Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-14T13:15:14Z No. of bitstreams: 1 Joyce Torres D Paula.pdf: 452376 bytes, checksum: 55709c518ef93d26744bf054acb405b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-14T13:15:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Joyce Torres D Paula.pdf: 452376 bytes, checksum: 55709c518ef93d26744bf054acb405b4 (MD5) Previous issue date: 2013-03-02 / The objective of this research was to measure the concentration of glutamine (GLN) plus glutamate (GLU) in milk and blood of dairy cows, milk composition ([Lactose], [Fat], [Protein], [Total solids]) and somatic cell count (SCC) in different periods of lactation, and the concentration of these amino acids in the blood of their calves Samples of blood and milk were collected from 21 Holstein cows during five months of lactation (first, second, third, fifth and tenth) and serum samples from 28 calves in first three months of life. The results were analyzed by ANOVA, with 5% of significance and the Tukey test, with the same level of significance. There was not statistical difference (P>0,05) in [GLN + GLU] in the blood of the cows and calves, neither in the concentration of these amino acids in the milk; [Lactose], [Fat] and CCS also were not affected (P>0,05). It was observed higher protein content (P<0,05) in the fifth and tenth months of lactation (~ 3,61% in both) relative to the first, second and third months; the total solids was higher in the tenth month (~12,92%) related to the first and second months of lactation (~ 11,83% and ~ 11,81%, respectively). The period of lactation did not affect [glutamine] plus [glutamate], neither in the concentration of these amino acids in milk. SCC, [lactose] and [fat] did not change, and only [protein] and [total solids] were significant different. There was no correlation with age of calf and [glutamine] plus [glutamate]. / A glutamina, aminoácido condicionalmente essencial, é considerada como fator limitante na produção leiteira. Assim, Objetivou-se mensurar a concentração de glutamina (GLN) mais glutamato (GLU) no leite e sangue de vacas leiteiras, a composição do leite e a contagem de células somáticas (CCS) nos diferentes períodos de lactação, além da concentração destes aminoácidos no sangue de seus respectivos bezerros. Foram colhidas amostras de sangue e leite de 21 vacas holandesas durante cinco meses da lactação e amostras sanguíneas de 28 bezerros nos três meses iniciais de vida. No sangue determinaram-se [GLN+GLU] e no leite verificaram-se a concentração de GLN+GLU, Lactose, Gordura, Proteína, Extrato Seco Total (EST) e CCS. Os resultados foram analisados pelo ANOVA, com significância de 5% e pelo teste de Tukey, com mesmo nível de significância. Observou-se que não houve diferença estatística (P>0,05) nas [GLN+GLU] no sangue de fêmeas e bezerros, nem na concentração destes no leite; a [Lactose], [Gordura] e CCS também não alteraram (P>0,05). Contudo, constatou-se maior teor proteico (P<0,05) no quinto e no décimo mês de lactação (~3,61%, em ambos), em relação ao primeiro, segundo e terceiro mês; o EST foi maior no décimo mês (~12,92%) relacionado ao primeiro e ao segundo mês de lactação (~11,83% e ~11,81%, respectivamente). Concluí-se que o período de lactação não interferiu na concentração sanguínea de glutamina mais glutamato, nem na concentração destes aminoácidos no leite, bem como não alterou a contagem de células somáticas e o teor de lactose e gordura, promovendo alterações apenas no nível de proteína e EST. Percebeu-se, ainda, que a idade do bezerro não influenciou a concentração sanguínea de glutamina mais glutamato.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2017-03-31T13:47:03Z No. of bitstreams: 1 Clenilson Marquezin.pdf: 329825 bytes, checksum: ce5f5c8532740cd86db6eac9e541febc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-31T13:47:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Clenilson Marquezin.pdf: 329825 bytes, checksum: ce5f5c8532740cd86db6eac9e541febc (MD5) Previous issue date: 2010-07-23 / his experiment was conducted to evaluate the effect of supplementation with Aminogut® (L-glutamine and L-glutamic acid in the form of free amino acids) in sows on the morphometry of the intestinal villi and crypt depth of suckling piglets at 28 days old. We used 14 sows pluriparous numbers of births over 4 (four), crossbred, acquired through the crossbreeding of breeds (Large White X Landrace), distributed in a completely randomized design matrices were divided into two groups, 7 animals per replicate. T0- control, without supplementation, T1-supplementation with Aminogut® at a ratio of 2.5% of the total diet. Each treatment were sacrificed four piglets, which had chosen the piglet weaning weight closer to the average litter weight. The diets were isonitrogenous and isocaloric and obeyed the nutritional requirements of a proposal for each physiological state. The period of supplementation of females began 7 (seven) days before the expected date of childbirth. Analyses of the villi and crypt depth of small and large intestine were performed on biopsies / UFRPE. The group with Aminogut® had a greater crypt depth (P<0.01) differed from the control treatment which was less crypt depth, both the small intestine and for the bulk. In conclusion, supplementation in sows with L-glutamine and Lglutamic acid, increased the depth of the crypts of both small intestine and large intestine, and had no effect on the weight of the piglets. / presente experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito da suplementação com Aminogut® (L-glutamina e L-ácido glutâmico na forma de aminoácidos livres) em dietas para matrizes suínas sobre a morfometria das vilosidades intestinais e profundidade de criptas de leitões lactentes aos 28 dias de idade. Foram utilizadas 14 matrizes suínas pluríparas com números de partos acima de quatro, mestiças, provenientes do cruzamento das raças, (Landrace X Large White), distribuídas em um delineamento inteiramente casualizado. As matrizes foram divididas em dois tratamentos, com sete animais por repetição. Os tratamentos foram: T0- controle, sem suplementação, T1- suplementação com Aminogut® (L-glutamina e L-ácido glutâmico) incluídos a um nível de 2,5 % a dieta. De cada tratamento foram sacrificados quatro leitões, escolhido o leitão que teve o peso à desmama mais próximo do peso médio da leitegada. As rações obedeceram as exigências nutricionais propostas para cada um dos estados fisiológicos. O período de suplementação das fêmeas iniciou-se sete dias antes da data provável do parto. As análises das vilosidades e profundidade das criptas do intestino delgado e grosso foram realizadas no BIOPA/ UFRPE. O grupo com Aminogut® apresentou uma maior profundidade das criptas (P<0,01) em relação ao tratamento controle que apresentou menor profundidade das criptas, tanto para o intestino delgado como para o grosso. Concluiu-se que a suplementação das dietas das matrizes com Aminogut®, proporcionou aumento na profundidade das criptas tanto do intestino delgado como do intestino grosso, porém não apresentou efeito sobre o peso dos leitões.