Made available in DSpace on 2014-12-17T14:02:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PaulaIM.pdf: 2175384 bytes, checksum: 7697a3aa18d03cba26e4a0d38dbd3b26 (MD5) Previous issue date: 2009-10-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Methomyl (Lannate?) is an insecticide from the carbamate group, frequently used in pest control in various types of crops. This compound works inhibiting the activity of the enzyme acetylcholinesterase. The use of physicochemical and ecotoxicological analysis is the most efficient strategy for the correct characterization and control of residues of metomil. The main objectives of this study were to evaluate the acute toxicity of methomyl in 96 hours of exposure and, through a sublethal assay of 5 hours, to assess its effect on the activity of acetylcholinesterase present in brain and squeletic dorsal muscle of the Danio rerio fish. The results showed that the LC50-96 found to D. rerio was 3.4 mg/L and it was found through the average of four definitive tests. In vitro assays were used to test the inhibitory action of methomyl directly over soluble AChE, extracted from the squeletic dorsal muscle, with maximum inhibition of 68.57% to the insecticide concentrations of 0.2 mg/L. In sublethal tests with D. rerio, inhibitory effect of methomyl was found over the soluble form of AChE in the squeletic dorsal muscle, both in one and five hours of fish exposure to the insecticide. In both period, the average values of inhibition were around 61%. In the same condition, no significant inhibitory effect of methomyl soluble and membrane AChE of the D. rerio was observed in the 0.42, 0.85, 1.70 and 2.50 mg/L concentrations and in both times of fish exposure / O Metomil (Lannate?) ? um inseticida do grupo dos carbamatos utilizado no combate a pragas em diversos tipos de lavouras, sua forma de a??o ? atrav?s da inibi??o da enzima acetilcolinesterase. Para uma caracteriza??o adequada e controle de seus despejos, a estrat?gia mais eficiente ? o uso integrado de an?lises qu?micas, f?sicas e ecotoxicol?gicas. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a toxicidade aguda em 96h do metomil, e atrav?s de um ensaio subletal de cinco (5) horas, estimar o seu efeito sobre a atividade da acetilcolinesterase no c?rebro e m?sculo esquel?tico dorsal da esp?cie Danio rerio. Os resultados demonstraram que no Danio rerio o valor da CL-50-96h encontrada foi de 3,40 mg/L, obtida atrav?s da m?dia de quatro testes realizados. Nos ensaios in vitro foi atestada a a??o inibit?ria da metomil diretamente sobre a AChE sol?vel extra?da do m?sculo esquel?tico dorsal do D. rerio com uma inibi??o m?xima de 68,57 % para a concentra??o de 0,2 mg/L do inseticida. Nos testes subletais com D. rerio foi constatado o efeito inibit?rio do metomil sobre a forma sol?vel da AChE de m?sculo esquel?tico dorsal, tanto em uma como em cinco horas de exposi??o do peixe ao inseticida. Em ambos os hor?rios os valores m?dios de inibi??o foram em torno de 61%. Nas mesmas condi??es n?o foi observada inibi??o significativa da atividade da AChE de membrana do m?sculos. N?o foi observado efeito inibit?rio do metomil sobre as AChE sol?vel e de membrana de c?rebro de D. rerio, nas concentra??es 0,42, 0,85, 1,70, 2,50 mg/L e em ambos os hor?rios de exposi??o dos peixes

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A hipertensÃo, uma das doenÃas mais comuns em todo o mundo, Ã uma doenÃa crÃnica onde a pressÃo sanguÃnea elevada pode afetar a saÃde. A enzima conversora de angiotensina I (ECA) pode aumentar a pressÃo arterial atravÃs da conversÃo da angiotensina I no potente vasoconstritor angiotensina II. Sendo assim, a inibiÃÃo da atividade da ECA Ã considerada uma abordagem terapÃutica Ãtil para combater a hipertensÃo. Alpinia zerumbet, uma planta aromÃtica abundante no nordeste do Brasil, Ã comumente utilizada na medicina popular devido suas propiedades diurÃticas e hipotensivas. AlÃm disso, vÃrios estudos relatam atividade antihipertensiva para esta espÃcie. Dessa forma, Alpinia zerumbet pode ser uma importante fonte de inibidores de ECA. Sabendo disso, resolveu-se investigar os extratos dos rizomas desta espÃcie na busca de compostos inibidores de ECA. A prospecÃÃo quÃmica do extrato hexÃnico do rizoma permitiu o isolamento de cinco substÃncias: Um estilbeno denominado (E)-3,5-dimetoxiestilbeno, inÃdito na espÃcie em estudo; um diterpeno de esqueleto labdano denominado (E)-15,16-bis-norlabda-8,11-dieno-13-ona; uma chalcona denominada 2â,4â-dihidroxi-6â-metoxi-3â-(3ââ-metil-6ââ-metil-etil-2ââ-ciclohexenil)chalcona; um esterÃide denominado β-sitosterol, comumente encontrado em plantas; e um hidrocarboneto aromÃtico da classe kavapirona denominado 5,6-dehidrokawain. Na determinaÃÃo estrutural dos compostos isolados, foram empregadas tÃcnicas espectromÃtricas de anÃlise unidimensionais [ressonÃncia magnÃtica nuclear (RMN) de 1H e 13C, e tÃcnicas bidimensionais (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC, NOESY). TambÃm foram realizados os testes de inibiÃÃo da enzima conversora de angiotensina, antioxidante, de inibiÃÃo da enzima acetilcolinestarase e larvicida dos extratos hexÃnicos e etanÃlicos dos rizomas de Alpinia zerumbet. Os dois extratos apresentaram potencial de inibiÃÃo da enzima conversora de angiotensina e antioxidante. Somente o extrato hexÃnico apresentou atividade larvicida, com CL50 823,1 ppm. Nenhum dos extratos em estudo apresentou potencial de inibiÃÃo da enzima acetilcolinesterase. / Hypertension is one of the most common diseases in the world, is a chronic disease in which high blood pressure