). Houve correlação positiva entre a expressão do HLA-G e IL-10, assim como entre o número de MM2 marcados por CD163 e CD206. No modelo de regressão logística binária, a variável número de macrófagos imunomarcados pelo anticorpo CD206 da região intratumoral mostrou-se significativa e relacionada com o evento metástase. CONCLUSÕES: As moléculas imunorreguladoras HLA-G e IL-10 expressas pelas células neoplásicas, assim como o número elevado de MM2 do microambiente tumoral devem ser considerados fatores envolvidos no comportamento biológico mais agressivo do MLA / BACKGROUND: Acral lentiginous melanoma (ALM) is an uncommon cutaneous tumor that usually has an aggressive behavior and results in an unfavorable prognosis. The pathogenic mechanism related to the clinical evolution remains unknown. Currently, evasion mechanisms related to the melanoma microenvironment, which can inhibit the anti-tumor immune response allowing disease progression, are the focus of numerous studies. The expression of human leukocyte antigen-G (HLA-G), Interleukin- 10 (IL-10) and M2-Macrophages (MM2) at the tumor site represents one of these immunosuppressive strategies developed for some neoplasms. However, those factors have not been studied specifically in ALM. OBJECTIVES: In order to verify if HLAG and IL-10 tumoral expression as well as MM2 population in the melanoma microenvironment are related to the histopathological features predictive of unfavorable prognosis in melanoma and metastasis, we compared those markers and cells between ALM and superficial spreading melanoma (SSM) groups. METHODS: We analyzed 67 ALM and 67 SSM cases. The tumors were classified in groups according thickness, ulceration, mitosis and metastasis. HLA-G, IL-10 and MM2 (CD163+ and CD206+) expression were evaluated using immunohistochemistry. The expression (tumoral positive area fraction) of HLA-G and IL-10, as well as the number of MM2 in the intratumoral and peritumoral area was compared between the groups of melanomas using Kruskal-Wallis and Wilcoxon\'s tests. The Pearson\'s test was used to establish the correlation between HLA-G and IL-10, as well as between CD163 and CD206. Also, a binary logistic regression model was used to analyze all variables in relation to metastasis. RESULTS: HLA-G and IL-10 tumoral expression as well as the number of MM2 in the intratumoral and peritumoral area was increased in ALM compared with SSM (p < 0.05). There was positive correlation between HLA-G and IL-10 tumoral expression, as well as between the number of MM2 marked by CD163 and CD206. In the binary logistic regression model, the MM2 CD206+ of the intratumoral area was significantly associated with metastasis. CONCLUSIONS: The HLA-G and IL-10 melanoma expression likewise the high number of MM2 in the tumoral microenvironment must be considered as features associated with the increased aggressiveness of the ALM

O melanoma maligno é a forma mais agressiva dos tumores cutâneos. Sendo o responsável por mais de 75% das mortes relativas á este tipo de câncer. O principal quimioterápico utilizado no tratamento do melanoma é a dacarbazina (DTIC), entretanto, as taxas de resposta são insatisfatórias. O composto DM-1 é um análogo estrutural da curcumina, e por esta razão possui propriedades biológicas semelhantes, como agente antiproliferativo e próapoptótico. A terapia de captura de nêutrons por boro (BNCT) atua por meio da deposição do isótopo 10Boro nas células tumorais e após a irradiação de nêutrons térmicos há produção de partículas alfa e lítio que destroem a célula. Neste trabalho estudou-se o mecanismo de ação destas três terapias, DTIC, DM-1 e BNCT no tratamento do melanoma e seus efeitos em células normais in vitro com a finalidade de obtenção de modalidades terapêuticas diferentes para o tratamento desta neoplasia. A IC50 foi obtida pela metodologia de MTT, além da análise da progressão do ciclo celular e marcadores de morte celular por citometria de fluxo. O composto DM-1 e a BNCT apresentaram efeito citotóxico seletivo para as linhagens de melanoma, com alta produção de radicais livres peroxidados. Nas mesmas condições, estes efeitos foram mínimos em células normais, diferente do tratamento com DTIC. Houve diminuição da proporção de matriz extracelular e colágeno solúvel sintetizado em células de melanoma tratadas com DM-1, BNCT e DTIC, entretanto, o quimioterápico