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Januaria.pdf: 2695991 bytes, checksum: fea39a26b7b89cfb880fab37ea0fafc6 (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / In this research, we aimed to evaluate the digestible lysine levels in pre-starter diets in the histomorphological development of 18-day embryos and newborn chicks. The performance until 21 days and dry matter digestibility and nitrogen balance in pre-starter rations and allometry of digestible and immune organs until 14 days of age. Three experiments were performed in the Avian facilities and in the Preventive Veterinary Medicine Department of the Veterinary and Animal Science College of the Federal University of Goiás, Brazil, with fertile eggs obtained from breeders in different ages and eggs with different weights at the moment of hatching. In experiment 1, effect of breeder ages and egg weights in the internal quality was evaluated during incubation period and its relation with embryo development until hatch. In experiment 2 digestible lysine supplementation in pre-starter diets for chicks hatched from eggs of different breeder ages and in experiment 3 for chicks obtained from eggs with different weights at the first day of hatching period. A total of 320 day-old chicks were allotted in each experiment in a completely randomized design and factorial arrangement 2X4 (breeder age: 34 and 52 weeks or egg weight: 56-65g and 66-72g and digestible lysine levels: 1.1; 1.2; 1.3 and 1.4%). Embryos and newborn chicks were necropsied at 18 days of incubation, at seven and 14 days after hatch, and collected samples of the small intestine (duodenum e jejunum) to prepare histological slides and gastrointestinal organs weighed. At hatch, chicks were weighed and allotted in battery cages from four to seven days of age and the metabolic assay performed in total excreta collection. Performance variables performed were final chick weight, weight gain, feed intake and ffed conversion. Nitrogen balance and nitrogen and dry matter coefficientwere calculated. Villus height and crypt depth were determined in histological sldes of duodenum and jejunum. Data were submmited to variance analysis and polynomial regression performed for digestible lysine levels. In experiment 1, breeder age and egg weight showed negative correlations with Haugh unit and positive correlation to percenual of albumen, yolk and eggshell, with embryo weight at 18 days of incubation and chick weight at hatch. In experiment 2, no interaction was observed between breeder age and digestible lysine levels in pre-starter rations. Chicks from older breeders showed better performance. In experiment 3, performance and digestibility were not affected by the increasing levels of digestible lysine in diets or egg weights at the moment of hatch. / Objetivou-se, com o presente trabalho, avaliar a suplementação de lisina digestível na ração no desenvolvimento histomorfológico de embriões com 18 dias de incubação, pintos neonatos e pintos na fase pré-inicial de produção. Avaliou-se, também, o desempenho das aves até 21 dias de idades e a digestibilidade da matéria seca e balanço de nitrogênio na fase pré-inicial e a alometria dos órgãos do aparelho digestório e sistema imune até 14 dias de vida. Realizaram-se três experimentos no Aviário Experimental e no Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás com ovos embrionados provenientes de matrizes com diferentes idades e ovos com diferentes pesos no início da incubação. No experimento 1, avaliou-se o efeito da idade da matriz e peso do ovo na qualidade interna dos ovos. Realizou-se a análise física dos ovos nas duas categorias em estudo (idade de matriz e peso de ovo) e durante a incubação verificou-se o desenvolvimento dos embriões até a eclosão. No experimento 2 foi avaliada a suplementação de lisina digestível em pintos de corte provenientes de matrizes com diferentes idades e no experimento 3 essa mesma suplementação foi testada em pintos de corte provenientes de ovos com diferentes pesos no momento da incubação. Foram utilizados 320 pintos para cada experimento. O delineamento experimental adotado foi DIC e esquema fatorial 2X4 (idade de matriz: 34 e 52 semanas ou peso de ovo: 56-65g e 66-72g e níveis de lisina digestível: 1,1; 1,2; 1,3 e 1,4%). Foram realizadas necropsias em embriões com 18 dias de incubação, em pintos neonatos e depois aos sete e 14 dias de vida das aves, período em que foram coletadas amostras do intestino delgado (duodeno e jejuno) para montagem de lâminas histológicas e pesagem dos órgãos do trato gastrointestinal (TGI). Ao nascimento, as aves foram pesadas e distribuídas em baterias de aço galvanizado e no período de quatro a sete dias foi realizado ensaio metabólico pelo método de coleta total de excretas. As características de desempenho avaliadas foram peso médio final, ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar. Foi determinado o balanço de nitrogênio, o coeficiente de digestibilidade de matéria seca e coeficiente de digestibilidade do nitrogênio. Para histomorfometria, foi verificada a altura de vilo e a profundidade de cripta do duodeno e do jejuno. Os dados foram submetidos à análise de variância e para os níveis de lisina digestível foi aplicada a regressão polinomial. No experimento 1 verificou que a idade da matriz e o peso do ovo têm correlação negativa com a unidade Haugh e correlação positiva com a porcentagem de albúmen, de gema, de casca, com o peso do embrião, com o peso do ovo aos 18 dias de incubação e com peso do pinto ao nascimento. No experimento 2 não se verificou interação entre idade da matriz e níveis crescentes de lisina na ração, os pintos provenientes de matrizes velhas apresentaram melhor desempenho. No experimento 3, o desempenho e a digestibilidade não foram afetados pelos níveis crescentes de lisina digestível na ração ou pelo peso dos ovos no momento da incubação.