can affect health. The angiotensin I converting enzyme (ACE) can increase blood pressure through the conversion of angiotensin I to the potent vasoconstrictor, angiotensin II. Thus, inhibition of ACE activity is considered a useful therapeutic approach to combat hypertension. Alpinia zerumbet, a herb abundant in northeastern Brazil, is commonly used in folk medicine due to its diuretic and hypotensive properties. Moreover, several studies reported for this species antihypertensive activity. Thus, Alpinia zerumbet can be an important source of ACE inhibitors. Knowing this, we decided to investigate the extracts of the rhizomes of this species in the search for compounds ACE inhibitors. Prospecting chemical hexane extract of the rhizome allowed the isolation of five substances: A stilbene, named (E) -3,5-dimethoxystilbene, unprecedented in the species in this study, a labdane diterpene skeleton called (E) -15.16-bisnorlabda- 8,11-diene-13-one; one chalcone called 2â,4â-dihydroxy-6â-methoxy-3â-(3ââ-methyl-6ââ- methyl - ethyl -2ââ-cyclohexenyl) chalcone; a steroid called β-sitosterol, commonly found in plants, and an aromatic hydrocarbon class kavapirone, called 5,6- dehidrokawain. In the structural determination of individual compounds, spectrometric techniques were employed dimensional analysis [nuclear magnetic resonance (NMR) 1H and 13C and two dimensional techniques (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY). Inhibition angiotensin converting enzyme, antioxidant potential, inhibition of acetilcolinestarase and larvicidal tests of ethanol and hexane extracts of the rhizomes of Alpinia zerumbet were tested. The two extracts showed potential for inhibition of angiotensin converting enzyme and antioxidant potential. Only the hexane extract showed larvicidal activity with LC50 823.1 ppm. None of the extracts studied showed potential inhibition of the enzyme acetylcholinesterase.

Alzheimer´s disease (AD) is a neurodegenerative disorder responsible for the largest number of cases of dementia in the elderly. The brain regions associated with the frontal cortex and the hippocampus are the most affected by the changes arising from the AD, resulting in loss of neuronal function, and the loss of memory and cognitive ability. In the cellular level, AD is associated with reduced levels of acetylcholine (ACh) in the synaptic process, decreasing cortical cholinergic neurotransmission. ACh is a neurotransmitter found in the brain and at(in the) neuromuscular junctions, forming part of the parasympathetic nervous system, your activity and staying in the synaptic cleft is regulated by hydrolysis catalyzed by acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) enzymes that modulate the levels of Ach in the nervous system. The outlook for new targets cholinesterase inhibitors has stimulated research using bioactive compounds of natural products and also the use of an animal model that provides better understanding of the mechanisms of cognitive development. Because they are microorganisms that produce secondary given this, metabolites of great importance for bioprospecting, a study of the anticholinesterase activity of compounds isolated from the endophytic fungus Phomopsis sp. (PE) associated with mangabeira (Hancornia speciosa). Furthermore, it was investigated the effect of menthol on the adult zebrafish memory in the passive avoidance test. The menthol was selected taking to account the screening conducted by our research group in previous work, where this compound showed potent anticholinesterase activity. In the search for promising compounds to anticholinesterase drugs, the present study aimed to evaluate the in vitro activity of the crude extract of the fungus, as well as their isolated compounds 5-methyl mellein (1), nectriapyrone (2), tyrosol (3) and tryptophol (4) in AChE and BuChE in vivo evaluation the effect of menthol on the acquisition of learning and memory consolidation. In all assays were obtained encouraging results. The crude extract of PE and its isolated compounds were effective to inhibit cholinesterase, and the tryptophol (4) was the most promising because it showed dual action on the enzymes being selective to BuChE. The study of exposure to menthol zebrafish showed that this compound produces no effect on memory. On the other hand, at all doses tested menthol reverses amnesia induced by scopolamine. This study, therefore, demonstrated the potencial use of these compounds isolated from PE as source of novel agents for the treatment of AD and that menthol may be indicated as therapeutic alternative for the treatment of memory deficits. / A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa responsável pelo maior número de casos de demência em idosos. As regiões cerebrais associadas ao córtex frontal e ao hipocampo são as mais comprometidas pelas alterações decorrentes da DA, resultando em perda da função neuronal, além de perda progressiva da memória e declínio cognitivo. Em nível celular, a DA está associada à redução das taxas de acetilcolina (ACh) no processo sináptico, diminuindo aneurotransmissão colinérgica cortical. A ACh é um neurotransmissor encontrado no cérebro e nas junções neuromusculares, compondo parte do sistema nervoso parassimpático, sua atividade e permanência na fenda sináptica são reguladas por hidrólise catalisadapela acetilcolinesterase (AChE) e pela butirilcolinesterase (BuChE) enzimas que modulam os níveis de ACh no sistema nervoso. A perspectiva por novos alvos inibidores das colinesterases tem estimulado pesquisas utilizando compostos bioativos de origem