Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d’une part le développementd’une nouvelle famille de protéines artificielles et d’autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L’objectif général était de développer une approchegénérale permettant d’obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d’anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d’expression, insensibilité à l’agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d’une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d’un motif idéalisé à partir d’une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l’architecture αRep choisie : Les protéines s’expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l’amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d’une bibliothèque d’αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d’exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L’ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l’organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées. / The main objective of this work was to design, produce and characterize a new familyof artificial proteins and to introduce new tailored specific binding sites within this structuralframework. Our general goal was to develop method allowing to rapidly generate newprotein binding specifically to any predefined target macromolecule. Binders based onartificial proteins can be viewed as antibody-like molecules but due to their different structurehave more favorable physical properties (expression, solubility, folding efficiency, stability)than antibodies and derivatives.The design and experimental assembly of a first generation artificial protein library isdescribed in part I. Proteins of this library are made by a repetition of a motif idealized from afamily of natural protein repeats (HEAT repeat). These artificial proteins, named αRep, havethe same general fold but the number of the repeated motif vary from protein to protein.Furthermore, a set of positions of each motif is highly variable within the library. Proteinisolated from this first generation library are well expressed, soluble, extremely stable andwere shown to have the designed secondary and tertiary structure.The methods used to improve the diversity and the experimental quality of the protein libraryare described in the second part of this thesis and have allowed us to create a secondgeneration αRep library. This library is based on the same general scheme but its diversitywas optimized by an improved design and experimental procedures known as filtration/shuffling.This highly diverse second generation library (1.7*109 independent clones) was usedto select variants with tailored binding specificities using phage display method. The resultsclearly show that news αReps binding tightly and specifically a range of arbitrarily definedprotein targets can be efficiently selected. The tertiary structure of complexes between αRepand their cognate target molecule were solved and allow to analyze the nature and detailedorganization of this newly engineered molecular recognition capacities.

Le film hydrolipidique est « l’ultime frontière entre l’organisme et l’environnement ». Ainsi, il offre à la peau une bonne protection et contribue largement à ses propriétés. Cependant, il peut être impliqué dans plusieurs perturbations cutanées. Le but de ce travail était d’obtenir un profil global de l’ensemble des lipides cutanés de surface, riche en informations structurales et capable de décrire l’organisation de ces molécules, permettant de suivre l’évolution physiologique du film hydrolipidique au niveau moléculaire. Plusieurs approches analytiques ont été développées et des outils statistiques et chimiométriques ont été utilisés pour exploiter les résultats.La caractérisation des lipides cutanés de surface (LCS) a été réalisée en chromatographie en phase gazeuse à haute température couplée à la spectrométrie de masse (HT-GC/MS). Le protocole analytique a été développé en conservant les structures lipidiques dans leur état intact. Plus de 200 composés ont été identifiés et répartis en 5 classes : acides gras libres, hydrocarbures, cires, stérols et glycérides. L’acide palmitique (C16:0) et l’acide sapiénique (C16:16) sont prépondérants et entrent dans la structure de très nombreux composés. Plusieurs approches quantitatives ont été mises en place : calcul des descripteurs chromatographiques, normalisation interne pour l’analyse par classe et exploitation chimiométrique des composés considérés individuellement.Trois problématiques ont été explorées par ces techniques et ont conduit aux résultats suivants :La répartition des LCS sur différentes zones corporelles se traduit par un ratio squalène/cholestérol plus élevé dans les zones riches en glandes sébacées que dans les zones pauvres. Ce descripteur est ainsi un bon critère d’évaluation de la balance sécrétion sébacée/desquamation. L’évolution des LCS en fonction de la localisation géographique et/ou la couleur de la peau a été étudiée en cherchant les variations de la composition par HT-GC/MS et de l’organisation par spectroscopie Raman. Une différence de composition a été mise en évidence entre les volontaires en fonction de la localisation géographique : le composé le plus impliqué est l’acide sapiénique (C16:1Δ6). Une différence de conformation (trans/gauche) au niveau des chaînes alkyles a été détectée.Enfin, l’adaptation de la barrière cutanée après la naissance a été déjà signalée mais sa traduction au plan moléculaire a pu être étudiée par le protocole analytique développé, chez les nourrissons dès les premiers jours après la naissance jusqu’à l’âge de 6 mois. Une diminution de la quantité globale de sécrétion sébacée a été observée, avec en parallèle, une augmentation sélective du cholestérol estérifié par des acides gras d’origine épidermique. Ceci indique un accroissement de la participation relative des lipides épidermiques dans le film hydrolipidique comme résultat d’une diminution de la sécrétion sébacée.Les approches analytiques développées dans ce travail de thèse permettent une caractérisation moléculaire fine des LCS en vue d’étudier l’évolution physiologique du film hydrolipidique. Les outils statistiques et chimiométriques ont permis une exploitation plus poussée des résultats pour extraire des informations inaccessibles par les approches classiques. Ce travail d’investigation offre de nombreuses perspectives, très prometteuses dans le domaine médical et dans le domaine cosmétique. / Skin hydrolipidic film is "the final frontier between the organism and the environment." Thus, it provides skin protection and contributes to its properties. However, it may be involved in several skin disturbances. The aim of this study was to obtain an overall profile of skin surface lipids (SSLs), rich in structural information and able to describe the organization of these molecules. This information allows monitoring the physiological evolution of hydrolipidic film at the molecular level. Several analytical approaches have been developed and chemometric and statistical tools were used to improve the interpretation of the results.SSL characterization was performed using high-temperature gas chromatography coupled with mass spectrometry (HT-GC/MS). The analytical protocol has been developed keeping the lipids in their intact structures. Over than 200 compounds were identified in the same run. These compounds have been classified in five lipid classes: free fatty acids, hydrocarbons, waxes, sterols and glycerides. The palmitic acid (C16:0) and sapienic acid (C16:16) are predominant and participate in the structure of many compounds. Several quantitative approaches have been implemented: calculation of chromatographic descriptors, normalization of the peak area for analysis by class and chemometric exploitation of individual compounds data.Three issues were explored by these techniques and lead to have the following results:The SSL distribution on different areas of the body, expressed as a squalene / cholesterol ratio, is higher in body areas rich in sebaceous glands than in poor areas. This descriptor is thus a good criterion for sebum secretion / desquamation balance measurement.The SSL evolution based on the geographical location and / or color of skin has been investigated by studying the variations in the composition and organization using HT-GC/MS and Raman spectroscopy. A difference in composition has been demonstrated between the volunteers according to geographical location: the most involved compound is the sapienic acid (C16: 1Δ6). A difference in conformation (trans / gauche) of at the alkyl chains was detected. Skin barrier adaptation after birth has already been reported. In this study, its evolution at the molecular level has been studied in infants from the first days after birth until the age of 6 months. A decrease in the total amount of sebaceous secretion was observed with, in parallel, an increase of cholesterol esterified with fatty acids of epidermal origin. This indicates an increase in the relative participation of epidermal lipids in the hydrolipidic film as the result of a decrease in sebaceous secretion. The analytical approaches developed in this thesis provide a detailed molecular characterization of SSLs in order to study the physiological evolution of the skin hydrolipidic film. Statistical and chemometric tools have allowed further exploitation of the results to extract information not accessible by conventional approaches. This investigative work offers many opportunities, promising in medicine and in cosmetics.

Le sommeil constitue un comportement vital complexe, identifié chez la quasi-totalité des animaux étudiés. Sur la base d’études princeps dans les années 50 chez le chat et l’homme, le sommeil a pu être séparé clairement en deux états distincts : le sommeil lent et le sommeil paradoxal. Ces deux états ont ainsi été caractérisés sur la base de critères électroencéphalographiques, physiologiques et comportementaux. Basé sur une définition mammalienne, il a ainsi été montré que les mammifères terrestres et les oiseaux, tous deux homéothermes, possédaient ces deux états de sommeil. Cependant, l'origine évolutive de ces deux états reste inconnue et nous ne savons toujours pas s’ils ont évolué de façon indépendante ou s’ils ont été hérités d'un ancêtre commun. Les amphibiens et les reptiles, positionnés à la base des tétrapodes et des amniotes constituent par conséquent, des taxons clés dans la compréhension de l'évolution de ces deux états de sommeil. Afin de mieux comprendre la phylogénie de ces deux états, nous avons réalisé dans un premier temps une revue et méta-analyse de la littérature du sommeil chez ces espèces. Dans un second temps, et dans le but de pouvoir conduire des approches comparatives et ainsi mieux décrire la plasticité du sommeil, nous avons développé un dispositif miniature sans fil permettant d’enregistrer simultanément l’électrophysiologie, la physiologie, la température et le comportement en laboratoire et en milieu naturel. Enfin, nous avons conduit une étude électrophysiologique, physiologique, pharmacologique et comportementale chez deux espèces de squamates (Salvator merianae et Pogona vitticeps). Cette étude nous a permis de montrer que deux états électroencéphalographiques de sommeil existaient chez ces espèces. Cependant, elles ont aussi révélé des divergences phénotypiques importantes au sein même des lézards, ainsi qu’avec le sommeil des mammifères et des oiseaux, démontrant ainsi une origine commune mais complexe des deux états de sommeil / Sleep is a vital and complex behavior, identified in nearly all animals. Based on studies on cats and humans conducted in the 50’s, sleep was separated into two distinct sleep states: slow wave sleep and paradoxical sleep (or REM sleep). Those two states were identified based on electroencephalographic, physiological and behavioral parameters. Based on this mammalian definition, it has been demonstrated that those two states exist in terrestrial mammals and birds, both homeotherms. However, the evolutive origin of these sleeps states remains unknown and we do not know whether they evolved independently or if they were inherited from a common ancestor. Amphibians and reptiles are respectively positioned at the base of the tetrapod and the amniote tree. Therefore, they constitute key taxa in the understanding of the origin of these states. In order to understand the phylogeny of these states, we first performed an exhaustive review and meta-analysis of the sleep literature in these groups. Next, in order to be able to conduct comparative approaches and better understand the sleep plasticity, we developed a standalone miniature device to record electrophysiology, physiology, temperature, and behavior simultaneously and this under both lab and field conditions. Finally, we conducted an electrophysiological, physiological, pharmacological and behavioral study of two squamates species (Salvator merianae and Pogona vitticeps). This study revealed that two electro-encephalographical sleep states exist in these species. However, they also showed that the phenotype of these states diverged between the two lizards and between the lizards on the one hand and mammals and birds on the other hand. This would suggest a common, but complex, origin of these two sleep states

Le chapiteau ibéro-maghrébin apparaît aujourd’hui comme l’une des expressions les plus caractéristiques de la sculpture islamique médiévale : il connaît du IXe au XIVe siècle, avec une riche production, une incessante adaptation à son contexte politique et social ; il s’affirme ainsi comme un reflet privilégié de l’art islamique en Occident et de son évolution. Notre choix s’est porté sur cet élément architectural car il apparaît comme un élément clé — membre d’architecture et œuvre ornementale à la fois — pour appréhender l’art et les techniques du monde ibéro-maghrébin du bas Moyen Age confrontée à la poussée chrétienne des XIIIe et XIVe siècles. Seules les villes nasrides, mérinides et abd al-wadides échappent aux reconquêtes du XIIIe siècle. Le chapiteau constitue l’un des témoins de ce nouveau contexte historique et géographique de l’art islamique d’Occident. Pour mieux saisir ce phénomène, nous avons pris le parti d’étudier les chapiteaux islamiques ibéro-maghrébins dans une perspective diachronique. Ils apparaissent comme le fruit d’une longue évolution que nous avons tenté de saisir dans sa globalité avant de mettre en lumière, à partir d’un catalogue raisonné, la production des trois émirats et des diverses écoles développées au bas Moyen Age. La perspective ibéro-maghrébine retenue a permis d’établir une grille de classement typologique inédite, qui englobe toute la zone visée. Elle met en lumière une évidente évolution et une diversité qui révèle les particularismes liés à la vitalité de foyers d’art sans cesse plus nombreux. Cette évolution, marquée par bien des diversifications régionales, témoigne, au reste aussi bien, de riches échanges entre les émirats de l’aire culturelle ibéro-maghrébine. / The Ibero-Maghrebian capital is one of the most characteristic forms of medieval Islamic sculpture. Prolifically produced from the 9th to the 14th century, it was constantly adapted to its social and political context, and became a prime reflection of Islamic art in the West and its evolution. In the present work I chose to focus on this architectural element because it is key, as at once architectural member and ornamental work, to understanding the art and techniques of the Ibero-Maghrebian world of the Low Middle Ages, and notably its confrontation with the Christian push of the 13th and 14th centuries. Only Nasrid, Marinid and Zayyanid cities escaped the reconquests of the 13th century, and the capital is one of the reflections of this new historical and geographical context for Islamic art in the West. To better grasp this phenomenon, I chose to study Ibero-Maghrebian Islamic capitals from a diachronic perspective. These capitals are the fruit of a long process of evolution, which I describe overall before examining the production of the three emirates and the various schools developed in the Low Middle Ages. By taking an Ibero-Maghrebian perspective, I was able to establish a novel typological framework which encompasses productions throughout the entire area. It highlights clear change over time and a diversity that reflects particularisms linked to the vitality of increasingly numerous centres of production. This evolution, marked by many regional diversifications, testifies to the rich exchanges between the emirates of the Ibero-Maghrebian cultural space.

Le poisson Astyanax mexicanus présente, au sein de la même espèce, plusieurs populations de poissons de rivières (SF) et de poissons de grottes aveugles (CF). Chez les poisons cavernicoles aveugles, les yeux se développent presque normalement pendant l’embryogenèse. Mais 24 heures après la fécondation (hpf), quand l’embryon éclot, le cristallin entre en apoptose, ce qui déclenche la dégénérescence progressive de l’œil entier. Mon projet de thèse visait à comprendre le mécanisme conduisant à l’apoptose du cristallin, jusqu’alors totalement incompris, en partant du postulat selon lequel le défaut devait avoir lieu pendant les stades précoces du développement du cristallin. Le cristallin se développe à partir d’une placode, un épaississement de l’ectoderme au stade neurula. Toutes les placodes, qui donnent naissance à des organes des sens de la tête, sont issues du champ panplacodal, situé à la bordure de la plaque neurale antérieure à 10 hpf. Nous avons comparé la régionalisation de ce champ chez les deux morphes, par hybridations in situ de gènes marqueurs des différentes placodes. Chez le CF, le territoire présomptif du cristallin est réduit à 10 hpf, et le cristallin est plus petit à tous les stades étudiés. D’autre part, la placode olfactive est étendue, et donne naissance à un épithélium olfactif plus large chez le CF. Les modifications de taille de ces deux placodes pourraient être le résultat évolutif d’un « trade-off » entre ces deux composantes sensorielles. La régionalisation modifiée du champ panplacodal chez le CF est due au moins partiellement à des différences spatiales et temporelles d’expression des molécules de signalisation Shh, Fgf, et peut-être Bmp4.Nous avons pensé que la petite taille du cristallin pouvait être la cause directe de son entrée en apoptose, par un défaut d’effet de communauté. Nous avons réalisé une ablation laser partielle des cellules précurseurs du cristallin à 12-14 hpf chez l’embryon SF, mimant ainsi la taille du cristallin CF. L’apoptose dans le petit cristallin des larves SF à 60 hpf n’a pas été augmentée, ce qui montre que la petite taille n’est pas suffisante pour induire l’apoptose.L’apoptose du cristallin pourrait aussi provenir de défauts de morphogenèse ou d’un problème de lignage cellulaire. Nous utilisons donc l’imagerie biphoton in vivo sur des embryons SF et CF, de 10 à 24 hpf, préalablement injectés au stade une cellule avec des ARNm de H2B-mCherry et Ras-GFP pour marquer les noyaux et les membranes. Les premiers résultats sur les poissons de surface montrent que nous pouvons suivre à rebours les cellules du cristallin de la fin du film jusqu’au champ panplacodal, et étudier la morphogenèse et les divisions.La différenciation du cristallin est également affectée chez le CF : au moins 5 cristallines, qui sont des protéines structurales du cristallin, ne sont pas exprimées correctement chez le CF, d’après des hybridations in situ et des qPCR. Cependant, le rôle fonctionnel de deux de ces modifications d’expression a été testé, et individuellement, elles n’expliquent pas le phénotype apoptotique. Nous émettons l’hypothèse qu’une combinaison de défauts d’expression de plusieurs cristallines serait à l’origine de l’apoptose du cristallin CF. Enfin, et plus largement, les forces évolutives qui ont conduit à la perte de l’œil chez Astyanax mexicanus ne sont pas encore comprises. Par une étude d’évolution moléculaire à l’échelle du transcriptome nous avons identifié des mutations fixées entre SF et CF, et avons pu mettre en évidence une accumulation de mutations dans des « gènes d’yeux » chez les CF. Cela suggère un relâchement de la pression de sélection sur ces gènes, peut-être devenus inutiles dans l’obscurité. De même, les séquences des cristallines de CF paraissent accumuler des mutations fixées à un taux élevé vu leur bas niveau de polymorphisme. / The fish Astyanax mexicanus presents, within the same species, several populations of river-dwelling surface fish (SF) and blind cave-living fish (CF). In blind cavefish, the eyes first develop almost normally during embryogenesis. But 24 hours after fertilization (hpf), when the embryo hatches, the lens enters apoptosis, which triggers the progressive degeneration of the entire eye. My thesis project aimed at understanding the mechanism leading to lens apoptosis, which was so far unknown. We reasoned that the defect(s) should take place during the early stages of lens development. The lens develops from a placode, a thickening of the ectoderm at the neurula stage. All placodes, giving rise to sense organs of the head, originate from the “panplacodal” field, located at the border of the anterior neural plate at 10 hpf. We compared the patterning of the panplacodal field in the 2 morphs, using in situ hybridizations for placodal marker genes. In CF, the lens placode territory is reduced at 10 hpf, and the lens is smaller at all stages examined. Conversely, the olfactory placode is enlarged, and gives rise to a bigger olfactory epithelium in CF. The modifications in size of these two placodes could result evolutionarily from a trade-off between these two sensory components. Developmentally, the modified patterning of the panplacodal field in CF is at least partly due to the spatial and temporal differences in the expression of Shh and Fgf (and perhaps Bmp4) signaling molecules.We hypothesized that the small size of the lens could be the direct cause of its apoptosis, through a lack of community effect. We performed partial laser ablation of lens precursor cells at 12-14hpf in surface fish (thereby mimicking the CF lens size). Apoptosis in the resulting small lens of SF larvae at 60hpf was not enhanced, showing that small size is not sufficient to induce apoptosis. Lens apoptosis could also result from morphogenesis defects or from a problem in cell lineage. We are performing two-photon live imaging, from 10 to 24 hpf, of SF and CF embryos previously injected at the one cell stage with H2B-mCherry and Ras-GFP mRNAs to label nuclei and membranes. First results on surface fish show that we can back-track lens cells to the panplacodal field, and follow morphogenesis and divisions. Lens differentiation is also affected in cavefish: at least 5 crystallins, which are lens structural components, are not expressed correctly in CF, based on in situ hybridization and qPCR data. However the functional role of two of these expression modifications / losses was tested and, individually, they don’t seem to explain the apoptosis phenotype. We propose that a combination of several crystallins expression defects would explain CF lens apoptosis.Finally, and more globally, evolutionary forces that led to eye loss in Astyanax mexicanus are not yet understood. Through a transcriptome-wide molecular evolution approach, we identified fixed mutations in transcripts between SF and CF, and we could show an accumulation of mutations in “eye genes” in CF. This suggests that the selection is relaxed on these genes, that have maybe become useless in the dark. Similarly, CF crystallin sequences seem to accumulate fixed mutations at a high rate, considering their low polymorphism level.

Il est débattue sur le temps closural finale de l'océan paléo-asiatique et la position. Certains géologues ont préconisé la suture "Solonker" marque la zone closural finale du Permien , tandis que d'autres insistent sur le fait Paléozoïque milieu. Nos trois domaines d'étude, le Hongqi , le Ondor Somme et le Mandula ont essentiel et important de résoudre ces controverses. Les unités litho-tectonique reconnus dans le domaine Hongqi-Ondor Sum sont le mélange Belt de Hongqi-Ondor Sum, la Belt de l'arc Bainaimiao, craton du Nord de Chine et les roches sédimentaires post-orogéniques. Le mélange Belt de Hongqi-Ondor Sum connu déformation ductile en deux phases et une phase de la déformation ductile-fragile. D1 est responsable de la S1 foliation, linéation minérale L1, et intrafolial pli F1. Les critères cinématiques indiquent un sens cisaillement de top-to-the-NW. D2 est caractérisée par divers taille de plis asymétriques avec axe presque NE correspondant à la poussée NW cisaillement. D3 formé le cadre régional dans le Hongqi et les zones Ondor Sum. La zone Mandula contient les sédiments olistostrome, les sédiments turbiditiques et roches volcanosédimentaires. Grains de zircons détritiques dans des échantillons sédimentaires indiquent la zone d'étude Mandula reçu des matériaux d'arc Bainaimiao et matières contemporaines de l'éruption volcanique du Permien. Les sédiments et les roches volcaniques dans la région Mandula soumettent un NW-SE ou près de N-S du raccourcissement. Les données géologiques indiquent qu'une subduction et collsion dans Paléozoïque inférieur, et rifting et fermeture rift dans Palezoic supérieur. Les fragments ophiolitiques "Solonker" sont en effet olistostrome. Composants ophiolitiques typiques ne sont pas observés dans la région Mandula. / It is hotly debated about the final closural time and position of the Paleo-Asian Ocean. Some geologists advocated the “Solonker” suture marks the final closural zone in Permian, whereas others insist in middle Paleozoic. Our three study areas, the Hongqi, the Ondor Sum and the Mandula is essential and important to solve those controversies. The litho-tectonic units recognized in the Hongqi-Ondor Sum area include the Hongqi-Ondor Sum mélange belt, the Bainaimiao arc belt, North China Craton and post-orogenic unconformably sedimentary rocks. The Hongqi-Ondor Sum mélange belt experienced two phase ductile deformation and one phase ductile-brittle deformation. D1 is responsible for the regional greenschist foliation S1, elongated mineral lineation L1, and intrafolial fold F1. The kinematic criteria indicates a top-to-the-NW shearing sense. D2 is characterized by various sized of unsymmetrical folds with nearly NE axis corresponding to the NW thrust shearing. D3 formed the regional framework in the Hongqi and the Ondor Sum areas. The Mandula area contains olistostrome sediments, turbiditic sediments and volcano-sedimentary rocks. Detrital zircon grains in sedimentary samples argue the Mandula study area received the southern Bainaimiao arc materials and coeval Permian volcanic erupting materials nearby. The sediments and volcanic rocks in Mandula area subject a nearly NW-SE or N-S compressional shortening. The geological data support that an Early Paleozoic subduction and collsioan, Late Palezoic rifting and rift closure model. The so called “Solonker” ophiolitic fragments indeed are olistostrome. Typical ophiolite components are not observed in the Mandula area.

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Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique. Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme / Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid. In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture. Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fattyacids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17- eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively). The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzymes

Les Porifères et les Cténophores sont probablement les deux lignées animales les plus anciennes. Leur étude permet de retracer l’histoire précoce des métazoaires, et d’aborder l'origine de la distinction entre les lignées somatique et germinale. En effet, chez les éponges cette distinction n’existe pas: les archéocytes et choanocytes pouvant donner les cellules somatiques et les gamètes.Après avoir établi la liste des gènes considérés comme impliqués dans la gamétogenèse chez les métazoaires, j’ai caractérisé leurs séquences et retracé leur histoire grâce à des analyses comparatives intégrant les principales lignées animales. Enfin, un suivi in situ d'Oscarella lobularis m’a permis d’affiner son cycle de vie et d’accéder à toutes les étapes du développement pour étudier l’expression de ces gènes et de tester leur implication dans la gamétogenèse.Ainsi, j'ai montré que 18 gènes du GMP (Germline Multipotency Program) sont présents ancestralement chez les animaux. Parmi ceux-ci 11 s’expriment pendant la gamétogenèse, au cours de l’embryogenèse, de la reproduction asexuée et de la régénération. Enfin, le suivi in situ a montré l’influence de la variation de la température et de la matière organique sur le déclenchement de la gamétogenèse.Mon travail suggère d’une part, que la spécification des cellules germinales est régie par des mécanismes génétiques communs à l’échelle de métazoaires, et d’autre part que ces gènes pourraient être impliqués dans la multipotence. Ces résultats renforcent l’hypothèse proposant une origine commune de la lignée germinale et des cellules souches somatiques. / Porifera and Ctenophora are probably the two most ancient animal lineages. Their study therefore allows to trace back the early history of metazoans and to address the origin of the distinction between somatic and germ lines. Indeed, in sponges this distinction does not exist: archeocytes and choanocytes can give rise to both somatic cells and gametes.After establishing the list of genes considered to be involved in gametogenesis in metazoans, I searched for these candidate genes (by local blast) in the transcriptomes of two sponge species (Oscarella lobularis and Oopsacas minuta). I thereby managed to characterize their sequences (phylogenetic and protein domain analyzes) and to trace their evolution through comparative analyzes including all main animal phyla. Finally, the in situ monitoring of O. lobularis enabled me to refine its life cycle and access all key developmental stages in order to study the expression of candidate genes in order to test their possible involvement in gametogenesis in this species.I have shown that 18 GMP (Germline Multipotency Program) genes are present ancestrally in animals. Among them, at least 11 are expressed not only during gametogenesis but also during embryogenesis, asexual reproduction and regeneration. Finally, in situ monitoring showed the influence of temperature variations and organic matter availability on gametogenesis.My work suggests, firstly that the specification of germ cells is controlled by common genetic mechanisms across metazoans, and secondly that these ancestral genes might be involved in pluripotency. These results reinforce the hypothesis suggesting a common origin of the germline and somatic stem cells.

Depuis quelques années, les codes de calculs Monte Carlo évoluant qui couplent un code Monte Carlo, pour simuler le transport des neutrons, à un solveur déterministe, qui traite l'évolution des milieux dû à l'irradiation sous le flux neutronique, sont apparus. Ces codes permettent de résoudre les équations de Boltzmann et de Bateman dans des configurations complexes en trois dimensions et de s'affranchir des hypothèses multi-groupes utilisées par les solveurs déterministes. En contrepartie, l'utilisation du code Monte Carlo à chaque pas de temps requiert un temps de calcul prohibitif.Dans ce manuscrit, nous présentons une méthodologie originale évitant la répétition des simulations Monte Carlo coûteuses en temps et en les remplaçant par des perturbations. En effet, les différentes simulations Monte Carlo successives peuvent être vues comme des perturbations des concentrations isotopiques de la première simulation. Dans une première partie, nous présenterons donc cette méthode, ainsi que la méthode de perturbation utilisée: l'échantillonnage corrélé. Dans un second temps, nous mettrons en place un modèle théorique permettant d'étudier les caractéristiques de la méthode des échantillons corrélés afin de comprendre ses effets durant les calculs en évolution. Enfin, dans la troisième partie nous discuterons de l'implémentation de cette méthode dans TRIPOLI-4® en apportant quelques précisions sur le schéma de calcul qui apportera une accélération importante aux calculs en évolution. Nous commencerons par valider et optimiser le schéma de perturbation à travers l'étude de l'évolution d'une cellule de combustible de type REP. Puis cette technique sera utilisée sur un calcul d'un assemblage de type REP en début de cycle. Après avoir validé la méthode avec un calcul de référence, nous montrerons qu'elle peut accélérer les codes Monte Carlo évoluant standard de presque un ordre de grandeur. / For several years, Monte Carlo burnup/depletion codes have appeared, which couple Monte Carlo codes to simulate the neutron transport to deterministic methods, which handle the medium depletion due to the neutron flux. Solving Boltzmann and Bateman equations in such a way allows to track fine 3-dimensional effects and to get rid of multi-group hypotheses done by deterministic solvers. The counterpart is the prohibitive calculation time due to the Monte Carlo solver called at each time step.In this document we present an original methodology to avoid the repetitive and time-expensive Monte Carlo simulations, and to replace them by perturbation calculations: indeed the different burnup steps may be seen as perturbations of the isotopic concentration of an initial Monte Carlo simulation. In a first time we will present this method, and provide details on the perturbative technique used, namely the correlated sampling. In a second time we develop a theoretical model to study the features of the correlated sampling method to understand its effects on depletion calculations. In a third time the implementation of this method in the TRIPOLI-4® code will be discussed, as well as the precise calculation scheme a meme to bring important speed-up of the depletion calculation. We will begin to validate and optimize the perturbed depletion scheme with the calculation of a REP-like fuel cell depletion. Then this technique will be used to calculate the depletion of a REP-like assembly, studied at beginning of its cycle. After having validated the method with a reference calculation we will show that it can speed-up by nearly an order of magnitude standard Monte-Carlo depletion codes.