nÃo hà / A glutamina (Gln), aminoÃcido por ser nÃo-essencial, nÃo à tradicionalmente incluÃdo nas raÃÃes animais. As propriedades metabÃlicas da Gln fazem dela um aminoÃcido condicionalmente essencial em perÃodos de estresse e catabolismo, quando o organismo nÃo tem a habilidade de suprir em tempo hÃbil sua demanda nutricional. A presente pesquisa foi dividida em 2 partes, a primeira delas teve por objetivo de avaliar o metabolismo da glutamina (Gln) e da glutamina sintetase (GS) no perÃodo lactacional de camundongos fÃmeas primÃparas, a segunda parte teve o objetivo de avaliar os efeitos da suplementaÃÃo da Gln na dieta, fornecida em 2 formas, uma delas, pura (L-glutamina) e uma outra associada ao Ãcido glutÃmico (AminoGut Ajinomoto) para matrizes suÃnas primÃparas. No primeiro experimento caracterizou-se a importÃncia da GS e da Gln e evidenciou-se o seu importante papel no metabolismo, quando o animal se encontrava em catabolismo. No segundo experimento, a glutamina mais uma vez demonstrou sua importÃncia na manutenÃÃo da higidez da matriz. Mais estudos devem ser feitos no intuito de estabelecer nÃveis adequados de suplementaÃÃo e de avaliar a subsequente performance reprodutiva de matrizes suÃnas assim como o desempenho dos leitÃes apÃs o desmame / The glutamine (Gln), a non-essential amino acid, normally it isnât included in the animal feed. The metabolic properties of glutamine made it an essential conditionally amino acid during stress and catabolism, when the body has no ability to attend the nutritional requirements. The present research was divided in two parts; the first one had the objective to characterize the glutamine (Gln) and the glutamine synthetase (GS) during lactation of primiparous mice and the second one, the aim was to evaluate the effects of glutamine supplementation, given in two forms, pure (L-glutamine) and in association with glutamic acid (AminoGut by Ajinomoto) for primiparous gilts. In the first experiment was characterized the importance of GS and Gln, and the important role on the animal metabolism during a catabolism. In the second experiment was demonstrated the importance of Gln to maintain the gilt health. More studies should have to establish the adequate level of Gln supplementation and to evaluate the reproductive performance of gilts as well as the piglets development after weaning.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2015-01-30T10:42:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao - Bruno Samuel Borges - 2014.pdf: 863862 bytes, checksum: f4b35c12b5a03658635541f8a6445926 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-01-30T12:42:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao - Bruno Samuel Borges - 2014.pdf: 863862 bytes, checksum: f4b35c12b5a03658635541f8a6445926 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-30T12:42:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao - Bruno Samuel Borges - 2014.pdf: 863862 bytes, checksum: f4b35c12b5a03658635541f8a6445926 (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / We aimed to evaluate digestible tryptophan level in males and females broilers on pre-initial (one to seven days old) and initial phase (eight to 21 days old) diets. Four experiments were conducted, one with males on pre-initial phase, one with males on initial phase, another with females on pre-initial and one with females on initial phase. The design was completely randomized with four treatments, five replicates with ten animals each, where each repetition consists an experimental unit. In the experiment, tryptophan requirement was determined using diets with different digestible tryptophan levels. A deficient tryptophan diet was formulated, considered the basal diet, which was supplemented with L -tryptophan replacing inert material in order to achieve digestible tryptophan desirable levels. The treatments of experiment 1 consisted of: T1 - 0.209% digestible tryptophan diet (basal diet); T2 - 0.223% digestible tryptophan diet; T3 - 0.235% digestible tryptophan diet; T4 - 0.248% digestible tryptophan diet for male broilers in preinitial phase; Treatments for experiment 2 were: T1 - 0.187% digestible tryptophan diet (basal diet); T2 - 0.200% digestible tryptophan diet; T3 - 0.211% digestible tryptophan diet; T4 - 0.223% digestible tryptophan diet for male broilers on initial phase; Treatments for experiment 3 are: T1 - 0.212% digestible tryptophan diet (basal diet); T2 - 0.225% digestible tryptophan diet; T3 - 0.238% digestible tryptophan diet; T4 - 0.252% digestible tryptophan diet for female chickens cut i n pre-starter; Treatments for experiment 4 are: T1 - diets with 0.186% digestible tryptophan (basal diet); T2 - diet with 0.198% digestible tryptophan; T3 - diet with 0.209% digestible tryptophan; T4 - diet with 0.221% digestible tryptophan for female broiler chickens on initial phase. Diets were formulated with corn, soybean meal, poultry gut meal and bone meal, supplemented with industrial amino acid LLysine, DL-methionine, L-threonine, L-arginine, L-valine, and L-tryptophan. Feed intake, weight gain, feed conversion, as well as nutrients digestibility evaluation was performed. Performance and diet nutrients metabolism data were subjected to variance analysis (ANOVA). Digestible tryptophan levels estimates were made by linear models and quadratic regression at 5% probability. SAS 9.2 was used. After analyzing obtained data, it was found that; amino acid supplementation did not affect broilers of neither sex performance. Digestible tryptophan levels for male broilers on pre-initial phase of 0.209% and on initial phase of 0.187%, and digestible tryptophan levels for female broilers in pre-initial of 0,212% and on initial phase of 0,186% is recommended. / Objetivou-se avaliar o nível de triptofano digestível nas rações de frangos de corte machos e fêmeas nas fases pré-inicial (um a sete dias de idade) e inicial (oito a 21 dias de idade). Foram realizados quatro experimentos, sendo o experimento 1 com machos na fase pré-inicial, experimento 2 com machos na fase inicial, experimento 3 com fêmeas na fase pré-inicial e experimento 4 com fêmeas na fase inicial. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro tratamentos, cinco repetições e dez animais por repetição, em que cada repetição compreendia a uma unidade experimental. Nos experimentos a exigência de triptofano foi determinada utilizando dietas com diferentes níveis de triptofano digestível. Foi formulada uma ração com deficiência em triptofano, considerada a ração basal, a qual foi suplementada com L-triptofano em substituição ao material inerte com o objetivo de alcançar os níveis de triptofano digestível desejáveis. Os tratamentos do experimento 1 consistiram em: T1 – dieta com 0,209% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,223% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,235% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,248% de triptofano digestível para frangos de corte machos na fase pré-inicial; Os tratamentos para o experimento 2 foram : T1 – dieta com 0,187% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,200% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,211% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,223% de triptofano digestível para frangos de corte machos na fase inicial; Os tratamentos para o experimento 3 são: T1 – dieta com 0,212% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,225% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,238% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,252% de triptofano digestível para frangos de corte fêmeas na fase pré-inicial; Os tratamentos para o experimento 4 consistem em: T1 – dietas com 0,186% de triptofano digestível (ração basal); T2 – dieta com 0,198% de triptofano digestível; T3 – dieta com 0,209% de triptofano digestível e; T4 – dieta com 0,221% de triptofano digestível para frangos de corte fêmeas na fase inicial. As rações foram formuladas contendo milho, farelo de soja, farinha de vísceras de aves e farinha de carne e osso, suplementada com os aminoácidos industriais L-Lisina, DL-metionina, L-treonina, L-arginina, L-valina, e L-triptofano. Foram avaliados o consumo de ração, o ganho de peso e a conversão alimentar, bem como foi realizada a avaliação da digestibilidade dos nutrientes das rações. Os dados de desempenho e metabolização dos nutrientes da ração foram submetidos à análise de variância (ANOVA). As estimativas dos níveis de triptofano digestível foram efetuadas através dos modelos de regressão linear e quadrática, em nível de 5% de probabilidade. Foi utilizado o programa SAS 9.2. Após análise dos dados obtidos nesse estudo, verificou-se que a suplementação aminoacídica não influenciou o desempenho dos frangos de corte de ambos os sexos. Recomenda-se níveis de triptofano digestível para frangos de corte machos na fase pré-inicial de 0,209% e na fase inicial de 0,187%, e níveis de triptofano digestível para frangos de corte fêmeas na fase pré-inicial de 0,212% e na fase inicial de 0,186%.

Protozoários do gênero Leishmania são parasitas digenéticos, com uma fase no tubo digestório de um hospedeiro invertebrado (promastigota), e uma fase parasita intracelular de macrófagos (amastigotas). Estudar a demanda de L-arginina no parasita é interessante, uma vez que o aminoácido é indispensável para a sobrevida do parasita e, ao mesmo tempo, serve de substrato para a produção de óxido nítrico, principal composto microbicida dos macrófagos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis do ponto de vista fisiológico e caracterizar o gene que codifica o transportador do aminoácido, bem como a regulação da sua expressão em resposta a diferentes condições biológicas. Para medir o influxo de L-arginina em fagolisossomos, utilizamos macrófagos J774 infectados com L. (L.) amazonensis e desenvolvemos uma metodologia com citometria de fluxo com sorting para a purificação da organela. Validamos microscopicamente a presença do parasita na organela por sua fluorescência, e avaliamos a integridade da membrana externa dessa com marcador de pH ácido. Paralelamente, o gene que codifica o transportador de arginina do parasita foi caracterizado. Foram encontradas duas cópias em tandem que produzem dois transcritos (5.1AAP3 e 4.7AAP3), cujas regiões 5\'UTR e 3\'UTR são diferentes. Por meio de PCR quantitativo em tempo real, avaliamos a expressão desses transcritos e verificamos que 5.1AAP3 é mais expressa ao longo do desenvolvimento do parasita, com um máximo em fase estacionária. A determinação da meia-vida dos mRNA das duas cópias indicou uma duração de 32,6±5,0min para o mRNA de 4.7AAP3, enquanto que o de 5.1AAP3 não apresentou decaimento até 180min do estudo, evidenciando que a estabilidade maior pode ser a razão de sua maior abundância. A submissão de parasitas à privação de arginina levou a aumento na tomada do aminoácido concomitante ao aumento do transcrito 5.1AAP3. Mutantes nulos de arginase submetidos à privação de arginina respondem com uma taxa de incorporação mais baixa em relação aos parasitas selvagens, e mantém a resposta à privação mesmo com os parasitas em fase estacionária, diferente do observado nos parasitas selvagens. Esse conjunto de resultados nos levou a sugerir que a expressão do transportador pode ser regulada pela estabilidade do mRNA, e que o pool de arginina interno ao parasita pode controlar, num mecanismo de retroalimentação negativo, a expressão de seu transportador. / Protozoan of genus Leishmania are digenetic parasites that present a stage in the life in insect gut (promastigotes) and an intracellular phase (amastigotes) inside vertebrate host macrophages. The study of L-arginine influx consists in an interesting matter, since the amino acid is used on NO production pathway (the main macrophage microbial pathway) but are also important for parasites survival. The aim of this work was to perform a genetic and physiological characterization of the arginine transport in Leishmania (Leishmania) amazonensis. To verify how does the arginine uptake occurs in the phagolisosomes, we used J774 macrophages infected with L. (L.) amazonensis to establish a flow cytometry sorting protocol to purify the organelle. Microscopic validation of organelle integrity was achieved by acidic pH marker treatment and detection of fluorescent parasites. The arginine transporter coding gene was characterized. We found two copies in tandem that produces two transcripts, named 5.1AAP3 and 4.7AAP3, with distinct 5\'UTR and 3\'UTR. By quantitative real time PCR we found that 5.1AAP3 mRNA expression varies along parasite development. This copy was, also, more abundant than 4.7AAP3 mRNA. This last mRNA showed a half-life of 32.6±5.0 min, while the 5.1AAP3 mRNA did not decay until 180min. As response to arginine starvation, wild type parasites increase the uptake of arginine, as well as the abundance of 5.1AAP3 mRNA. Arginase null parasites starvation responses showed lower arginine uptake rates compared to wild type responses. Unlike wild type, the null mutants also respond to starvation in stationary phase. This data set allow us to propose that arginine internal pool can downregulate its transporter expression in a feed-back mechanism.

Neste trabalho foi realizada a síntese de amidas, bem como de ácidos e ésteres borônicos, derivados dos aminoácidos L-cistina e L-cisteína, através de rota sintética simples, curta e de baixo custo, com o intuito de busca e a identificação de novo(s) inibidor(es) do proteassomo 20S. Esta classe de compostos possui estrutura que permite a inserção de diversos grupos funcionais, o que confere versatilidade e a construção de biblioteca de compostos que contém partes hidrofílicas e hidrofóbicas importantes para posterior avaliação inibitória. Para tanto, empregou-se rota sintética química convencional e rota biocatalisada para a formação da ligação amida. Os compostos derivados de L-cisteína foram obtidos via síntese clássica de peptídeos a qual forneceu os compostos desejados em rendimentos de até 85%. Por outro lado, tentativas de obtenção das amidas via biocatálise não se mostraram efetivas. Já amidas derivadas de L-cistina foram obtidas em rendimentos de até 79%, via síntese tradicional e até 100% de conversão através de rota biocatalítica. A inserção do átomo de boro nas estruturas se deu utilizando-se metodologias sintéticas já bem estabelecidas na literatura. Os ésteres borônicos derivados de L-cisteína foram obtidos em bons rendimentos (até 78%), enquanto que não foi possível obter-se compostos de boro derivados de L-cistina. Por sua vez, os compostos contendo ácido borônico na estrutura foram sintetizados via reação de hidrólise dos respectivos ésteres borônicos, em rendimentos moderados (até 34%). Após a obtenção dos compostos contendo grupamentos organoboro realizou-se avaliação inibitória dos mesmos frente ao proteassomo 20S. Valores de IC50 iguais a 52 &#181;M foram obtidos para composto derivado de L-cisteína contendo grupamento éster borônico, que se mostraram inibidores moderados e reversíveis. Ácidos borônicos se mostraram sem capacidade de inibir o proteassomo 20S. Adicionalmente, realizaram-se estudos de modelagem molecular com a finalidade de elucidar os resultados obtidos experimentalmente. Inicialmente realizaram-se cálculos de modelagem molecular através da realização de docking de alguns compostos e após geração de modelo farmacofórico. De maneira geral observou-se que os inibidores derivados da L-cisteína não ocupam a mesma cavidade que o fármaco bortezomibe, o que pode explicar a diferença na atividade dos compostos frente à inibição do proteassomo 20S. Também se observou que, tendo-se a interação dos inibidores com a enzima, a vizinhança do átomo de boro tem grande influência na capacidade inibitória, uma vez que estes grupamentos determinam qual a região da cavidade do proteassomo 20S será ocupada pelo inibidor. / In our study, amides, boronic acids and esters derivatives from L-cysteine and L-cysteine were synthesized by simple, short and inexpensive synthetic route, in order to search for new inhibitor(s) of the 20S proteasome. This class of compounds has a structure that allows inclusion of various functional groups, giving it versatility and allowing the construction of library compounds containing hydrophilic and hydrophobic moieties, important for further evaluation. To this end, we used conventional chemical synthetic route and biocatalysis for peptide bond formation. The compounds derived from L-cysteine were obtained by classical synthesis of peptides which provided the desired compounds up to 85% yields. On the other hand, attempts to obtain the amides via biocatalysis were not effective. However, amides derived from L-cystine were obtained with up to 79% yields via chemical synthesis and conversion up to 100% using biocatalytic route. The insertion of the boron atom in the structures was possible using synthetic methodologies well established in literature. Boronic esters derived from L-cysteine were obtained in good yields (up to 78%), whereas it was not possible to obtain boron compounds derived from L-cystine. In turn, compounds containing boronic acids in the structure were synthesized by hydrolysis reaction of the respective boronic esters in moderate yields (up to 34%). With organoboron compounds in hand, we turned our attention to inhibitory assessment against the 20S proteasome. IC50 up to 52 &#181;M were obtained when L-cysteine boronic ester derivatives were evaluated. These compounds are moderate and reversible inhibitors. L-cysteine boronic acids derivatives have shown not ability to inhibit the 20S proteasome. Additionally, molecular modeling studies were carried out in order to elucidate the results obtained experimentally. Initially molecular modeling calculations were carried out by performing docking experiments of some compounds. Generation of pharmacophoric model calculations was also executed. In general, it was observed that inhibitors derived from L-cysteine do not occupy the same cavity that drug bortezomib, which may explain the difference in the activity of compounds against the inhibition of 20S proteasome. We also observed that, with the interaction of inhibitors and enzyme, the side chains around boron atom has a great influence on inhibitory capacity, since these groups determine which region of the 20S proteasome cavity is occupied by the inhibitor.

Os argilominerais são empregados na área farmacêutica e cosmética tanto como excipientes quanto ingredientes ativos. Esses compostos inorgânicos são inertes quimicamente, apresentam estruturas definidas e alta estabilidade térmica, o que contribui para o uso nessas áreas. Atualmente a indústria farmacêutica busca modificações no sistema de entrega de drogas (melhorias no tempo, local e taxa de liberação), objetivando um aumento na estabilidade das drogas e a prevenção e diminuição de efeitos colaterais. Nesse sentido, surge a necessidade de desenvolver novas formulações farmacêuticas, novos métodos de preparação e novos materiais. Considerando o fato dos argilominerais incorporarem espécies diversas entre suas lamelas, é interessante explorar a possibilidade de uso dessas matrizes inorgânicas como carregadores de espécies bioativas. O principal objetivo do presente trabalho foi preparar e caracterizar argilas de uso farmacêutico e/ou cosmético intercaladas com espécies que apresentam potencial terapêutico. Para tanto, usou-se duas argilas esmectitas naturais do tipo montmorilonita (Cloisita Sódica e Veegum HS) e uma esmectita sintética do tipo hectorita (Laponita RD). Os aminoácidos L-lisina, L-arginina e L-ornitina, e o dipeptídeo L-carnosina foram imobilizados em argilas catiônicas, por meio de reação de troca iônica. Na preparação dos materiais híbridos, alguns parâmetros experimentais foram avaliados: concentração hidrogeniônica (pH) da suspensão de reação, proporção argila/aminoácido e tempo de reação. As argilas precursoras e os materiais híbridos obtidos foram caracterizados por difratometria de raios X, espectroscopia vibracional na região do infravermelho e Raman, análise termogravimétrica acoplada à espectrometria de massas e análise química de carbono. Os valores de distância interlamelar (d(001)) dos materiais sugerem que a cadeia carbônica das espécies orgânicas se orienta paralelamente em relação às lamelas de baixa densidade de carga dos argilominerais. Nos espectros vibracionais na região do infravermelho há predominância das bandas características da estrutura inorgânica, mas as bandas entre 1800 e 1400 cm-1 relativas aos grupos funcionais do aminoácido permitem inferir sobre o seu grau de protonação no material híbrido. A acidez de Brönsted gerada pela polarização das moléculas de água associadas à argila foi observada para as montmorilonitas empregadas neste estudo. Amostras preparadas em suspensões nas quais o valor do pH era maior que o valor da primeira constante ácida (pKa1) dos aminoácidos apresentam bandas atribuídas ao estiramento C=O de grupo carboxilato protonado. Os espectros Raman foram obtidos apenas para a argila sintética, uma vez que as naturais apresentam luminescência. O espectro Raman da L-carnosina imobilizada em Laponita indica a presença preponderante da espécie zwitteriônica; o deslocamento das bandas atribuídas aos grupos amida e carboxílico do dipeptídeo para região de menor energia sugere a formação de ligações de hidrogênio com os grupos silanol da Laponita. Os resultados de análise termogravimétrica acoplada à espectrometria de massas dos materiais híbridos são distintos daqueles observados para os aminoácidos livres. A temperatura de início de decomposição das espécies orgânicas não é praticamente modificada após imobilização nas argilas, mas os processos térmicos se estendem até regiões de maior temperatura, evidenciando a influência da estrutura inorgânica sobre a decomposição térmica dos aminoácidos. Através dos dados de quantidade de carbono e de água nas amostras, calculou-se a concentração de aminoácidos nos materiais híbridos (massa de aminoácido / 100 gramas de material). As maiores concentrações de aminoácido (entre seis e oito por cento) foram observadas para as amostras de Cloisita e Veegum HS, isoladas em condições nas quais predomina a interação eletrostática entre as lamelas e os aminoácidos com carga positiva. Nas condições experimentais empregadas neste trabalho não foi observada a saturação das argilas com os aminoácidos, ou seja, as cargas das lamelas não foram totalmente neutralizadas pelos íons orgânicos. / Clay minerals are used as excipients or active ingredients in the pharmaceutical and cosmetic fields. These inorganic compounds are chemically inert, have defined structures and high thermal stability, which make them useful for these areas. Currently the pharmaceutical industry seeks modifications in the drug delivery systems (improvements in the time, place and rate of release), aiming an increase in the stability of the drugs and also the prevention and reduction of side effects. In this way, it is a need to develop new pharmaceutical formulations, new preparation methods and new materials. Considering the fact that clay minerals incorporate various species between their layers, it is interesting to explore the possibility of using these inorganic matrices as carriers of bioactive species. The main aim of this work was to prepare and characterize clays of pharmaceutical and/or cosmetic usage intercalated with species of therapeutic potential. Two natural smectite clays of montmorillonite type (Sodium Cloisite and Veegum HS) and one synthetic smectite of hectorite type (Laponita RD) were employed. The amino acids L-lysine, L-arginine and L-ornithine, and the L-carnosine dipeptide were immobilized on cationic clays by ion exchange reaction. Some experimental parameters were evaluated in the preparation of hybrid materials: hydrogen ion concentration (pH) of reaction suspension, clay/amino acid proportion and reaction time. Pristine clays and hybrid materials were characterized by X-ray diffraction, infrared and Raman vibrational spectroscopies, thermogravimetric analyses coupled to mass spectrometry and chemical analysis of carbon. The materials values of interlayer distance (d(001)) suggest that the carbon chain of the organic species is oriented parallel to the layers of clay minerals. The infrared vibrational spectra are dominated by the inorganic structure bands; however the bands between 1800 and 1400 cm-1 related to the functional groups of the amino acid allow to infer about the protonation degree in the hybrid material. The Brönsted acidity generated by the polarization of water molecules associated with the clay was observed for montmorillonite samples used in this study. Materials prepared in suspensions in which the pH value was greater than the value of the first acid constant (pKa1) show bands assigned to the C=O stretching of protonated carboxylate group. Raman spectra were obtained only for the synthetic clay, since the natural ones luminesce. Raman spectrum of L-carnosine immobilized on Laponita indicates the presence of mostly zwitterionic species; the displacement of bands assigned to amide and carboxylic groups of the dipeptide to the lower energy region suggests the formation of hydrogen bonds with the Laponita silanol groups. The results of thermogravimetric analyses coupled to mass spectrometry of hybrid materials are different from those observed for the free amino acids. The onset temperature of the organic species decomposition is practically unmodified after the immobilization on clays, but thermal processes are postponed up to higher temperature, revealing the inorganic structure influence on the amino acids thermal decomposition. Data on the carbon and water amounts in the samples were used to calculate the concentration of amino acids in the hybrid materials (mass of amino acid / 100 grams of material). The highest concentrations of amino acid (between six and eight percent) was observed for Cloisite and Veegum HS samples, isolated under conditions in which the electrostatic interaction between the layers and the positively charged amino acids are predominant. Under the experimental conditions employed in this study no saturation of clay with amino acids was observed, i.e. the layer charges were not completely neutralized by the organic ions.

As peçonhas de serpentes contêm uma mistura complexa de substâncias farmacologicamente ativas, como metaloproteases, fosfolipases A2, serino-proteases, L-aminoácido oxidase (LAAO), além de outros importantes compostos sem ação enzimática. LAAOs são flavoproteínas que catalisam a desaminação oxidativa de L-aminoácidos e produzem o -cetoácido correspondente, com a concomitante liberação de amônia e peróxido de hidrogênio. A peçonha de Lachesis muta (L. muta) contém L-aminoácido oxidase, a qual pode contribuir com o envenenamento. Portanto, o objetivo deste trabalho é a purificação da L-amino acido oxidase de peçonha de Lachesis muta (LmLAAO) e a sua caracterização bioquímica, estrutural e funcional. Para isso, foram desenvolvidos dois protocolos distintos de purificação, os quais forneceram LmLAAO com grande pureza. No primeiro protocolo, 20 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a uma gel filtração em Sephacryl S100®. Das dez frações obtidas, a primeira fração apresentou atividade L-aminoácido oxidase e foi submetida a mais um passo cromatográfico em Mono Q®. A homogeneidade da fração com atividade L-aminoácido oxidase após a troca iônica foi comprovada por presença de banda única com 60,2 kDa em SDS-PAGE. O segundo protocolo de purificação foi uma sequência de três passos cromatográficos, na qual 200 mg de peçonha bruta de L. muta foram submetidos a gel filtração em Sephacryl S200®, seguido por interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose® e Affi- gel Blue Gel®. Da mesma forma, a pureza da enzima obtida depois desses passos cromatográficos foi comprovada por presença de banda única com 64 kDa em SDS-PAGE. Em ambos os protocolos de purificação, LmLAAO manteve sua atividade enzimática. A massa molar de LmLAAO foi determinada por espectrometria de massas (MALDI-TOF) e apresentou valor de 60,85 kDa. Além disso, foi determinado o valor do ponto isoelétrico da LmLAAO como 5,1. A LmLAAO mostrou preferência catalítica por aminoácidos hidrofóbicos (L-Metionina L-Leucina e L-Fenilalanina) e apresentou perda de atividade catalítica quando submetida à altos valores de pH ou de temperatura. Os parâmetros cinéticos foram determinados e a constante de Michaelis-Menten para o substrato L-Leucina foi de 0,9737 mmol/L e a velocidade máxima de reação foi de 0,06345 mol peróxido de hidrogênio/min. A sequência N-terminal dos 40 primeiros resíduos da LmLAAO purificada foi determinada por degração de Edman e a sua estrutura primária completa foi deduzida da sequência do cDNA obtido da glândula de peçonha. Verificou-se uma grande identidade entre as sequências em aminoácidos da LAAO de L. muta e as de outros viperídeos. A estrutura da LmLAAO foi resolvida por substituição molecular usando as coordenadas atômicas da LAAO de Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). As atividades farmacológicas da LmLAAO foram determinadas in vivo e in vitro. A injeção da enzima (10 µg) não induziu edema de pata em camundongos, nem hemorragia (50 µg) e nem toxicidade sistêmica (100 µg). No entanto, provocou uma leve mionecrose (100 µg) e edema em músculo quadríceps de camundongo, aumentando a creatina quinase plasmática. In vitro, foram testadas as atividades citotóxicas da LmLAAO em células de carcinoma. Os dados obtidos mostram IC50 de 22,70 µg/mL, para linhagem AGS (carcinoma de estômago), e IC50 de 1,41 µg/mL linhagem MCF-7 (carcinoma de mama). Para a atividade antiparasitária, foi determinada uma IC50 de 2,22 µg/mL para a forma promastigota de Leishmania brasiliensis. No entanto, a LmLAAO (32 µg/mL) não apresentou toxicidade relevante para a forma tripomastigota de Tripanosoma cruzi. Concluindo, este trabalho descreve o isolamento e a caracterização estrutural e funtional de uma nova LAAO da peçonha de L. muta. A enzima mostrou efeitos antitumorais e leishmanicida, sem toxicidade sistêmica relevante, mas apresentou significativa ação edematogênica e miotóxica local. Este estudo é relevante não apenas por contribuir para uma melhor compreensão do papel da LAAO no envenenamento, mas também por demonstrar seu potencial biotecnológico como agente terapêutico. / Snake venoms comprise a complex mixture of pharmacologically active substances, such as metalloproteases, phospholipase A2, serine proteases and L-amino acid oxidases (LAAOs) other compounds showing no enzymatic activity. LAAOs are flavoproteins catalyzing the oxidative deamination of L-amino acids to produce the corresponding -keto acid with the concomitant release of ammonia and hydrogen peroxide. Lachesis muta (L. muta) venom contains L-amino acid oxidase which may contribute to the envenomation. The aim of this study is the purification of an L-amino acid oxidase from Lachesis muta venom (LmLAAO) and its structural and functional characterization. For that, two purification protocols were performed and both provided highly pure LmLAAO. In the first protocol, 20 mg of crude venom of L. muta were submitted to a gel filtration on Sephacryl S100® and yielded ten fractions, whose were tested for L-amino acid oxidase activity. The first fraction showed L-amino acid oxidase activity and it was submitted to a further chromatographic step on Mono Q®. The homogeneity of the fraction showing L-amino acid oxidase activity after ion exchange was confirmed by the presence of a single band corresponding to 60.2 kDa by SDS-PAGE. The second purification protocol was a sequence of three chromatographic steps, where 200 mg of crude L. muta venom were submitted to gel filtration on Sephacryl S200, followed by hydrophobic interaction on Phenyl Sepharose® and Affi-gel-Blue Gel. For the second protocol, the purity of LmLAAO was confirmed by the presence of a single band with 64 kDa as determined by SDS-PAGE. In both purification protocols LmLAAO kept its enzymatic activity. The molar mass of LmLAAO was determined by mass spectrometry (MALDI-TOF) and showed a value of 60.85 kDa. Moreover, the isoelectric point was 5.1. In addition, LmLAAO showed a catalytic preference for hydrophobic amino acids (L-methionine, L-leucina and L-phenylalanine) and lost its catalytic activity when subjected to high pH or temperature. The kinetic parameters for LAAO were determined and the Michaelis-Menten constant for the substrate L-leucine was 0.9737 mmol/L, and the maximum reaction velocity was 0.06345µmol hydrogen peroxide/min. Furthermore, the sequence of the first forty residues was determined by Edman degradation and the complete sequence of LmLAAO was resolved by cloning cDNA obtained from the venom glands. The amino acid sequence of LmLAAO showed a great identity with sequences of LAAOs from other viper snakes. The LmLAAO structure was solved by molecular replacement using the the atomic coordinates of the LAAO from Agkistrodon halys pallas (PDB 1REO). In addiction, LmLAAO pharmacological activities were determined in vivo and in vitro. Thus, LmLAAO (10 µg) did not induce paw edema in mice, neither hemorrhage (50 µg) nor systemic toxicity (100 µg). However, it caused a mild myonecrosis (100 µg) and edema in the quadriceps muscles of mice, increasing plasma creatine kinase. In vitro activities of LmLAAO in carcinoma cells was assayed. The IC50 of LmLAAO on AGS cell line (stomach cancer) was 22.70 µg / mL, and the IC50 of LmLAAO on MCF-7 cell line (breast carcinoma) was 1.41 µg/mL. Moreover, antiparasitic activity of LmLAAO was determined on promastigote of Leishmania brasiliensis and an IC50 of 2.22 µg/mL was found, whereas on trypomastigote form Trypanosoma cruzi LmLAAO showed no toxicity at doses of 32 µg/mL. In conclusion, this work reports the isolation and the structural and funtional characterization of a new LAAO from L. muta snake venom. The enzyme showed antitumoral and leishmanicidal effects, without relevant systemic toxicity, but presented a significant local edema inducing and myotoxic action. This study is relevant not only for contributing to a better understanding of LAAO role in envenomation, but also for demonstrating its biotechnological potential as a therapeutic agent.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:48:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia_Antonia_Bartolomeu_Agustini.pdf: 975575 bytes, checksum: 5ae91eb501ea2fda179a5f66ab648bc2 (MD5) Previous issue date: 2010-12-10 / With the objective of determining the requirement of digestible threonine for laying hens from 50 to 66 and 75 to 90 weeks of age, two experiments were conducted at the Center for Experimental Stations of the Federal Technological University of Paraná, Campus Dois Vizinhos. A total of 150 Brown Shaver hens semiheavily a completely randomized design (CRD) submitted to a basal diet containing 2850 kcal / kg, 15.4% CP supplemented with 0.460, 0.490, 0.520, 0.550 and 0.580% of L-threonine (98%), which provided 0.000, 0.027, 0.058, 0.089 and 0.120% of threonine, respectively. The parameters evaluated were feed intake, threonine intake, feed/dozen eggs, feed/egg mass, egg weight, egg mass, percentage of egg components (yolk, shell, albumen, shell thickness and shell weight per unit surface area - PCSA), internal egg quality (Haugh unit, yolk index and albumen index) and specific gravity. In experiment 1, the requirement for threonine was, 520% in the diet, corresponding to 601 mg threonine/hen/day. In experiment 2, to provide the best performance and quality of eggs, hens do not require more than 0.525% of threonine, a consumption of 654.86 mg of threonine/bird/day / Com o objetivo de determinar a exigência nutricional de treonina digestível para poedeiras semipesadas no período de 50 a 66 e 75 a 90 semanas de idade, dois experimentos foram conduzidos no Núcleo de Estações Experimentais da Universidade Tecnológica Federal do Paraná, campus Dois Vizinhos. Para este fim, foram utilizadas 150 poedeiras Shaver Brown semipesadas num delineamento inteiramente casualizado (DIC) submetidas à uma ração basal contendo 2.850 Kcal EM/Kg, 15,4% de PB, suplementada com 0,460, 0,490, 0,520, 0,550 e 0,580% de L-treonina digestível (98%), que forneceu 0,000; 0,027; 0,058; 0,089 e 0,120% de treonina digestível, respectivamente. Os parâmetros avaliados foram o consumo de ração, consumo de treonina, conversão alimentar/dúzia de ovos, conversão alimentar/massa de ovos, peso de ovos, massa de ovos, porcentagem dos componentes dos ovos (gema, casca, albúmen, espessura de casca e peso da casca por unidade de superfície de área - PCSA), qualidade interna dos ovos (unidade Haugh, índice de gema e índice de albúmen) e gravidade específica. No experimento 1, a exigência de treonina digestível foi de 0,520% na ração, que corresponde a 601 mg de treonina/ave/dia. No experimento 2, para proporcionar os melhores resultados de desempenho e de qualidade de ovos, as poedeiras não exigem mais que 0,525% de treonina digestível, para um consumo de 654,86 mg de treonina digestível/ave/dia