No description available.

Memory of chirality (MOC) is an emerging strategy for asymmetric synthesis which relies upon the intermediacy of transiently non-racemic reactive species. In these reactions the configuration of the sole stereogenic center of the enantiopure starting material is "memorized" by a chiral non-racemic conformation in the intermediate; trapping then captures the stereochemical information, and generates a new stereogenic center with high fidelity. We experimentally and computationally studied the highly retentive deprotonation/alkylations of 1,4-benzodiazepin-2-ones (BZDs) that rely upon this strategy. We captured a transiently non-racemic BZD enolate intermediate in enantiopure form, then released the enolate and observed its subsequent reaction. This approach allowed the first ever step-wise observation of the stereochemical course of such a MOC process. Approximately 2 million deaths are caused by malaria every year in the world. In total roughly 3.2 billion people are living under the risk of malaria transmission. Current use of anticholinesterase insecticides has been limited by their toxicity to human beings. A major African malaria insect vector, Anopheles gambiae (Ag), was targeted. Based on sequence alignment and homology models of AgAChE, a strategy of dual-site binding was adopted that targets Trp84 in the active site and Cys286 at the peripheral site. Selective AChE inhibitors have been designed and synthesized. / Ph. D.

Worldwide, malaria is one of the deadliest diseases. In 2016 it sickened 216 million people and caused 445,000 deaths. In order to control the spread of this deadly diseases to human, we can either target the mosquito vector (Anopheles gambiae) or the parasite (Plasmodium falciparum). Due to recent emergence of resistance to current insecticides and antimalarial drugs there is a pressing need to discover and develop new agents that engage new targets in these organisms. To circumvent the effect of resistance to pyrethroid insecticides on the efficacy of insecticide treated nets (ITNs), the use of acetylcholinesterase (AChE) inhibitors on ITNs has drawn attention. In the first project, we explored a small library of γ- substituted oxoisoxazole- 2(3H)-carboxamides and isoxazol-3-yl carbamates, and nitriles as AChE inhibitors targeting wild- type (G3) and resistant (Akron) An. gambiae mosquito. In total 23 compounds were synthesized and evaluated. Both carbamates and carboximides with a 2-cyclopropylethyl side chain (1-87a and 1-88a) were extremely toxic to Akron mosquitos, yet these compounds did not exhibit appreciable selectivity between human and An. gambiae AChE. Unfortunately, none of the nitriles showed appreciable toxicity to G3 strain of the mosquitoes, nor did they inhibit An. gambiae AChE. In the second project, conducted in collaboration with Professor Michael Klemba, we focused on the mode of action of an established antimalarial drug, Mefloquine (MQ). Dr. Klemba's recently developed amino acid efflux assay was used to determine the effect of MQ and its open-ring analogs on hemoglobin endocytosis and catabolism in P. falciparum-infected erythrocytes. In total 26 MQ analogs were synthesized and 18 were studied in depth to determine their potency to inhibit leucine (Leu) efflux and parasite growth (SYBR Green). An excellent correlation (R² = 0.98) over nearly 4 log units was seen for these 18 compounds in the two assays. These data are consistent with the hypothesis that the antimalarial action of these compounds principally derives from inhibition of hemoglobin endocytosis. After this observation, a number of photo-affinity probes were designed and synthesized in hopes of isolating the molecular target of MQ. These analogs are currently being used by Dr. Klemba in pull-down experiments. In the third project, conducted in collaboration with Professor Belen Cassera, we sought to optimize a new antimalarial drug lead that would circumvent current resistance mechanisms. In Plasmodium parasites, the methylerythritol phosphate (MEP) pathway is known to be essential for its growth. This pathway is absent in humans, presenting the opportunity to develop potentially safe and effective therapeutic candidates. Previous work in the Cassera and Carlier lab had established that MMV008138 was the only compound in the Malaria Box that targeted the MEP pathway and that it was (1R,3S)-configured. My research expanded previous efforts in the Carlier group and produced synthesis of 73 analogs of MMV008138 (3-21a'1) that were tested for growth inhibition. These analogs featured variation at the A-, B-, C- and D-ring. In the process, a novel Pictet-Spengler ring expansion reaction of ortho-substituted acetphenones was discovered. The ring-expanded products were identified by means of 1D and 2D NMR experiments, HRMS, and X-ray crystallography. Among the 73 analogs prepared, four compounds showed similar growth inhibition potency to the lead 3-21a'1. In particular, the methoxyamide 3-80a, and the fluorinated A-ring analogs 3-124a, 3-124c and 3-124d all showed excellent (500-700 nM) growth IC₅₀ values against P. falciparum. All four showed full rescue upon co-application of IPP (200 μM), confirming that they target the MEP pathway. ADME-Tox evaluation of these new analogs will soon be underway. / PHD

La acetilcolinesterasa (AChE) hidroliza el neurotransmisor acetilcolina. La enzima se presenta en distintas formas moleculares. Tetrámeros hidrofílicos de AChE de suero fetal bovino se purificaron, sometieron a un tratamiento químico desnaturalizante o reductor, y estudiaron mediante análisis de sedimentación, cromatografía, fluorescencia intrínseca y unión de sondas hidrofóbicas. La transformación de los tetrámeros hidrofílicos en dímeros y monómeros anfifílicos demostró la alta flexibilidad conformacional de las subunidades de AChE, lo que podría ser crucial en la síntesis del conjunto completo de sus formas moleculares, y aportó una explicación de cómo algunas de sus formas interaccionan con las membranas. Para entender la heterogeneidad molecular de la AChE, también se empleó el anticuerpo AE-1, que interaccionó de forma desigual con oligómeros y monómeros de AChE de distintas fuentes. Experimentos de Western blot demostraron que el epítopo de AE-1 es de naturaleza confor macional. Finalmente, los datos experimentales descartaron la fosforilación de la AChE con proteína quinasa A. / Acetylcholinesterase (AChE) hydrolyzes the neurotransmitter acetylcholine. The enzyme exists in several molecular forms. AChE hydrophilic tetramers from fetal bovine serum were purified, chemically denatured or reduced, and studied by sedimentation analysis, hydrophobic chromatography, intrinsic fluorescence spectra and binding of amphiphilic probes. Conversion of the hydrophilic tetramers into amphiphilic dimers and monomers showed that AChE subunits possess a flexible conformation, which may be important for generating a full set of molecular forms, and gave an explanation of the interaction of certain AChE forms with membranes. Another approach to determine the molecular basis for the structural heterogeneity of AChE was to use the antibody AE-1, which distinctly reacted with AChE oligomers and monomers from different sources. The results of Western blot revealed that the determinant for AE-1 consisted of a conformational domain, not a primary sequence region. Finally, the experimental data rejected the phosphorylation of AChE at non-consensus protein kinase A sites.