natural e também a utilização de modelo animal que proporcione melhor compreensão dos mecanismos do desenvolvimento cognitivo. Diante disso, pelo fato deserem microrganismos produtores de metabólitos secundários de grande importância para bioprospecção, foi realizado um estudo da atividade anticolinesterásica de compostos isolados do fungo endofítico Phomopsis sp. (PE) associado à mangabeira (Hancornia speciosa Gomes). Além disso, foi investigado o efeito do mentol sobre a memória de zebrafishadulto através do teste da esquiva passiva. O mentol foi selecionado tomando-se como base o screening realizado por nosso grupo de pesquisa, onde esse composto apresentou potente atividade anticolinesterásica. Na busca por compostos promissores a fármacos anticolinesterásicos, opresente trabalho teve como objetivo a avaliação in vitroda atividade do extrato bruto do fungo, e de seus compostos isolados 5-metil meleína (1), nectriapirona (2), tirosol (3) e triptofol (4) frente às enzimas AChE e BuChE, assim como a avaliação in vivodo efeito do mentol sobre a aprendizagem e consolidação da memória. O extrato bruto do PE e os seus compostos isolados apresentaram efeito na inibição das colinesterases, sendo o triptofol (4) o mais promissor, pois apresentou ação dual sobre as enzimas sendo seletivo para BuChE. O estudo da exposição de zebrafishao mentol revelou que este composto não produz efeito sobre a memória. Por outro lado, em todas as concentrações testadas o mentol foi capaz de reverter a amnésia induzida por escopolamina. Diante dos resultados, conclui-se que os compostos isolados do PE podem ser considerados como alternativas para o desenvolvimento de novos fármacos anticolinesterásicos e que o mentol pode ser indicado como alternativa terapêutica para tratamento de déficits de memória.

Made available in DSpace on 2016-08-19T12:56:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_FernandaGabrielleSoaresSilva.pdf: 1148440 bytes, checksum: 5fda93ea5a22fe5304a59aa6f8b2f3b0 (MD5) Previous issue date: 2016-06-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The quality control of soil and groundwater has become an increasing need because human activities have led to contamination of ecosystems and affected human health. Agriculture, for instance, has left ecosystems waste organophosphate insecticides (OFs), highly toxic. In order to make an analysis of the impacts of these compounds in agricultural areas, it is required to have reference values taken in undisturbed areas, presenting the same type of soil and groundwater. In this regard, the ideal is that these compounds are not present in these ecosystems. In this paper, an electrochemical biosensor based on the acetylcholinesterase enzyme, immobilized by crosslinking with glutaraldehyde in the presence of estuarine macroalgae, was used to analyze levels of OFs pesticides in soil and groundwater samples collected in areas without human interference, throughout the state of Maranhão, Brazil. Biosensors applied presented, after optimization, sensitivity with detection limit between 0,054 and 1,44 μg/L, reproducibility with variation coefficient, CVs, internal measure between 8.3 and 9% and stability, showing minor variation in responses after being stored for 3 months), which made them suitable to be used in the organophosphates monitoring in the environmental matrices. Were also analyzed some physico-chemical parameters of quality of waters and soils, it has been verified that these are within the standards of the Brazilian legislation. The monitoring of the presence of levels, using the biosensor described herein, enabled to discard contamination hypothesis by these pollutants, nevertheless it is known that such compounds can have high mobility in environmental compartments. / O controle da qualidade de solos e águas subterrâneas tem-se tornado uma necessidade cada vez maior, pois as atividades humanas têm levado à contaminação de ecossistemas e afetado a saúde humana. A agricultura, por exemplo, tem deixado nos ecossistemas resíduos de inseticidas organofosforados (OFs), altamente tóxicos. Para se fazer uma análise dos impactos provocados por esses compostos em áreas agrícolas, é necessário que se tenha valores de referência de qualidade tomados em áreas não antropizadas, que apresentem mesma tipologia de solos e águas subterrâneas. Nesse particular, o ideal é que estes compostos não estejam presentes nesses ecossistemas. No presente trabalho, um biossensor eletroquímico à base da enzima acetilcolinesterase, imobilizada por ligação cruzada com glutaraldeído em presença de uma macroalga estuarina, foi utilizado para analisar pesticidas OFs em amostras de solo e de águas subterrâneas coletadas em áreas sem interferência humana, em todo o Estado do Maranhão, Brasil. Os biossensores empregados apresentaram, após otimização, sensibilidade com limite de detecção entre 0,054 e 1,44 μg/L, reprodutibilidade com coeficientes de variação, CVs, intramedidas entre 8,3 e 9% e estabilidade, apresentando mínimas variações nas respostas após armazenados por 3 meses, o que os tornou adequados para serem utilizados no monitoramento de organofosforados nas matrizes ambientais. Também foram analisados alguns parâmetros físico-químicos de qualidade de águas e solos, tendo sido verificado que estes encontram-se dentro dos padrões da legislação brasileira. A monitoração da presença de OFs, empregando o biossensor aqui descrito, possibilitou descartar a hipótese de contaminação por esses poluentes, não obstante se saiba que tais compostos podem ter elevada mobilidade nos compartimentos ambientais.