ocasionou isoladamente diminuição também em células normais. O potencial elétrico mitocondrial das células de melanoma foi diminuído nos três protocolos de tratamento, assim como houve aumento na quantidade de DNA fragmentado. Este efeito não foi encontrado em células normais tratadas com DM-1 e BNCT. O composto DM-1 foi capaz de induzir apoptose via intrínseca e extrínseca, avaliado pela Anexina V e por marcadores de cinética e de morte celular. A terapia de BNCT induziu apoptose e necrose, indicando que esta terapia atua por diferentes vias em cada linhagem celular. BNCT e DM-1 induziram aumento na expressão dos marcados próapoptóticos, como Bax, citocromo c, caspase 3 e 8 clivadas, além de diminuir os valores na expressão de ciclina D1 e Ki-67, relacionados com a progressão do ciclo celular e proliferação. O quimioterápico DTIC apresentou alguns indícios de apoptose em células de melanoma, mas seus efeitos em células normais foram extensivos, ocasionando morte e parada do ciclo celular em melanócitos, células endoteliais e fibroblastos. O composto DM-1 apresentou formação de corpos apoptóticos, modificações no citoesqueleto e clivagem de caspase 9 e Parp em linhagens de melanoma humano. Desta forma, o composto DM-1 e a BNCT mostraram-se ferramentas terapêuticas mais eficazes no controle da progressão e no aumento da morte celular em células de melanoma. O poder efetivo da terapia de BNCT e do composto DM-1 faz com que a possibilidade de terapias combinatórias tenha resultados extremamente favoráveis na modulação da resposta proliferativa desses tumores. / Malignant melanoma is the most aggressive skin cancer. It is responsible for more than 75% of deaths. The main and most active chemotherapy in the melanoma treatment is represented by dacarbazine (DTIC), however, response rates are disappointing. The DM-1 compound is a curcumin structural analogue and it has similar biological properties, such as an antiproliferative and pro-apoptotic agent. Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) works through the deposition of the isotope 10Boron in tumor cells, with subsequent irradiation of thermal neutrons, which produce alpha particles and lithium that destroy the cell. In this study, the action mechanism of these three therapies, DTIC, DM-1 and BNCT in the melanoma treatment and its effects in vitro on normal cells were studied in order to obtain different therapeutic modalities for cancer treatment. The IC50 was obtained by MTT method, besides the analysis of cell cycle progression and cell death markers by flow cytometry. The DM-1 and BNCT showed selective cytotoxic in melanoma cell lines, with high of free radicals production. In the same conditions, these effects were minimal in normal cells, unlike the treatment with DTIC. There was a decrease in the proportion of extracellular matrix and soluble collagen synthesized in melanoma cells treated with DM-1, BNCT and DTIC, however, only DTIC also resulted in decreased in normal cells. The mitochondrial electrical potential of melanoma cells was decreased in the three treatment protocols, as there was an increase in the amount of fragmented DNA. This effect was not found in normal cells treated with DM-1 and BNCT. The compound DM-1 was able to induce apoptosis by the intrinsic and extrinsic pathways, as assessed by Annexin V, cell death and kinetic markers. BNCT induced apoptosis and necrosis, indicating that this therapy acts through different pathways in each cell line. DM-1 and BNCT induced an increase of pro-apoptotic markers, such as Bax, cytochrome c, cleaved caspase 3 and 8 expression, and they reduced cyclin D1 and Ki-67, expression related to the progression of the cell cycle and proliferation. The DTIC has shown some signs of apoptosis in melanoma cells, but its effect on normal cells were extensive, causing death and cell cycle arrest in melanocytes, fibroblasts and endothelial cells. The DM-1 showed apoptotic bodies formation, cytoskeleton changes and caspase 9 and Parp cleavage in human melanoma cell lines. Thus, the DM-1 and BNCT showed as therapeutic tools more with high effectiveness in controlling the cell cycle progression and cell death increase in melanoma cells. The effectiveness of BNCT and DM-1 makes the possibility of combinatorial therapies, with extremely favorable results in the modulation of the proliferative response of these tumors.

