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AvaliaÃÃo do impacto do uso de agrotÃxicos nos trabalhadores rurais dos MunicÃpios de Ribeiro GonÃalves, Baixa Grande do Ribeiro e UruÃuà â Piauà / Evaluation of the Impact of the use of Pesticides on Agricultural Laborersâ Health in the Cities of UruÃuÃ, Ribeiro GonÃalves and Baixa Grande do RibeiroTatiana Vieira Souza Chaves 27 November 2007 (has links)
CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os agrotÃxicos estÃo entre os mais importantes fatores de risco para a saÃde dos trabalhadores. No PiauÃ, a expansÃo agrÃcola implementada nos cerrados, por intermÃdio da intensificaÃÃo do plantio de soja, a partir da dÃcada de 1990, consistiu em um forte fator para o aumento do uso de agrotÃxicos. A utilizaÃÃo indiscriminada dos agrotÃxicos, geralmente, està associada a intoxicaÃÃes agudas e crÃnicas. A dosagem de colinesterase plasmÃtica e eritrocitÃria sÃo parÃmetros relevantes para diagnÃstico de casos cuja exposiÃÃo se deu, principalmente, de forma aguda. A genotoxicidade associada ao uso destes produtos vem sendo estudada, sendo fortes as evidÃncias que estes produtos sÃo carcinogÃnicos. No estado do PiauÃ, em setembro de 2005, no municÃpio de Ribeiro GonÃalves, ocorreram mortes cuja suspeita principal era de intoxicaÃÃo por uso dos pesticidas agrÃcolas. Este fato desencadeou uma investigaÃÃo nos municÃpios produtores de soja (UruÃuÃ, Ribeiro GonÃalves e Baixa Grande do Ribeiro). O objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto do uso de agrotÃxicos sobre a saÃde dos trabalhadores rurais dos municÃpios de UruÃuÃ, Ribeiro GonÃalves e Baixa Grande do Ribeiro. Dividiu-se, metodologicamente, o estudo em trÃs etapas. Na primeira, aplicou-se questionÃrio sÃcio epidemiolÃgico de acordo com OrganizaÃÃo Mundial de SaÃde (OMS) e coletaram-se amostras de material biolÃgico para anÃlises bioquÃmicas, hematolÃgicas e enzimÃticas (acetil colinesterase plasmÃtica e eritrocitÃria) de 120 trabalhadores agrÃcolas da regiÃo sul do PiauÃ. Na segunda etapa, estudou-se 75 indivÃduos. Estes se submeteram a uma segunda avaliaÃÃo, tendo como ferramenta os mesmos exames anteriormente realizados. Como terceira etapa, realizou-se o teste de micronÃcleo em 31 indivÃduos que encontravam-se com os parÃmetros alterados. Fez-se coleta de cÃlulas da mucosa oral, para avaliaÃÃo do nÃvel de lesÃo de DNA atravÃs de contagem de micronÃcleos. Quanto ao questionÃrio sÃcio epidemiolÃgico os resultados encontrados indicaram que 100% da populaÃÃo estudada pertencia ao sexo masculino, com idade mÃdia de 35 anos. Ainda sobre o questionÃrio, 66% eram casados, 76,67% trabalhavam em fazendas (lavradores, operadores de mÃquinas e tÃcnicos agrÃcolas), 16,67% eram agentes de endemias ou servidores pÃblico, sendo que 21,3% tomavam medicamento sem prescriÃÃo mÃdica e que 71,67% nÃo realizaram exames mÃdicos nos Ãltimos 06 meses. A investigaÃÃo evidenciou ainda que, quanto ao estilo de vida e trabalho, 33,33% dos trabalhadores possuem o hÃbito de fumar, 55,83% de consumir bebidas alcoÃlicas, 29,9% entraram em contato direto com o agrotÃxico durante o preparo do produto, 38% atravÃs da aplicaÃÃo do produto por pulverizaÃÃo, 10% atravÃs da limpeza e manutenÃÃo dos equipamentos, 17,5% nÃo utilizavam nenhuma proteÃÃo, sendo que a grande maioria utilizavam apenas 01 tipo de EPI. Outro achado relatado refere-se que os trabalhadores utilizaram mais de 34 diferentes formulaÃÃes, sendo as classes mais utilizadas os inseticidas (45,18%), herbicidas (27,68%) e fungicidas (6,21%). Quanto ao tempo de exposiÃÃo dos trabalhadores aos pesticidas, 50,84% estavam expostos a menos de 2 anos e 10% estavam expostos a mais de 10 anos. Dentre os sintomas mais relatados, os efeitos no SNC destacaram-se com 230 queixas relatadas durante a aplicaÃÃo do questionÃrio sÃcio-epidemiolÃgico. Sobre o destino final das embalagens, 84,21% dos mesmos eram queimados, enterrados e deixados a cÃu aberto, sendo 15,79% entregues na central de recebimento. Em relaÃÃo Ãs anÃlises bioquÃmicas e hematolÃgicas dos indivÃduos submetidos à primeira coleta, os resultados indicaram que 11,67%; 4,17%; 10,83%; 0,83% ; 5,83%; 5% e 9,17% encontravam-se com nÃveis respectivamente alterados de Gama GT, Fosfatase Alcalina e TGO/ TGP, UrÃia, Creatinina componentes protÃicos, acetilcolinesterase plasmÃtica e eritrocitÃria . Na segunda etapa, os achados indicaram que os indivÃduos estavam com os nÃveis alterados de: gama GT ( 4,00%); fosfatase alcalina e TGO/TGP ( 4,00%); urÃia (4,00%); creatinina (5,33%); proteÃnas totais (17,33%); acetilcolinesterase plasmÃtica (4,00%) e acetilcolinesterase eritrocitÃria (2,67%). Com relaÃÃo à terceira etapa, dos 31 indivÃduos que realizaram teste de micronÃcleo 84,00% encontravam-se com danos citogenÃticos. Os danos citogenÃticos evidenciados nÃo apresentaram correlaÃÃes com idade, fumo, bebidas, equipamentos de proteÃÃo, medicamentos e doenÃas, confirmando a correlaÃÃo dos danos citogenÃticos evidenciados, com a exposiÃÃo aos agrotÃxicos (P<0,05) / The pesticides are some of the main risky factors for agricultural laborersâ health. In the state of PiauÃ, the agricultural expansion which was implemented in the cerrados through the growth of the soy crops in the 90âs was a relevant factor that increased the use of pesticides. The unbalanced usage of pesticides is often related to acute and chronic poisonings. The dosage of plasma cholinesterase and erythrocyte cholinesterase are relevant parameters to diagnose mainly cases in which an acute contact has occurred. The genotoxicity related to the use of these kinds of products has been studied and there are strong evidences that they are carcinogenic. Deaths which the main suspicion was poisoning by the misuse of agricultural pesticides happened in September of 2007 in the city of Ribeiro GonÃalves, state of PiauÃ. The fact unchained an investigation in the cities that produce soy (UruÃuÃ, Ribeiro GonÃalves and Baixa Grande do Ribeiro). The purpose of this study was evaluating the impact of the use of pesticides on agricultural laborerâs health in the cities of UruÃuÃ, Ribeiro GonÃalves and Baixa Grande do Ribeiro. The study was divided in three steps. Firstly, a social epidemiologic questionnaire Word Health Organization (WHO) was applied and samples and collected material to biochemical, hematological and enzymatic plasma acetylcholinesterase and erythrocyte acetylcholinesterase analysis of 120 agricultural laborers from the region. The second step was a study of these workers. These ones submitted salf of Piauà to a second evaluation which used, as a tool, the tests which had been previously discribed. In the third step 31 individuals with irregular parameters were submitted to a micronucleus test. Cells from the oral mucosa were collected to evaluate the level of DNA injury through micronucleus counting. The results of the social epidemiologic questionnaire pointed that 100% of the subjects who had benn studied were males with an average age of 35 years old. 66% were married, 76.67% worked in farms (farmers, machinists and agricultural technicians), 16.67% worked as endemic diseases agents or civil servants. 