La galanthamine est un alcaloïde isoquinoléique, utilisé dans le monde entier pour le traitement palliatif de la maladie d’Alzheimer en raison de son pouvoir inhibiteur de l’acétylcholinestérase. Cet alcaloïde est extrait à partir de bulbes d’Amaryllidaceae, Leucojum aestivum, Galanthus nivalis, et Narcissus sp. ou obtenu par synthèse chimique. La difficulté principale de cette dernière réside dans le respect de la configuration des centres d'asymétrie. La culture de tissus in vitro pourrait constituer une alternative intéressante pour obtenir ce composé à haute valeur ajoutée. Le premier objectif de ce projet, vise à améliorer l’accumulation de cet alcaloïde par les biais des biotechnologies. Le second objectif est de rechercher par criblage phytochimique (HPLC, LCMS, GCMS, et HPTLC-MS) de bulbes in vitro et in vivo d’Amaryllidaceae, de nouveaux alcaloïdes biologiquement actifs. Le troisième objectif porte sur l’étude de la voie de biosynthèse en vue de réaliser une synthèse biomimétique de la galanthamine. Nous avons établi des cultures in vitro de 3 espèces d’Amaryllidaceae. La variation des paramètres exogènes a conduit à une accumulation accrue d’alcaloïdes (0,02 à 0,2 % MS). Le criblage phytochimique a conduit à l’identification d’alcaloïdes nouveaux issus des cultures in vitro, n’existant pas in vivo, et présentant un puissant pouvoir inhibiteur de l’acétylcholinestérase (40 à 80 % Inh). L’ajout, de la 4’-Ométhyl-d3-norbelladine aux cultures in vitro a conduit à sa métabolisation en trois types d’alcaloïdes deutérés. Une stimulation de la synthèse et du relargage de la galanthamine native (0,15 % MS et 0,16 % Milieu) a été observée en présence du précurseur deutéré / Galanthamine is an Amaryllidaceae alkaloid used worldwide for the symptomatic treatment of Alzheimer’s disease because of his capacity to inhibit the acetylcholinesterase enzyme. There are two galanthamine sources for medical applications. One is the total synthesis, a complicated process because galanthamine has three asymmetric carbons, requiring stereochemically controlled synthesis. Galanthamine is also extracted from bulbs of some Amaryllidaceae such as Leucojum aestivum, Galanthus nivalis, and Narcissus sp.. The first aim of this work is to improve the accumulation of this alkaloid using biotechnologies. The second aim consists on the phytochemical screening (HPLC, LCMS, GCMS, et HPTLCMS) of in vivo and in vitro Amaryllidaceae bulbs, in order to identify new alkaloids with important pharmacological activities. Finally, the third aim concerns the study of the biosynthesis pathway in order to establish a biomimetic synthesis of galanthamine. Therefore, we established in vitro cultures of three Amaryllidaceae species. The variation of exogenousparameters led to the obtainment of high galanthamine accumulation (0.02 to 0.2 % DW). The phytochemical screening showed new alkaloids in extracts of in vitro cultures, which did not exist in in vivo extracts, and possessing high acetylcholinesterase activity (40 to 80 % Inh). The 4’-O-methyl-d3-norbelladine is incorporated into three different groups ofAmaryllidaceae alkaloids. The addition of the labelled precursor to shoot cultures stimulated the synthesis of native galanthamine (0.15 % DW and 0.16 % Culture medium)

The aim of this study was to determine the mean lethal concentration (96 h) for waterborne copper (LC50), as well as the effect of the exposure to copper on growth, metabolic parameters (glycogen, glucose, lactate, and protein) in some tissues, activity of acetylcholinesterase (AChE) (brain and muscle), amylase and maltase (intestine) in silver catfish (Rhamdia quelen). The LC50 for copper was 0.4 mg/L. On growth experiments fish were exposed to 10 and 20% LC50, i.e., 0.04 and 0.08 mg/L respectively. Exposure to copper did not change growth parameters (weight, length and biomass). In the liver, lactate levels increased in juveniles exposed to 0.04 mg/L and decreased in those maintained at 0.08 mg/L, while protein levels decreased in those exposed to both concentrations compared to unexposed specimens. Glycogen levels in the muscle were lower in fish exposed to both concentrations, glucose and lactate were higher in those exposed to 0.04 mg/L and decreased in juveniles maintained at 0.08 mg/L, while protein was higher in those exposed to 0.08 mg/L. Glucose and lactate plasma levels were higher in juveniles exposed to 0.04 mg/L, but protein levels were lower in those maintained at both copper concentrations. Amylase activity was lower in juveniles exposed to both concentrations, but maltase was higher in those exposed to 0.04 mg/L than control group. Brain