Ο εγκέφαλος των θηλαστικών είναι αρκετά ευάλωτος στις επιδράσεις περιβαλλοντικών τοξινών, λόγω των ιδιαίτερων δομικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του. Η έκθεση σε μια νευροτοξίνη εκδηλώνεται συνήθως μέσω γνωστικών και συμπεριφορικών διαταραχών, που συνοδεύουν δυσμενείς νευροχημικές αλλαγές και καθορίζονται από το είδος, την ηλικία, το φύλο, το γενετικό προφίλ, τη δόση, την οδό και τη χρονική περίοδο έκθεσης. Ωστόσο, η χρόνια έκθεση σε ένα νευροτοξικό παράγοντα είναι δυνατόν να επάγει μη αναστρέψιμη νευρωνική βλάβη και εκφύλιση. Το αργίλιο (Al), που συνιστά το τρίτο σε αφθονία στοιχείο στη φύση, ασκεί ποικίλες νευροτοξικές επιδράσεις, ανάλογα με τη χημική μορφή του μετάλλου, τη δόση, την οδό και την περίοδο έκθεσης, ενώ αμφιλεγόμενη παραμένει η εμπλοκή του στην παθογένεια της νόσου του Alzheimer. Η αφλατοξίνη Β1 (AFB1) ανήκει στην ομάδα των μυκοτοξινών (δευτερογενής μεταβολίτης των μυκήτων του γένους Aspergillus), μολύνει καλλιέργειες και ζωοτροφές και αποτελεί ισχυρή ηπατοτοξίνη και ηπατοκαρκινογόνο. Εντούτοις, η νευροτοξικότητα της AFB1 είναι ελάχιστα μελετημένη και οι λίγες αναφορές που παρουσιάζουν την εκδήλωση συμπεριφορικών διαταραχών, αφορούν την έκθεση σε αναπτυξιακό στάδιο. Εκτενής και εντατική είναι τις τελευταίες δεκαετίες η έρευνα της νευροπροστατευτικής δράσης φαρμακευτικών φυτών και των βιοδραστικών συστατικών τους, με απώτερο στόχο την πρόληψη ή αντιμετώπιση της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας που επάγεται από γενετικούς ή/και περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ενδιαφέρον για τον ελλαδικό χώρο, λόγω της υψηλής εμπορικής του αξίας, έχει το καλλιεργούμενο φυτικό είδος Crocus sativus L., του οποίου οι στύλοι (κρόκος ή σαφράν) χρησιμοποιούνται στη διατροφή ως άρτυμα και η φαρμακευτική τους αξία έχει αναγνωριστεί εδώ και χιλιετίες. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να συμβάλλει στην έρευνα της νευροτοξικής δράσης του Al και της AFB1 και του νευροπροστατευτικού ρόλου των στύλων του C. sativus, εστιάζοντας σε παραμέτρους της μνημονικής λειτουργίας ενηλίκων μυών, της χολινεργικής/μονοαμινεργικής διαβίβασης και της οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου τους. ΜΕΘΟΔΟΙ: Σε αρσενικούς ενήλικες Balb-c μύες (n=7-10/ομάδα) χορηγήθηκε δια στόματος AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) διαλυμένο στο κανονικό πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες ή ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) AFB1 (0.3 και 0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) για 4 ημέρες. Η ικανότητα εκχυλισμάτων των στύλων του C. sativus και της κροκετίνης, του κύριου βιοδραστικού μεταβολίτη των καροτενοειδών συστατικών (κροκίνες) του κρόκου, να προλαμβάνουν ή να ανατρέπουν τις βλαπτικές επιδράσεις του Al και της AFB1 στον εγκέφαλο των μυών, διερευνήθηκε ακολουθώντας τα εξής σχήματα χορήγησης: α) υδατικό/μεθανολικό εκχύλισμα κρόκου (60 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. τις τελευταίες 6 ημέρες της περιόδου χορήγησης του AlCl3 (50 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα στο πόσιμο νερό για 5 εβδομάδες), β) αφέψημα κρόκου (0.45 mg/mL) καταναλώθηκε για 2 εβδομάδες πριν τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. τις τελευταίες 4 ημέρες της περιόδου χορήγησης του αφεψήματος), και γ) καθαρή κροκετίνη (4 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα) χορηγήθηκε i.p. για 3 ημέρες πριν ή μετά τη χορήγηση AFB1 (0.6 mg/kg σωματικού βάρους/ημέρα i.p. για 4 ημέρες). Μελετήθηκαν επίσης, οι επιδράσεις των προηγούμενων σχημάτων χορήγησης του αφεψήματος κρόκου και της κροκετίνης στον εγκέφαλο υγιών ενηλίκων μυών. Η ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών αξιολογήθηκε με τη δοκιμασία παθητικής αποφυγής. Η ενεργότητα της ακετυλοχολινεστεράσης [AChE, διαλυτές σε άλας (SS)/απορρυπαντικό (DS) ισομορφές], της βουτυρυλοχολινεστεράσης (BuChE, SS/DS ισομορφές) και της μονοαμινοξειδάσης (ΜΑΟ, -Α και -Β ισομορφές) προσδιορίστηκαν στον ολικό εγκέφαλο (-ce, πλην παρεγκεφαλίδας) και την παρεγκεφαλίδα, ως δείκτες της χολινεργικής και μονοαμινεργικής διαβίβασης, αντιστοίχως. Επίσης, μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), ως δείκτες της λιπιδικής υπεροξείδωσης και της αντιοξειδωτικής άμυνας, αντιστοίχως, των εγκεφαλικών ιστών. Με τη χρήση φασματομετρίας ατομικής απορρόφησης μετρήθηκαν τα επίπεδα Al στους εγκεφαλικούς ιστούς, ενώ, για πρώτη φορά, η κροκετίνη προσδιορίστηκε στον ολικό εγκέφαλο (-ce) των μυών μετά την i.p. χορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, με HPLC ανάλυση. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η μακρόχρονη πρόσληψη υψηλής δόσης AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού οδήγησε σε εξασθένηση της μάθησης/μνήμης των μυών, σημαντική μείωση της ενεργότητας της AChE και BuChE, αύξηση της ενεργότητας των ισομορφών της ΜΑΟ του ολικού εγκεφάλου (-ce), αλλά αναστολή της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας, σημαντική αύξηση των επιπέδων MDA στον εγκέφαλο και μείωση της συγκέντρωσης GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Συσσώρευση του μετάλλου καταγράφηκε στους εγκεφαλικούς ιστούς των μυών που λάμβαναν AlCl3. Μνημονικό έλλειμμα εμφάνισαν οι μύες που έλαβαν την υψηλή (0.6 mg/kg) αλλά όχι χαμηλή δόση (0.3 mg/kg) AFB1. Επίσης, η βραχύχρονη i.p. χορήγηση της μυκοτοξίνης ανέστειλε τις χολινεστεράσες (ChEs), ενεργοποίησε τη ΜΑΟ, αύξησε σημαντικά τη λιπιδική υπεροξείδωση και μείωσε τα επίπεδα GSH στους εγκεφαλικούς ιστούς. Ωστόσο, διαφορική απόκριση στην έκθεση στην AFB1 παρουσίασαν οι ισομορφές της BuChE και ΜΑΟ των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χορηγούμενη δόση. Αντιχολινεστερασική και αντιοξειδωτική δράση επέδειξαν τόσο η μακρόχρονη πρόσληψη αφεψήματος κρόκου όσο και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση κροκετίνης στους εγκεφαλικούς ιστούς των υγιών μυών, ενώ δεν μετέβαλλαν τη μνημονική τους ικανότητα. Η βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου στο τέλος της περιόδου πρόσληψης AlCl3, αν και δεν είχε καμία επίδραση στη γνωστική ικανότητα των μυών, αντέστρεψε σημαντικά τις επαγόμενες από το Al αλλαγές της ενεργότητας της ΜΑΟ και των επιπέδων MDA και GSH των εγκεφαλικών ιστών. Επιπλέον, η ενεργότητα των ισομορφών της AChE των εγκεφαλικών ιστών μειώθηκε περαιτέρω σημαντικά μετά τη χορήγηση του εκχυλίσματος. HPLC ανάλυση του ολικού εγκεφάλου (-ce) των μυών αποκάλυψε, για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, την παρουσία κροκετίνης μετά τη βραχύχρονη συγχορήγηση εκχυλίσματος κρόκου, η οποία δεν ανιχνεύτηκε στους μύες μάρτυρες. Η μακρόχρονη καθημερινή κατανάλωση αφεψήματος κρόκου πριν την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 απέτρεψε την επαγόμενη από τη μυκοτοξίνη μνημονική εξασθένηση, αναστολή της DS-BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Α του εγκεφάλου και της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και οξειδωτική βλάβη των λιπιδίων στους εγκεφαλικούς ιστούς. Επίσης, οι μύες που κατανάλωναν το αφέψημα εμφάνισαν περαιτέρω σημαντική μείωση της ενεργότητας των ισομορφών της AChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), της DS-AChE της παρεγκεφαλίδας και των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών. Αν και η βραχύχρονη i.p. χορήγηση καθαρής κροκετίνης πριν ή μετά την έκθεση σε υψηλή δόση AFB1 δεν επηρέασε την ικανότητα μάθησης/μνήμης των μυών, έδρασε αποτελεσματικά στην πρόληψη ή αντιστροφή της επαγόμενης από τη μυκοτοξίνη αναστολής της BuChE του ολικού εγκεφάλου (-ce), ενεργοποίησης των ισομορφών της ΜΑΟ του εγκεφάλου και αύξησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης των εγκεφαλικών ιστών. Ωστόσο, μόνο η προηγηθείσα χορήγηση κροκετίνης απέτρεψε την αύξηση της ενεργότητας της ΜΑΟ-Β της παρεγκεφαλίδας και τη μείωση των επιπέδων GSH των εγκεφαλικών ιστών, που προκάλεσε η χορήγηση της AFB1. Διαφορική απόκριση (περαιτέρω αναστολή ή αύξηση) στη χορήγηση κροκετίνης εμφάνισαν οι ισομορφές της AChE των εγκεφαλικών ιστών, ανάλογα με τη χρονική ακολουθία της χορήγησης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ: Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η μακρόχρονη πρόσληψη AlCl3 μέσω του πόσιμου νερού και η βραχύχρονη συστημική έκθεση στην AFB1 ασκούν ισχυρές νευροτοξικές επιδράσεις στους ενήλικες μύες, όπως