21.3% of them used non-prescribed medication and 71.67% had not did medical tests for the last 6 months. About life and work style the investigation showed that 33.33% of the workers is smokers, 55.83% drink alcohol, 29.9% has direct contact with the pesticide while it was being prepared to be use, 38% during the pulverization process, 10% during the equipment cleaning and maintenance, 17.5% did not take any safety protection measure, while the most used only a single kind of EPI. Another related discovery about the workers showed that they used more than 34 different formulations. Insecticides (45.18%), herbicides (27.68%) and fungicides (6.21%) were the most used products. Concerning the time of exposure the workers had to the pesticides, 50.84% were exposed to them for less than 2 years and 10% for more than 10 years. The effects on the SNC detached themselves among the most related symptoms with a 230 complaints reported during the application of the social epidemiologic questionnaire. Concerning the final destination of the containers, 84.21% were burned, buried and left outdoors while 15.79% were brought to the appropriate organ headquarter. The results from the biochemical and hematological analysis indicated that 11.67%; 4.17%; 10.83%; 0.83%; 5.83%; 5% e 9.17% of the individuals who were submitted to the first sample collection had, respectively, irregular levels of Gamma-Glutamyl Transferase (GGT); Alkaline Fosfatase and Glutamic-Oxaloacetic Transaminase/ Glutamic Pyruvic Transaminase; Urea; Creatinine; Proteic components; Plasma acetylcholinesterase and Erythrocyte acetylcholinesterase. The findings in the second step indicated that the individuals had irregular levels of: Gamma GT (4.00%); Alkaline Fosfatase and GOT/GPT (4.00%); Urea (4.00%); Creatinine (5.33%); Total Protein (17.33%); Plasma acetylcholinesterase (4.00%) and Erythrocyte acetylcholinesterase (2.67%). In the third step, 84.00% of the 31 subjects who had a micronucleus test presented cytogenetic injuries. The cytogenetic injuries which could be observed were not related to age, smoke, alcohol consumption; safety equipment, medications and diseases which confirms the co-relation between the presented cytogenetic injuries and the exposure to pesticides ( P<0.05)
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DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS EMPREGANDO SPME-GC/MS E BIOSSENSORES AMPEROMÉTRICOS PARA ANÁLISE DO INSETICIDA PARATION METÍLICO EM AMOSTRAS DE ARROZ IN NATURA / DEVELOPMENT AND METHODS EMPLOYING SPME-GC/MS AMPEROMETRIC BIOSENSOR FOR METHYL PARATHION ANALYSIS OF PESTICIDE IN SAMPLES OF RICE IN NATURASilva, Darlan Ferreira da 11 October 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-10-11 / Organophosphate insecticides, especially those based on the active ingredient methyl parathion, have been extensively used in crop protection of rice in the State of Maranhão. In this work, an optimized chromatographic method for determination of the methyl parathion insecticide by using solid phase microextraction in a confined environment (headspace) followed by analysis employing gas chromatography with mass spectrometric detection (HS-SPME-GC/MS). Electroanalytical methods using amperometric biosensors were also developed and used to analyze the composite samples of fresh rice. The optimized method using SPME resulted in satisfactory results for sensitivity (limit of detection: 0.026 mg/L-1), precision (coefficients of variation between 6.1 and 22.4%, 8.8% and 32.5 and 19.7 and 24.6%, for milled rice samples, rice with shells and full rice, respectively) and accuracy (recoveries ranging from 73.2 to 90% for milled rice samples, from 88.7 to 89.5%, for paddy rice samples and from 59.5 to 60.6% for full rice samples). In the case of biosensors, these have been built based on acetylcholinesterase enzyme (AChE), commercially obtained or genetically modified, having the sensors prepared with carbon paste modified with TCNQ (tetracyanoquinodimethane) mediator. Better sensitivities were observed with sensors based on AChE enzymes extracted from Drosophila melanogaster. Detection limits of 10.0, 0.05 and 0.001 μg.L-1 were found for the sensors based on AChE (ee), AChE (eb) and mutant enzymes (AChE (Dros) B08 e B12), respectively. The efficiency of the detection method of the methyl parathion insecticide in rice samples without any previous treatment was evidenced by an average recovery of 103.9%, 101%, 102.3% and 105.6%, for the sensors prepared with AChE (ee), AChE (eb), AChE (Dros) B08 and B12 enzymes, respectively. In general, the chromatographic technique used was practical and efficient for direct detection of insecticide residues in rice samples in a wider range of concentration (0.1 a 1 mg.Kg-1). Since the biosensor was more sensitive and effective in smaller amounts (0.0005 a 0.01 mg.Kg-1) of such insecticide in rice, considering the additional advantage of speed and decreasing cost of the analytical technology. / Os inseticidas organofosforados, em especial aqueles à base do princípio ativo paration metílico, têm sido extensivamente usados na proteção de cultivos de arroz no Estado do Maranhão. Neste trabalho, foi otimizado um método cromatográfico para determinação do inseticida paration metílico usando microextração em fase sólida em ambiente confinado (headspace), seguido de análise empregando cromatografia a gás com detecção por espectrometira de massas (HS-SPME-GC/MS). Métodos eletroanalíticos empregando biossensores amperométricos também foram desenvolvidos, tendo sido empregados para análise do composto em amostras de arroz in natura. O método otimizado empregando SPME resultou em resultados satisfatórios quanto à sensibilidade (limite de detecção: 0,026 mg/L-1), precisão (coeficientes de variação entre 6,1 e 22,4%; 8,8 e 32,5% e 19,7 a 24,6%, para as amostras de arroz polido, arroz com casca e arroz integral respectivamente) e exatidão (recuperações na faixa de 73,2 a 90%, para as amostras de arroz polido; de 88,7 a 89,5 %, para as amostras de arroz com casca e de 59,5 a 60,6%, para as amostras de arroz integral). No caso dos biossensores, estes foram construídos à base de enzimas acetilcolinesterase (AChE), comerciais e geneticamente modificadas, tendo sido os sensores preparados com pasta de carbono modificada com o mediador TCNQ (tetracianoquinodimetano). Melhores sensibilidades foram verificadas com sensores preparados à base de enzimas AChE extraídas da Drosophila Melanogaster. Limites de detecção de 10; 0,05 e 0,001μg.L-1 foram encontrados para os sensores preparados com as enzimas AChE (ee), AChE (eb) e mutantes (AChE (Dros) B08 e B12), respectivamente. A eficiência do método de detecção do inseticida paration metílico em amostras de arroz sem nenhum prévio tratamento foi comprovada pelas recuperações médias de 103,9%; 101 %; 102,3% e 105,6 % para os sensores preparados com as enzimas AChE (ee), AChE (eb), AChE (Dros) B08 e B12 respectivamente. De modo geral, a técnica cromatográfica empregada foi prática e eficiente para detecção direta de resíduos do inseticida em amostras de arroz, em uma faixa maior de concentração (0,1 a 1 mg.Kg-1). Já os biossensores foram mais sensíveis e eficientes em teores menores (0,0005 a 0,01 mg.Kg-1) do inseticida no arroz, considerando ainda a vantagem adicional da rapidez e menor custo da técnica analítica.