AChE activity was lower in fish exposed to both concentrations while muscle AChE activity was not affected after 45 days of exposure. It can be concluded that copper can change several metabolic parameters and enzymes of toxicological and feeding interest even at sublethal concentrations. / O objetivo deste estudo foi verificar a concentração letal média em 96 h (CL50) para o cobre, bem como o efeito da exposição ao cobre sobre o crescimento, parâmetros metabólicos (glicogênio, glicose, lactato e proteína) em alguns tecidos (fígado, músculo e cérebro) e a atividade da acetilcolinesterase (AChE) (cérebro e músculo), amilase e maltase (intestino) em jundiás (Rhamdia quelen.). A CL50 para o cobre foi 0,4 mg/L. Nos experimentos de crescimento os peixes foram expostos durante 45 dias a 10 e 20% da CL50, ou seja, 0,04 e 0,08 mg/L respectivamente. A adição de cobre não alterou os parâmetros de crescimento avaliados (peso, comprimento e biomassa). No fígado, os níveis de lactato aumentaram nos exemplares expostos a 0,04 mg/L e diminuíram nos mantidos em 0,08 mg/L, enquanto que os níveis de proteína diminuíram em ambas as concentrações em relação ao grupo controle. No músculo houve redução na atividade do glicogênio nos exemplares mantidos nas duas concentrações testadas, a glicose e o lactato aumentaram nos expostos a 0,04 mg/L e diminuíram nos expostos a 0,08 mg/L, e a proteína aumentou nos mantidos em 0,08 mg/L. Os níveis de glicose e lactato no plasma foram maiores nos exemplares mantidos em 0,04 mg/L e diminuíram os níveis de proteína nos expostos a ambas as concentrações de cobre. A atividade da amilase foi menor nos juvenis expostos a ambas as concentrações, enquanto a da maltase foi maior em 0,04 mg/L quando comparada ao grupo controle. A atividade da AChE cerebral foi menor nos exemplares expostos a ambas concentrações, enquanto que a AChE muscular não sofreu alterações após os 45 dias de exposição. Conclui-se que o cobre mesmo em concentrações subletais pode alterar diversos parâmetros metabólicos e enzimas de interesse toxicológico e alimentar.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cigarette smoke is a serious health problem and the most important cause of avoidable death in the world. It has a complex mixture with more than 4700 constituents, including nicotine and reactive oxygen species (ROS). The most common cause of its toxicity is the atherosclerosis and lipid peroxidation being nicotine an immunosuppressant compound. Among the major cellular changes promoted by nicotine is the disorder in the aggregation of platelets, which participate in the regulation of thromboembolic processes releasing nucleotides such as adenosine diphosphate (ADP). Once exerted the signaling events the nucleotides are degraded by the action of the enzymes NTPDase, 5´- nucleotidase and adenosine deaminase (ADA). This purinergic cascade of enzymatic hydrolysis is also present in lymphocytes and supplies a great amount of signaling modulating the immune system. Another important signaling molecule is acetylcholine (ACh) which is quicklys hydrolyzed by acetylcholinesterase (AChE) and is associated with the cognition process. The first hypothesis to be tested in this study was to investigate the activity of ectonucleotidases in platelets and the ADA from plasma of rats exposed to cigarette smoke during four weeks. The results in platelets demonstrated an increase for adenosine triphosphate (ATP), ADP, adenosine monophosphate (AMP) hydrolysis and adenosine deamination. These results suggest a compensatory organic response to regulate the evels of adenosine, a powerful inhibitor of platelet aggregation and important modulator of vascular tone. The second hypothesis was studied in vivo and in vitro the hydrolysis of nucleotides and nucleosides in lymphocytes of rats submitted to nicotine exposure per se. The in vivo results of lymphocytes demonstrated a decrease in the hydrolysis of ATP, ADP and adenosine in the concentrations of 0.25 and 1.0 mg/kg of nicotine. The expression of NTPDase protein and the counting of lymphocytes in rats were also diminished after nicotine exposure. The quantification of nucleotides and nucleoside in serum of rats treated with nicotine in the dose of 0.25 mg/kg showed an increase in the ATP (39%), ADP (39%) and adenosine (303%) levels. For the in vitro study the ATP-ADP-adenosine hydrolysis were diminished by nicotine in the nicotine concentrations tested (1 mM, 5 mM, 10 mM and 50 mM). These results suggest that alterations in the activity and expression of these enzymes in lymphocytes can contribute for the understanding of the mechanisms involving the