A periodontite é um processo inflamatório crônico de origem bacteriana mediado por citocinas, em especial, interleucina-1 (IL1) e fator de necrose tumoral (TNF&#945;). Polimorfismos genéticos de IL1 e TNFA têm sido associados com a variação de expressão dessas proteínas, o que poderia justificar as diferenças interindividuais de manifestação da doença. O objetivo do presente estudo foi investigar possíveis associações entre os genes IL1B, IL1RN e TNFA e a suscetibilidade à periodontite agressiva e à periodontite crônica severa. Foram selecionados 145 pacientes do Estado do Rio de Janeiro, 43 com periodontite agressiva (PAgr) (33,1 4,8 anos), 52 com periodontite crônica severa (PCr) (50,6 5,8 anos) e 50 controles (40,1 7,8 anos). Os DNAs genômicos dos integrantes dos grupos PAgr, PCr e controle foram obtidos através da coleta de células epiteliais bucais raspadas da parte interna da bochecha com cotonete. Os SNPs IL1B -511C>T, IL1B +3954C>T e TNFA -1031T>C foram analisados pela técnica de PCR-RFLP, utilizando as enzimas de restrição Ava I Taq I e Bpi I, respectivamente. O polimorfismo de número variável de repetições in tandem (VNTR) no intron 2 do gene IL1RN foi feita pela análise direta dos amplicons. Todos os polimorfismos foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%. As frequências alélica e genotípica do polimorfismo IL1B +3954C>T no grupo PCr foram significativamente diferentes das observadas no grupo controle (p=0,003 e p=0,041, respectivamente). A freqüência do alelo A2 do polimorfismo IL1RN VNTR intron2 no grupo PAgr foi significativamente maior do que no grupo controle (p=0,035). Não houve associação entre os polimorfismos IL1B -511C>T e TNFA -1031T>C e as periodontites agressiva e crônica. A presença dos alelos 2 nos genótipos combinados de IL1RN VNTR intron2 e IL1B +3954C>T no grupo PCr foi significativamente maior quando comparada ao grupo controle (p=0,045). Entretanto, não se observou associação entre as combinações genotípicas IL1B -511C>T / IL1B +3954C>T e IL1RN VNTR / IL1B -511C>T e a predisposição à doença periodontal. De acordo com os nossos resultados podemos sugerir que, para a população estudada, o polimorfismo IL1B +3954C>T interfere no desenvolvimento da periodontite crônica, enquanto a presença do alelo A2 do polimorfismo IL1RN VNTR intron2 pode ser considerado como indicador de risco para a periodontite agressiva. O presente estudo também nos permite sugerir que a ausência de homozigose dos alelos 1 nos genótipos combinados de IL1RN VNTR intron2 e IL1B +3954C>T pode representar maior suscetibilidade à periodontite crônica severa. / Periodontitis is a chronic inflammatory disease of bacterial origin mediated by cytokines, especially interleukin 1 (IL1) and tumor necrosis factor (TNF&#945;). Genetic polymorphisms of IL1 and TNF&#945; have been associated with expression variation of these proteins, what could justify interindividual differences in the disease forms. The aim of this study was to investigate possible associations between IL1B, IL1RN and TNFA genes and the susceptibility to aggressive periodontitis and severe chronic periodontitis. We selected 145 patients from Rio de Janeiro state, 43 with aggressive periodontitis (PAgr) (33.1 4.8 years old), 52 with severe chronic periodontitis (PCr) (50.6 5.8 years old), and 50 controls (40.1 7.8 years old). Genomic DNAs of patients of PAgr, PCr and control groups were obtained through the collection of oral epithelial cells scraped from the inside cheek with a swab. The SNPs IL1B -511C>(p<0,05) T, IL1B +3954C>T, and TNFA -1031T>C were analyzed by PCR-RFLP technique using the restriction enzymes Ava I, Taq I and Bpi I, respectively. The polymorphism of variable number of tandem repeats (VNTR) in intron2 of the IL1RN gene was done by direct analysis of amplicons. All polymorphisms were analyzed by 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Allelic and genotypic frequencies of the IL1B +3954C>T polymorphism in the PCr group were significantly different as compared to those observed in the control group (p=0.003 and p=0.041, respectively). The frequency of A2 allele of IL1RN intron 2 VNTR polymorphism in the PAgr group was significantly higher than in the control group (p=0.035). There was no association between the polymorphisms IL1B -511C>T and TNFA -1031T>C and aggressive and chronic periodontitis. The presence of alleles 2 in combined genotypes of IL1RN intron 2VNTR and IL1B +3954 C>T in the PCr group was significantly higher as compared to the control group (p=0.045). However no associations between the genotypic combinations IL1B -511C>T IL1B +3954C>T and IL1RN VNTR / IL1B -511C>T and predisposition to periodontal disease were observed. According to our results one can suggest that for the studied population the IL1B +3954C>T polymorphism interferes in the development of chronic periodontitis, whereas the presence of the A2 allele of IL1RN intron 2 VNTR polymorphism may be considered as an indicator of risk for aggressive periodontitis. The present study also allows us to suggest that the absence of homozygous for alleles 1 in the combined genotypes of IL1RN intron 2 VNTR and IL1B +3954C>T may increase the susceptibility to severe chronic periodontitis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da artrite encefalite caprina (CAE) sobre a expressÃo de BMP-15, BMPR-IB e GDF-9 em folÃculos ovarianos, bem como os efeitos de fitohemaglutinina (PHA) e EGF na sobrevivÃncia e ativaÃÃo de folÃculos primordiais, e na expressÃo de genes para o sistema de TNF-&#945; no tecido ovariano cultivado caprino. Os nÃveis de BMP-15, BMPR-IB e GDF-9 em folÃculos primordiais/primÃrios e secundÃrios, bem como em CCOs e parede folicular de folÃculos antrais foram avaliados por PCR em tempo real (experimento 1). Para os estudos in vitro, fragmentos de tecido ovariano foram cultivados por seis dias em &#945;-MEM sozinho ou suplementado com EGF (100ug), PHA (10&#956;g/mL) ou ambos (experimento 2). Antes e depois do cultivo, o tecido ovariano foi processado para anÃlise morfolÃgica ou armazenado para avaliar a expressÃo de RNAm para TNF-&#945; e seus receptores. Os resultados mostraram que a expressÃo de BMP-15 e GDF-9 em folÃculos primordiais/primÃrios de cabras infectadas foram significativamente maiores do que em animais saudÃveis, mas a expressÃo de GDF-9 em folÃculos secundÃrios de cabras infectadas foi significativamente menor. AlÃm disso, a expressÃo de RNAm para BMP-15 na parede folicular de folÃculos antrais de cabras infectadas foi significativamente maior do que em cabras saudÃveis. ApÃs o cultivo dos fragmentos ovarianos em todos os meios testados, observou-se a reduÃÃo nos percentuais de folÃculos primordiais, e aumento de folÃculos em desenvolvimento quando comparado ao grupo controle nÃo cultivado. AlÃm disso, houve um aumento significativo no diÃmetro folicular apÃs cultivo em meio suplementado com EGF. ApÃs o cultivo de tecido ovariano de cabras infectadas em meio suplementado com PHA, os folÃculos primordiais apresentavam diÃmetros maiores do que os de animais saudÃveis. AlÃm disso, observou-se um aumento nos nÃveis de RNAm para TNF-&#945; apÃs cultivo de tecido ovariano na presenÃa de ambos EGF e PHA em animais saudÃveis, mas este mesmo tratamento proporcionou uma reduÃÃo de RNAm para TNF-&#945; e aumento dos transcritos de TNFR-II em animais infectados. Pode-se concluir que a CAE influencia a expressÃo de RNAm para BMP-15 e GDF-9 em folÃculos ovarianos caprinos e a PHA e o EGF diferencialmente regulam a expressÃo de TNF-&#945; e TNFR-II em tecidos ovarianos. / This study aims to investigate the effects of caprine arthritis encephalitis (CAE) on the expression of BMP-15, BMPR-IB and GDF-9 in ovarian follicles, as well as the effects of phytohemagglutinin (PHA) and EGF on the survival and activation of primordial follicles, and on expression of mRNA for TNF-&#945; and its receptors in cultured goat ovarian tissue. The levels of BMP-15, BMPR-IB and GDF-9 in primordial/primary and secondary follicles, as well as in COCs and follicular walls from antral follicles were evacuated by real-time PCR (experiment 1). Ovarian tissues were cultured for six days in &#945;-MEM+ alone or supplemented with EGF (100Âg/mL), PHA (10Âg/mL) or both (experiment 2). Before and after culture, ovarian fragments were processed for morphological analysis or stored to evaluate the expression of mRNA for TNF&#945; and its receptors. The results showed that the expression of BMP-15 and GDF-9 in primordial/primary follicles from infected goats was significantly higher than in health animals, but the expression of GDF-9 in secondary follicles from infected goats was significantly lower. Additionally, the expression of mRNA for BMP-15 in follicular wall of antral follicles from infected goats was significantly higher than in healthy goats. After culturing ovarian fragments in all tested media, reduced percentages of primordial follicles, and increased of developing follicles was observed when compared to uncultured control. Furthermore, there was a significant increase in follicular diameter after culture in medium supplemented with EGF. Ovarian tissue from infected goats cultured in medium supplemented with PHA had primordial follicles with higher diameters than those from healthy animals. An increase in the levels of mRNAs for TNF-&#945; was observed after culturing ovarian tissue in presence of both EGF and PHA in healthy animals, but this same treatment promoted a reduction of mRNAs for TNF-&#945; and and increase of TNFR-II transcripts in infected animals. In conclusion, CAE influences the expression of mRNA for BMP-15 and GDF-9 in goat ovarian follicles and PHA and EGF differentially regulate the expression of TNF&#945; and TNFR-II in cultured ovarian tissue.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-09-19T12:33:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação de Mestrado com Ficha Catalográfica - Leonilda (6).pdf: 1607291 bytes, checksum: 83e1d52bc2be1f64f2a2a27dc1f58889 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-19T12:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação de Mestrado com Ficha Catalográfica - Leonilda (6).pdf: 1607291 bytes, checksum: 83e1d52bc2be1f64f2a2a27dc1f58889 (MD5) Previous issue date: 2016-02-18 / A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana 1 (HIV-1) tem como característica clássica a depleção de linfócitos T (LT) CD4+, que quando não tratada culmina na Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Com o surgimento terapia antirretroviral (TARV), na década de 80, ocorreu uma verdadeira revolução. A TARV, apesar de não eliminar o vírus, consegue manter a carga viral em níveis indetectáveis, melhorando a qualidade de vida dos portadores. No entanto, entre 15-30% dos indivíduos em uso regular de TARV e com carga viral indetectável não consegue recuperar os níveis de LT CD4+ (Recuperação Imunológica). Estudos apontam que a apoptose pode estar envolvida na diminuição dos LT CD4+ e que variações genéticas como polimorfismos de base única (SNPs) em moléculas envolvidas nas vias da apoptose podem levar a diferentes respostas imunológicas do indivíduo à infecção. Neste sentido, o presente estudo se propôs a investigar o papel de SNPs (rs1800692, rs767455, rs2270926, rs8904, rs1800629) em genes codificadores de proteínas que ativam a via extrínseca da apoptose através do TNF-α/TNFR1, e sua relação com a recuperação imunológica de pacientes com uso regular de TARV. Foram estudados 113 pacientes HIV positivos, atendidos e tratados no Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP), em uso de TARV por um ano e com carga viral indetectável, os quais foram divididos em dois grupos: sucesso imunológico (controle) e falha imunológica (caso). Não foram observadas associações entre os polimorfismos dos genes estudados com o sucesso ou falha imunológica apresentada pelos indivíduos fazendo uso regular da TARV. Também não foi observada nenhuma associação entre a falha imunológica e as variáveis clínicas: peso, etnia, idade, gênero e esquema terapêutico. Apesar da ausência de associações dos SNPs estudados com a falha imunológica, alguns fatores limitantes do estudo devem ser considerados (pequeno número amostral, não inclusão de outras moléculas da via estudada), se fazendo necessário novos estudos de réplica em outras populações. / Infection by Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) has as a classic feature the depletion of T lymphocytes (TL) CD4 + that, when untreated, culminates in Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). With the advent of HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy), in the 80s, there was a real revolution. The ART, although it doesn't eliminate the virus, it can keep the viral load in undetectable levels, improving the quality in patient's' lifes. However, 15-30% of individuals regularly using HAART and with undetectable viral load, cannot recover CD4 + LT levels (Immune Recovery). Studies have shown that apoptosis may be involved in CD4 + depletion and genetic variations, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs), in molecules involved in apoptosis pathways can lead to different immune responses from the individuals to the infection. Therefore, the present study aims to investigate the role of SNPs (rs1800692, rs767455, rs2270926, rs8904, rs1800629) in genes encoding proteins that activate the extrinsic pathway of apoptosis, by TNF-α / TNFR1, and its relationship with immune recovery of patients in regular use of HAART. We studied 113 HIV-positive patients assisted and treated by the Institute of Integrative Medicine Professor Fernando Figueira (IMIP), who were under HAART for at least one year and with undetectable viral load, which we divided into two groups: immunological success (control) and immunological failure (case). There were no associations between the polymorphisms of the studied genes with the immune failure presented by individuals making regular use of HAART. Also, it has been observed no associations between the immunologic failure with the clinical variables: weight, ethnicity, age, gender and treatment regimen. Despite the absence of associations of SNPs studied with immunological failure, some limitations of the study should be considered (small sample size, no inclusion of other molecules of the studied pathway), thus new replica studies in other populations are necessary.

Herpes Zoster é uma doença causada pela reativação do vírus Varicela Zoster nos gânglios sensoriais, caracterizada pelo desenvolvimento de lesões na pele e dor. Não há modelos animais disponíveis para estudo da patofisiologia da doença. No entanto, um modelo murino que utiliza o HSV-1 tem sido usado para tal fim, visto que os animais desenvolvem lesões zosteriformes e desenvolvem hipersensibilidade na pata infectada. Não há dados na literatura acerca da resposta imune que se desenvolve nos gânglios da raiz dorsal destes animais. Logo, o objetivo deste trabalho foi o de avaliar células e mediadores inflamatórios presentes nos gânglios da raiz dorsal e sua relação com a hiperalgesia durante a infecção cutânea por HSV-1. Durante a fase aguda da infecção, os camundongos desenvolveram hiperalgesia nas patas ipsilaterais a partir do 3 dia pós-infecção, que perdurou até o 7 dia pós-infecção. A maior carga viral foi detectada nos gânglios L4, L5 e L6, os quais compõem o nervo ciático, que inerva a área infectada. O tratamento dos animais infectados com dexametasona ou fucoidina resultou na redução do comportamento de hiperalgesia, a partir do 5 dia pós-infecção, que corresponde ao período em que a migração de leucócitos passa a aumentar nos gânglios da raiz dorsal. Macrófagos, neutrófilos e linfócitos T CD4 foram detectados nos gânglios durante a infecção aguda. No entanto, linfócitos T CD8 estavam ausentes. A expressão do mRNA de TNF- e COX-2 estava aumentada nos gânglios, e o tratamento de animais infectados com drogas inibidoras de ambos resultou na redução da hiperalgesia. Os receptores do tipo Toll-like e da IL-1 não participam da geração da hipersensibilidade herpética. Após 50 dias da infecção, constatou-se que alguns animais apresentavam comportamento de hiperalgesia irreversível, semelhante à neuralgia pós-herpética humana (NPH). Não houve diferença significativa na incidência da NPH em animais de linhagens ou sexos diferentes. Ainda, o tratamento com drogas anticonvulsivantes e antidepressivas, mas não com morfina e anti-inflamatórios, resultou na redução transiente da hiperalgesia. Neste período, não há participação da inflamação na manutenção da hiperalgesia. A expressão de TNF- e COX-2 retorna aos níveis basais, e não são mais detectados neutrófilos e macrófagos. No entanto, a migração de linfócitos T CD4+ e CD8+ aos gânglios aumenta de maneira tempo-dependente. Durante a NPH, detectou-se uma intensa ativação das células satélites gliais, que contribuem para a manutenção da hiperalgesia pós-herpética. Nossos resultados demonstram que a manutenção hiperalgesia herpética é resultado da intensa resposta inflamatória que ocorre nos gânglios da raiz dorsal infectados, com aumento da produção de TNF- e COX-2, importantes mediadores para a hipersensibilidade. No entanto, durante a neuralgia pós-herpética, não há participação de células ou mediadores inflamatórios, mas de células da glia, as quais são importantes na manutenção da hiperalgesia. / Herpes Zoster is a disease caused by reactivation of varicella zoster virus in sensory ganglia, characterized by dermal rash and pain. There are no animal models available to study the pathophysiology of the disease. A murine model of HSV-1 infection on the hind paw skin has been used to study HZ, since mice develop HZ-like skin lesions and pain-related responses. There are no data available about the immune response in dorsal root ganglion (DRG) of these mice. Thus, the aim of this study was to evaluate cells and inflammatory mediators present in DRGs and its relationship with hiperalgesia during HSV-1 cutaneous infection. During the acute phase of infection, mice developed hyperalgesia in ipsilateral paws from 3 days post-infection, which persisted until 7 days post-infection. The highest viral load was detected in ganglia L4, L5 and L6. Treatment of infected mice with fucoidin or dexamethasone resulted in the reduction of hyperalgesic behavior, from the 5th post-infection day, which corresponds to the period in which leukocyte migration increase in the dorsal root ganglia. Macrophages, neutrophils and CD4 + T lymphocytes were detected in the ganglia during acute infection. However, CD8 + T lymphocytes were absent. The mRNA expression of TNF- and COX-2 was increased in dorsal root ganglia, and the treatment of infected mice with drugs that inhibits both mediators resulted in reduced hyperalgesia. The Toll-like receptors and IL-1 does not participate in the generation of herpetic hypersensitivity. After 50 days of infection, it was found that some animals presented irreversible hyperalgesic behavior, like human post-herpetic neuralgia (PHN). There was no significant difference in the incidence of PHN in animals of different genders or strains. Furthermore, treatment with anticonvulsant and antidepressant drugs, but not morphine and anti-inflammatory, resulted in transient reduction of hyperalgesia. In this period, there is no participation of inflammation in the hyperalgesia maintenance of. The expression of TNF- and COX-2 returns to baseline levels, and neutrophils and macrophages are no longer detected. However, the migration of CD4 + and CD8 + to ganglia increases in a time-dependent manner. During NPH, an intense activation of glial cells satellites was detected, that contributes to the maintenance of post-herpetic hyperalgesia. Our results demonstrate that herpetic hyperalgesia maintenance is a result of an intense inflammatory response that occurs in the infected dorsal root ganglia, with increased production of TNF- and COX-2. However, during post-herpetic neuralgia, there is involvement of glial cells, which are important in hyperalgesia maintenance.

A sinalização purinérgica tem sido demonstrada como um um importante modulador dediversos processos fisiológicos e fisiopatológicos. Dentre os receptores purinérgicos, o receptor P2X7 distingui-se por requerir altas concentrações de ATP em sua ativação. As demonstrações prévias de que a glândula pineal responde a diferentes estímulos purinérgicose a altas concentrações de ATP sugere um papel para os receptores P2X7 nesta glândula, embora sua expressão e função não estivesse estabelecida. O objetivo deste trabalho, portanto, foi caracterizar funcionalmente o receptor P2X7 na glândula pineal de ratos. Os resultados obtidos demonstram, pela primeira vez, a expressão gênica e proteica do receptor P2X7 na glândula pineal. Os efeitos da ativação destes receptores levam a uma inibição nos níveis de melatonina induzida por isoprenalina por um mecanismo independente da via do fator de transcrição NF-kB e da fosfolipase C. Além disso, a estimulação destes receptores inibiu a síntese de TNF induzida por LPS, resultado este semelhante ao observado na presença do pré-tratamento com antagonistas do receptor P2X7. Estes dados confirmam a presença de receptores P2X7 na glândula pineal e reiteram o relevante papel da estimulação purinérgica a sobre a síntese de melatonina e sobre a capacidade da pineal em responder a PAMPs, como o LPS / Purinergic signalling has been demonstrated as an important modulator ofseveral physiological and pathophysiological processes. Among the purinergic receptors, the activation of P2X7 receptor requireshigh concentrations of ATP. The previous demonstration that the pineal gland is responsive to different purinergic stimulus and to high concentrations of ATPsuggests a role for P2X7, although its expression and function remained unclear. The aim of this study was to functionally characterize the P2X7 receptor in the rat pineal gland.The data showedthe P2X7 receptor mRNA and protein expression in the pineal gland. The effect of its activation leads toan inhibition of melatonin content induced by isoprenaline through an independent NF-kB and PLC pathways. Furthermore, the P2X7 receptor activation inhibits the LPS-induced TNF synthesis, a similar result observed in the presence of the pre-treatment with P2X7 receptors antagonists. These data demonstrate the presence of P2X7 receptors in the rat pineal gland and confirm the relevant role of the purinergic stimulation to the pineal melatonin synthesis and responsiveness to PAMPs such as LPS

A hipotermia é uma das respostas presentes em casos mais graves de sepse. Em modelos animais, essa hipotermia parece regulada e pode ter valor adaptativo quando a febre torna-se uma ameaça ao hospedeiro. A leptina é um hormônio produzido pelo tecido adiposo e está envolvido com balanço energético. Geralmente descrita como pró-inflamatória, a leptina ainda tem o seu papel controverso. Neste trabalho, avaliamos a leptina em doses fisiológicas em modelo de choque endotóxico em ratos. A leptina mostrou-se anti-inflamatória atenuando a hipotermia e a hipotensão induzidas por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) e reduzindo a secreção de TNF-&#945;. O mesmo efeito não foi observado quando infundida no sistema nervoso central. In vitro, a leptina não alterou a produção de TNF-&#945;, IL-1&#946; e IL-10 em macrófagos peritoneais e alveolares estimulados com LPS. Podemos concluir que, em doses fisiológicas, a leptina pode atuar em outras células da periferia que contêm seu receptor alterando a produção de TNF-&#945; e mediando a inflamação sistêmica. / Hypothermia is associated with most severe cases of sepsis. In animal models, this hypothermia may be regulated and may have adaptive value when fever becomes harmful to the host. Leptin is a hormone produced by fat tissue and involved in energy balance. Generally described as pro-inflammatory, leptin also has its controversial role. In this paper, we evaluate leptin in physiologic doses in model of endotoxin shock in rats. Leptin was found to be anti-inflammatory attenuating hypothermia and hypotension induced by bacterial lipopolysaccharide (LPS) and also reducing TNF-&#945; secretion. The same effect was not observed when infused into the central nervous system. In vitro, leptin did not change the TNF-&#945;, IL-1&#946; and IL-10 in peritoneal and alveolar macrophages stimulated with LPS. We can conclude that in physiologic doses, leptin can act on other peripheric cells that contain its receptor, changing TNF-&#945; production and mediating systemic inflammation.

PiT1/SLC20A1 a été identifiée pour la première fois comme récepteur rétroviral, puis de nombreuses autres études réalisées in vitro ont permis de révéler ces différentes fonctions. PiT1 est notamment un transporteur de phosphate-sodium dépendant. Par le biais de cette activité de transporteur de phosphate inorganique (Pi), PiT1 est impliqué dans plusieurs processus cellulaires comme la minéralisation osseuse, la calcification vasculaire (dans certaines pathologies), et la réabsorption rénale et intestinale de Pi. Dans notre laboratoire, afin de mieux caractériser les fonctions physiologiques de PiT1, un Knock Out (KO) total pour cette protéine a été généré. Les souris présentent un phénotype létal embryonnaire et une atteinte hépatique. Au vu de ces résultats, d’autres études, réalisées dans le laboratoire, ont mis en évidence l’implication de PiT1 dans la prolifération et l’apoptose cellulaire. Ces fonctions nouvellement décrites sont spécifiques à PiT1 et indépendantes de sa fonction de transporteur de Pi.Les objectifs majeurs de mon travail de thèse ont consisté à mieux comprendre le rôle de PiT1 dans les mécanismes apoptotiques déclenchés par le TNF-α. Pour cela, j’ai étudié la cascade d’activation du TNF-α dans les cellules Hela exprimant de manière stable un shPiT1 ou un shScramble. En effet, mes résultats suggèrent que l’association de TRAF2 ; un élément clé de l’activation de la voie des MAPKs ; à PiT1 par le bisais de sa large boucle intracellulaire, permettrait la dissociation des kinases en amont de la voie des MAPKs, GCK (MAP4K) et MLK3 (MAP3K), induisant leur désactivation et ainsi la régulation négative de JNK. La désactivation de JNK induit à son tour à l’inhibition des caspases et donc la signalisation apoptotique. Par ailleurs, j’ai montré que la suractivation de JNK dans les cellules invalidées pour PiT1 corrèle avec la dissocition antérieur du complexe TRAF2-cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (cIAPs). Ainsi, le complexe pro-apoptotique formé de la caspase-8, la protéine FAS-Associated via Death Domaine (FADD) et du Receptor Interactinf Protein 1 (RIP1) était plus actif.Par ailleurs, la boucle PiT1 et la boucle PiT2 ; son homologue ; ont été échangées, permettant ainsi l’obtention des protéines chimères P2-BclP1 et P1-BclP2. Celles-ci représenteraient des outils intéressants pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires engagés dans cette voie apoptotique. Enfin, le rôle de PiT1 dans l’apoptose induite par le TNF-α étudié dans des modèles cellulaires a été confirmé dans deux modèles murins faisant ainsi et pour la première fois un lien entre PiT1 et une pathologie inflammatoire, l’hépatite fulminante. Ces résultats montrent que l’absence de PiT1 sensibilise le foie à l’apoptose; à l’appui d’autres résultats ; PiT1 pourrait être considéré comme une cible thérapeutique dans des pathologies inflammatoires et cancéreuses. / PiT1/SLC20A1 was identified for the first time as retroviral receptor then phosphate inorganic-dependent sodium transporter activity. Through this more a function of phosphate inorganic (Pi) transporter, PiT1 is involved in multiple cellular processes such as bone mineralization, vascular calcification, renal and intestinal reabsorption of Pi. In our laboratory, a total mice Knock Out (KO) for this gene encoding for PiT1 was generated to characterize its physiological functions. The embryonic mice PiT1 KO have a lethal phenotype through liver damage. We have previously found that additional transport-independent functions. PiT1 is involeved in proliferation and in the regulation of tumour necrosis factor (TNF)-induced apoptosis. Modulated cells was mediated by an increased activation of c-Jun N-terminal Kinase (JNK).The aim of my study was to define the role of PiT1 in apoptotic mechanisms of TNF-α signaling. For that, I have studied the regulation cascade of TNF-α pathway in Hela cells expressing shPiT1 or shScramble. My results suggest that intra-cytoplasmic loop domain of PiT1 was interact with TRAF2 ; a key element in the MAPK pathway activation. Furthermore, we also have shown that TNF-induced association of two JNK upstream kinases (Germinal Centre Kinase (GCK or MAP4K) and Mixed Lineage Kinase 3 (MLK3 or MAP3K) to PiT1 suggesting that PiT1 inducing their deactivation and thus down-regulation of JNK. Furthermore, we have shown that JNK increased signalling in PiT1-depleted cells correlates with the earlier dissociation of TRAF2 – cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (cIAPs) complexes. Thus, the apoptotic complex formed by caspase-8, Fas-Associated protein via Death Domain (FADD) and Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) was more effectively activated. Moreover, PiT1 and PiT2 loops, were exchanged, thus allowing obtaining chimeric proteins BclP1-P2 and P1-BclP2. These proteins represent valuable tools to explore the mechanisms involved in the apoptotic pathway. Finally, we confirmed the relevance of these observations in vitro and showed that PiT1 gene conditional deletion in the liver of adult mice increases their sensitivity to fulminant hepatitis TNF-induced. These results are the first report of the involvement of PiT1 in a fatal pathology.

Esquistossomose é uma das doenças parasitárias com maior incidência mundial. Schistosoma mansoni, a única espécie encontrada no Brasil, tem um ciclo de vida complexo que inclui seis estágios de desenvolvimento distintos e dois hospedeiros, sendo um deles o homem. Nosso grupo identificou um gene que codifica um receptor que possui homologia com o receptor de TNF-&#945; humano em S. mansoni (SmTNFR) e descrevemos o efeito in vitro da citocina humana TNF-&#945; sobre a expressão gênica em larga escala no parasita. A via de sinalização através da qual o TNF-&#945; atua sobre o parasita permanece desconhecida. Em humanos, o TNF-&#945;, ao se ligar à isoforma do receptor que é mais semelhante ao SmTNFR, inicia uma cascata de fosforilação que conduz à ativação de diversas proteínas quinases que levam à ativação de fatores de transcrição. A nossa hipótese é a de que esta citocina humana atuaria no parasita de forma semelhante, resultando na alteração da expressão gênica do parasita observada em nosso trabalho anterior. No presente trabalho tivemos como objetivo verificar se há aumento de proteínas fosforiladas após o tratamento in vitro de vermes com o TNF-&#945; humano, e identificá-las, elucidando a via de sinalização induzida por esta citocina em S. mansoni. A fim de identificar as proteínas que são significativamente diferencialmente fosforiladas após exposição de S. mansoni à citocina humana, vermes machos adultos foram incubados em cultura por 15 min com TNF-&#945; (20 ng / ml), ou somente com o veículo, em controles, seguido da extração de proteínas totais. Utilizamos a abordagem fosfoproteômica por meio da realização de eletroforese bidimensional, seguida de coloração com corante específico para fosfoproteínas Pro-Q Diamond (Invitrogen). Para identificar quais proteínas tiveram fosforilação alterada pelo tratamento, fizemos uma análise quantitativa dos spots (volume dos spots) nas imagens dos géis corados com Pro-Q, utilizando o software 2D Platinum (GE). Em seguida a coloração de proteína total dos géis foi realizada utilizando Coomassie Blue Coloidal, para localização de todos os spots de proteínas de cada gel. Cortamos dos géis os spots de proteínas que apresentaram mudanças estatisticamente significativas na fosforilação (n = 3 réplicas; p <0,05, teste-t), com base na comparação de seus volumes relativos nas imagens dos géis das amostras tratadas comparadas com as controles, e em seguida as proteínas das amostras foram identificadas por espectrometria de massa. Analisamos três réplicas biológicas e observamos 45 spots que tiveram fosforilação significativamente alterada, sendo que 42 deles apresentaram fosforilação aumentada e 3 apresentaram fosforilação diminuída após o tratamento com a citocina. Entre os spots identificados por espectrometria de massa, verificou-se que proteínas relacionadas a processos metabólicos, sinalização celular, citoesqueleto e contração muscular estavam entre as que sofreram aumentos de fosforilação com o tratamento com TNF-&#945; humano. Embora a abordagem experimental adotada para este estudo não tenha sido sensível o suficiente para concluir qual via canônica de transdução de sinal é ativada por TNF-&#945; humano em S. mansoni, este estudo confirmou o aumento da fosforilação de proteínas-alvo induzido por TNF-&#945; humano, abrindo novos caminhos para uma investigação mais aprofundada que caracterize o papel das proteínas identificadas como alteradas por essa via de sinalização, e permita entender melhor a importância do TNF-&#945; humano na biologia do S. mansoni e na interação parasita-hospedeiro. / Schistosomiasis remains one of the parasitic diseases with the highest incidence worldwide. Schistosoma mansoni, the only species found in Brazil, has a complex life cycle which includes six life stages and two hosts, one of them being humans. Our group has identified a gene that encodes a TNF-alpha receptor-like in S. mansoni (SmTNFR) and described the in vitro effect of human TNF-alpha cytokine on large-scale gene expression of the parasite. The signaling pathways by which TNF-alpha acts upon the parasite remain unknown. In humans, when TNF-alpha binds to the receptor isoform that is most similar to SmTNFR it initiates a phosphorylation cascade that activates a signaling pathway leading to the activation of transcription factors. Our hypothesis is that this cytokine could act in the parasite through a phosphorylation cascade that activates transcription factors resulting in the change of gene expression observed in our previous work. The aim of this work was to verify if there were proteins that showed increased phosphorylation upon the in vitro treatment of worms with human TNF-alpha, identifying them, to try and elucidate the signaling pathway by which the cytokine acts in S. mansoni. In order to identify which proteins are significantly differentially phosphorylated upon exposure of S. mansoni to the human cytokine, we incubated male adult worms for 15 min in culture with human TNF-alpha (20 ng / ml), or with vehicle only, in controls, and we extracted total proteins from the parasites. We used the phosphoproteomics approach of bidimensional gel electrophoresis followed by phospho-specific staining of gels using Pro-Q Diamond dye (Invitrogen). To identify which proteins were phosphorylated or had their phosphorylation changed due to the treatment, we quantified the spots (determined the spots volumes) from Pro-Q stained gels using Image Master 2D Platinum software (GE). A total protein staining of the gels was performed using Coomassie Brilliant Blue (CBB) in order to localize all protein spots in the gel. We excised from CBB stained gels the protein spots that showed statistically significant changes in phosphorylation (n= 3 replicates; p-value<0.05, t-test), based on the relative volumes of their spot images with respect to the total volume of spots in the gel, with samples from treated compared to control parasites, and subsequently the proteins in these samples were identified by mass spectrometry. We have analyzed three biological replicates and observed 45 spots that were differentially phosphorylated; 42 of them had their phosphorylation increased and 3 had their phosphorylation decreased upon a 15-min-treatment of male adult worms with the cytokine. Among the spots identified by mass spectrometry, we found proteins related to metabolic process, cell signaling, and cytoskeleton and muscle contraction. Although the experimental approach adopted for this study was not sensitive enough to conclude which canonical signal transduction pathway is activated by human TNF-alpha in S. mansoni, this kind of study confirmed the increase in phosphorylation of target proteins induced by human TNF-alpha, opening new paths for further investigation in order to characterize the role of the proteins identified as altered by this specific signaling, which will lead to a better understanding of the importance of this cytokine in the biology of S. mansoni and in host-parasite interaction.

Bei juveniler idiopathischer Arthritis konnte eine prämature Immunoseneszenz nachgewiesen werden. Ein Erklärungsmodell ist, dass die prämature Immunoseneszenz den primären Defekt darstellt, der das Immunsystem zum Versagen der Selbsttoleranz führt. Eine andere Deutungsmöglichkeit stellt die prämature Immunoseneszenz als Folge von chronischer Stimulation und Aktivierung des Immunsystems durch die Autoimmunerkrankung selbst dar. In dieser Arbeit wurden die Immunoseneszenz-Parameter (naive T-Zellen, RTE, IL-7-Level, TRECs, relative Telomerlänge, Ki-67-Expression) von JIA-Patienten - unterteilt in eine DMARD-Gruppe und eine TNFα-Inhibitor-Gruppe - mit denen von gesunden Vergleichsprobanden verglichen. Eine fortgeschrittenere Immunoseneszenz bei den Gesunden könnte möglicherweise durch vermehrte chronische Virusinfekte erklärt werden, die jedoch in dieser Arbeit nicht erfasst wurden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine potenzielle Rekonstitutionsfähigkeit mit Verbesserung der Immunoseneszenz-Parameter bei DMARD-Therapie demonstriert werden. So trat ein höherer Anteil an naiven T-Zellen und an RTE auf, was vermuten lässt, dass der fortschreitende Verlust der Thymusfunktion bei Patienten mit Autoimmunerkrankung reversibel sein könnte. Bei Vergleich der TNFi-Patienten mit der DMARD-Gruppe konnte eine weiter fortgeschrittene Immunoseneszenz festgestellt werden. Dies könnte durch die Ansammlung von schwereren, DMARD-refraktären Patienten, aber auch durch die unterschiedliche, aber nicht-signifikante Altersverteilung bedingt sein. Bei längerer Einnahmedauer des TNFα-Inhibitors zeigte sich ein tendenziell stärkeres Auftreten von naiven T-Zellen und RTE, kombiniert mit geringeren Anteilen differenzierterer Subpopulationen. So scheinen TNFα-Inhibitoren die Fähigkeit zu besitzen, die prämature Immunoseneszenz positiv zu beeinflussen oder zumindest eine Verlangsamung des prämaturen Alterungsvorgangs zu bewirken. / In juvenile idiopathic arthritis, a premature immunosenescence was shown. One possible explanation is that premature immunosenescence causes the primary defect which leads to the break-down of self-tolerance. Another possibility is that premature immunosenescence is the consequence of chronical stimulation and immune activation through the disease itself. For this dissertation, parameters of premature immunosenescence (namely naive T-cells, RTE, IL-7, TREC, RTL, expression of Ki-67) were determined in JIA patients - divided into two distinct groups with and without TNF alpha inhibitor (“DMARD”, “TNFi”) - and compared to healthy controls. More advanced immunosenescence in healthy subjects might be due to increased occurrence of chronic viral infections, which were not examined here. In DMARD, potential reconstitution with improvement of aging parameters was demonstrated. Higher percentages of naive T-cells and RTE could lead to the hypothesis that the progressive loss of thymic function might be reversible in patients with autoimmune diseases. In TNFi, parameters indicated more advanced immunosenescence. This could be explained by more severe cases of JIA, refractory to conventional treatment, or slightly, not-significant differences in the age distribution. With longer intake of TNFi, increased percentages of naive T-cells and RTE with decrease of further differentiated subsets were shown. Hence, TNFα inhibitors seem to have the ability to influence the immune system positively or to lead at least to a deceleration of the premature aging process.

[pt] Simulações de dinâmica molecular coarse-grained foram usadas para investigar diferentes polímeros para o encapsulamento de um siRNA para a transposição em modelos de surfactante pulmonar. Os modelos consistiam em uma monocamada de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC) ou uma mistura 70:30 de DPPC e 1,2-palmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1 -sn-glicerol) (DPPG). Os nanocarreadores escolhidos para encapsular o siRNA anti-TNF foram o polietilenoglicol (PEG) e a polietilenimina (PEI). Acredita-se que o uso do siRNA para o silenciamento genético da citocina TNF pode ser terapêutico para algumas doenças inflamatórias, em especial, pulmonares. As simulações mostraram que as nanopartículas contendo apenas PEG promovem o arraste de fosfolipídeos do modelo de surfactante pulmonar, formando uma coroa lipídica. As nanopartículas contendo apenas PEI ou PEI e PEG causaram certas perturbações à monocamada, porém, nenhum colapso do filme durante a transposição da nanopartícula foi observado. O método de amostragem guarda-chuva foi utilizado para calcular a energia livre de Gibbs da transposição da nanopartícula através do modelo de surfactante pulmonar contendo apenas DPPC. A presença do PEG na nanopartícula causou uma diminuição na energia livre de Gibbs em relação ao siRNA nãoencapsulado, enquanto a presença do PEI não causou mudança. Os resultados implicam que siRNA encapsulado com ambos PEI e PEG melhoram a transposição do siRNA anti-TNF através de modelos de surfactante pulmonar na interface gáslíquido. / [en] Coarse-grained molecular dynamics was used to investigate different polymers to encapsulate the siRNA for its transposition through two lung surfactant models. These models consisted of a monolayer containing either 1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) or a 70:30 mixture of DPPC and 1,2- palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1 -sn-glycerol) (DPPG). The nanocarriers chosen to encapsulate the anti-TNF siRNA were polyethylene glycol (PEG) and polyethyleneimine (PEI). It is believed that the use of siRNA to genetically silence the cytokine TNF might be therapeutic to treat several inflammatory diseases, in particular, pulmonary ones. The simulations showed that the nanoparticles containing PEG promoted the lipid depletion of the lung surfactant model by forming a lipid corona. The nanoparticles containing only PEI, or both PEG and PEI showed some perturbation of the lung surfactant model, however no collapse during the nanoparticle transposition was observed. The umbrella sampling method was used to calculate the Gibbs free energy of transposition through the pure DPPC lung surfactant model. The nanoparticles containing PEG showed a decreased Gibbs free energy as compared with naked siRNA, while PEI nanoparticles have not caused any change. The implication of this finding is that siRNA encapsulated with both PEI and PEG enhances the transposition of anti-TNF siRNA through lung surfactant models at the gas-liquid interface.