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Efeitos da quercetina na atividade da cetilcolinesterase, na peroxidação lipídica e nos testes comportamentais em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina / Effects of activity in quercetin acetylcholinesterase, in lipid peroxidation and behaviour in tests in rats streptozotocin-induced diabeticMaciel, Roberto Marinho 28 February 2013 (has links)
Diabetes mellitus (DM) refers to a group of common metabolic disorders that share the phenotype of hyperglycemia, is a chronic condition that arises when the pancreas does not produce enough insulin or when the body can not effectively use the insulin produced.The condition of chronic hyperglycemia promotes an imbalance between the production of free radicals and endogenous antioxidant defense, causing oxidative stress and finally lipid peroxidation, structures and cell membranes rich in lipids. Quercetin (QUE) is a flavonoid that has antioxidant and anti-inflammatory properties and is therefore investigated as a possible adjuvant in the treatment of diabetes. In this study we analyzed the actions of excess free radicals, promoted by type 1 diabetes mellitus (DM T1) at both systemic and mainly in the cholinergic system. Moreover, the possible effects of antioxidant protection and anti-inflammatory of QUE were analysed. We used 130 male Wistar rats, weighing 160 to 250 g and divided into 2 groups: non-diabetic and diabetic, which are divided into 5 treatments: 0.9% saline, 25% ethanol and QUE (5, 25 and 50 mg/kg).The induction of DM T1 occurred with a single intraperitoneal injection of 70 mg/kg streptozotocin (STZ). Fifteen days later, the treatment with QUE for 40 days started. At the end of the experiment behavioral tests and collection of biological material (blood and tissues) were performed. The untreated diabetic group compared to non-diabetic control showed: reduction of the islets and beta-cell population, weight loss, chronic hyperglycemia, leukopenia associated with neutropenia, decreased insulin and albumin, increase in fructosamine, triglycerides, urea, alkaline phosphatase (ALP), alanine aminotransferase (ALT), in addition to protein fractions of beta and gamma globulin.The increase of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) levels was accompanied by a reduction in the concentration of hepatic superoxide dismutase. Failed aversive memory formation and anxious behavior were observed in these animals, as well as increase in the activity of acetylcholinesterase (AChE) in brain structures and sites (cortex, hippocampus, striatum and synaptosomes) and TBARS (cortex, hippocampus and striatum). Diabetic rats treated with QUE in relation to diabetic control had increased albumin (50 mg/kg), reduction in betaglobulins (25 and 50 mg/kg) and gamma globulins (50 mg/kg), decreased triglycerides (5, 25 and 50 mg/kg). Quercetin reverted the aversive memory failure and showed anxiolytic properties. AChE activity were decreased in the cortex (50 mg/kg), hippocampus (5 and 50 mg/kg) and synaptosomes (50 mg/kg). Levels of TBARS were reduced in the cortex, hippocampus and striatum (5, 25 and 50 mg/kg). Quercetin increased the concentration of insulin in non-diabetic and diabetic groups (5, 25 and 50 mg/kg). When administered in non-diabetic animals, QUE increased the uneasiness of the animals (50 mg/kg) increased AChE activity in the hippocampus (5, 25 and 50 mg/kg), striatum (5 mg/kg) and synaptosomes (25 mg/kg), lowering in the cortex (5 mg/kg), furthermore, increased the level of TBARS in the cortex (25 mg/kg).From these results we conclude that QUE have antioxidant and anti-inflammatory properties which may be used in conjunction with treatment of diabetes. However, it also had undesirable properties, such as pro-oxidant effect and induces insulin resistance. / Diabetes melito (DM) refere-se a um grupo de distúrbios metabólicos comuns que compartilham o fenótipo da hiperglicemia, sendo uma condição crônica que surge quando o pâncreas não produz insulina em quantidade suficiente ou quando o organismo não consegue utilizar de modo eficaz a insulina produzida. A condição de hiperglicemia crônica favorece o desequilíbrio entre a produção de radicais livres e a defesa antioxidante endógena, gerando o estresse oxidativo e por fim a peroxidação lipídica de estruturas e membranas celulares, ricas em lipídios. A quercetina (QUE) é um flavonoide que apresenta propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias, sendo por isso, investigada como possível adjuvante no tratamento do DM. No presente trabalho foram analisadas as ações do excesso de radicais livres, promovido pelo diabetes melito tipo 1 (DM T1) tanto em nível sistêmico como, principalmente, no sistema colinérgico. Além disso, os possíveis efeitos de proteção antioxidante e anti-inflamatória da QUE. Foram utilizados 130 ratos Wistar, machos, pesando entre 160 a 250 g, distribuidos em 2 grupos: não diabéticos e diabéticos, sendo cada um deles divididos em 5 tratamentos: salina 0,9%, etanol 25% e QUE (5, 25 e 50 mg/Kg). A indução do DM T1 se deu com uma única injeção intraperitoneal de 70 mg/Kg de estreptozotocina (STZ). Quinze dias depois, teve início o tratamento com QUE por 40 dias. Ao término do experimento, foram realizados os testes comportamentais e a coleta de material biológico (sangue e tecidos corporais). O grupo diabético sem tratamento em relação ao controle não diabético apresentou: redução das ilhotas de Langerhans e da população de células beta, perda de peso, hiperglicemia crônica, leucopenia associada à neutropenia, redução na insulina e albumina, elevação na frutosamina, triglicerídeos, ureia, fosfatase alcalina (FA), alanina aminotransferase (ALT), além das frações proteicas de beta e gamaglobulinas. Houve aumento das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) sérico e redução na atividade de superóxido dismutase hepática. Falha na formação de memória aversiva e comportamento ansioso foram observados nesses animais, bem como, elevação na atividade da acetilcolinesterase (AChE) nas estruturas e sítios cerebrais (córtex, hipocampo, estriado e sinaptossomas) e TBARS (córtex, hipocampo e estriado). Os ratos diabéticos tratados com QUE em relação ao grupo controle diabético: apresentaram elevação na albumina (50 mg/Kg), redução nas betaglobulinas (25 e 50 mg/Kg) e gamaglobulinas (50 mg/Kg), diminuição dos triglicerídeos (5, 25 e 50 mg/Kg). A quercetina nas concentrações utilizadas reverteu a falha de memória aversiva e apresentou propriedades ansiolíticas. A atividade da AChE foi reduzida: no córtex (50 mg/Kg), no hipocampo (5 e 50 mg/Kg) e sinaptossomas (50 mg/Kg). Houve diminuição nos níveis séricos das TBARS no córtex, hipocampo e estriado (5, 25 e 50 mg/Kg). A quercetina elevou a concentração da insulina, nos grupos não diabéticos e diabéticos (5, 25 e 50 mg/Kg). Quando administrada em animais não diabéticos a QUE aumentou a inquietação dos animais (50 mg/Kg); aumentou a atividade da AChE no hipocampo (5, 25 e 50 mg/Kg), estriado (5 mg/Kg) e sinaptossomas (25 mg/Kg), diminuindo no córtex (5 mg/Kg). Além disso, aumentou o nível de TBARS no córtex (25 mg/Kg). A partir desses resultados conclui-se que a QUE possui propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias que podem ser utilizadas no tratamento auxiliar do DM. Contudo, também apresentou propriedades não desejáveis, como efeito pró-oxidante, o que sugere a resistência à insulina.