suppression of the immune system caused by nicotine. Finally, the third hypothesis was to investigate the activity of AChE and the level of lipid peroxidation in striatum, cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum of rats exposed to cigarette smoke and treated with vitamin E (50 mg/kg/day) during four weeks. The results had demonstrated an increase in the activity of AChE and in the levels of lipid peroxidation in the striatum, cerebral cortex and cerebellum, suggesting that this type of exposition can affect the functionality of the cholinergic system and increase the oxidative damage in the central nervous system (SNC). In addition, vitamin E was capable to reverse these increases, suggesting the use of this antioxidant compound in this type of exposition. Moreover, this study also suggests that cigarette smoke and nicotine modulate the purinergic system of platelets and lymphocytes, which may lead the propensity of thromboembolic and immunosuppressant illnesses, with mobilization of the phisiological defenses for a compensatory response. / A fumaça de cigarro é um grave problema de saúde e a mais importante causa de morte evitável no mundo. Possui uma complexa mistura com mais de 4000 constituintes, incluindo a nicotina e compostos que geram espécies reativas de oxigênio (EROs) no organismo. A causa mais comum de sua toxicidade é a aterosclerose e a peroxidação lipídica sendo a nicotina um composto imunossupressor. Entre as alterações celulares causadas pela nicotina, destacam-se os distúrbios na agregação de plaquetas e estas participam da regulação nos processos tromboembólicos, pela liberação de nucleotídeos tais como a adenosina difosfato (ADP). Uma vez exercido os eventos de sinalização os nucleotídeos são degradados pela ação das enzimas NTPDases, 5´-nucleotidase e adenosina desaminase (ADA). Esta cascata enzimática de hidrólise das purinas também está presente nos linfócitos e fornece um grande leque de sinalizações modulando a resposta imune. Outra molécula importante de sinalização é a acetilcolina (ACh) que é rapidamente hidrolisada pela acetilcolinesterase (AChE) e está associada ao processo de cognição. A primeira hipótese a ser testada neste estudo foi investigar a atividade das ectonucleotidases em plaquetas e a ADA no plasma de ratos expostos à fumaça de cigarro por quatro semanas. Os resultados em plaquetas demonstraram um aumento para a hidrólise de adenosina trifosfato (ATP), ADP, adenosina monofosfato (AMP) e adenosina. Esses resultados sugerem uma resposta orgânica compensatória com objetivo de manter os níveis de adenosina, um potente inibidor da agregação plaquetária e importante modulador do tônus vascular. A segunda hipótese foi realizar estudos in vivo e in vitro da hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeos em linfócitos de ratos submetidos a exposição à nicotina per se. Os resultados in vivo de linfócitos demonstraram um decréscimo da hidrólise de ATP, ADP e adenosina nas concentrações de nicotina de 0,25 e 1,0 mg/kg. A expressão da proteína NTPDase e a contagem de linfócitos em ratos também foram diminuídas pela nicotina. A determinação dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeos no soro de ratos tratados com nicotina na dose de 0,25 mg/kg aumentou para o ATP (39%), o ADP (39%) e a adenosina (303%). Para o estudo in vitro a hidrólise de ATP-ADP-adenosina foi diminuída pelas concentraçoes de nicotina (1 mM, 5 mM, 10 mM e 50 mM). Estes resultados sugerem que alterações na atividade e expressão destas enzimas nos linfócitos pode contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvendo a supressão da resposta imune causada pela nicotina. Por fim, a terceira hipótese, foi investigar a atividade da AChE e o nível de peroxidação lipídica no estriado (ES), no córtex cerebral (CC), no hipocampo (HC) e no cerebelo (CE) de ratos expostos à fumaça de cigarro e tratados com vitamina E (50 mg/kg/dia) por quatro semanas. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da AChE e no nível de peroxidação lipídica no ES, no CC e no CE, sugerindo que este tipo de exposição pode afetar a funcionalidade do sistema colinérgico e aumentar os danos oxidativos no sistema nervoso central (SNC). Em adição, a Vitamina E foi capaz de reverter estes efeitos, o que sugere uma boa escolha de terapia com este antioxidante neste tipo de exposição. Alem disso, este estudo também pode sugerir que a fumaça de cigarro e a nicotina modulam o sistema purinérgico de plaquetas e linfócitos, o que pode levar a propensão de doenças tromboembólicas e imunossupressoras, com a mobilização das defesas do organismo para uma resposta compensatória.