A interação entre células tumorais e células estromais tem um papel central na progressão neoplásica. As células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) podem se integrar ao microambiente tumoral onde modulam o crescimento dos tumores por meio de distintos mecanismos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel das MSCs na metástase, a principal causa de morte em pacientes com câncer. Utilizando um modelo de melanoma murino ortotópico, nós demonstramos que MSCs obtidas da medula óssea de camundongos (MO-MSCs) ocupam o nicho perivascular nos tumores primários e aumentam 2,5 vezes a incidência de micrometástases pulmonares quando co-infundidas com células de melanoma B16. Observamos ainda que o meio condicionado das MO-MSCs não altera o potencial de colonização pulmonar das células B16 infundidas sistemicamente. Isto indica que as MO-MSCs modulam as fases iniciais da cascata metastática, durante a qual ocorrem os processos de invasão e intravasão nos vasos sangüíneos. Em correlação com estes efeitos pró-metastáticos, o secretoma das MO-MSCs induziu a transição epitélio-mesenquimal (EMT) nas células de melanoma in vitro. Após cultivo em meio condicionado das MO-MSCs, as células B16 adquiriram uma morfologia evidentemente fibroblástica. Ao mesmo tempo, houve o rearranjo dos filamentos de actina e o aumento da expressão de marcadores mesenquimais como fibronectina, vimentina, FSP1, N-caderina e ZEB2, acompanhado da repressão transcricional de E-caderina. A ativação da EMT pelo secretoma das MO-MSCs resultou na aquisição de propriedades metastáticas nas células de melanoma. Após cultivo em meio condicionado de MO-MSCs, as células B16 tiveram seu potencial de ancoragem à fibronectina reduzido, ao passo que houve o aumento na mobilidade e no potencial de invasão em matrizes tridimensionais. Utilizando inibidores competitivos de ATP contra o receptor tirosina-cinase Met, demonstramos que a aquisição de todas as propriedades metastáticas avaliadas e a ativação da EMT nas células de melanoma é mediada pela ativação da via HGF/Met. Estes dados destacam o papel das MOMSCs no microambiente tumoral como fonte perivascular de moléculas indutoras da EMT, cuja ativação leva a aquisição de traços metastáticos nas células de melanoma. Além disso, a inibição da via HGF/Met pode neutralizar os efeitos das MO-MSCs sobre as células tumorais, contribuindo para a repressão de propriedades fundamentais que sustentam a progressão e a disseminação neoplásica. Estas informações são importantes para o desenvolvimento seguro das MO-MSCs como ferramenta terapêutica e demonstram a importância da sinalização entre MSCs e células tumorais na disseminação metastática. Mais especificamente, estas observações reforçam a inibição da via HGF/Met como uma abordagem promissora para o tratamento da metástase. / The crosstalk between tumor cells and stromal cells can profoundly impact tumor progression. Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported to integrate the tumor microenvironment where they are described to modulate tumor growth by distinct mechanisms. However, little is known about the impact of MSCs on metastasis, the main cause of death in patients with cancer. Using an orthotopic mouse melanoma model, we showed that mouse bone marrow-derived MSCs (BMMSCs) occupy the perivascular niche within primary tumors and increased by 2.5-fold the incidence of lung micrometastases after co-infusion with B16 melanoma cells. Also, MO-MSCs conditioned medium did not affect the lung colonization ability of systemically infused B16 cells. This indicates that MO-MSCs induces the initial steps of the metastatic cascade, during which the invasion and intravasion occurs. Correlating with these metastatic effects, the BM-MSCs\' secretome activated the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) in B16 cells in vitro. After culture in BMMSCs\' conditioned medium, B16 cells acquired an evident fibroblastic morphology. Simultaneously, we observed the rearrangement of actin filaments and the upregulation of mesenchymal markers such as fibronectin, vimentin, FSP1, Ncadherin and ZEB2. In agreement with the loss of epithelial phenotype, BM-MSCs\' secretome also suppressed E-cadherin expression in B16 cells. The activation of EMT by BM-MSCs leaded to the acquisition of metastatic traits in melanoma cells. After culture in BM-MSCs\' conditioned medium, B16 cells displayed reduced anchorage to fibronectin and increased motility and invasiveness in threedimensional matrix plugs. Inhibition of Met receptor with competitive ATP inhibitors demonstrated that the induction of EMT and the resultant acquisition of metastatic traits are driven by activation of HGF/Met signaling pathway. Taken together, these evidences highlight the role of BM-MSCs as a perivascular source of EMT-inductive signals, whose activation leads to acquisition of metastatic traits in melanoma cells. Furthermore, inhibition of HGF/Met signaling pathway can neutralize the effects of BM-MSCs on tumor cells, thereby allowing the repression of fundamental properties which support tumor progression and metastasis. This information is useful to safely develop BM-MSCs as therapeutic tool and demonstrate the relevance of the signaling between MSCs and tumor cells during metastasis. More specifically, it reinforces that inhibition of Met signaling can be a promissory approach for the treatment of metastasis.