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Avaliações neuroquímicas, enzimáticas e comportamentais em ratos infectados experimentalmente com trypanosoma evansi e utilização da curcumina como possível agente terapêutico / Neurochemical, enzymatic and behavioral assessment of trypanosoma evansi experimentally infected rats and the use of curcumin as a possible therapeutic agentWolkmer, Patricia 20 May 2013 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The pathogenesis of Trypanosoma evansi (T. evansi) infection on central and peripheral nervous
system (CNS) and immunologic system it is not completely understood. This study was conducted to
investigate the effects of infection by T. evansi on the behavioral performance of rats, relating them to
neurochemical alterations of the glutamatergic system and activity of important enzymes such as Ca2 +
ATPase, Na + / K + ATPase and acetylcholinesterase (AChE) in the brain. Furthermore, we evaluated
the activity of AChE in the T. evansi, using a biochemical protocol and discussed some possibilities for
the interaction between the presence of this enzyme in the parasite and its possible relation with the
host. Also, we investigated the in vivo effect of curcumin as an antitrypanosomal agent to contribute in
the search for new therapies. To this end, we conducted a series of studies, as follow that are
presented as scientific articles: in the Article I are presented data from rats experimentally infected
with T. evansi and in which the activity of AChE in total brain, cerebellum and blood and plasma
butyrylcholinesterase activity on days 3 (T3) and 5 (T5) post infection (pi) were evaluated. In the
Article II trypanosomes were isolated by Dietil Amino Etil-celulose column to perform enzymatic
assays of AChE activity in the parasite. Article III presents the results of daily oral administration of
Curcumin (20 or 60 mg / kg) as a preventive treatment (for 30 or 15 days pre-infection) or as curative
treatment (for 15 days pi) for T. evansi infection in rats. The animals were evaluated for parasitemia,
proinflammatory cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) in plasma. Also
blood AChE activity was studied. In the manuscript I were evaluated behavioral changes (memory and
anxiety), glutamate uptake, activity of AChE and ATPases (Ca +2 and Na +, K +) in brain structures of
T. evansi infected rats (5 and 30 dpi). Together these studies suggest that rats infected with T. evansi
have cognitive impairment, probably caused by changes on energy metabolism (ATPases) and in the
cholinergic and glutamatergic systems. That way, alterations observed during behavioral tests
probably indicate the progression of clinical disease as a result of neurochemical dysfunction. It was
also demonstrated that it is possible to biochemically detect the AChE activity in the T. evansi and this
could cause the hydrolysis of acetylcholine in the parasite. It was also demonstrated that pretreatment
with curcumin induces immunomodulatory effects, altering inflammatory cytokines and activity of
AChE in rats infected with T. evansi. The treatments reduced parasitic load and mortality. Therefore,
curcumin should be considered as a feeding supplement in trypanosomiasis endemic areas. / Com este trabalho, buscou-se compreender os mecanismos da patogenia do Trypanosoma evansi no
sistema nervoso central (SNC), periférico e imunológico. Para isso, foram avaliados os efeitos da
infecção por T. evansi sobre o desempenho comportamental de ratos, relacionando-os com
alterações neuroquímicas do sistema glutamatérgico e com as atividades de importantes enzimas
cerebrais como a Ca+2ATPase, a Na+/K+ATPase e a acetilcolinesterase (AChE). Avaliou-se também,
a atividade da AChE no T. evansi usando um protocolo de bioquímica, buscando discutir
algumas possibilidades de interação entre a presença desta enzima no parasita e suas possíveis
relações com o hospedeiro. Também, foi investigado o efeito in vivo da curcumina como agente
tripanocida, a fim de contribuir na busca de novas terapias. Com estes propósitos, foram
realizadas varios estudos, sendo: no artigo I buscou-se avaliar se a infecção pelo protozoário
altera o sistema colinérgico. Para isso, foram utilizados ratos experimentalmente infectados com
T. evansi e avaliada a atividade da AChE no cérebro total, no cerebelo e no sangue e a atividade
da butirilcolinesterase plasmática nos dias 3 e 5 pós infecção (pi); no artigo II tripanossomas
foram isolados por coluna de dietilaminoetilcelulose para realizar ensaios enzimáticos da
atividade da AChE no parasito; no artigo III doses diárias de Curcumina (20 ou 60 mg / kg)
diluída em óleo de milho foram administradas diariamente por via oral (gavagem) como
tratamento preventivo (30 ou 15 dias pré-infecção) e como tratamento durante quinze dias pi. Os
animais foram avaliados quanto a parasitemia, as citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α, IL-1,
IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) plasmáticas e a atividade sanguínea da AChE; no manuscrito I
foram avaliadas as alterações comportamentais (memória e ansiedade), a captação de
glutamato, atividade da AChE e das ATPases (Ca +2 e Na +, K +) nas estruturas encefálicas nos
dias 5 e 30 de ratos infectados com T. evansi. Com estes estudos, pode-se concluir que ratos
infectados com T. evansi apresentam déficit cognitivo, provavelmente causados por alterações
nos parâmetros do metabolismo energético (ATPases) e nos sistemas colinérgico e
glutamatérgico, sugerindo que as alterações observadas durante testes comportamentais
provavelmente indicam uma disfunção neuroquímica. Também foi demonstrado que é possível
detectar bioquimicamente a atividade da AChE no T. evansi e esta deve ser responsável pela
hidrólise da acetilcolina no parasita. Quando os animais infectados foram tratados com
curcumina demonstrou-se que o pré-tratamento com este composto induz efeitos
imunomodulatórios, alterando os parâmetros inflamatórios tais como as citocinas e a atividade da
AChE sanguínea. Desta forma, sugere-se que a curcumina pode ser utilizada como um
suplemento alimentar em áreas endêmicas de tripanossomíase, uma vez que reduziu a carga
parasitária e a mortalidade em ratos infectados com T. evansi, contribuindo assim com novas
alternativas de tratamento.
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Sensibilidade da enzima acetilcolinesterase (e.c. 3.1.1.7) à nicotina in vitro e in vivo / Sensitivity of the acetylcholinesterase enzyme (E.C. 3.1.1.7) at nicotine in vitro and in vivoFigueiró, Micheli 18 August 2005 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work valued the sensibility of the acetylcholinesterase from different sources and brain regions at nicotine in vitro, and the effects of the acute and subchronic exposures at the alkaloid on the brain acetylcholinesterase and serum cholinesterase activities, body weight gain and cerebral weight of female rats. The activity of cholinesterases was determined by spectrophotometric method of Ellman (1961), using acetylthiocholine as substrate. In the nicotine in vitro study, the enzymatic analysis was performed with nicotine concentrations ranging from 0 to 1 mM and substrate concentration of 0 -1 mM. In the ex vivo enzymatic assay, 0.8 mM of acetyltiocholine was used. The results regarding at the effects of the nicotine in vitro demonstrated that the enzyme activity from rat brain, human blood and purified of Electric Eel was competitively inhibited by lower nicotine concentrations. The similar effect may be due to the predominance of the G4 molecular globular form in these three sources. The acetylcholinesterase activity from brain structures: cortex, striatum, hippocampus, hypothalamus and cerebellum, was inhibited by nicotine. Considering the IC50, the inhibitory effect was similar among the structures, although the striatum and cortex enzyme seems to be more sensitive, whereas the hypothalamus seems to be less sensitive to alkaloid. The kinetics constants calculated by Michaelis-Menten methods for striatum, cortex and hypothalamus demonstrated that the nicotine induce an increase of Km and a decrease of Vmax. These results showed that the increase of the substrate concentration was not enough for to reach the original Vmax (absence of inhibitor), even in the presence of the low nicotine concentrations. The effects of ex vivo nicotine exposure were investigated after acute or subchronic alkaloid administration. Female Wistar rats with 30 days old received one dose of 0, 0.5, 1 or 5 mg/kg (i.p.) of nicotine (acute exposure) and 10 minutes later were anesthetized and killed by decapitation. Brain was removed and homogenized, the blood was colleted and both centrifuged for obtain the S1 fraction and serum, respectively. In the subchronic exposure, female Wistar rats of 30 days old received doses of 0, 0.5 or 1.0 mg/kg (s.c.) of nicotine for 15 or 30 days, administered twice a day (0, 1 or 2 mg/kg/day). The animals were weighed every two days and killed 12 h after the last injection. The brain and the blood were prepared as previously described. The results demonstrated that the cerebral AChE and serum ChE activities were not changed by acute or subchronic exposure (15 or 30 days) at nicotine. The body weight gain and the cerebral weight also were not altered by alkaloid exposure.
The absence of effect on the enzymatic activities ex vivo may be related at least the two possibilities: low levels of nicotine reached in vivo; or a possible enzymatic inhibition present in vivo induced by treatments but not apparent due to substrate excess assayed ex vivo, since the in vitro inhibitory effect of the nicotine on the AChE presents an competitive component. / Este trabalho avaliou a sensibilidade da enzima acetilcolinesterase de diferentes fontes e regiões cerebrais à nicotina in vitro, e os efeitos da exposição aguda e subcrônica ao alcalóide sobre as atividades da acetilcolinesterase cerebral e colinesterase sérica, ganho de peso corporal e peso cerebral de ratas. As atividades enzimáticas foram determinadas segundo o método espectrofotométrico de Ellman (1961), utilizando-se acetiltiocolina como substrato. No estudo in vitro, os efeitos da nicotina foram analisados em concentrações que variaram de 0 a 1 mM do alcalóide e de 0 a 1 mM de substrato. Nos ensaios enzimáticos ex vivo foram utilizadas concentrações fixas de 0,8 mM de acetiltiocolina. Os resultados referentes aos efeitos da nicotina in vitro demonstram que a atividade da enzima de cérebro de ratas, de sangue humano e purificada de órgão Elétrico de Enguia foi inibida competitivamente pelas menores concentrações de nicotina testadas. O efeito semelhante sobre as três fontes pode ser conseqüência da predominância da forma molecular G4 da enzima. A atividade da acetilcolinesterase das estruturas cerebrais: córtex, estriado, hipocampo, hipotálamo e cerebelo, mostrou-se inibida pela nicotina. De acordo com o IC50, o efeito inibitório foi similar entre as estruturas, embora a enzima de
estriado e córtex tenha sido mais sensível e a de hipotálamo menos sensível ao alcalóide. As constantes cinéticas calculadas de acordo com o método de Michaelis-Menten para estriado, córtex e hipotálamo demonstraram que a nicotina induz um aumento de Km e diminuição de Vmax. Estes resultados revelam que o aumento da concentração de substrato não foi suficiente para recuperar a velocidade da reação, mesmo na presença das menores concentrações de nicotina. Os efeitos da nicotina ex vivo foram investigados administrando-se o alcalóide aguda ou subcronicamente. Ratas Wistar com 30 dias de idade receberam uma dose de 0, 0,5, 1,0 ou 5,0 mg/kg (i.p.) de nicotina (exposição aguda) e após 10 minutos foram anestesiadas e mortas por decapitação. O cérebro foi removido e homogeneizado, o sangue coletado e ambos submetidos à centrifugação a fim de obter-se a fração S1 e soro, respectivamente. Na exposição subcrônica, ratas Wistar de 30 dias receberam doses de 0, 0,5 ou 1,0 mg/kg (s.c.) de nicotina por 15 ou 30 dias, 2 vezes ao dia (0, 1,0 ou 2,0 mg/kg/dia). Os animais foram pesados a cada 2 dias e 12 horas após a administração da última dose foram sacrificados. O cérebro e o sangue foram preparados como descrito anteriormente. Os resultados demonstram que as atividades da AChE cerebral e ChE sérica não se apresentaram modificadas pela exposição aguda ou subcrônica (15 ou 30 dias) à nicotina. O ganho de peso corporal e o peso cerebral também não foram alterados pela exposição ao alcalóide. A ausência de efeitos da nicotina sobre as atividades enzimáticas ex vivo pode estar relacionada pelo menos a duas hipóteses: níveis baixos de nicotina atingidos in vivo; ou uma possível inibição enzimática presente in vivo induzida pelos tratamentos, mas não aparente devido ao excesso de substrato ensaiado ex vivo, uma vez que o efeito inibitório da nicotina sobre a AChE in vitro possui um componente competitivo.
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EFEITO DO EXTRATO DE SYZYGIUM CUMINI, IN VITRO, NA ATIVIDADE DE ENZIMAS QUE DEGRADAM NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS DE ADENINA E ÉSTERES DE COLINA E SOBRE O PERFIL OXIDATIVO EM PACIENTES COM DIABETES MELLITUS TIPO 2 / EFFECT OF SYZYGIUM CUMINI EXTRACT, IN VITRO, ON THE ACTIVITY OF ENZYMES THAT DEGRADE ADENINE NUCLEOTIDES AND NUCLEOSIDES AND ESTERS OF CHOLINE AND ON THE OXIDATIVE PROFILE IN PATIENTS WITH TYPE 2 DIABETES MELLITUSBona, Karine Santos de 01 February 2011 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Diabetes mellitus (DM) is a metabolic disorder of multiple etiology characterized by chronic hyperglycemia resulting from deficiency of production and / or insulin action. This state of hyperglycemia may cause a variety of cardiovascular, renal, neurological and eye complications. Adenosine deaminase (ADA), ecto-5 'nucleotidase (5'NT) and Acetylcholinesterase (AChE) are important enzymes responsible for regulating the levels of adenosine (ado) and acetylcholine (ACh) respectively, and changes in their activities have been demonstrated in various diseases, including Diabetes. Syzygium cumini is a plant mostly used for the treatment of DM and presents hypoglycemic, anti-inflammatory, antipyretic and antioxidants properties. The aim of this study was to verify the effect of aqueous leaf extract of Syzygium cumini (ASc) in 100 and 200μg/mL concentrations, in vitro, on enzymes 5'NT in platelets, ADA in erythrocytes and platelets and AChE in erythrocytes, as well as on parameters of oxidative stress in samples of Type 2 diabetic patients. The results showed an increase in the activity of ADA and 5'NT in platelets from diabetic (n=30) compared to the control group (n=17), as well as in the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS). ASc at concentrations of 100 and 200 μg / mL was able to reverse these effects. Correlations between 5 NT activity and triglycerides levels, as well as between ADA activity and glucose levels were also found in this work. An increase in the activity of enzymes ADA and AChE in erythrocytes of patients with type 2 diabetes (n=30) compared to the control group (n=20), as well as changes in parameters of oxidative stress, such as increased levels of TBARS and decrease in superoxide dismutase (SOD) activity and levels of non-protein sulfhydryl groups (NP-SH) in these cells also were observed. Likewise, ASc reduced the ADA and AChE activities and lipid peroxidation, and reversed the effect of the evaluated oxidative parameters. Still, there were found significant positive correlations between levels of Vitamin C and protein sulfhydryl groups (P-SH), plasma glucose and levels of P-SH and NP-SH, levels of P-SH and ADA activity, besides a negative correlation between TBARS and NP-SH levels. Therefore, it is possible to suggest that the ASc was able to promote a compensatory response in the platelet function and may act in the maintenance of adenosine levels and vasodilatation and thereby, contributes to the maintenance of the vascular integrity which is important in the hyperglycemic state. It is also possible that ASc might modulate the levels of ACh, interfering with oxidative stress and / or inflammatory processes from the diabetic state. So far, these results confirm the already known antioxidants properties of Syzygium cumini, which makes this compound present significant effects on the cellular metabolism, as well as the reduction and prevention of cardiovascular disease risk in diabetics. / O Diabetes mellitus (DM) é uma disfunção metabólica de múltipla etiologia caracterizado por hiperglicemia crônica resultante da deficiência da produção e/ou ação da insulina. Esse estado de hiperglicemia pode provocar uma série de complicações cardiovasculares, renais, neurológicas e oculares. A adenosina deaminase (ADA), ecto-5 nucleotidase (5 NT) e acetilcolinesterase (AChE) são importantes enzimas responsáveis por regular os níveis de adenosina (ado) e acetilcolina (ACh), respectivamente, e alterações nas suas atividades têm sido demonstradas em várias doenças, incluindo o DM. O Syzygium cumini é uma das plantas mais utilizadas no tratamento do DM, apresenta propriedades hipoglicêmicas, antiinflamatórias, antipiréticas e antioxidantes. O objetivo deste estudo foi verificar o efeito do extrato aquoso das folhas de Syzygium cumini (ASc), nas concentrações de 100 e 200 μg/mL, in vitro, sobre as enzimas 5 NT em plaquetas, ADA em eritrócitos e plaquetas e AChE em eritrócitos, bem como sobre parâmetros de estresse oxidativo em amostras de pacientes diabéticos Tipo 2. Os resultados demonstraram um aumento na atividade das enzimas ADA e 5 NT em plaquetas de diabéticos (n=30) em relação ao grupo controle (n=17), assim como nos níveis de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). ASc, nas concentrações de 100 e 200 μg/mL foi capaz de reverter estes efeitos. Correlações entre a atividade da 5 NT e os níveis de triglicerídeos, bem como entre a atividade da ADA e os níveis de glicose também foram encontradas nesse trabalho. Um aumento na atividade das enzimas ADA e AChE em eritrócitos de pacientes com Diabetes tipo 2 (n=30) em relação ao grupo controle (n=20), além de alterações nos parâmetros de estresse oxidativo, como aumento nos níveis de TBARS e redução na atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD) e nos níveis de grupamentos sulfidrílicos não protéicos (NP-SH) nessas células também foram observados. Igualmente, ASc reduziu a atividade das enzimas ADA e AChE e a lipoperoxidação, e reverteu o efeito dos parâmetros oxidantes avaliados. Ainda foram encontradas correlações positivas significativas entre os níveis de Vitamina C e grupamentos sulfidrílicos protéicos (P-SH), glicose plasmática e níveis de P-SH e NP-SH, níveis de P-SH e atividade da ADA, além de correlação negativa entre os níveis de TBARS e NP-SH. Portanto, é possível sugerir que o ASc foi capaz de promover uma resposta compensatória na função plaquetária, podendo atuar na manutenção dos níveis de adenosina e na vasodilatação e, assim, contribuindo para a manutenção da integridade vascular importante no estado hiperglicêmico, tendo em vista o papel cardioprotetor exercido pela mesma. Também é possível que ASc possa modular os níveis de ACh, interferindo no estresse oxidativo e/ou nos processos inflamatórios provenientes do estado diabético. Ao mesmo tempo esses resultados corroboram com as já conhecidas propriedades antioxidantes de Syzygium cumini, o que faz com que esse composto apresente efeitos significativos no metabolismo celular, bem como na redução e prevenção do risco de doença cardiovascular em diabéticos.
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Avaliação do sistema purinérgico e colinérgico em córtex de ratos após hipóxia-isquemia neonatal / Evaluation of purinergic and cholinergic system in the cerebral cortex of rats after neonatal hypoxia-ischemiaPimentel, Victor Camera 15 March 2013 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hypoxia-ischemia (HI) neonatal is a major cause of morbidity and mortality during the perinatal period and it is an important risk factor for the development of a number of human neurological disorders, such as cerebral palsy, epilepsy, and motor and learning deficits. Cerebral HI results in hemodynamic, biochemical and neurophysiological alterations as a direct consequence of the lack of oxygen and glucose. The central nervous system presents a relatively high consumption of oxygen and glucose which relies almost exclusively on the oxidative phosphorylation process for the production of energy thus it is highly susceptible to hypoxic-ischemic insult. During the HI event, the rapid suppression in the process of oxidative phosphorylation initiates a series of poisonings that occur simultaneously and are directly related to the evolution of brain injury. Thus, knowing that the pathogenesis of neonatal HI is a highly complex and multifactorial event, this study aimed to investigate possible changes in the purinergic and cholinergic systems in the cerebral cortex of newborn rats subjected to HI, at different post-insult (immediately, 72 h and 8 days after neonatal HI),. Furthermore, analyzes were performed to assess the levels of lipid peroxidation and some peripheral markers of inflammation such as tumor necrosis factor alpha TNF-α; Interferon-gamma - IFN-γ; interleukins IL-1β and IL-6. Results demonstrated that immediately after HI, the activity of nucleotide triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) and 5 '-nucleotidase (5`-NT) cytosolic increased in the cerebral cortex. In synaptosomes, an increase in the activity of ecto-adenosine deaminase (ecto-ADA) was observed, while the activity of Na+/K+ ATPase was inhibited. There was no change in the expression of adenosine kinase (ADK). Interestingly, the Na+/K+ ATPase activity was correlated negatively with the cytosolic NTPDase activity and TBARS content. Our results showed an increase in lipid peroxidation levels immediately, 72 h and 8 days after HI. The activity of acetylcholinesterase (AChE) showed time-dependent changes in the cerebral cortex of these animals. The same was observed for AChE activity in erythrocytes and ADA. Regarding the levels of proinflammatory cytokines (TNF-α, IFN-γ, IL-1β and IL-6) investigated, all showed increased serum levels. Immediately after HI, the ADA activity showed a strong positive correlation with all cytokines analyzed. Eight days after HI there was an inflammatory process with increased activity of ADA, myeloperoxidase (MPO) and N-acetyl-glucosaminidase (NAG). In this same period, we observed that ADA1 isoenzyme was responsible for the increase in the ADA activity after HI insult. Interestingly, adenosine receptors A1 (A1Rs) and ADK protein expression showed a decrease 8 days after insult. Thus, the results described here suggest that neonatal HI alters the cholinergic and purinergic signaling in the cortex of newborn rats. However, the understanding of these events may help in the development of new therapies for hypoxic-ischemic brain injury. / A hipóxia-isquemia (HI) neonatal é uma das principais causas de morbidade e mortalidade durante o período perinatal, constituindo um fator de risco importante para o desenvolvimento de uma série de desordens neurológicas em humanos tais como, a paralisia cerebral, a epilepsia e déficits motores e de aprendizagem. A HI cerebral resulta em alterações hemodinâmicas, bioquímicas e neurofisiológicas como uma consequência direta da falta de oxigênio e glicose. O sistema nervoso central por possuir um consumo relativamente alto de oxigênio e glicose, dependendo quase que exclusivamente do processo de fosforilação oxidativa para a produção de energia, torna-se altamente suscetível ao insulto hipóxico-isquêmico. Durante o evento HI, a rápida supressão no processo de fosforilação oxidativa inicia uma série de eventos tóxicos que ocorrem simultaneamente e estão diretamente relacionados com a evolução da lesão cerebral. Assim, sabendo que a patogênese da HI neonatal é um evento multifatorial e altamente complexo, este trabalho teve como objetivo principal investigar, em diferentes tempos pós-insulto (imediatamente, 72 horas e 8 dias após a HI neonatal), as possíveis alterações nos sistemas purinérgico e colinérgico em córtex cerebral de ratos neonatos submetidos à HI. Além disso, foram realizadas análises para avaliar os níveis de peroxidação lipídica e marcadores periféricos de inflamação tais como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), o interferon gama (IFN-γ) e as interleucinas 1β e 6 (IL-1β e IL-6, respectivamente). Os resultados demonstram que imediatamente após a HI a atividade da nucleotídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase) e da 5`-nucleotidase (5`-NT) citosólicas aumentaram no córtex cerebral. Em sinaptossomas houve um aumento na atividade da ecto-adenosina desaminase (ecto-ADA), enquanto a atividade da Na+/K+ ATPase mostrou-se reduzida. Não foi observada nenhuma alteração na expressão da adenosina quinase (ADK). Interessantemente, a atividade da Na+/K+ ATPase correlacionou-se negativamente com a atividade da NTPDase citosólica e com os níveis de peroxidação lipídica. Nossos resultados demonstraram um aumento nos níveis de peroxidação lipídica imediatamente após o insulto, os quais foram mantidos 72 horas e 8 dias após a HI. A atividade da acetilcolinesterase (AChE) mostrou alterações tempo-dependente no córtex cerebral destes animais. O mesmo foi observado para a atividade da AChE e da ADA em eritrócitos. Quando os níveis das citocinas pró-inflamatórias (TNF-α; IFN-γ; IL-1β e IL-6) que foram investigadas, todas apresentaram seus níveis séricos aumentados. Imediatamente após a HI, a atividade da ADA apresentou uma forte correlação positivas com todas as citocinas analisadas. 8 dias após a HI observou-se um processo inflamatório com aumento da atividade da ADA, mieloperoxidase e N-acetil-β-D-glucosaminidase. Neste mesmo período, podemos evidenciar que a ADA1 é a isoenzima responsável pelo aumento da ativada da ADA neste momento pós-insulto. Interessantemente, observamos uma redução na expressão dos receptores de adenosina A1 (A1Rs) sem alteração na expressão da adenosina quinase (ADK). Assim, os resultados descritos aqui sugerem a HI neonatal altera a sinalização purinérgica e a atividade da acetilcolinesterase em córtex cerebral de ratos neonatos. Além disso, possibilitará uma melhor compreensão dos eventos que se inciam com o evento HI, e consequentemente auxiliaram na busca e desenvolvimento de novas terapias para a lesão cerebral hipóxico-isquêmica.
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Développement d'une procédure originale pour la multi-détection de composés toxiques utilisant des biocapteurs à base d'acétylcholinestérase / Development of an original procedure for toxic compounds multi-detectionusing an acetylcholinesterase-based biosensorsStepurska, Kateryna 03 June 2016 (has links)
Les travaux présentés dans ce manuscrit concernent le développement d‘une approche originale permettant la détermination de plusieurs composés (principalement aflatoxines et pesticides organophosphorés), à l‘aide de biocapteurs électrochimiques basés sur l‘inhibition de l‘acétylcholinestérase. Dans un premier temps, un nouveau biocapteur potentiométrique utilisant des transistors à effet de champ sensibles au pH (pH-FETs) comme transducteurs a été développé pour la détermination de l‘aflatoxine B1 (AFB1) et différent paramètres d‘élaboration et de fonctionnement du biocapteur ont été optimisés. Le biocapteur proposé est caractérisé par une stabilité opérationnelle élevée and bonne reproductibilité du signal en cours d‘utilisation et de stockage. Le biocapteur a ensuite été évalué pour l‘analyse d‘échantillons réels (blé, sésame, noix et pois) et une simulation mathématique de la réponse du biocapteur potentiométrique à l‘AFB1 a été proposée pour la première fois et validée. Dans un deuxième temps, un biocapteur conductimétrique utilisant des microélectrodes interdigitées en or a été développé. La sensibilité de ce biocapteur aux aflatoxines ainsi qu‘à d‘autres classes de substances toxiques, tels que les pesticides organophosphorés, les métaux lourds, les glycoalkaloïdes, et les surfactants, a été déterminée. Une nouvelle procédure originale, permettant la détermination sélective de toxines multiclasses par application successive de solutions de réactivation visant spécifiquement des inhibiteurs irréversibles ou réversibles, a été finalement proposée. En utilisant cette méthode, il a été montré que les biocapteurs enzymatiques pouvaient être appliqués à l‘analyse des aflatoxines et des pesticides organophosphorés, ainsi qu‘à la détermination de la toxicité globale des échantillons / Investigations reported in this manuscript are focused on the development of an original approach for the detection of several toxic compounds, mainly aflatoxins and organophosphorus pesticides, using acetylcholinesterase (AChE)-based inhibitory electrochemical biosensors. In a first step, a new potentiometric biosensor using pH Sensitive Field-Effect Transistors (pH-FETs) as transducers was investigated for aflatoxin B1 (AFB1) determination and different elaboration and working parameters were optimized. The proposed biosensor was characterized by high operational stability and reproducibility of the signal during the work as well as during the storage. The biosensor was further evaluated for real samples analysis (wheat, sesame, walnuts and peas) and a mathematical simulation of the potentiometric biosensor response to aflatoxin B1 was proposed for the first time and validated. In a second step, a conductometric biosensor using interdigitated gold microelectrodes was developed. The sensitivity of the biosensor to aflatoxins and other classes of toxic substances, such as organophosphorus pesticides, heavy metals ions, glycoalkaloids, and surfactants, was determined. A new and original procedure, enabling the selective determination of multiclass toxins by applying successive reactivation solutions targeting either irreversible or reversible inhibitors, was finally proposed. Using this method, the electrochemical enzyme inhibitory biosensors could be applied to the analysis of aflatoxins and organophosphorus pesticides, as well as for the determination of total toxicity of the samples
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Collagen XIII as a neuromuscular synapse organizer:roles of collagen XIII and its transmembrane form, and effects of shedding and overexpression in the neuromuscular system in mouse modelsHärönen, H. (Heli) 02 January 2018 (has links)
Abstract
Collagen XIII is a transmembrane protein consisting of intracellular, transmembrane and extracellular domains. The latter can be cleaved by proteases of the furin family at the plasma membrane and in the trans-Golgi network. Both the transmembrane and shed collagen XIII are expressed at the neuromuscular junctions of mice and humans. Such motor synapse passes the contraction signal from the central nervous system to the muscles and brings about all voluntary movements. Loss of both forms of collagen XIII in mice and loss-of-function mutations in the COL13A1 gene in humans leads to congenital myasthenic syndrome characterized by decreased neuromuscular transmission and muscle weakness.
To study the roles of the two collagen XIII forms, a novel mouse line was engineered to harbor only the transmembrane collagen XIII by mutating the furin cleavage site. Transmembrane collagen XIII was discovered to be sufficient to prevent adhesion defects, Schwann cell invagination, the ineffective vesicle accumulation and dispersion of both acetylcholinesterase and acetylcholine receptors, phenotypes seen in the complete lack of collagen XIII. On the other hand, lack of shedding led to acetylcholine receptor fragmentation, aberrantly increased neurotransmission and presynaptic complexity. Remarkably, in vivo and in vitro interaction of collagen XIII and acetylcholinesterase-anchoring ColQ was detected. Furthermore, muscle and neuromuscular junction phenotype in the lack of both forms of collagen XIII closely resembled those in the human patients harboring mutations in the COL13A1 gene and these mice were validated as a good model for studying the human disease. Misexpression of collagen XIII was studied with mice exhibiting transgenic overexpression of the protein. Overexpression of collagen XIII was detected to be mostly extrasynaptic in the muscles of such mice. Exogenous collagen XIII was found at the myotendinous junctions, tenocytes and fibroblast-like cells, in addition to some localization in the near vicinity of the neuromuscular junctions. Collagen XIII expression was found, for the most part, to be normal at the neuromuscular junctions, although some were devoid of collagen XIII. The neuromuscular junction phenotype resembled in many ways the findings made in the lack of collagen XIII. Furthermore, acetylcholine receptor and nerve pattern was discovered to be widened. / Tiivistelmä
Kollageeni XIII on solukalvoproteiini, jonka rakenne koostuu solunsisäisestä, solukalvon läpäisevästä ja solun ulkoisesta osasta, joka pystytään entsymaattisesti irrottamaan solukalvoilta. Täten se esiintyy kahdessa eri muodossaan; solukalvomuotoisena ja soluvälitilan lihasperäisenä proteiinina hiirten ja ihmisten hermolihasliitoksessa. Tässä motorisessa synapsissa keskushermostosta peräisin oleva lihaksen supistumiskäsky välittyy lihakseen ja aikaan saa tahdonalaiset liikkeet. Molempien kollageeni XIII:n muotojen puute hiirillä ja COL13A1 geenin mutaatiot ihmisillä johtavat synnynnäiseen myasteeniseen oireyhtymään, jossa heikentynyt hermolihasliitoksen toiminta johtaa lihasheikkouteen.
Kollageeni XIII:n eri muotojen hermolihasliitosvaikutusten selvittämiseksi luotiin hiirilinja, jossa kollageeni XIII ilmenee geneettisen manipulaation seurauksena ainoastaan solukalvomuodossaan. Tutkimukset osoittivat solukalvomuotoisen kollageeni XIII:n tarvittavan hermon ja lihaksen kiinnittymiseen toisiinsa, hermovälittäjäainerakkuloiden ankkuroimiseen hermopäätteeseen, estämään Schwannin solujen tunkeutuminen synapsirakoon, asetyylikoliiniesteraasin sitomiseen ja asetyylikoliinireseptorien vakaantumiseen. Soluvälitilan kollageeni XIII:n puutos puolestaan johti lihaksen puolen liitoksen pirstaloitumiseen sekä hermopäätteiden liialliseen kasvuun ja aktiivisuuteen. Kollageeni XIII todettiin sitoutuvan asetyylikoliiniesteraasia hermolihasliitokseen ankkuroivan kollageeni Q:n kanssa. Lisäksi molempien kollageeni XIII:n muotojen suhteen poistogeenisten hiirten hermolihas- ja lihaslöydökset todettiin muistuttavan COL13A1 geenin mutaatioista kärsivien ihmisten vastaavia löydöksiä todistaen nämä hiiret hyväksi tautimalliksi tulevaisuuden hoitomuotojen suunnitteluun.
Kollageeni XIII:n ylimäärän vaikutusta hermolihasliitokseen ja lihaskudokseen tutkittiin kollageeni XIII:a ylenmäärin ilmentävillä hiirillä. Kollageeni XIII todettiin ilmentyvän ylenmäärin lihaksessa fibroblastinkaltaisissa soluissa, lihasjänneliitoksessa ja hermolihasliitoksen lähettyvillä, mutta ei hermolihasliitoksessa. Osa hermolihasliitoksista näissä hiirissä ilmensi jopa vähemmän kollageeni XIII:a kuin normaalisti. Asetyylikoliinireseptorien ja hermojen valtaama alue todettiin leventyneeksi ja hermolihasliitoslöydökset muistuttivat molempien kollageeni XIII:n muotojen suhteen poistogeenisien hiirten löydöksiä.
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Exploring non-covalent interactions between drug-like molecules and the protein acetylcholinesterase / En studie av icke-kovalenta interaktioner mellan läkemedelslika molekyler och proteinet acetylkolinesterasBerg, Lotta January 2017 (has links)
The majority of drugs are small organic molecules, so-called ligands, that influence biochemical processes by interacting with proteins. The understanding of how and why they interact and form complexes is therefore a key component for elucidating the mechanism of action of drugs. The research presented in this thesis is based on studies of acetylcholinesterase (AChE). AChE is an essential enzyme with the important function of terminating neurotransmission at cholinergic synapses. AChE is also the target of a range of biologically active molecules including drugs, pesticides, and poisons. Due to the molecular and the functional characteristics of the enzyme, it offers both challenges and possibilities for investigating protein-ligand interactions. In the thesis, complexes between AChE and drug-like ligands have been studied in detail by a combination of experimental techniques and theoretical methods. The studies provided insight into the non-covalent interactions formed between AChE and ligands, where non-classical CH∙∙∙Y hydrogen bonds (Y = O or arene) were found to be common and important. The non-classical hydrogen bonds were characterized by density functional theory calculations that revealed features that may provide unexplored possibilities in for example structure-based design. Moreover, the study of two enantiomeric inhibitors of AChE provided important insight into the structural basis of enthalpy-entropy compensation. As part of the research, available computational methods have been evaluated and new approaches have been developed. This resulted in a methodology that allowed detailed analysis of the AChE-ligand complexes. Moreover, the methodology also proved to be a useful tool in the refinement of X-ray crystallographic data. This was demonstrated by the determination of a prereaction conformation of the complex between the nerve-agent antidote HI-6 and AChE inhibited by the nerve agent sarin. The structure of the ternary complex constitutes an important contribution of relevance for the design of new and improved drugs for treatment of nerve-agent poisoning. The research presented in the thesis has contributed to the knowledge of AChE and also has implications for drug discovery and the understanding of biochemical processes in general.
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