απέδειξαν η επαγωγή μνημονικής εξασθένησης και οι νευροχημικές διαταραχές. Η αναστολή του γνωστικού ελλείμματος από τη μακρόχρονη κατανάλωση αφεψήματος κρόκου, υποστηρίζει τη νευροπροστατευτική δράση του κρόκου έναντι της νευροτοξικότητας της AFB1 και τον αναδεικνύει ως ελπιδοφόρο διατροφικό παράγοντα στην πρόληψη της εγκεφαλικής δυσλειτουργίας. Ωστόσο, οι ευεργετικές επιδράσεις της κροκετίνης στους νευροχημικούς δείκτες της εγκεφαλικής λειτουργίας υπό συνθήκες τοξικότητας και η απόδειξη της βιοδιαθεσιμότητάς της στον εγκέφαλο, προτείνουν τη συμβολή των καροτενοειδών συστατικών του κρόκου στις νευροπροστατευτικές του ιδιότητες και ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνησή τους ως νευροπροστατευτικών παραγόντων. / Mammalian brain is quite susceptible to environmental toxins, due to its special structural and functional features. Exposure to a neurotoxin is commonly manifested through cognitive and behavioral disturbances that follow adverse neurochemical changes and are defined by the animal species in question, the age, the gender, the genetic profile, the dose, the route and the period of exposure. However, chronic exposure to a neurotoxic agent may induce irreversible neuronal damage and degeneration. Aluminum (Al), which is the third most abundant element in nature, exerts diverse neurotoxic effects, depending on the metal’s chemical form, the dose, the route and the period of exposure, while its implication in the pathogenesis of Alzheimer’s disease remains controversial. Aflatoxin B1 (AFB1) is classified to the group of mycotoxins (secondary metabolite of the fungi of Aspergillus sp.), contaminates crops and feeds and constitutes potent hepatotoxin and hepatocarcinogen. Nevertheless, AFB1 neurotoxicity is poorly studied and the few reports focus on the manifestation of behavioral disorders after exposure at developmental stage. During the last decades, extensive research on the neuroprotective action of medicinal plants and their bioactive components is carried out, with the aim of prevention or treatment of brain dysfunction that is provoked by genetic and/or environmental agents. The plant Crocus sativus L. is of particular interest in Greece ,due to its large-scale cultivation and the high commercial value of its styles (saffron); saffron is used as a spice in diet and its medicinal properties have been recognized for millenia. The aim of the present study was to contribute to the investigation of the neurotoxic activity of Al and AFB1 and the neuroprotective role of saffron, focusing on aspects of memory function, brain cholinergic/monoaminergic transmission and oxidant/antioxidant state in adult mice. METHODS: Male adult Balb-c mice (n=7-10/group) received either AlCl3 orally (50 mg/kg body weight/day) dissolved in normal drinking water for 5 weeks or AFB1 intraperitoneally (i.p.) (0.3 and 0.6 mg/kg body weight/day) for 4 days. The potential of saffron extracts and crocetin, the main bioactive metabolite of saffron carotenoid constituents (crocins), in prevention or reversal of the detrimental effects of Al and AFB1 on mouse brain, was investigated by adopting the following administration schemes: a) aqueous methanolic extract of saffron (60 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for the last 6 days of AlCl3 treatment period (50 mg/kg body weight/day in drinking water for 5 weeks), b) saffron infusion (0.45 mg/mL) was consumed for 2 weeks prior to AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for the last 4 days of saffron infusion treatment period), and c) pure crocetin (4 mg/kg body weight/day) was administered i.p. for 3 days before or after AFB1 administration (0.6 mg/kg body weight/day i.p. for 4 days). The effects of the previous administration schemes of saffron infusion and crocetin on brain of healthy adult mice, were also studied. The learning/memory ability of mice was evaluated by step-through passive avoidance task. The activity of acetylcholinesterase [AChE, salt-(SS)/detergent-soluble (DS) isoforms], butyrylcholinesterase (BuChE, SS/DS isoforms) and monoamine oxidase (MAO, -A and -B isoforms) was assessed in whole brain (-ce, minus cerebellum) and cerebellum, as indices of cholinergic and monoaminergic transmission, respectively. Moreover, malondialdehyde (MDA) and reduced glutathione (GSH) concentrations were determined as indices of lipid peroxidation and antioxidant defence, respectively, in cerebral tissues. Cerebral tissues’ Al levels were measured by atomic absorption spectrometry, while, for the first time, crocetin was determined in mouse whole brain (-ce) after i.p. administration of saffron extract by HPLC analysis. RESULTS: Long-term intake of high dose of AlCl3 through drinking water resulted in learning/memory impairment of mice, significant reduction of AChE and BuChE activity, increase of MAO isoforms’ activity in whole brain (-ce), but inhibition of cerebellar MAO-B, significant elevation of brain MDA levels and decrease of GSH content in cerebral tissues. Metal accumulation was recorded in brain tissues of AlCl3 treated mice. Mice receiving high (0.6 mg/kg) but not low dose (0.3 mg/kg) of AFB1 displayed memory deficit. Furthermore, short-term i.p. administration of mycotoxin inhibited cholinesterases (ChEs), activated MAO, increased significantly lipid peroxidation and reduced GSH levels in cerebral tissues. However, brain tissues’ BuChE and MAO isoforms presented differential response to AFB1 exposure, depending on the administered dosage. Both long-term saffron infusion intake and short-term i.p. administration of crocetin exerted anti-cholinesterase and antioxidant action in healthy mice’ cerebral tissues, while their memory performance remained unchanged. Although short-term co-administration of saffron extract at the end of AlCl3 treatment period had no effect on cognitive capacity of mice, it reversed significantly the Al-induced changes in MAO activity and the levels of MDA and GSH of cerebral tissues. Moreover, cerebral AChE isoforms’ activity was further significantly decreased following saffron extract co-administration. HPLC analysis of mouse whole brain (-ce) revealed, for the first time, the presence of crocetin after short-term saffron extract co-administration, which was not detected in control mice. Long-term daily consumption of saffron infusion prior to AFB1 (high dose) exposure prevented the mycotoxin-induced memory impairment, inhibition of whole brain (-ce) DS-BuChE, increase of brain MAO-A and cerebellar MAO-B activity, and oxidative damage of lipids in brain tissues. Also, saffron infusion pre-treated mice displayed further significant decrease of the activity of AChE isoforms in whole brain (-ce), DS-AChE in cerebellum and the levels of GSH in cerebral tissues. Although, short-term i.p. administration of pure crocetin before or after AFB1 (high dose) exposure had no effect on learning/memory ability of mice, it effectively prevented or reversed the mycotoxin-induced inhibition of whole brain (-ce) BuChE, activation of brain MAO isoforms and elevation of cerebral tissues’ lipid peroxidation. However, only crocetin pre-treatment inhibited the increase of cerebellar MAO-B activity and reduction of brain tissues’ GSH content which were provoked by AFB1 administration. Cerebral tissues’ AChE isoforms presented differential response (further decrease or increase) to crocetin treatment, depending on time course of administration. CONCLUSION: The findings of the present study show that long-term intake of AlCl3 through drinking water and short-term systemic exposure to AFB1, exert strong neurotoxic effects on adult mice, as evidenced by the induction of memory impairment and the neurochemical disturbances. The inhibition of cognitive deficit by long-term saffron infusion consumption supports its neuroprotective action against AFB1 neurotoxicity and highlights saffron as a promising dietary agent in prevention of brain dysfunction. However, the beneficial effects of crocetin on neurochemical indices of brain function under toxicity and the demonstration of its bioavailability in brain, suggest the contribution of saffron carotenoids in saffron’s neuroprotective properties and encourage their further investigation as neuroprotective agents.