Rýdlová Kateřina: Alkaloids Narcissus 'Dutch Master' (Amaryllidaceae) and their biological activity III. Diploma thesis 2017. Charles university in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmaceutical Botany and Ecology. The aim of this work was isolation of compounds from the selected fraction ND 3 - 5 obtained by column chromatography of a Narcissus 'Dutch Master' alkaloid extract. Preparation of the extract and its column chromatography was performed by Mgr. Daniela Hulcová as a part of her doctoral study. Two substances NDM-1 and NDM-2 were isolated from fraction ND 3 - 5 by column chromatography and preparative TLC. The structures were determined as (+)-masonine and (+)-homolycorine on the basis of NMR, GC-MS analysis, optical rotation and their comparison with literature data. Isolated alkaloids were tested on inhibitory activity against human erythrocyte acetylcholinesterase, plasma butyrylcholinesterase and prolyloligopeptidase. Activity of alkaloids was expressed as IC50 values: (+)-masonine (IC50 AChE = 305 ± 34 μM, IC50 BuChE = 229 ± 24 μM, IC50 POP = 314 ± 34 μM), (+)-homolycorine (IC50 AChE = 63.7 ± 4.3 μM, IC50 BuChE = 151 ± 20 μM, IC50 POP = 173 ± 41 μM). In comparison with standards of galanthamine (IC50 AChE = 1.710 ± 0.1 μM, IC50 BuChE = 42.3 ± 1.3 μM),...

L’objectif de ce travail a consisté à évaluer différents effets écotoxiques de la deltaméthrine et du malathion sur trois souches du crustacé cladocère Daphnia magna. Deux de ces 3 souches appartiennent au même clone A (souches 1 et 3), ce qui a permis d’observer des différences de sensibilité inter- et intra-clonale. Les tests d’écotoxicité aiguë (48h) ont révélé, aussi bien pour la deltaméthrine que pour le malathion, que la souche 1 est plus sensible que la souche 2, elle-même plus sensible que la souche 3. Les tests chroniques (21 jours) ont montré que le critère commun majoritairement affecté par les deux pesticides est le nombre de nouveaux nés par adulte. Ces tests ont confirmé la sensibilité de la souche 1. La deltaméthrine et le malathion sont embryotoxiques puisque l’exposition des daphnies aux fortes concentrations de deltaméthrine et de malathion a induit des malformations. Pour ces effets, la souche 1 est également plus sensible que la souche 2, elle-même plus sensible que la souche 3. Nous avons aussi observé l’apparition de mâles, mais uniquement dans la descendance de la souche 1 exposée à la deltaméthrine. Le dosage de l’activité spécifique de l’acétylcholinestérase (AChE), pour les deux insecticides, a montré une inversion de l’ordre de sensibilité des souches. L’AChE, biomarqueur d’exposition et d’effet, peut être donc considérée aussi comme biomarqueur de susceptibilité. L’analyse protéomique a permis de révéler plusieurs cibles cellulaires de la deltaméthrine chez la souche 1 par rapport à la souche 2. Elle est surtout venue confirmer la plus grande sensibilité de la souche 1 par rapport à la souche 2. L’ensemble de ces résultats rappelle que le facteur génétique est une source de variation et souligne les perspectives offertes par l’analyse protéomique / The aim of this work was to evaluate different ecotoxic effects of deltamethrin and malathion on three strains of the cladoceran Daphnia magna. Two of the three strains belong to the same clone A (strains 1 and 3), which allowed to observe differences in inter-and intra-clonal sensitivity. The acute ecotoxicity tests (48h) showed for both deltamethrin and malathion, that one strain is more sensitive than strain 2, itself more sensitive than strain 3. Chronic tests (21days) showed that the common criterion mainly affected by both pesticides is the number of neonates per adult. These tests confirmed the sensitivity of the strain 1. Deltamethrin and malathion are embryotoxic as daphnid exposure to high concentrations of deltamethrin and malathion induced malformations. For these effects, strain 1 is also more sensitive than strain 2, itself more sensitive than strain 3. We also observed the appearance of males, but only in the offspring of the strain 1 exposed to deltamethrin. The determination of the specific activity of acetylcholinesterase (AChE), for both insecticides, showed a reversal of the order of susceptibility testing. Thus, as a biomarker of exposure and effect, AChE can also be considered as a biomarker of susceptibility. Proteomic analysis revealed several cellular targets of deltamethrin in strain 1 compared to strain 2. It confirms the greater sensitivity of strain 1 compared to strain 2. All these results point out that the genetic factor is a source of variation and highlight the opportunities offered by proteomic analysis

Orientador: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_NormaMachadoda_D.pdf: 6129934 bytes, checksum: 5d8a07895afd2e470c9fd5caf8ac9fb8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Cochliomyia hominivorax é considerada uma importante praga por causar perdas econômicas para a pecuária na região Neotropical. Este ectoparasita tem sido controlado principalmente por inseticidas, entretanto, este método normalmente resulta na seleção de indivíduos resistentes. Nesta tese foram investigados mecanismos associados com resistência a inseticidas organofosforados e piretróides. Os resultados apresentados nesta tese estão divididos em dois artigos. No artigo 1 foram investigados dois mecanismos de resistência a piretróides, um conhecido como kdr (knockdown resistance), associado à mutações no canal de sódio, e a mutação W251S no gene da carboxilesterase E3, a qual têm sido associada à hidrólise de piretróides. Foram investigadas populações da atual distribuição geográfica de C. hominivorax através de PCR-RFLP. Para a mutação kdr (L1014F) nenhum indivíduo mutante foi encontrado. Entretanto, a mutação W251S foi encontrada em todas as populações, com as mais altas freqüências nas amostras da Venezuela (100%) e Colômbia (93.75%). Em algumas populações amostradas, apesar da freqüência do alelo mutante ter sido relativamente baixa, o número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante foi alto. No bioensaio com cipermetrina (piretróide tipo II), utilizando amostras de Estiva (MG), os resultados analisados através do teste exato de Fisher indicaram que para a mais baixa concentração (p=0.0003) e para uma concentração intermediária (p= 0.024), a presença da mutação W251S está correlacionada com as chances de sobrevivência. Entretanto, na mais alta concentração (p= 0.221) a presença desta mutação não foi correlacionada com a sobrevivência, o que possivelmente indica dificuldade em hidrolisar este tipo de piretróide em concentrações maiores. No Artigo 2, as mutações G137D no gene da carboxilesterase E3, e as mutações I298V, G401A e F466Y no gene da acetilcolinesterase, associadas com resistência a organofosforados, foram investigadas nas mesmas populações do artigo 1, através de PCR-RFLP e sequenciamento direto de PCR. A região codificante completa da acetilcolinesterase também foi caracterizada e proposto um modelo para a estrutura tridimensional desta proteína com base na estrutura da acetilcolinesterase de Drosophila melanogaster. Possíveis alterações na proteína causadas pelas mutações associadas com resistência a organofosforados foram discutidas. No gene da acetilcolinesterase somente 2 de 135 indivíduos analisados apresentaram uma das mutações investigadas, a F466Y, o que pode estar associado ao alto custo no valor adaptativo do indivíduo, causado por algumas mutações neste gene ou inexistência dos demais alelos mutantes nestas populações. Entretanto, para a mutação G137D no gene da E3 foi encontrado um alto número de indivíduos portadores de pelo menos um alelo mutante na maioria das populações brasileiras e no Uruguai. Em Cuba, Venezuela e Colômbia nenhum indivíduo mutante para G137D foi encontrado, o que pode estar relacionado com os inseticidas usados no controle de C. hominivorax nestas regiões ou com a inexistência do alelo mutante nestas localidades. Os resultados de ambos os trabalhos indicam que mutações no gene da carboxilesterase E3 são um dos principais mecanismos de resistência selecionados nesta espécie, dentre os investigados até o momento. Este estudo representa um importante avanço no entendimento da base molecular da resistência a inseticidas em um importante ectoparasita. / Abstract: Cochliomyia hominivorax is an important ectoparasite, causing considerable economic losses to livestock sector in Neotropical region. This ectoparasite has been controlled mainly by applying insecticides, however, this method usually results in the selection of resistant individuals. In this thesis, mechanisms associated with organophosphate and pyrethroid insecticide resistance were investigated. The results presented in this thesis are divided in two articles. In the Article 1 two mechanisms associated with pyrethroid resistance were investigated, the kdr (knockdown resistance), a generic term for mutations in the sodium channel, and a mutation in the residue 251 of the carboxylesterase E3 gene, which have been associated with pyrethroid hydrolysis. Populations of actual geographical distribution of C. hominivorax were investigated through PCR-RFLP. For the kdr mutation, no mutant individuals were found. However, the W251S mutation was found in all populations investigated, with the highest frequencies in the samples from Colombia (100%) and Venezuela (93.75%). In some populations, despite relatively low mutant allele frequency, the number of individuals having at least one mutant allele was high. A bioassay with cypermethrin (pirethroid type II) was also performed, using samples from Estiva (MG). The results of the Fisher's exact test for the lowest concentration (p=0.0003, a= 0.05) and for an intermediate concentration (p= 0.024, a= 0.05) indicated that the presence of W251S mutation are correlated with the survival. However, at the highest concentration, Fisher's exact test (p= 0.221, a= 0.05) indicated that the presence of this mutation was not correlated with survival. These results indicate that the W251S mutation in C. hominivorax probably presents difficulties in hydrolyzing of this kind of pyrethroid, in high concentrations. In the Article 2, the G137D mutation, in the carboxylesterase E3 gene, and the I298V, G401A and F466Y mutations in the acetylcholinesterase gene, associated with organophosphate resistance, were investigated. The same populations of article 1 were analyzed using PCR-RFLP and PCR direct sequencing. The complete coding region of acetylcholineserase also was characterized and a putative model for the three-dimensional structure of this protein was proposed, based on solved structure of Drosophila melanogaster. Possible alterations in the protein, caused by mutations associated with organophosphate resistance, were discussed. For the acetylcholinesterase gene, only 2 of 135 individuals analyzed presented one of the mutations investigated, the F466Y. This fact may be related with the fitness cost of some mutations in this gene, or the inexistence of mutant alleles in these populations. For the G137D mutation, a high number of individuals having at least one mutant allele were found in most of the Brazilian populations and in Uruguay. In Cuba, Venezuela and Colombia no G137D mutant was found, a finding that may be related to the insecticides used for C. hominivorax control in these regions. The results of these two works indicate that mutations in the carboxylesterase E3 gene are one of the main insecticide resistance mechanisms selected in this species, so far investigated. This study represents a significant advance in the understanding of the molecular basis of insecticide resistance in an important livestock ectoparasite. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular