Thrombin is a critical enzyme involved in blood coagulation and haemostasis. For this reason the study of its interactions with substrates, inhibitors and modulator is essential. It is also a unique enzyme in the serine protease family because unlike enzymes like trypsin and chymotrypsin its activity is modulated by various endogenous and exogenous ligands. This is due to the presence of “exosites” on the thrombin surface. Exosite II, unlike exosite-I, has not been characterized for its allosteric effect. In order to understand the structural basis of interaction and inhibition of inhibitor 4AS, which possibly interacts with exosite-II, native bovine thrombin crystals and human thrombin crystals grown in presence of 4-AS were prepared. X-ray diffraction data was collected on 4AS soaks of native bovine thrombin as well as human thrombin crystals. The data were phased by molecular replacement using appropriate search models. The structures were refined to R factors of 0.24 and 0.27 for native bovine thrombin-4AS soaks and human thrombin-4AS co-crystals respectively. Examination of a 2Fo-Fc electron density map revealed no density for 4-AS. Low affinity of the inhibitor may be the reason for its absence in the solved structures. In the process of solving these structures, unliganded native bovine thrombin in a new crystal form, previously unreported in literature, was solved. The structure shows an overall topology similar to that found in previously published thrombin molecules. Examination of the crystal packing shows that the exosite-II is solvent exposed. This crystal form can be used in the future to study interaction of exosite-II ligands. To characterize the interaction of sucrose octasulfate with thrombin, which may interact with thrombin exosite-II, fluorimetric equilibrium binding titrations were performed using the active site fluorescent probe para-amino benzamidine. At physiological salt concentrations, the KD was found to be ~22 μM, which is lower than heparin fragment of corresponding length. The higher affinity was attributed to the high charge density of the ligand. Measurement of KD at different salt concentrations showed a significant amount of contribution to the binding energy from ionic interactions. Based on the salt dependence experiments, the number of charged interactions per sucrose octasulfate molecule interacting with thrombin was found to be 3.5. Competitive experiments of sucrose octasulfate with FDs (a sulfated dehydro-polymer being investigated in the lab for its anticoagulant properties) for inhibition of thrombin activity showed competitive effects that did not appear to follow Dixon-Webb competitive phenomenon. It was found that sucrose octasulfate itself is a weak inhibitor of thrombin. To investigate the mode of interaction, co-crystals of sucrose-ocasulfate complexed with thrombin were prepared. High resolution data (2.2 Å) was collected. The structure solved using this data showed weak density for two sucrose octasulfate molecules. Sucrose octasulfate was modeled into this density and refined. The refined structure shows that two sucrose octasulfate molecules bind to two thrombin monomers of the asymmetric unit at exosite-II. One of the sucrose octasulfate molecules interacts with both monomers, and could be present as an artifact of crystal packing. The second molecule interacts with exosite-II of only one of the thrombin monomers. The key residues involved in the interaction are Lys236, His91, Arg93 and Arg101. The thrombin-sucrose octasulfate structure does not show any major deviation from unliganded structure. It is possible that the conformational change may have been masked due to crystal packing. Characterization of this novel interaction mode of sucrose octasulfate interaction with thrombin adds one more candidate to the list of compounds that interact with exosite-II in a manner very similar to heparin, but unlike heparin can inhibit thrombin activity.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'objectif de cette thèse était d'élucider le rôle des transporteurs de saccharose dans les racines d’A. thaliana pour mieux comprendre la répartition du carbone dans la plante entière.Nous nous sommes focalisés sur l’étude des deux principaux transporteurs de saccharose exprimés dans les racines : AtSUC1 et AtSUC2. Une étude du mutant KO suc1 et une étude des plantes greffées présentant la mutation KO du gène AtSUC2 uniquement dans les racines ont été réalisées sur des plantes au stade adulte (30 à 32 jours après semis) cultivées en rhizobox. De plus, les localisations de l’expression des gènes et des protéines de ces transporteurs ont été réalisées dans les racines de plantes adultes pour la première fois. La localisation de l’expression d’AtSCU1 dans les pointes racinaires, nous a permis de conclure sur un rôle potentiel d’AtSUC1 dans le déchargement du saccharose du phloème dans les zones de croissance des racines et/ou un rôle potentiel de senseur du signal glucidique ou du déficit hydrique, probablement en lien avec l’ABA. Les résultats montrent qu’AtSUC2 aurait un rôle dans le développement racinaire, certainement via le déchargement du saccharose du phloème dans les zones d’élongation des racines et dans le rechargement du phloème le long des racines (notamment dans les départs de racines latérales). De plus, AtSUC2 pourrait avoir un rôle dans l’augmentation locale d’hexoses liée à l’émergence des racines latérales. Enfin, nos résultats indiquent une contradiction entre la localisation de l’expression du gène AtSUC2 retrouvée dans le parenchyme cortical et la localisation de la protéine qui n’est pas retrouvée dans ces cellules. Néanmoins les deux approches s’accordent sur la localisation dans les cellules compagnes. / The aim of this thesis was to elucidate the role of sucrose transporters in the roots of Arabidopsis thaliana to have a better comprehension of the carbon partitioning in the whole plant.We focused on the study of the two main sucrose transporters expressed in the roots: AtSUC1 and AtSUC2. A study of the KO mutant suc1 and a study on grafted plants with the KO mutation of the AtSUC2 gene only in the roots (micro-graft) were carried out on adult plants (30 to 32 days after sowing) grown in rhizobox. In addition, the localization of the expression of the genes and proteins of transporters were carried out in the roots of adult plants for the first time. The localization of AtSCU1 expression in the root tips allowed us to conclude on a potential role of AtSUC1 in the sucrose phloem unloading in root growth areas and/or a potential role of sensor of carbohydrate signal or of water deficit, probably related to ABA. The results also show that AtSUC2 has a role in root development and certainly via sucrose phloem unloading in root elongation’s areas and in the phloem reloading along the roots (especially in sites of emergence of lateral roots). In addition, AtSUC2 may have a role in the local increase of hexoses associated with the emergence of lateral roots. Finally, our results indicate a contradiction between the localization of the AtSUC2 gene expression found in the cortical parenchyma and the localization of the protein that is not found in these cells. Nevertheless the two approaches agree on the localization in the companion cells.

Objetivou-se compreender melhor o modelo de indução de acidose láctica ruminal (ALR) com sacarose destacando-se aspectos básicos da fermentação ruminal e suas consequências, assim como avaliação comparativa da eficácia de dois aditivos (Virginiamicina VM e Monensina MON), associados ou não, na prevenção desta enfermidade em bovinos adultos de corte. Para tal, foram utilizados 30 fêmeas da raça Nelore, providas de cânula ruminal, com cerca de 413 kg de peso corpóreo. Os animais foram mantidos em baias individuais e alimentados com dieta basal composta de 75% de feno de capim de coast-cross e de 25% de ração concentrada comercial, por 30 dias antes da indução de ALR. Durante esse período os bovinos foram distribuídos em cinco grupos iguais de seis animais cada, assim constituídos: controle (CON); MON 30 ppm; VM 25 ppm; VM 34 ppm e MON 30 ppm + VM 25 ppm. Os aditivos foram administrados numa mistura de 500 g fubá, antes do oferecimento do alimento. Em seguida, foi realizada indução individual de ALR com uso de sacarose de acordo com peso metabólico corrigido, administrada pela cânula ruminal. Foram obtidas amostras de conteúdo ruminal, sangue, urina e fezes, assim como realizado exame físico nos seguintes momentos: zero (basal) e após três, seis, 12 e 18 horas da indução. Foi realizada análise de variância (Teste F) dos dados que obedeceram à distribuição paramétrica, e utilizado o comando Proc mix para medidas repetidas no tempo de duas vias considerando os fatores tratamento, tempo e interação entre tratamento e tempo. Alguns dados foram submetidos ao teste T de Student. Os dados que não obedeceram a distribuição paramétrica foram avaliados pelos testes de Kruskal-Wallis e qui-quadrado. Para o estudo da relação entre duas variáveis foi determinado os índices de correlação e determinação. Ocorreu acidose ruminal intensa, por grande produção inicial de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), seguido de ácido láctico, com predomínio do isômero L sobre o D, os quais com a glicose gerada na fermentação provocaram aumento de osmolaridade nesse conteúdo. A acidose sistêmica foi de grau moderado em pequena parte dos bovinos, com presença de desidratação num expressivo número de animais. Boa parte dos bovinos tratados (n =15) apresentavam depressão nervosa e desidratação. Ocorreu pontualmente um quadro de hipertermia no auge da fermentação ruminal. Os melhores resultados preventivos da ALR foram obtidos com a associação VM + MON, a qual postergou a produção de ácido láctico, quer seja pela menor produção deste, como pela conversão de ácido láctico L em ácidos acético e propiônico. Ao término do experimento essa associação promoveu maior pH e menor acúmulo de ácido láctico L, assim como viabilizou que um menor número de animais necessitassem ser tratados, em relação ao grupo controle. As duas diferentes doses de VM tiveram resultados intermediários, seguidos da MON, a qual não se recomenda como único aditivo com fins de prevenção da ALR. / The objective was to better understand the induction model of rumen lactic acidosis (RLA) with sucrose, highlighting the basic aspects of ruminal fermentation and its consequences, as well as comparative evaluation of the efficacy of two additives (Virginiamycin VM and Monensin MON), associated or not, in the prevention of acidosis in adult beef cattle. For this purpose, 30 Nellore ruminally-cannulated females were used, with average body weight of about 413 kg. The animals were kept in individual stalls and fed a basal diet composed of 75% coast-cross grass hay and 25% commercial concentrated feed for 30 days prior to RLA induction. During this period the cattle were distributed into five equal groups of six animals each, as follows: control (CON); MON 30 ppm; VM 25 ppm; VM 34 ppm and MON 30 ppm + VM 25 ppm. The additives were provided in a 500 g corn meal before the feed was offered. Subsequently, individual RLA induction with sucrose was performed according to corrected metabolic weight, via ruminal cannula. Samples of rumen contents, blood, urine and feces were collected, and physical examination at: zero (baseline) and after three, six, 12 and 18 h after induction. Variance analysis (Test F) of the data that obeyed the parametric distribution was performed, and the Proc mix command was used for repeated measurements in two-way time considering the factors treatment, time and interaction between treatment and time. Some data were submitted to Student\'s t-test. The data that did not obey the parametric distribution were evaluated by the Kruskal-Wallis and chi-square tests. The correlation and determination indices were determined for the study of the relationship between two variables.. A severe ruminal acidosis occurred due to the large initial production of short chain fatty acids (SCFA), followed by lactic acid, with predominance of the L over D-isomer, which with the glucose generated in the fermentation caused an increase in osmolarity in this content. Systemic acidosis was moderate in a small number of cattle, with dehydration in an expressive number of animals. Most treated cattle (n =15) presented nervous depression and dehydration. A temporary hyperthermia occurred at the peak of ruminal fermentation. The best results of RLA prevention were obtained from VM + MON association, which postponed the lactic acid production, either by its lower production, or by the conversion of L-lactic acid in in acetic and propionic acids. At the end of the experiment, this association promoted greater pH and lower L-lactic acid accumulation, and a smaller number of animals needed to be treated, compared to the control group. The two different doses of VM had intermediate results, followed by MON, which is not recommended as a single additive for the RLA prevention.

Neste trabalho foi avaliada a degradação de alquilbenzeno linear sulfonado (LAS) de água residuária de lavanderia comercial (ARLC) em reator anaeróbio de leito fluidificado (RALF) utilizando areia como material suporte, lodo oriundo de UASB empregado no tratamento de resíduos de suinocultura como inóculo e tempo de detenção hidráulica de 18 horas. O período de 330 dias de operação foi divido em quatro etapas: (a) etapa I, com adaptação da biomassa ao substrato sintético contendo etanol e sacarose (1:1 DQO); (b) etapa II, com adição de ARLC (18,2 ± 11,5mgLAS.L-1) ao substrato sintético mais etanol e sacarose (1:1 DQO); (c) etapa III, com adição de ARLC (25,4 ± 8,8 mgLAS.L-1) ao substrato sintético mais etanol e (d) etapa IV, com adição de ARLC (20,4 ± 5,8 mgLAS.L-1) ao substrato sintético, sem adição de fonte suplementar de carbono. Equilíbrio reacional ao longo das etapas de operação foi verificado em função da baixa concentração de ácidos orgânicos voláteis e sólidos suspensos voláteis efluente. Na etapa I, verificou-se 82,9 ± 13,6% de remoção de DQO para 683,9 ± 110,4 mgDQO.L-1 afluente. Para todas as etapas de operação, observou-se a manutenção dessa eficiência sempre superior a 88%. Verificou-se aumento da eficiência de remoção do surfactante de 51,7 ± 23,9% na etapa II na presença de etanol e sacarose (1:1 DQO) (872,3 ± 141,8 mgDQO.L-1 afluente), para 72,9 ± 18,8% na etapa III, somente com etanol (705,0 ± 155,8 mgDQO.L-1 afluente), e de 76,8 ± 16,9% na etapa IV, após a retirada das fontes suplementares de carbono (633,4 ± 156,88 mgDQO.L-1 afluente). A substituição de sacarose e etanol por somente etanol foi extremamente favorável para a remoção do LAS, isto porque foram identificadas alterações das populações microbianas de acordo com a modificação da fonte suplementar de carbono relacionadas, principalmente, ao nível taxonômico de família. Na etapa II, observou-se predomínio de representantes da família Comamonadaceae (abundância relativa de 47% no biofilme). Também para o biofilme das etapas III e IV, verificou-se decréscimo para menos de 4% da abundância relativa de representantes pertencentes à família Comamonadaceae. Todavia, verificou-se aumento da abundância relativa de representantes da família Rhodocyclaceae (18%, 88% e 77% no biofilme das etapas II, III e IV, respectivamente). O principal gênero da família Comamonadaceae identificado na etapa II foi Curvibacter, cujo crescimento pode estar associado a açúcares (abundância relativa de 28% no biofilme). Verificou-se decréscimo da abundância relativa deste gênero inferior a 0,9% nas etapas III e IV. Para os representantes da família Rhodocyclaceae foram identificados gêneros possivelmente relacionados à degradação do LAS: Dechloromonas, Georgfuchsia e Zoogloea (78%, 67% e 98% dos gêneros pertencentes à família Rhodocyclaceae identificados no biofilme das etapas II, III e IV, respectivamente). Por meio do sequenciamento massivo, 37 gêneros possivelmente relacionados à degradação do LAS foram identificados. Quarenta compostos xenobióticos, alguns tóxicos à biota aquática, foram detectados no efluente via cromatografia gasosa/espectrometria de massas. Verificou-se, por meio do índice de Bray-Curtis, maior similaridade entre a biomassa do biofilme e do separador de fases de uma mesma etapa do que entre amostras de biomassa de etapas de operação distintas, evidenciando que houve diferenciação das populações de acordo com a fonte de carbono empregada. Por meio do balanço de massa global, observou-se que somente 0,81% do LAS removido ficou adsorvido. / In the present study, the degradation of linear alkylbenzene sulfonate (LAS) from laundry wastewater (LW) was investigated by using an anaerobic fluidized bed reactor (AFBR) with sand as support material, inoculum coming from a UASB reactor used in the treatment of swine manure, and hydraulic retention time of 18 hours. The operation time was divided into four stages: (a) stage I composed by the adaptation of the biomass in the presence of synthetic substrate containing sucrose and ethanol (1:1 COD); (b) stage II with addition of LW (18.2 ± 11.5mgLAS.L-1) plus synthetic substrate containing sucrose and ethanol (1:1 COD); (c) stage III with LW (25.4 ± 8.8 mgLAS.L-1) plus synthetic substrate containing ethanol; (d) stage IV with addition of LW (20.4 ± 5.8 mgLAS.L-1) plus synthetic substrate without supplementary carbon source. Low concentration of volatile organic acids and volatile suspended solids were observed in the reactor effluent indicating the system exhibited good stability. The COD removal efficiency was 82.9 ± 13.6% during the biomass adaptation in stage I (683.9 ± 110.4 mg.L-1 of COD influent). That removal efficiency was high throughout the operational time, exceeding 88%. The surfactant removal efficiency increased from 51.7 ± 23.9% in stage II with the presence of ethanol and sucrose (872.3 ± 141.8 mgCOD.L-1 influent) to 72.9 ± 18.8% in stage III, with only ethanol (705.0 ± 155.8 mgCOD.L-1 influent). In the stage IV, after the withdrawal of additional carbon sources, the removal efficiency was 76.8 ± 16.9% (633.4 ± 156.88 mgCOD.L-1 influent). The replacement of sucrose and ethanol by only ethanol favored the LAS efficiency removal due to the microbial community change according to the additional carbon source modification, what was mainly detected at family level. In stage II there was a predominance of representatives of Comamonadaceae family (relative abundance of 47% in the biofilm). That relative abundance decreased to less than 4% in stages III and IV. However, there was an increase in relative abundance of representatives of the Rhodocyclaceae family (18%, 88% and 77% of the biofilm in stages II, III and IV, respectively). The main genus of Comamonadaceae family identified in stage II was Curvibacter whose growth may be associated with sugars (relative abundance of 28% in the biofilm). That relative abundance was decreased to less than 0.9% in stages III and IV. For representatives of Rhodocyclaceae family, some genera possibly related to the degradation of LAS were identified: Dechloromonas, Georgfuchsia and Zoogloea (78%, 67% and 98% of the genera of the Rhodocyclaceae family identified in the biofilm from stages II, III and IV, respectively). By means of massive sequencing, 37 genera possibly related to degradation of LAS were identified. Forty xenobiotic compounds, some of them toxic to aquatic biota, were detected in the reactor effluent through gas chromatography/ mass spectrometry. According to the Bray-Curtis similarity, the samples collected in the same operation stage showed higher similarity coefficients than those collected in the same sampling site (biofilm from support material or phase separator). That result confirms the microbial community differentiation according to the carbon source employed. Through the overall mass balance, it was found that only 0.81% of LAS added was removed by adsorption.

Durante o crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae em meios contendo sacarose, a enzima invertase hidrolisa a sacarose no ambiente extracelular em glicose e frutose, as quais são posteriormente captadas pelas células por difusão facilitada. Num trabalho prévio, a localização da enzima invertase foi modificada nesta levedura, eliminando-se a forma extracelular e superexpressando-se a forma intracelular da enzima (Stambuk et al., 2009). Como resultado, a captação de sacarose por esta linhagem modificada (iSUC2) é realizada pelo co-transporte ativo com íons H+, implicando no gasto de 1 mol de ATP para cada mol de H+ extrudado pelas células para manutenção do pH intracelular. Como forma de compensar este gasto energético, espera-se que a linhagem iSUC2 desvie uma maior parte do fluxo de carbono para a geração de energia e, consequentemente, para a formação de etanol, em relação a uma linhagem selvagem. No presente trabalho, uma avaliação fisiológica quantitativa de uma linhagem com esta modificação genética foi realizada tanto em quimiostatos limitados por sacarose, como em cultivos descontínuos com sacarose como única fonte de carbono. Os dados obtidos em quimiostatos anaeróbios demonstram que na linhagem iSUC2 a enzima invertase ficou retida no ambiente intracelular e apresentou atividade absoluta total cerca de duas vezes maior que na linhagem-referência (SUC2). Além disto, verificou-se um aumento de 4% no fator de conversão de sacarose a etanol (Y ETH/S), em relação à linhagem SUC2. No entanto, como foi observado que cerca de 8 % da sacarose não foi consumida pelas células da linhagem iSUC2 durante o estado-estacionário dos quimiostatos anaeróbios, decidiu-se melhorar a capacidade do transporte ativo deste dissacarídeo nesta linhagem através de uma estratégia de engenharia evolutiva caracterizada pelo cultivo destas células em quimiostatos longos limitados por sacarose, em anaerobiose. Obteve-se assim, após cerca de 60 gerações, uma linhagem mutante (iSUC2 evoluída) com atividade de transporte de sacarose 20 vezes superior à linhagem iSUC2, sendo capaz de consumir toda a sacarose do meio de cultivo. Esta linhagem apresentou um aumento de 11% no YETH/S e uma diminuição de 27% no fator de conversão de sacarose a células (YX/S), quando comparada à linhagem-referência. A análise do transcriptoma revelou o aumento da expressão de vários genes codificadores de transportadores de hexoses, bem como genes relacionados ao metabolismo de maltose, incluindo o gene do transportador de alta-afinidade para alfa-glicosídeos AGT1, quando a linhagem iSUC2 evoluída foi comparada à linhagem iSUC2. Detectou-se que a evolução em quimiostato resultou na duplicação do gene AGT1, sem que houvesse mutação neste gene. Através da superexpressão do gene AGT1 na linhagem iSUC2, conseguiu-se gerar uma linhagem que apresentou YETH/S muito próximo ao da linhagem iSUC2 evoluída. No entanto, outros parâmetros fisiológicos, foram diferentes nestas duas linhagens, indicando que a duplicação do gene AGT1 não foi a única mutação que ocorreu durante o processo de evolução em quimiostato. Este trabalho ilustra o potencial da combinação entre engenharia metabólica e engenharia evolutiva para a obtenção de linhagens de levedura melhoradas, para aplicação na produção industrial de etanol combustível a partir de meios contendo sacarose. / When growing on sucrose-containing substrates, Saccharomyces cerevisiae secretes invertase that hydrolyses sucrose into glucose and fructose, which are subsequently assimilated by facilitated diffusion. In a previous work, the cellular location of invertase in yeast was modified, by eliminating the extracellular form of the enzyme and over-expressing the intracellular one (Stambuk et al., 2009). As a result, sucrose uptake by this modified strain (iSUC2) occurs by an active H+-sucrose symport system, in which 1 ATP needs to be used by the cells to extrude the proton co-transported. In order to compensate for this, it is expected that these cells will deviate a higher proportion of the carbon flow towards energy generation, and consequently to ethanol formation, in comparison with the wild-type phenotype (SUC2). In the present work, a quantitative physiological evaluation of the iSUC2 strain was performed in both batch and chemostat cultures. Cells from the iSUC2 strain harvested from steady-state anaerobic sucrose-limited chemostats retained all invertase intracellularly and showed a 2-fold higher total invertase activity, when compared to the SUC2 strain grown under identical conditions. Besides this, the ethanol yield on sucrose in the former cells was 4% higher than in the latter case. However, due to the high levels of residual sucrose during these cultivations with the iSUC2 strain, we attempted to improve the transport capacity in the iSUC2 strain by evolutionary engineering. After 60 generations of cultivation in an anaerobic sucrose-limited chemostat, an evolved strain was selected, which presented a 20-fold increase in the sucrose transport capacity, when compared with the parental strain (iSUC2), leading to almost no residual sucrose. During growth of this evolved strain in anaerobic sucrose-limited chemostats, the ethanol yield on sucrose was 11% higher and the biomass yield on sucrose was 27% lower, when compared with the SUC2 strain. Transcriptome analysis revealed an increase in the expression level of several hexose transporters, as well as many MAL-related genes, including the gene for the high-affinity permease AGT1. Indeed, it was verified that this gene was duplicated during the evolution experiment, but no point mutation was detected. By over-expressing the AGT1 gene in the iSUC2 strain, it was possible to attain a similar ethanol yield on sucrose, when compared to the evolved iSUC2 strain. However, several other physiological parameters were different in both strains, indicating that the AGT1 gene duplication was not the only mutation that occurred during evolution in the chemostat. To conclude, this work illustrates that the combination of metabolic and evolutionary engineering is a powerful strategy to obtain improved sucrose-fermenting yeast strains.

Alimentos funcionais têm estado cada vez mais presentes na dieta humana devido aos seus efeitos benéficos à saúde e entre tais alimentos, destaca-se o mirtilo. Reconhecido como uma super-fruta, o mirtilo é caracterizado por apresentar alta concentração de antocianinas, pigmentos com atividade antioxidante associada ao combate de doenças como câncer, osteoporose, Alzheimer e oftalmológicas, e que devido à sua versatilidade é utilizado amplamente na gastronomia mundial. A produção de mirtilo é liderada pelos Estados Unidos e Canadá e com a crescente demanda pelos frutos, o cultivo do mirtileiro têm se expandido para países do Hemisfério Sul, como o Brasil. Por se tratar de uma cultura proveniente de clima temperado, o mirtileiro demanda um determinado número de horas de frio (NHF) durante o inverno para superar seu período de dormência e entrar no período reprodutivo, o que pode limitar a expansão da produção para regiões de temperaturas mais altas. Como forma de ampliar as áreas de cultivo do mirtileiro, a Universidade da Flórida desenvolveu cultivares de menor exigência em frio e entre elas, estão \'Emerald\' e \'Jewel\', ambas cultivadas no município de Piracicaba, SP. Em Dezembro de 2016, plantas destas cultivares foram podadas e no ano de 2017 avaliadas quanto ao crescimento vegetativo e reprodutivo, conteúdo e repartição de carboidratos e desempenho fotossintético. O crescimento menos vigoroso de \'Emerald\' resultou em uma forma de armazenamento e translocação de carboidratos mais eficiente, o que refletiu numa maior produção de frutos desta cultivar frente à \'Jewel\'. Em \'Emerald\', os valores de fotossíntese condutância estomática. concentração intercelular de CO2, índice de área foliar e clorofila foram maiores que em \'Jewel\', no entanto, o desempenho fotossintético em ambas as cultivares foi afetado por condições de alta temperatura do ar e baixa umidade relativa. Os resultados obtidos neste estudo confirmam a importância da adoção de manejos que proporcionem equilíbrio entre o crescimento vegetativo e reprodutivo dos mirtileiros, otimizando a repartição dos carboidratos, a fotossíntese e favorecendo a assimilação de carbono, principalmente durante o período de produção dos frutos. / Functional food have been increasingly present in the human diet due to its beneficial effects on health, and among such foods, stands out blueberries. Recognized as a super fruit, blueberry is characterized by its high concentration of anthocyanins, pigments with antioxidant activity associated with the fight against cancer, osteoporosis, Alzheimer\'s and ophthalmological diseases, and due to its versatility, it is widely used in world gastronomy. Blueberry production is led by the United States and Canada and with the increasing demand for fruits, the blueberry growth has expanded to countries in the Southern Hemisphere, such as Brazil. As a tipical temperate fruit crop, blueberry plants demands a certain number of chilling hours during the winter to overcome its dormancy period and enter the reproductive period, which may limit the expansion of blueberry production in regions of higher temperatures. As a strategy to expand the growing areas, the University of Florida has developed blueberry cultivars of low-chilling requirement and among them are \'Emerald\' and \'Jewel\', both growth in the city of Piracicaba, State of Sao Paulo, Brazil. In December 2016, plants of both cultivars were pruned and in 2017 they were evaluated regarding its vegetative and reproductive growth, carbohydrate contents and partition and photosynthetic performance. The less vigorous growth of \'Emerald\' resulted in more effective carbohydrate storage and partition, wich reflected in a higher yield than \'Jewel\'. In \'Emerald\', the values for photosynthesis, stomatal condutance, intercellular CO2 concentration, LAI and chlorophyll were higher than in \'Jewel\', however, the photosynthetic performance of both cultivars was affected by high air temperature and low umidity conditions. The results obtained in this study confirm the importance of cultural practices which provide balanced growth and development to blueberry plants, optimizing the carbohydrates partition and photosynthesis, supporting carbon assimilation specially during fruit production.

As plantas apresentam diversas adaptações fisiológicas à baixa disponibilidade de fósforo (Pi) do solo. Este trabalho discute os custos fisiológicos e energéticos associados com essas estratégias, focado nas respostas da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) à disponibilidade de Pi durante a simbiose com micorrizas arbusculares (Glomus clarum). Esses custos são importantes componentes para a adaptação a solos com baixo Pi, afetando a aquisição e conteúdo de fósforo; o crescimento e concentração de açúcares em tecidos vegetais. Plantas de cana-de-açúcar foram cultivadas em vasos com ou sem micorrizas (Glomus clarum), e sob a disponibilidade de baixo (20 mg kg-1) ou alto (202 mg kg-1) fósforo. Raízes e parte-aérea foram coletadas para as análises após 14, 30, 44 e 58 dias pós-inoculação (dpi) com Glomus clarum . A condição de BP causou a deficiência de Pi nas plantas, micorrízicas ou não. As plantas sob AP continham um teor foliar de Pi adequado, e partir dos 44 dpi acumularam pelo menos 6 vezes mais Pi parte-aérea, do que as cultivadas sob BP, efeito mais evidente nas micorrízicas. A eficiência de absorção, indicada pelo acúmulo de Pi na parte-aérea a uma dada biomassa da raiz, foi igual para todos os tratamentos, sugerindo que as eficiências radicular e micorrízica da absorção de Pi foram similares, independentemente da doses de Pi. A disponibilidade de fósforo não afetou a biomassa total das plantas, sendo as cultivadas sob BP mais eficientes na utilização deste nutriente. Por outro lado, as plantas micorrízicas suplementadas com BP apresentaram maior crescimento da raiz e redução na parte-aérea, resultando no aumento da proporção raiz:parte-aérea. Aos 58 dpi, a glicose, frutose e sacarose presente nas folhas de plantas micorrízicas foi 3,8, 2,3 e 2,4 vezes respectivamente mais concentrada do que nas não micorrízicas. Esses resultados sugerem que, nestas condições experimentais, o estabelecimento da simbiose não foi uma associação mutualística típica, afetando o perfil de crescimento e a alometria da cana cultivada com BP. As concentrações de fotoassimilados na folhas de planta micorrízicas indicam que houve aumentos nas taxas fotossintéticas, mas isso não resultou no maior crescimento do macrosimbionte. A tecnologia de amplificação quantitativa de transcritos reversos (RT-PCR) se tornou uma opção para a validação funcional de genes, com alta sensibilidade, acurada quantificação e eficácia. A quantificação relativa da expressão gênica é conseqüentemente fácil e determina a expressão de um gene em relação a outro expresso e relativamente constante. Neste trabalho foi analisada a variabilidade de expressão dos genes de cana-de-açúcar codificando a actina (Actina), gliceraldeido fosfato desidrogenase (GAPDH), tubulina (Tubulina), e ubiquitinas (UbiQ1 e UbiQ2) em diversos tecidos, e comparou-se a variabilidade obtida utilizando os programas Genorm e NormFinder. Em seguida, foram realizadas análises de expressão gênica utilizando o programa REST para a validação estatística da expressão de genes de cana-de-açúcar. O gene UbiQ1 foi mais estável nos tecidos ou órgãos testados: meristema, inflorescência, folha, colmo e raízes tratadas com alto e baixo fósforo. Tendo o gene UbiQ1 como referência, a expressão relativa dos genes transportadores de fosfato de alta afinidade de cana-de-açúcar PT7 e PT8 foi avaliada em amostras de raiz fertilizadas com alto ou baixo Pi, inoculadas ou não com fungo micorrízico e coletadas aos 58 dpi. Esses dois genes pertencem à família Pht1 de transportadores de fosfato e são similares aos ortólogos de arroz ORYsa;tPht1;7 e ORYsa;Pht1;8. Sob a deficiência de Pi, o transportador de fosfato PT7 foi induzido em raízes não colonizadas; já nas micorrízicas foi pouco expresso, sendo que altas taxas de colonização radicular suprimiram a expressão do PT7. O gene PT8 pouco variou sua expressão, sendo sutilmente mais expresso em plantas micorrízicas do que nas não micorrízicas sob o suprimento de BP. Estes resultados indicam que o PT7 é induzido em raízes sob estresse por fósforo e provavelmente associado à absorção radicular de Pi. Enquanto o gene PT8 possui uma modulação pouco variável provavelmente envolvido na manutenção do fluxo ou homeostase de Pi, possivelmente associado com a absorção radicular e micorrízica de fosfato. O PT7 e o PT8 foram expressos em tratamentos de médio/longo prazo, apresentando expressão ou indução em resposta a privação por Pi, o que é consistente com a função proposta de aquisição e mobilização de Pi para esta família de transportadores. A cana-de-açúcar micorrízica mostrou alta plasticidade de resposta ao BP / Plants display a wide array of physiological adaptations to low soil phosphorus (Pi) availability. This work discussed physiological and energetic costs associated with these strategies, focusing on sugarcane responses to Pi availability during the development of arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis. Such costs are important components of adaptation to low phosphorus soils affecting phosphorus acquisition and leve, growth and soluble sugars concentration in plant tissues. Sugarcane plants were grown in pots, with or without AM (Glomus clarum), and with low (20 mg kg-1) or high (200 mg kg-1) phosphorus supply. Roots and shoots were harvest for analysis after 14, 30, 44 and 58 days post-inoculation (dpi) with the fungus Glomus clarum,. The low Pi supply caused Pi deficiency in mycorrhizedl or non-mycorrhizedl plants. The efficiency of Pi absorption, indicated by shoot Pi accumulation in correlation to root biomass, suggested that root and mycorrhizal Pi absorption were similar, regardless of the Pi doses. Phosphorus availability did not affect the whole-plant biomass, and plants under low Pi supply, used more efficiently this nutrient. On the other hand, mycorrhized plants supplemented with low Pi presented the highest root growth and shoot reduction, resulting in high root:shoot ratio. At 58 dpi, glucose, fructose and sucrose concentrations in leaves of mycorrhized plants were 3.8, 2.3 and 2.4-fold higher respectively, than in non-mycorrhizedl plants. These results suggested that, under these experimental conditions, mycorrhizal symbiosis establishment was not a typical mutualistic association affecting sugarcane growth profile and allometry, when cultivated under low Pi. The photosynthate levels of leaves from mycorrhizd plants indicated an increase in photossynthetic rate but withut resulting in higher macrobiont growth. The quantitative amplification of reversed transcripts (RT-PCR) technology has become a method of choice for functional gene validation, with sensitiveness, accurate quantification and high-throughput. The relative quantification is easier determined by relative expression in comparison to a constitutively expressed refernce gene. Here, the expression variability of a sugarcane actin gene (Actin) glyceraldehydo phosphate dehydrogenase (GAPDH), tubulin (Tubulina), and ubiquitins (UbiQ1 and UbiQ2) from various tissues were analysed and compared based on the ranking list from the Genorm and NormFinder softwares. Expression analysis based on the REST software gave the proper statistic validation. UbiQ1 was the most stable gene among the candidate gen-references along the various tissues or organs tested: meristem, inflorescence, leaf, stem and roots treated with high and low phosphorus. Considering UbiQ1 as the reference gene, the relative expression of the sugarcane high-affinity phosphate transporters genes PT7 and PT8 were assessed from roots fertilized with low Pi or high Pi , inoculated or not with the mycorrhizal fungus, harvest 58 dpi. Both genes belong to the Pht1 Pi transporter and share similarity with the rice orthologs ORYsat;Pht1;7 and ORYsat;Pht1;8. Under Pi deficiency, the phosphate transporter PT7 was induced in non-colonized roots, but less expressed in mycorrhizedl ones, with high root colonization rate suppressing PT7 expression. PT8 showed low variability in expression, slightly more expressed in mycorrhized plants than in non-mycorhized plants under low Pi supply. These results indicated that PT7 was induced in Pi stressed roots, and possibly associated with the root Pi uptake, while PT8 had limited modulation in expression and probably involved on Pi fluxes or homeostasis, likely associated with both root and mycorrhizal phosphate uptake pathways. PT7 and PT8 were induced during medium/long-term treatments, showing induction or constant expression in both acquisition and mobilization of Pi in response to Pi deprivation, which is consistent with the proposed role of this tranporter family. Mycorrhizedl sugarcane showed a highly plastic response to low Pi

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o perfil metabólico da utilização dos açúcares por diferentes leveduras (BG-1, CAT-1, FLEISCHMANN, PE-2, 1403-7A e LCM001) em diferentes meios de crescimento e também analisar o comportamento e a atividade de invertase destas leveduras durante um processo fermentativo com reciclos de células, semelhantemente ao processo industrial, levando em consideração os parâmetros: produção de etanol, formação de biomassa, produção de trealose, glicogênio, glicerol, rendimento e eficiência fermentativa. Os experimentos foram divididos em três partes: a 1a foi a quantificação da atividade de invertase das diferentes leveduras, em mosto de fermentação à base de mel e água (13% ART), a 2a analisouse o perfil de metabolização em diferentes meios de crescimento à base de YEP com 2% de açúcares (glicose, sacarose, ou glicose + sacarose), e a 3a foi a realização de uma fermentação alcoólica com 4 reciclos de células, com mosto de mel (13% ART), sendo os três primeiros utilizados para a avaliação do rendimento fermentativo, bem como seus indicadores (trealose, glicogênio, viabilidade, entre outros) e o último, destinado ao perfil de metabolização de açúcares em condições de fermentação. Os resultados mostram que as leveduras possuem diferentes atividades de invertase (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomassa; 1403-7A e LCM001, não possuem atividade), apresentam diferentes velocidades de hidrólise da sacarose, tanto em meios de crescimento como mostos (BG-1 e FLEISCHMANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h e LCM001 = >24 h), assim como a velocidade de metabolização dos açúcares presentes nestes. Conclui-se que a atividade de invertase é dependente da linhagem de levedura, assim como a velocidade de metabolização dos açúcares em meios de crescimento e mosto. A análise do perfil de metabolização de açúcares não permite identificar a presença de transportador de sacarose. No geral, as leveduras selecionadas apresentam melhor desempenho fermentativo. Por outro lado, verificou-se que as linhagens com transportador de sacarose apesar da menor produção de álcool, apresentaram uma boa eficiência fermentativa. O maior problema por parte destas últimas, é o alto tempo de fermentação e a baixa taxa de multiplicação, com conseqüente queda na viabilidade celular. / The aim of this work was to evaluate the metabolic profile in the utilization of sugars, using different yeast strains (BG-1, CAT-1, FLEISHMANN, PE-2, 1403-7A and LCM001) with different growth medium and also to analyze behavior and the invertase activities of these yeast strains during fermentative process with recycling, similar to the industrial process. The following parameters were used: ethanol production, biomass formation, trealose production, glycogen, glycerol, ethanol yield and fermentation efficiency. The trials were divided into three parts: First was activity quantification of invertase using different yeast strains, with a mix of molasses and water (13% ART), the second was analyzed the metabolization profile with different growth medium using YEP added 2% of sugars (glucose, sucrose, or glucose + sucrose), and the third it was the alcoholic fermentation with 4 yeast cell recycles, using wort of molasses and juice ( 13 % ART), The first three were utilized to evaluate the fermentation yield and also theirs indicatives (trealose, glycogen, viability within others) and, the last one was performed to study the profile of sugars metabolization in fermentation conditions. The results showed that those yeasts produced different invertase activities (BG-1 = 7,34; FLEISCHMANN = 5,75; CAT-1 = 3,76; PE-2 = 2,39 gART.h-1.gbiomass; 1403-7A and LCM001 did not have invertase activity), different velocity of sucrose hydrolysis, as much as medium growth as worts (BG-1 and FLEISCHANN = 2 h; CAT-1 = 3h; PE-2 = 4h; 1403-7A = 24 h and LCM001 = >24 h), also as the velocity of sugars metabolization present on this medium. It can be concluded that the invertase activity is dependent of yeast strain, as the velocity of sugars metabolization in growth medium and wort. The profile analysis of metabolization of sugars did not allow to identify the presence of sucrose transporter. In general, the selected yeasts present the best fermentation performance. On the other hand, it was observed the strains with sucrose transportation did not show stress. The major problem of these yeasts were the high fermentation time and low propagation rate, and a decrease of the viability.

A produção de etanol de primeira geração já está consolidada em nosso país e a crescente necessidade de aumento de produção tem movimentado pesquisadores da academia e da indústria em direção ao desenvolvimento da tecnologia de etanol de segunda geração a partir do aproveitamento do bagaço e da palha de cana-de-açúcar. O colmo da cana-de-açúcar é constituído de feixes fibrovasculares dispersos em tecido parenquimatoso e envolvido em sua parte externa pela casca. Embora esteja concentrada no tecido parenquimatoso, a extração do caldo é realizada a partir do esmagamento de todo o colmo. Este processo exige o emprego de maiores pressões de esmagamento e fornece um material (bagaço) bastante heterogêneo que dificulta a possível separação das frações fibra e medula. Visando a obtenção de frações mais homogêneas, bem como facilitação do processo de extração, este trabalho propõe a separação prévia das frações externas (casca) e internas (miolo) da cana-de-açúcar e posterior tratamento das mesmas por processos de deslignificação (polpação). A produção das amostras foi realizada a partir de colmos de cana-de-açúcar pela produção de discos de um centímetro de espessura, cortados perpendicularmente à direção do crescimento. A partir dos discos e empregando punções de diferentes diâmetros foram produzidos anéis externos (casca) e discos internos (miolo) com diferentes espessuras/diâmetros. Cada um dos anéis/discos foi esmagado em prensa hidráulica e as frações resultantes submetidas a dois processos de polpação (Soda e Organossolve). O caldo obtido pelo esmagamento das diferentes frações foi analisado quanto ao volume produzido, concentração de açúcares e presença de extrativos. A prensagem das frações miolo permite a recuperação de um caldo mais claro e na mesma quantidade que a obtida da prensagem da fração integral. A fração casca concentra os extrativos (principalmente ceras) e apresenta baixo teor de umidade (da ordem de 40%) quando comparado às frações integral e miolo. A polpação soda foi realizada a 160°C durante 60 minutos e a polpação organossolve a 190°C durante 150 minutos. Nestas condições, a polpação Soda preservou em maior extensão as hemiceluloses e, como consequência, produziu polpas com maiores rendimentos quando comparado com o processo Organossolve. As polpas obtidas das frações casca e das frações miolo, apresentaram, respectivamente, as maiores e as menores concentrações de lignina residual. A separação prévia das frações casca e miolo podem levar a economia no processo de obtenção de etanol de 1ª geração. Os resíduos da prensagem (bagaço fracionado) podem se constituir de substratos mais adequados para aproveitamento da fração fibrosa (casca) e para produção de etanol de 2ª geração (a partir da fração miolo). / The production of first generation ethanol is already consolidated in our country and the growing need for increased production has moved researchers from academia and industry toward the development of technology for second generation ethanol from sugarcane bagasse and straw. The stalk of sugarcane consists of fibrovascular bundles dispersed parenchymal tissue and involved in their outer hulls. Although concentrated in parenchymal tissue, the extraction of the juice is made from the crushing of the whole stalk. This process requires the use of high pressures and provides a crushed material (bagasse) that is quite heterogeneous and difficults the separation of the fiber and pith fractions. In order to obtain more homogeneous fractions as well as facilitation of the extraction process, this work proposes the previous separation of the external (rings) and internal fractions (core) of sugarcane and the subsequent treatment of the fractions by using delignification (pulping) processes. The production of the samples was made from stalks of raw sugarcane by cutting discs of about one centimeter thick, perpendicular to the direction of growth. The external layer (rings) were separated from the internal one (disks) by using punches with different diameters. Each of the rings/disks were crushed in a hydraulic press and the resulting fractions were submitted to two pulping processes (Soda and Organosolv). The juice obtained by crushing the different fractions was analyzed by determining the volume produced, sugar concentration and presence of extractives. The pressing of the disks allows the recovery of a lighter juice and the same volume as the obtained from the integral fraction (whole stalk). The bark fraction concentrates the extractives (mainly waxes) and has a low moisture content (around 40%) when compared to the integral and disk fractions. The soda pulping was carried out at 160°C for 60 minutes and the organosolv pulping at 190°C for 150 minutes. Under these conditions, soda pulping preserved in a greater extent the hemicelluloses and as a consequence, produced pulps with higher yield when compared to the organosolv process. Pulps obtained from the bark and core fractions showed, respectively, the higher and lower concentrations of residual lignin. The previous separation of the bark and core fractions can lead to savings in the process of obtaining first generation ethanol. The residue from the crushings (fractionated bagasse) may be more appropriate to valorize the fiber fraction (bark) and for production of second generation ethanol (from the core).