Στόχος: Η νόσος του Alzheimer (ΝΑ) είναι η πιο κοινή μορφή άνοιας, η παθολογία της οποίας χαρακτηρίζεται εν μέρει από την εναπόθεση ινιδίων που σχηματίζονται από την αμυλοειδική πρωτεΐνη β (Αβ), τα οποία οδηγούν στην καταστροφή των χολινεργικών νευρώνων, πρωτίστως στον εγκεφαλικό φλοιό και τον ιππόκαμπο. Η εκτεταμένη αυτή απώλεια των νευρώνων είναι προοδευτική και έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή γνωστικών εγκεφαλικών λειτουργιών και τη δημιουργία σοβαρότατης, μη αναστρέψιμης άνοιας. Η Αβ-επαγόμενη τοξικότητα συνοδεύεται από ποικίλα γεγονότα, συμπεριλαμβανομένου του οξειδωτικού στρες (O.S) το οποίο χαρακτηρίζεται από αύξηση των επιπέδων των ενεργά αντιδρώντων ειδών οξυγόνου (ROS) όπως το Η2Ο2. Έρευνες αναφέρουν ότι οι τοξικοεπαγόμενες κυτταρικές βλάβες, συνεισφέρουν σημαντικά στην νευροτοξικότητα και την παθολογία της ΝΑ. Με τα πρόσφατα δεδομένα να υποδηλώνουν άμεση συσχέτιση της ΝΑ με την εναπόθεση της Αβ, το οξειδωτικό στρες και την απώλεια της χολινεργικής διαβίβασης, το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας έχει στραφεί, είτε στην ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού, είτε στη ρύθμιση του μεταβολισμού της αμυλοειδικής προ-πρωτεΐνης ΑΡΡ προς το μη-αμυλοειδογενές μονοπάτι καθώς επίσης και προς την ενίσχυση των μνημονικών διεργασιών. Τα φυσικά προϊόντα αποτελούν πηγή χρήσιμων φαρμακευτικών σκευασμάτων (π.χ. η γαλανταμίνη είναι ένα από τα εγκεκριμένα φαρμακευτικά σκευάσματα για τη ΝΑ) τα συστατικά των οποίων αποτελούν έναυσμα για το σχεδιασμό αποτελεσματικότερων φαρμάκων, σε σχέση κυρίως με τις ανεπιθύμητες δράσεις. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον μεταξύ των φυτών για τον ελλαδικό χώρο έχει το φυτό Crocus sativus L., το οποίο καλλιεργείται στο χωριό Κρόκος της Κοζάνης για τους κόκκινους στύλους του, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρύτατα στη διατροφή ως άρτυμα (κρόκος ή σαφρόν). Ο κρόκος, πέραν των ιδιοτήτων του ως καρύκευμα, αποτελεί ένα φυτικό σκεύασμα με σημαντικές ιατρικές ιδιότητες, το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί κατά κόρον στην παραδοσιακή ιατρική. Οι στύλοι του κρόκου περιέχουν ασυνήθιστα υδρόφιλα καροτενοειδή, τις κροκίνες, οι οποίες είναι γλυκοζίτες της κροκετίνης. Σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η μελέτη των νευροπροστατευτικών μηχανισμών των συστατικών των στύλων του φυτού Crocus sativus και άλλων ενδημικών ειδών Crocus με έμφαση στη νόσο του Alzheimer. To εκχύλισμα των στύλων του C. sativus (CSE) και τα συστατικά του, καθώς και άλλα ενδημικά είδη Crocus χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση: (α) των αντιοξειδωτικών τους ιδιοτήτων και της επίδρασης τους στη συσσωμάτωσης της Αβ, τόσο in vitro, όσο και σε κυτταρικές καλλιέργειες (SH-SY5Y, HEK293, CHOAPP770) και (β) των μνημονικών διεργασιών, της οξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου και της ενεργότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) ενήλικων και γηραιών αρσενικών Balb-c μυών μετά από ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση CSE (7-ημερών) (30 & 60 mg/Kg βάρος σώματος) (n = 9/ομάδα). Μεθοδολογία: Οι αντιοξειδωτικές ιδιότητες του εκχυλίσματος των στύλων προσδιορίστηκαν με εκτίμηση της ισοδύναμης με το Trolox ικανότητας να δεσμεύει ελεύθερες ρίζες (TEAC) και της ικανότητας αναγωγής του σιδήρου (FRAP), ενώ η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στη συσσωμάτωση ινιδίων της Αβ μελετήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS-PAGE), τη μέθοδο της θειοφλαβίνης Τ και της δέσμευσης σε DNA. Η επίδραση των φυτικών εκχυλισμάτων στο μεταβολισμό της ΑΡΡ πραγματοποιήθηκε τόσο στα κυτταρικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα, όσο και στο θρεπτικό μέσο μετασχηματισμένων CHO κυττάρων (CHOAPP770), με ανάλυση κατά Western και με ανοσοκατακρήμνιση, ενώ οι επιπτώσεις του H2O2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες, προσδιορίστηκαν με μέτρηση της κυτταρικής ζωτικότητας (ΜΤΤ assay), των επιπέδων ελευθέρων ριζών (DCF-DH2 assay) και της ενεργότητας της κασπάσης-3. Η αξιολόγηση της συμπεριφοράς των πειραματοζώων, πραγματοποιήθηκε με το τεστ παθητικής αποφυγής. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής/αντι-αποπτωτικής δράσης των φυτικών εκχυλισμάτων σε ενήλικες και γηραιούς μύες πραγματοποιήθηκε σε ολικό εγκεφαλικό ομογενοποίημα και εκτιμήθηκε υπολογίζοντας την ικανότητα αναγωγής του σιδήρου (FRAP), των συγκεντρώσεων του ασκορβικού οξέος, της γλουταθειόνης, της μηλονικής διαλδεϋδης και της κασπάσης-3. Η μελέτη της πιθανής ανασταλτικής δράσης των εκχυλισμάτων στην ενεργότητα της AChE μελετήθηκε με τη μέθοδο του Ellman, ενώ ο τύπος αναστολής, προσδιορίστηκε με κινητικές μελέτες. Αποτελέσματα: Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι, in vitro, τα εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus παρουσίασαν υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα από αυτή της τομάτας και του καρότου, καθώς και σημαντική δοσο- και χρονο-εξαρτώμενη ανασταλτική επίδραση στη δημιουργία ινιδίων της Αβ. Η trans-κροκίνη-4, ο διγεντιοβιοζυλ-εστέρας της κροκετίνης, το κύριο καροτενοειδές συστατικό του εκχυλίσματος των στύλων, προκάλεσε αναστολή της συσσωμάτωσης της Αβ ακόμη και σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτή της διμεθυλοκροκετίνης (ένα συνθετικό ανάλογο της κροκετίνης το οποίο δεν φέρει σάκχαρα στα άκρα του), υποδηλώνοντας έτσι ότι η δράση των καροτενοειδών ενισχύεται από την παρουσία των σακχάρων. Εν συγκρίσει με τον C. sativus, ο C. boryi και ο C. niveus παρουσίασαν πολύ πιο ισχυρή αντιαμυλοειδική δράση, γεγονός που πιθανότατα να οφείλεται στη διαφορετική σύσταση τους. Στις κυτταρικές καλλιέργειες, τα αποτελέσματα ελέγχου του μεταβολισμού της ΑΡΡ με ανοσοαποτύπωση κατά Western, έδειξαν ότι μόνον το ολικό εκχύλισμα των στύλων του C. sativus, καθώς και η σαφρανάλη, μια εκ των επιμέρους συστατικών του, αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των αμυλοειδικών (sAPPβ) και μη-αμυλοειδικών (sAPPα) μορφών της ΑΡΡ, στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των CHOAPP770 κυττάρων. Η trans-κροκίνη-4 αύξησε τα επίπεδα έκκρισης των sAPPβ, γεγονός που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή των μονάδων σακχάρων στη διαδικασία της αμυλοειδογένεσης. Δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης της ολικής πρωτεΐνης (holoAPP), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των sAPPα/β στο θρεπτικό μέσο μπορεί να οφείλεται στη μετατόπιση της ισορροπίας του μεταβολισμού της ΑΡΡ προς το μονοπάτι της α- ή της β-εκκριτάσης. Επιπροσθέτως, ανοσοκατακρήμνιση της Αβ έδειξε ότι παρουσία των φυτικών εκχυλισμάτων, καμία μεταβολή δεν παρατηρήθηκε ούτε και στην αμυλοειδογένεση, στο σχηματισμό δηλαδή συσσωμάτων της Αβ, μεγάλου μοριακού βάρους, παρά την τάση προς αύξηση του p3 υπολείμματος. Η αύξηση που παρατηρήθηκε στην παραγωγή των διμερών δομών της Αβ παρουσία των συστατικών του C. sativus, εν συγκρίσει με τα ολικά εκχυλίσματα των στύλων των ειδών Crocus, υποδηλώνει ότι τα καροτενοειδή εμπλέκονται κατά κάποιον τρόπο στην διαδικασία της αμυλοειδογένεσης, ενισχύοντας τη δημιουργία και σταθερότητα των διμερών. Επώαση των κυττάρων με H2O2 οδήγησε σε μείωση της κυτταρικής ζωτικότητας, η οποία συνοδεύτηκε και από αύξηση των επιπέδων των ROS και ενεργοποίηση της κασπάσης-3. Τα ανωτέρω, αντιστράφηκαν πλήρως, ύστερα από επώαση των SH-SY5Y κυττάρων με εκχυλίσματα από τα τρία είδη Crocus, με τον C. sativus να είναι αποτελεσματικότερος όλων, ενώ εξίσου αποτελεσματικά ήταν και τα επιμέρους συστατικά του C. sativus, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: CRT≥Σαφρανάλης ακόμη και στις υψηλές συγκεντρώσεις Η2Ο2. Στην HEK293 κυτταρική σειρά, η συγχορήγηση της CRT και της σαφρανάλης με διαβαθμιζόμενες συγκεντρώσεις Η2Ο2, οδήγησε σε προστασία έναντι του Η2Ο2-επαγόμενου οξειδωτικού στρες και της παραγωγής ROS, εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα κρόκου, το οποίο δεν επέδειξε προστατευτική δράση. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι τα επιμέρους συστατικά του C. sativus προστάτευσαν έναντι της κυτταροτοξικότητας του H2O2 σε όλα τα κυτταρικά συστήματα, μέσω μείωσης του οξειδωτικού φορτίου και της παραγωγής ROS. Αντιθέτως, επώαση των υπό μελέτη φυτοχημικών σε κυτταρικό σύστημα επιβαρυμένο με Αβ (μετασχηματισμένη CHO κυτταρική σειρά) προκάλεσε επιμέρους επιδείνωση της Η2Ο2-επαγόμενης τοξικότητας. Παρόλα αυτά, η χορήγηση κρόκου οδήγησε σε αύξηση των κυτταρικών επιπέδων της GSH, ενώ εξίσου σημαντική ήταν και η μείωση που παρατηρήθηκε στα επίπεδα της MDA, με το βαθμό αποτελεσματικότητας να διαμορφώνεται ως εξής: C. boryi=C. niveus=CRT≥Σαφρανάλης. Τα αποτελέσματα της χορήγησης CSE σε μύες έδειξαν στατιστικώς σημαντική βελτίωση στη μνήμη/μάθηση των ενηλίκων και γηραιών μυών. Παρατηρήθηκαν επίσης μειωμένα επίπεδα υπεροξείδωσης λιπιδίων και κασπάσης-3, αύξηση της συγκέντρωσης της ανηγμένης γλουταθειόνης και του ασκορβικού οξέος στον εγκέφαλο των μυών που τους χορηγήθηκε CSE. Επιπλέον, η δραστικότητα της διαλυτής σε άλας και σε απορρυπαντικό μορφής της AChE μειώθηκε στατιστικώς σημαντικά στους ενήλικες μύες μετά από χορήγηση CSE, σε αντίθεση με τους αντίστοιχους γηραιούς, όπου δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή. Επιπροσθέτως, in vitro ανάλυση της ενεργότητας της AChE, έδειξε ότι παρουσία των απομονωθέντων κροκινών και της σαφρανάλης, παρατηρήθηκε δοσοεξαρτώμενη αναστολή της ενεργότητας του εν λόγω ενζύμου (μη-συναγωνιστική αναστολή) –όμοια με αυτή της γαλανταμίνης- εν αντιθέσει με το ολικό εκχύλισμα των στύλων των ειδών Crocus το οποίο δεν ήταν και τόσο δραστικό. Αυτός ο τύπος αναστολής υποδηλώνει ότι το σημείο πρόσδεσης τους βρίσκεται στο αλλοστερικό τμήμα του ενζύμου της AChE, το οποίο κατέχει, πιθανότατα, κύριο ρόλο και στη διέγερση της εναπόθεσης ινιδίων της Αβ. Συμπεράσματα: Η έλλειψη αποτελεσματικής θεραπείας έναντι της ΝΑ, κάνει τη χρήση φυτικών σκευασμάτων, πολλαπλών στόχων και με ισχυρές νευροπροστατευτικές ιδιότητες, να θεωρείται ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία, η οποία θα είναι αποτελεσματική έναντι των μηχανισμών που υπόκεινται των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, π.χ. του οξειδωτικού στρες, της συσσωμάτωσης των πρωτεϊνών, των συμπεριφορικών και μνημονικών αλλαγών κ.ά. Τα αποτελέσματα μας συγκλίνουν προς αυτή την κατεύθυνση, καθότι υποδηλώνουν την πιθανή χρήση των συστατικών των στύλων του C. sativus στην αναστολή της αμυλοειδογένεσης και της εναπόθεσης της Αβ στον ανθρώπινο εγκέφαλο, ενώ καταδεικνύουν, για πρώτη φορά, ότι η ευεργετική για τη μνήμη δράση που παρατηρήθηκε ύστερα από χορήγηση κρόκου στους ενήλικους και γηραιούς μύες, συσχετίζεται πιθανότατα με την υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα του εγκεφάλου και εν μέρει, την αναστολή της ενεργότητας της AChE (για την περίπτωση των ενηλίκων μυών). Παρόλα αυτά όμως, καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα της AChE των γηραιών μυών, που είχαν λάβει εκχύλισμα κρόκου, παρά την ενίσχυση των αντιοξειδωτικών συστημάτων του οργανισμού, γεγονός που ενισχύει τη σπουδαιότητα της ενσωμάτωσης μιας υγιεινούς διατροφής για τη λειτουργία του εγκεφάλου, από την πρώιμη ενηλικίωση. Το γεγονός, όμως, ότι οι στύλοι του C. sativus αποτελούν μέρος της διατροφής μας ως άρτυμα (κρόκος, σαφράνι ή ζαφορά) μεγεθύνει την αξία αυτών των πειραματικών ευρημάτων αφού θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν άμεσα. Η ταυτοποίηση των κροκινών ως ένα από τα κύρια δραστικά φυτοχημικά θα μπορούσε να αξιοποιηθεί στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων για τη νόσο του Alzheimer. Όμως, επιπρόσθετες μελέτες απαιτούνται προκειμένου να διερευνήσουμε την αποτελεσματικότητα αυτού του φυτικού εκχυλίσματος και των συστατικών του ως αντιαμυλοειδικά σκευάσματα. / Objective: Alzheimer’s disease (AD) is characterized pathologically by the deposition of amyloid-β (Aβ) peptide aggregates and neurofibrillary tangles, which lead to destruction of cholinergic neurons in the cerebral cortex and the hippocampus. That loss is progressive and results in profound memory disturbances and irreversible impairment of cognitive function. Aβ-induced toxicity is accompanied by a variegated combination of events, including oxidative stress (O.S) which is characterized by an increase in the levels of reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Research indicates that cellular insults resulting from free radicals may be a major contributor to the neurotoxicity and pathology of AD. With recent findings suggesting links between AD, deposition of Aβ, O.S. and loss of cholinergic transmission, much attention has been devoted currently, either to antioxidant research or regulation of the amyloid precursor protein (APP) metabolism towards the non-amyloidogenic pathway, as well as to memory enhancing agents. Natural products are still a source of useful drugs (i.e. galanthamine, one of the approved therapies of AD) and of lead compounds for the design of more effective compounds with less side-effects. Of particular interest among the plants that grow in Greece, acquires the plant Crocus sativus, which is cultivated in Kozani, Greece, for its red-coloured styles, which are used as a spice (saffron). Saffron has been used for medicinal purposes for millennia. Its styles are a source of unusual polar carotenoids (crocins), i.e. mono- and di-glycosides of crocetin. The aim of the present study was to examine the possible neuroprotective mechnisms of Crocus sativus’ and other endemic Crocus species’ styles constituents, in relation to AD. In the present study, the Crocus sativus styles extract (CSE) and its constituents and other endemic Crocus species have been used to evaluate: (a) the antioxidant properties and effect on Aβ-aggregation both in vitro and in various cell culture systems (SHSY5Y, HEK293, CHOAPP770) and (b) learning and memory, brain oxidative status and acetylcholinesterase activity (AChE) of adult and aged, male Balb-c mice, after CSE intraperitoneal (7-days) administration (30 & 60 mg/kg body weight) (n= 9/group). Methodology: The in vitro antioxidant properties of the tested phytochemicals were determined by measuring the ferric-reducing antioxidant power (FRAP) and Trolox-equivalent antioxidant capacity (TEAC), while its effects on Aß-aggregation and fibrillogenesis were studied by SDS-PAGE, thioflavine T (ThT)-based fluorescence assay and DNA-shift binding assay. The effects of plant extracts on the regulation of APP processing in stably transfected CHO cells (CHOAPP770) was examined by Immunoprecipitation (IP)/Western blot. Measurements of cell viability and scavenging of ROS production after co-treatment with Η2Ο2 and various concentrations of plant extracts were performed by 3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), 2',7'-dichlorofluorescein (DCF) assays and determination of caspase-3 activity. Evaluation of rodent learning and memory was done by a double trial, step-through test. Mice were sacrificed on day 7 and the effects on the oxidant status and AChE of whole brain homogenates was studied by determination of FRAP, ascorbic acid concentration (colorimetric), malondialdehyde and glutathione levels (fluorometric) and by the Ellman’s reagent. Caspase-3 activity (colorimetric) was also determined. Results: In our in vitro study, the water:methanol (50:50, v/v) extracts of Crocus species were shown to possess good antioxidant properties, higher than those of tomatoes and carrots and inhibit Aß fibrillogenesis in a concentration and time-dependent manner. The main carotenoid constituent, transcrocin- 4 (TC4), the di-gentibiosyl ester of crocetin, inhibited Aß fibrillogenesis at lower concentrations than dimethylcrocetin (DMCRT, a synthetic analogue of crocetin, lacking its sugar components), revealing that the action of the carotenoid is enhanced by the presence of the sugars. In the cell culture system, results showed that CSE and safranal treatment significantly enhanced both the release of amyloidogenic/and non-amyloidogenic soluble forms of sAPPα and sAPPβ into the conditioned media of CHOAPP770 cells. Τrans-crocin-4 resulted in an increase in sAPPβ, indicating the possible implication of sugan units in the process of amyloidogenesis. No difference was observed in full-length APP indicating that the increase of sAPPα/β in the media may be related to a shift in the balance of APP metabolism towards the α- or β-secretase pathway, rather than due to an increase in the expression levels of cellular APP. In addition, immunochemical labelling of Aβ revealed a trend towards p3 production in the cell culture media treated with the tested compounds. Plant extracts had no effect on production of higher molecular mass Aβ species. The increase in Aβ dimmers observed in the presence of C. sativus constituents, in contrast to the crude Crocus styles extracts, was ascribed to the implication of carotenoids in the amyloidogenic process, resulting in the formation and stability of dimmers. Hence, any attenuation of Aβ fibrillogenesis that may have been observed was not because of an overall inhibition of Aβ production. Treatment of cells with H2O2 caused the loss of cell viability, which was associated with the elevation of ROS level and the activation of caspase-3. These phenotypes induced by H2O2, were totally reversed by the tested phytochemicals in the SH-SY5Y cell line, with C. sativus being the most effective. Its carotenoid constituents were equally effective, with CRT≥safranal, even at higher H2O2 concentrations. In HEK293 cell line, co-treatment of the cells with varying concentrations of H2O2, along with CRT and safranal, resulted in reduced H2O2–induced cytotoxicity and ROS production, in contrast to the crude extract of C. sativus, which was less effective. Based on these observations, it seems that in both cell lines tested, the carotenoid constituents of C. sativus reduced the H2O2-induced oxidative damage, probably by reducing oxidative stress and ROS production. In contrast, only moderate effects were observed in stably transfected CHO cells, where co-treatment of the cells with H2O2 and the tested phytochemicals resulted in additional cytotoxicity. However, incubation of this cell line with C. sativus resulted in an increase in GSH levels, followed by a decrease in the MDA values, with C. boryi & C. niveus being equally effective and more effective than CRT and safranal. Results in mice, showed that only the CSE (60 mg/kg)-treated adult and aged mice exhibited a significant improvement in learning and memory. CSE administration resulted also in reduced lipid peroxidation products, in higher total brain antioxidant activity and reduced caspase-3 activity of both adult and aged mice. Furthermore, AChE activity was significantly decreased in CSE-treated adult mice; while no alterations were observed in CSE-treated aged mice. Interestingly, analysis of the in vitro potency of pure crocin constituents for AChE inhibition revealed a dose-dependent inhibitory profile, in the order of CRT≥Safranal>DMCRT, which mimicked that of galanthamine. This suggests that these compounds bind to different loci of the aromatic gorge of AChE, which might be at (or satisfactory close to) the subsites of the aromatic gorge, which seems to play an important role in accelerating Aβ plaque deposition. Conclusions: The lack of an effective treatment against AD, along with our inability to alter the genetic pool, makes the use of plant extracts with potent multi-targets and neuroprotective actions, as ideal candidates against the underlying mechanisms that characterize neurodegenerative diseases, like oxidative stress, protein misfolding, behavioral/cognitive alterations etc. Our finding also point towards such direction by indicating the possible use of C. sativus styles constituents for inhibition of aggregation and deposition of Aβ in the human brain. They also showed, for the first time, that the significant cognitive enhancement observed after CSE administration in adult & aged mice is closely related to higher brain antioxidant properties and inhibition of AChE (in the case of adult mice). However, no alterations were observed in the brain AChE levels of aged mice stressing the importance of healthy diet and early nutritional intervention on brain function from adulthood to senescence, as it may prove to be a valuable asset in “quenching the fires” of oxidative stress in aging and perhaps in neurodegenerative diseases. The fact though that saffron, as a spice, is part of our nutrition provides additional value to our experimental results, which could be of immediate use. The identification of crocins as one of the most effective contained phytochemicals could, in the long term, be used as new therapeutic means against AD. However, additional studies are required in order to dealinate further the effectiveness of the current plant extract as a potent “anti-amyloidogenic drug.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The phytochemical study of the crude extract hexane, methanol and fractions (acid ether, basic ether and basic acetate) from the stem bark of E. crista-galli (Fabaceae) resulted in the isolation of four compounds: The phytosterol stigmasterol (70), the triterpene lupeol (71) and the alkaloids erysotrine (1) and epierythratidine (50), usual in the genus Erythrina. The structures of the isolated metabolites were elucidated by 1H and 13C NMR uni and bidimensional, and compared with standard sample and data available in the literature. The extracts, fractions and isolated compounds were tested for their antimicrobial and antitumor front cancer cells HT29 (colorectal) activities, as well as regarding the capacity of inhibition of enzymes prolyl oligopeptidase, dipeptidil peptidase-VI and acetylcholinesterase. The crude methanolic extract, all fractions and individual compounds showed high antimicrobial activity mainly against Gram-positive and Gram-negative bacteria. The results were satisfactory in POP inhibition assays, when the crude methanolic extract and its fractions, mainly acid ether fraction, showed great inhibitor potential against this enzyme. For DPP-IV only the crude hexane extract was active. The in vitro antitumoral activity of the crude methanolic extract, basic fractions and the isolate alkaloids was investigated at different concentrations against the human colon cancer cell line HT-29 (PicoGreen dsDNA assay). The results suggest that the anti-proliferative effect of E. crista-galli extract on HT-29 cancer cells may be attributed, at least in part, to the presence of the erythrinian alkaloids 1 and 50. / O estudo fitoquímico do extrato bruto hexânico, metanólico e frações (éter ácida, éter básica e acetato básica) das cascas do caule de E. crista-galli (Fabaceae) resultou no isolamento de quatro compostos: o fitoesterol estigmasterol (70) e o triterpeno lupeol (71) além dos alcaloides erisotrina (1) e epieritratidina (50) usuais do gênero Erythrina. As estruturas dos metabólitos isolados foram elucidadas através de RMN 1H e 13C, uni e bidimensionais, além de comparação com amostra padrão quando existente e dados disponíveis na literatura. Os extratos, as frações e os compostos isolados foram testados quanto à sua atividade antimicrobiana, antitumoral frente a células cancerígenas HT29 (colorretal) e de inibição das enzimas POP, DPP-IV e AChE. Dentre as amostras testadas, o extrato bruto metanólico (EBM), suas frações (FEA, FEB e FAB) e compostos isolados apresentaram grande potencial antimicrobiano principalmente frente as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. Os resultados obtidos nos ensaios enzimáticos foram satisfatórios para a enzima POP, onde o EBM e suas frações, principalmente a fração éterea ácida (FEA), demonstraram grande potencial inibidor desta enzima. Para a DPP-IV apenas o extrato bruto hexânico (EBH) mostrou-se ativo. O efeito antitumoral da planta em questão também foi investigado e os resultados obtidos indicam que o EBM, a combinação das frações FEB e FAB e o alcaloide epieritratidina (50) possuem um grande efeito antiproliferativo frente às células do colorretal (HT29) após 72 horas de exposição.

Ratos Wistar machos adultos jovens (6 meses) e velhos (24-25 meses) foram alocados em treinamentos de endurance (corrida em esteira) ou resistido (escalada em grade) durante 6 semanas e comparados a controles sedentários (n=6). Ao final, músculos dos membros posteriores (sóleo e gastrocnêmio) foram analisados por histogramas e atividade total da enzima acetilcolinesterase (AChE). Na medula espinhal lombar, motoneurônios (MN) foram contados, bem como astrócitos da substância cinzenta marcados com GFAP. Densidades ópticas foram medidas nos cornos ventral (CV) e dorsal (CD) para CGRP-ir (MN e CD), AChE e 5-HT-ir (CV e CD). Para histogramas, dados foram analisados usando-se MANOVA e post hoc de Tukey. Os demais dados foram analisados usando-se ANOVA de 1 via e post hoc de Duncan. Resultados: histogramas de ratos jovens mostraram perfis de distribuição distintos após corrida (predominância de fibras de médio diâmetro) ou escalada (predominância de fibras de grande diâmetro) no músculo gastrocnêmio, mas não no sóleo. O perfil de predominância de fibras de pequeno diâmetro observado em ratos velhos sedentários foi igualmente revertido por corrida ou escalada, mas ratos velhos apresentaram limitado aumento de fibras de maior diâmetro. Tanto corrida quanto escalada diminuíram a atividade da AChE muscular. A medula espinhal de animais velhos apresentou menor número de MN e aumento do número de astrócitos. Tanto corrida quanto escalada reduziram a astrogliose no CV, mas não no CD. Ratos velhos mostraram aumento da CGRP-ir em MN, mas nenhum treinamento alterou a CGRP-ir em MN ou no CD. Tanto corrida quanto escalada aumentaram a AChE no CV em todos os grupos treinados. A escalada diminuiu AChE no CD e 5-HT-ir no CV. Nos ratos jovens, a corrida elevou 5-HT-ir no CD, mas não nos ratos velhos. Estes resultados sugerem que distintas modalidades de exercícios crônicos evocam diferentes respostas de neurotransmissores na medula espinhal em diferentes idades. / Young (6 months) and aged (24-25 months) male Wistar rats were assigned to endurance training (ET - treadmill running) and resistance training (RT - grid climbing with increasing weights) during 6 weeks and compared to sedentary controls (n=6). At the end, hindlimb muscles (soleus and gastrocnemius) were analysed by histograms and total AChE activity. In the lumbar spinal cord, motoneurons (MN) were counted, as well as gray matter's GFAP-labeled astrocytes. Optical densities were measured in the ventral (VH) and dorsal (DH) horns for CGRP-ir (MN and DH), AChE staining and 5-HT-ir (VH and DH). Data from histograms were analysed using MANOVA and Tukey’s post hoc. The remaining data Weir analysed using ANOVA and Duncan´s post hoc. Results: gastrocnemius, but not soleus, muscle histograms in young rats showed distinct fiber distribution profiles under ET (toward medium-diameter fibers) and RT (toward large-diameter fibers). The predominance in small-diameter muscle fibers in aged rats was similarly reversed by ET and RT, but aged rats presented limited increase in large-diameter muscle fibers. Both ET and RT decreased muscle AChE activity. The aged spinal cords presented MN loss and greater astrocyte numbers. Both ET and RT reduced astrogliosis in VH, but not in DH. The aged rats displayed elevated CGRP-ir in MN, and neither ET nor RT altered CGRP-ir in MN or DH. Exercise (ET and RT) markedly increased AChE staining in VH in all groups. RT decreased AChE in DH and 5-HT-ir in VH. In young rats, running elevated 5-HT-ir in the DH. These results suggest that different chronic exercise modalities and age evoke distinct spinal cord neurotransmitter responses.

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010 / Os agrotóxicos são substâncias usadas para exterminar pragas ou doenças que causam danos às plantações. Os organofosforados são agrotóxicos responsáveis por 70 por cento das intoxicações ocupacionais e atuam inibindo a enzima acetilcolinesterase por meio da fosforilação do aminoácido serina do sítio ativo. Existem diversos métodos de diagnóstico para monitorar a exposição a estes compostos, tais como: identificação e análise quantitativa de compostos livres noplasma; identificação e análise quantitativa de metabólitos na urina; determinação da atividade de colinesterases no plasma ou no sangue total. Entretanto, estas metodologias possuem algumas limitações, como por exemplo, a falta de especificidade, tecnologias de análise caras e variações interindividuais (sexo, idade, etc.). Uma tentativa de contornar estas limitações na quantificação da atividade de colinesterases é o desenvolvimento de metodologias baseadas na detecção da enzima fosforilada através de técnicas imunoquímicas. Este estudo teve como objetivo desenvolver um método de imunoensaio para o diagnóstico rápido da exposição humana aos organofosforados pela detecção deacetilcolinesterase inibida no sangue humano por anticorpos aviários produzidos contra uma sequência de aminoácidos ao redor da serina fosforilada do centro catalítico da enzima. Para isto, foram adquiridos dois decapeptídeos sintéticos correspondentes ao sítio catalítico "não fosforilado" (SOH) e outro com o resíduode serina fosforilado (SOP). Estes peptídeos foram conjugados com albumina bovina de soro (BSA), injetados em galinhas poedeiras da raça Isa-Brown e anticorpos IgY foram obtidas das gemas dos ovos das galinhas imunizadas. A especificidade dos anticorpos IgY anti-SOH e anti-SOP foi testada por meio de métodos ELISA constatando-se que estes anticorpos reconhecem os peptídeos livres, os peptídeos conjugados com BSA e a própria BSA. Além disso, ocorreu uma significativa reação cruzada, ou seja, os anticorpos IgY anti-SOH e anti-SOP não conseguiram diferenciar os peptídeo SOH e SOP. Estes resultados não permitem a indicação destes anticorpos para o desenvolvimento de métodos para diagnóstico de intoxicação. / Pesticides are chemical substances used to control plagues and diseases in plantations. Organophosphates are the pesticides involved in 70% of the occupational intoxications and act inhibiting the enzyme acetylcholinesterase by phosphorylation of the serine residue of catalytic centre. There are several methods for monitoring the exposition to these compounds, as so: identification and assay the free compounds into plasma; identification and assay metabolites into urine; cholinesterases assay into plasma or blood. However, these methods have some limitations, as for example lack of specificity, expensive analytical technologies and inter-individual variety (sex, age, etc.). One way to outline these limitations on cholinesterase assay is the development of methods based on phospho-enzyme detection by imunochemical techniques. This study have had the objective to developing an imuno-assay method for rapid diagnosis of human exposition to organophosphorus compounds by imuno-detection of inhibited acetylcholinesterase using aviary antibodies produced against a peptide sequence of the catalytic centre around phospho-serine residue. Two synthetic decapeptides were bought: one with the sequence of "not-phosphorylated" catalytic centre (SOH) and another with a serine-phosphorylated residue. These peptides were conjugated with bovine serum albumin (BSA), injected into Isa-Brown hens and antibodies IgY were isolated from egg yolk of immunized hens. The specificity of IgY anti-SOH and anti-SOP was tested using ELISA methods showing that these antibodies recognize free peptides, conjugated peptides and BSA. In addition, there was a significant cross reaction, or in other words, the antibodies IgY anti- SOH and anti-SOP failed on differentiate the peptide SOH and SOP. These results do not allow the indication of these antibodies for developing methods for intoxication diagnosis.

L'objectif de la présente étude est l’évaluation des effets de l'exposition gestationnelle et lactationnelle aux anguilles contaminées aux POP dont la Σ6 PCB-NDL, sur la mémoire, la capacité d’apprentissage, l’activité motrice, le comportement de résignation, le statut oxydatif et l'activité de l'acétylcholinestérase des souris de génération F1. Pour ce faire, des souris femelles ont été exposées, à partir du sixième jour de gestation (JG 6) jusqu'au jour postnatal 21 (JPN 21), par voie d'ingestion, aux anguilles contaminées contenant Σ 6 PCB-NDL. Trois doses de la Σ 6 PCB-NDL ont été choisies : 85, 216 et 400ng/kg/j en se référant à un groupe de souris témoins. Nos résultats ont montré que l'exposition gestationnelle et lactationnelle, aux anguilles contaminées, contenant la Σ 6 PCB-NDL, n’a pas affecté la capacité d’apprentissage, ni la mémoire. Cependant, le traitement, utilisé dans cette étude, pourrait causer une hyperactivité tardive, persistante et sexe dépendante qui ne touche les souris femelles de la génération F1. En outre, un effet « depresive-like » de l’exposition gestationnelle et lactationnelle des souris de génération F1 aux anguilles contaminée par les POP y inclus la Σ 6 PCB-NDL, a été relevé de façon sexe dépendante. Le comportement « depresive-like » ne touche que les souris mâles et il était persistant au fil de temps. L’étude du statut oxydatif des trois régions cérébrales (cortex préfrontal, hippocampe et cervelet), a révélé que le traitement pourrait perturber, de façon sexe dépendante, l’activité des enzymes antioxydants (Cat, SOD) au niveau du cortex préfrontal et de l’hippocampe. Les conséquences du stress oxydant, dans cette étude se sont manifestées par une augmentation du taux des protéines carbonylées au niveau du cortex préfrontal et de l’hippocampe de certains groupes de souris mâles traitées. Cependant, aucune différence significative, n’a été enregistrée, au niveau des trois régions cérébrales étudiées, dans le taux de MDA, entre les souris traitées et les souris témoins. La perturbation du statut oxydatif a été sexe dépendante, elle n’a touché que les souris mâles. L’étude de l’activité de l’acétylcholinestérase a montré que l’ingestion des souris gestantes et puis allaitantes des anguilles contaminées contenant Σ6PCB-NDL aux doses 85 et 400 ng / kg / jour était à l’origine d’une inhibition significative, par rapport au témoin de l’activité de l’acétylcholinestérase, au niveau du cortex préfrontal de leurs progéniture femelles. Alors qu’au niveau de l’hippocampe, une inhibition significative de l’activité de cette enzyme a été enregistrée chez les souris mâles traitées aux anguilles contenant Σ6PCB-NDL à la dose de 85 ng / kg / jour et chez toute la progéniture de souris femelles des groupes traitées / The objective of the present study is the evaluation of gestational and lactational exposure to contaminated eels, containing Σ6 NDL-PCBs, on learning, memory, motor activity, resignation behavior, oxidative status and acetylcholinesterase activity of the offspring mice. For this purpose female mice were orally exposed during gestational and breast feeding period (from JG6 to JPN 21), through standard diet containing contaminated eel with Σ6 NDL-PCBs or no. Three doses of Σ 6 NDL-PCBs were chosen: 85ng / kg / day, 216 ng / kg / day and 400ng / kg / day. A control group of female mice, receiving the standard diet without fish, was used. Results showed that gestational and lactational exposure to contaminated eels, containing Σ6 NDL-PCBs, did not affect the memory and learning capacities. However the early-life exposure to polluted eels containing Σ6 NDL-PCBs caused late, persistent and gender dependent neurobehavioral hyperactive effects in offspring mice that affects only offspring females. Furthermore our results suggest that the consumption of polluted fish by pregnant and lactating dams might cause neurobehavioral depression only in their male offspring, at progressive life stage. Moreover the study of oxidative status on the three brain areas (prefrontal cortex, hippocampus and cerebellum), revealed that the treatment had affected the activity of antioxidant enzymes (Cat, SOD) only in the prefrontal cortex, hippocampus of male mice. The consequences of oxidative stress in this study were revealed by an increase of protein carbonyl levels in the hippocampus and the prefrontal cortex of offspring male mice, exposed to chemically contaminated fish containing Σ6 NDL-PCBs at the dose of 85 and 216 ng / kg / day, respectively. However the treatment had no effect on the lipids. Indeed there were no significant differences in the MDA rate, in the three studied regions of the brain, between treated and control mice. Moreover, gestational and lactational exposure to contaminated eels, containing Σ6NDL-PCB at the dose of 85 and 400 ng / kg / day, had inhibited acetylcholinesterase activity, in the prefrontal cortex, only of female mice. However, in the hippocampus, the enzyme activity was inhibited of male mice, exposed to contaminated eels, containing Σ6NDL-PCB at the dose of 85 ng/ kg / day and in all the treated female offspring mice