Oxisteróis são derivados oxigenados do colesterol que podem ser formados por autoxidação ou por atividade de enzimas específicas. Eles apresentam inúmeras atividades biológicas, incluindo inibição da proliferação celular e citotoxicidade. Dentre os oxisteróis, 7-cetocolesterol (7-KC), que difere do colesterol por apresentar um grupamento cetônico no carbono 7, é conhecido por induzir morte celular por diferentes vias. Neste projeto de pesquisa pretendemos avaliar o uso de uma emulsão lipídica contendo oxisterol (OXLE) como veículo para entrega de 7-KC a células tumorais. Os efeitos tóxicos de OXLE foram avaliados nas linhagem celulares RPMI 8226 (mieloma múltiplo) e B16F10 (melanoma). As células foram tratadas com: a) uma emulsão conhecida por atuar funcionalmente como a LDL (LDE); b) OXLE (75 uM até 225 uM de 7-KC); c) 7-KC (100 uM). As distribuições das células nas diferentes fases do ciclo de duplicação celulares foram analisadas por citometria de fluxo com iodeto de propídio. Todos os tratamentos, nestas concentrações, levaram a acúmulo das células de mieloma na fase proliferativa do ciclo celular. Para analisar a resposta apoptótica, nos utilizamos o fluorocromo JC-1, que mede o potencial transmembranar mitocondrial. Ambas a linhagens celulares, quando tratadas com OXLE, apresentaram hiperpolarização do potencial transmembranar associado com progressivo decrescimento do mesmo. Os resultados mostram que os grupos OXLE e 7-KC induziram a uma morte massiva das células de mieloma. OXLE induziu um efeito citostático nas células de melanoma, caracterizadas por alterações de morfologia, com um aumento na polimerização das fibras de actina, hiperpolarização seguida de perda do potencial transmitocondrial (apoptose associada à despolarização) , presença de vacúolos autofágicos como figuras de mielina (morte celular programada do tipo II - Autofagia); e impossibilitando as células de fazer a citocinese, determinado pelo aparecimento de uma população de células poliplóides. Nossos resultados indicam que esta nova emulsão contendo um oxisterol em sua formulação não é apenas um veículo para moléculas hidrofóbicas, mas pode atuar como agente cistotático/citotóxico. A morte mediada por OXLE possui características de apoptose e autofagia. Estes resultados são promissores e o possível use de OXLE in vivo necessita de futuras investigações. / Oxysterols are oxygenated derivatives of cholesterol that may be formed by autoxidation or by action of specific enzymes. They exhibit a number of biologic activities including inhibition of cellular proliferation and cytotoxicity. Among oxysterols, 7-ketocholesterol (7-KC), that differs form cholesterol by a functional ketone group at C7, is known to induce cell death by different ways. Herein we evaluated the use of an oxysterol-containing lipid emulsion(OXLE) as a vehicle to deliver 7-KC to tumor cells. OXLE was evaluated regarding its toxicity on RPMI 8226 (multiple myeloma) and B16F10 (melanoma) cell lines. Cells were treated with: a) an emulsion known to act functionally as LDL (LDE); b) OXLE (75 uM to 225uM of 7KC); c) 7KC (100uM). The distribution of cells in the different phases of cell cycle was analyzed by flow cytometry with propidium iodide. All treatments, according to the concentrations, led the myeloma cells to an arrest in the proliferative phases of the cell cycle. To analyze the apoptotic response, we then used a fluorochrome (JC-1), which measures the mitochondrial transmembrane potential. Both cell lines when treated with OXLE had a hyperpolarization of the transmembrane potential that decrease progressively. The results showed that exposure to either OXLE or 7-KC induced a massive death of myeloma cells. OXLE had an cytostatic effect on melanoma cells characterized by morphologic alterations as increased polymerization of actin fibers; hyperpolarization followed by a dissipation of the mitochondrial transmembrane potential (apoptosis-associated depolarization); presence of IX autophagic vacuoles as myelin figures (programmed cell death type II - Autophagy); and impaired cytokinesis, as determined by the emergence of a polyploid population. Our results indicated that this new oxysterol-containing emulsion is not only a carrier for hydrophobic molecules, but it can act itself as a cytostatic/cytotoxic agent. Cell death mediated by OXLE have both apoptosis and autophagy characteristics. These results are promising and the possible use of OxLE in vivo warrants further investigation

O metaboloma é definido como a coleção qualitativa e quantitativa de todos os metabólitos de baixa massa molecular presentes nas células, os quais participam de reações bioquímicas necessárias para a manutenção, crescimento e fisiologia celular. A avaliação metabolômica permite o delineamento do processo bioquímico de sistemas a fim de ampliar o entendimento de como as patologias se manifestam. A Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) é usada para investigar uma variedade de processos biológicos em diversos sistemas. A magnética aplicada a células e biópsias de tecido intacto de melanoma murino B16F10 contribuiu para a caracterização bioquímica de biomarcadores das diferentes fases de progressão tumoral do melanoma murino B16F10. Os resultados obtidos neste estudo permitiram a identificação de 33 metabólitos possíveis, envolvidos na carga lipídica e no metabolismo secundário da via glicolítica, que favorecem o crescimento e a progressão tumoral. A presença da taurina, prolina, serina, fenilalanina, que aumentaram quantitativamente, são possíveis marcadores da invasão, progressão e metastatização. A análise quantitativa desses metabólitos mostrou diferença significativa em 11 compostos, dos quais 9 estão diretamente envolvidos na expressão das respostas proliferativas, de morte celular e angiogênese, nos diferentes períodos de crescimento do melanoma B16F10, avaliados neste estudo. Desta forma, os achados obtidos neste estudo, quando associados no futuro a outros fatores, poderão ser úteis no diagnóstico e auxiliar na escolha terapêutica alvo com maior especificidade e menores efeitos colaterais. RMN pode ter um importante impacto na monitorização de metabólitos em células e tecidos tumorais, possibilitando a detecção mais precoce de tumores malignos, em suma, através da combinação de métodos de ressonância magnética. / The metabolome is defined as the qualitative and quantitative collection of all low weight molecular metabolites in cells that participate in biochemical reactions necessary for the maintenance, growth and physiology of cell. The metabolomic evaluation allows the design of systems of biochemical process in order to broaden the understanding of how diseases manifest. The Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) is used for investigating a variety of biological processes in several systems. The magnetics applied to cell and tissue biopsies intact murine melanoma B16F10 contributed to the biochemical characterization of biomarkers of different stages of tumor progression of murine melanoma B16F10. The results obtained in this study allowed the identification of 33 potential metabolites involved in lipid content in the secondary metabolism of the glycolytic pathway, which promote growth and tumor progression. The presence of taurine, proline, serine, phenylalanine, which quantitatively increased, is possibly markers of invasion and metastasis progression. Quantitative analysis of these metabolites showed a significant difference in 11 compounds, of which 9 are directly involved in the expression of proliferative responses, cell death and angiogenesis in different periods of growth of B16F10 melanoma, evaluated in this study. Thus, the findings from this study, when associated in the future with other factors, may be useful in the diagnosis and may assist in choosing therapeutic target with greater specificity and fewer side effects. NMR may have a significant impact on monitoring metabolites in tumor cells and tissues, allowing for earlier detection of malignant tumors; in short, by combining MRI methods.

O melanoma maligno é o tipo de câncer de pele com pior prognóstico, devido à sua elevada probabilidade de causar metástases. Atualmente existem poucos tratamentos efetivos para o tratamento do melanoma, sendo que a sobrevida de pacientes que apresentam metástases é muito baixa, em torno de 8 meses, sendo que as taxas de cura nestas condições não ultrapassam 1%. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica seletiva e não invasiva, que vem demonstrando excelentes resultados clínicos no tratamento de tumores de pele do tipo não melanoma, como carcinoma espino e basocelular. O trabalho em questão aborda a efetividade da TFD, em linhagens humana de melanoma em diferentes fases de progressão da neoplasia, desde os estágios iniciais da doença (células de crescimento radial - RGP), até a fase metastática, não só em cultura de células em monocamada (2D), como também através do desenvolvimento de modelos celulares tridimensionais (3D), mistos ou não com fibroblastos humano, cuja proposta é mimetizar in vitro as reais condições de tumorigênese existentes in vivo, tais como o contato célula-célula entre as linhagens neoplásicas e os fibroblastos da derme, o contato célula-matriz extracelular (matriz de colágeno), além de propiciar o crescimento tumoral de forma livre de adesão ao substrato, o que é característico dos processos malignos. Em uma primeira etapa, o fármaco fotossensível Ftalocianina de Cloroalumínio (AlClPc) foi escolhido como agente fotossensibilizante utilizado nos estudos, sendo este encapsulado em vesículas lipossomais, propiciando a solubilidade do composto em meio aquoso, otimizando sua entrada nas células. As propriedades fotoquímicas e fotofísicas da formulação lipossomal foram avaliadas, garantindo que a encapsulação não interfere na capacidade fotodinâmica do agente. Como segunda etapa, a formulação foi testada nos modelos celulares 2D e 3D acima descritos, realizando-se não só estudos de toxicidade, mas também ensaios de morte celular (apoptose versus necrose), incorporação intracelular do fármaco (uptake), de forma quantitativa e também qualitativa, demonstrando a localização intracelular preferencial do fármaco. Tanto em culturas 2D como em culturas 3D, a formulação AlClPc lipossomal apresentou atividade farmacológica superior aos sistemas aplicáveis em TFD, já descritos na literatura, o que abre caminhos para a realização de estudos in vivo em animais com boas perspectivas de resposta ao tratamento do melanoma humano, com possibilidades de futuras aplicações clínicas. / Melanoma is the type of skin cancer with poor prognosis due to its high probability of suffering metastases. Currently there are few effective treatments for the this, and the survival of patients with metastases is very low, around 8 months, with cure rates of these conditions do not exceed 1%. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality selective and non-invasive, it has shown excellent clinical results in the treatment of non-melanoma skin cancers such as squamous and basal cell carcinoma. This work discusses the effectiveness of PDT in human melanoma cell lines in different stages of tumor progression, from the early stages of the disease (radial growth phase cells - RGP), to the metastatic stage, not only in cell culture in monolayer (2D), but also through the development of three-dimensional cellular models (3D), mixed or not with human fibroblasts, which aims to mimic in vitro, the real conditions existing in in vivo tumorigenesis, such as cell-cell contact between cancer cell lines and fibroblasts of the dermis, the contact cell-extracellular matrix (collagen matrix), as well as futher the growth of the tumor cells free from the substrate adhesion, which is characteristic of malignant processes. In a first step, the photosensitizer Cloroaluminum Phthalocyanine (AlClPc) was chosen to be used in the studies, which is encapsulated in liposomal vesicles, allowing the solubility of the drug in water, optimizing its intracellular incorporation. Furthermore, the photochemical and photophysical properties of the liposomal formulation were evaluated, ensuring that the encapsulation does not interfere with its photodynamic activity. As a second step, the formulation was tested in cellular models 2D and 3D above described, performing not only toxicity, but assays of cell death (apoptosis versus necrosis), intracellular drug incorporation (uptake), both quantitative and also qualitative, showing the main intracellular localization of the photosensitizer. Both in 2D cultures and 3D cultures, the liposomal AlClPc showed better pharmacological activity than the current applied PDT protocols, already described in the literature, and this is an open field for in vivo studies with animals with good prospects for responses to the treatment of human melanoma with possibilities for future clinical applications.