A síntese, aspectos estruturais, fotoquímica, fotofísica, atividade farmacológica e a fotoatividade citotóxica in vitro do complexo [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = ftalocianina) são descritas neste trabalho. O efeito biológico do complexo de rutênio foi estudado na presença e ausência de irradiação luminosa na janela terapêutica (600 - 850 nm), sob linhagem de células B16F10. Comparativamente, a atividade citotóxica de [Ru(NO)(ONO)pc] foi muito maior que [Rupc], sob diferentes níveis de potência do laser, sugerindo a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, após irradiação luminosa, pode ser um importante mecanismo pelo qual o complexo nitrosilo de rutênio apresenta maior atividade biológica, na linhagem de célula estudada. Após a ativação por irradiação luminosa, o complexo [Ru(NO)(ONO)pc] apresentou diminuição da viabilidade celular na linhagem B16/F10, com eficácia dependente da potência do laser. O encapsulamento de [Ru(NO)(ONO)pc] em lipossoma aumentou em cerca de 25 % a atividade citotóxica do complexo nitrosilo, quando comparado com o mesmo, porém em solução de PBS. Esta eficácia foi diretamente proporcional à quantidade de rutênio no interior da célula, cuja concentração foi determinada por espectrometria de massa ICP-MS, evidenciando maior eficácia no mecanismo de transporte do complexo nitrosilo para o interior da célula. A atividade fotocitotóxica foi atribuída principalmente aos fenômenos de apoptose, cujo o mecanismo foi derivado da análise por citometria de fluxo. O mecanismo de liberação de NO dá-se por processo redutimétrico do complexo [Ru(NO)(ONO)pc], haja vista que a vasodilatação estudada é dependente do NO, liberado do complexo nitrosilo, e independente da irradiação luminosa. Aliás, concentração da ordem de 1,0 x 10-7 M do complexo de rutênio em PBS ocasionou 100 % de vasodilatação, cuja concentração é semelhante ao do nitroprussiato de sódio, medicamento utilizado em clínica médica com severas restrições. Em princípio, a liberação de óxido nítrico pós-produção de oxigênio singlete, oriundo da irradiação luminosa na janela terapêutica, do complexo nitrosilo de rutênio, pode constituir-se num poderoso mecanismo para aumentar a eficácia da terapia fotodinâmica, uma portentosa terapia clínica que encontra limitação dependente do tamanho da área cancerígena bem como da vascularização desta área. / The synthesis, structural aspects, photochemistry, photophysical, farmacological studies and in vitro photoinduced cytotoxic properties of [Ru(NO)(ONO)pc] (pc = phthalocyanine) are described in this work. Its biological effect was studied in the presence and absence of therapeutic window light irradiation (600 - 850 nm) in B16/F10 cell line by means nitric oxide and singlet oxygen production. At comparable light irradiation potency levels [Ru(NO)(ONO)pc] was more effective than [Rupc] suggesting nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation may be an important mechanism by which the nitrosyl ruthenium complex exhibits more biological activity in cells. Following visible light activation, the [Ru(NO)(ONO)pc] complex showed an increased potency with photoinduced dose modifications in the B16/F10 cells. The liposome containing [Ru(NO)(ONO)pc] complex was over 25 % more active than the corresponding ruthenium complex in PBS solution. It was directly proportional to the amount of ruthenium inside the cell obtained by ICP-mass spectrometry evidencing the cross membrane barrier providing phenomenal increase of [Ru(NO)(ONO)pc] complex concentration inside the cell. The photocytotoxic activity was mainly attributed to the apoptosis phenomena by flux cytometry analysis. The mechanism of NO release occurs by reductimetric process of [Ru(NO)(ONO)pc] complex, considering the vasodilation studies, which vasorelaxation showed dependence on NO concentration and independence on light irradiation. Moreover, concentration of 1.0 x 10-7 M of the ruthenium complex in PBS caused 100% vasodilation, which is similar to the concentration of sodium nitroprusside, a drug used in medical clinic with severe restrictions. Furthermore, the nitric oxide release followed by singlet oxygen production upon light irradiation of the nitrosyl ruthenium complex produced two radicals capable to improve photodynamic therapy, a clinical therapy which efficiency is actually limited by the cancer area and vascularization

O endotélio vascular é responsável por várias funções como o controle do tônus vascular pela produção e/ou liberação de substâncias vasoconstritoras (EDCFs) e relaxantes (EDRFs). Na hipertensão arterial ocorre disfunção endotelial caracterizada pelo desequilíbrio entre EDCFs e EDRFs. Vários autores sugerem que essas alterações são decorrentes do aumento nas concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs). As EROs podem afetar a sinalização, produção e/ou biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), principal EDRF, assim como aumentar os níveis de prostanóides como prostaglandinas e tromboxanos, EDCFs produtos da COX. O principal alvo para o NO é a ativação da guanilil ciclase solúvel (GCs) no musculo liso vascular causando vasorelaxamento. No modelo de hipertensão arterial dois rins um clipe (2R-1C), ocorre aumento nos níveis de EROs e ativação da NADH/NADPH-oxidase, principal enzima produtora de EROs em células endoteliais. Em nosso estudo, utilizamos o composto NCX2121, que é estruturalmente formado por um doador de NO e inibidor da COX (indometacina). O estudo teve por objetivo caracterizar farmacologicamente a resposta relaxante do NCX2121 na aorta de ratos hipertensos 2R-1C e investigar a contribuição do endotélio vascular e das EROs para essa resposta. Verificamos que o composto NCX 2121 produz relaxamento da aorta de ratos 2R e 2R-1C, que é reduzido pela remoção do endotélio e inibição da enzima NO-Sintase (NOS). O relaxamento do composto NCX 2121 deve ser promovido pelo NO, uma vez que em aortas sem endotélio esse relaxamento foi abolido pelo ODQ. Porém, foi apenas reduzido em aortas com endotélio, isoladas de ratos normotensos (2R) e não foi alterado nas aortas com endotélio, isoladas de ratos 2R-1C. O NCX 2121 não alterou a fosforilação dos sítios de ativação ou inibição da eNOS. O NO não foi detectado em solução por análise amperométrica. O composto NCX2121 aumentou a concentração citosólica de NO, medida pela sonda fluorescente sensível a NO (DAF-2DA), por microscopia confocal. Na aorta de ratos 2R-1C, o relaxamento estimulado com o composto NCX2121 foi inibido pelas EROs e os níveis de EROs em células endoteliais isoladas, foi reduzido pelo composto NCX2121. O composto NCX 2121 reduziu os níveis de tromboxano na aorta de ratos 2R e 2R-1C. Os nossos resultados demonstram que o composto NCX2121 promove relaxamento pela liberação intracelular de NO e inibição da COX por reduzir a produção de prostanóides vasoconstrictores como o tromboxano. O composto NCX2121 não interfere com a ativação da NOS, mas reduz as EROs nas células endoteliais. / The vascular endothelium plays multiple roles on the tone control by the production and/or release of contractile factors (EDCFs) and relaxing factors (EDRFs). There is an imbalance between EDCFs and EDRFs in hypertension that is defined by endothelial dysfunction. In accordance to several authors, these alterations are due to increased production of reactive oxygen species (ROS). The ROS can affect the nitric oxide (NO) signaling, production and bioavailability that is the major EDRF. ROS can also increase the levels of prostaglandins and thromboxane (TX) that are EDCFs products of COX. The main target for NO is the activation of soluble guanylyl-cyclase (sGC) in the vascular smooth muscle cells causing vasorelaxation. In renal hypertensive rats (2K-1C), there is an increased production of ROS by NADH-NADPH-oxidase in the rat aorta endothelial cells. In the present study we used the compound NCX2121, in which chemical structure there is a NO donor and a non-selective COX inhibitor indomethacin. This study aimed to pharmacologically characterize the NCX2121 relaxing effect in 2K-1C rat aorta, and to investigate the contribution of the endothelial factors and ROS for this response. We verified that the relaxation-induced by NCX2121 was impaired by the endothelium removal and NO-synthase (NOS) inhibition. The relaxation induced by NCX2121 is due to NO, since sGC inhibition by ODQ completely abolished its effect in denuded endothelium 2K-1C rat aorta. However, in intact endothelium normotensive 2K rat aorta, the relaxing effect of NCX2121 was only partially inhibited whereas in 2K-1C it was not changed. NCX2121 did not change the phosphorylation sites of activation or inhibition of NOS. NO was not detected by amperometry in the organ bath during the relaxation induced by NCX2121, but it was measured in the cell cytoplasm by confocal microscopy. The vasorelaxation was inhibited by ROS, and NCX2121 decreased the ROS in isolated endothelial cells. NCX2121 reduced TX in 2K and 2K-1C rat aortas. Therefore, our results indicate that the compound NCX2121 induces relaxation by intracellular NO release and COX inhibition by the reduced production of contractile prostanoids such as TX. The compound NCX2121 does not modulate NOS, but it decreases ROS in the endothelial cells.

O monóxido de carbono (CO) tem um importante papel na fisiologia animal incluindo plasticidade sináptica, processos de memória e aprendizagem, inflamação e liberação de neuropeptídios hipotalâmicos. Recentemente tem sido demonstrado que a liberação de vasopressina (AVP) e ocitocina (OT) em resposta a alterações no balanço hidromineral pode ser modulada por esse neuromodulador gasoso, contudo, os mecanismos pelos quais essa modulação ocorre ainda não foram elucidados. Nesse sentido, nós mapeamos possíveis alvos intracelulares do CO pelos quais esse gás poderia afetar as respostas neuroendócrinas tais como as propriedades passivas de membrana de neurônios magnocelulares do núcleo supraóptico (SON), via de sinalização da p38 MAPK, sistema óxido nítrico (NO)/óxido nítrico sintase (NOS), participação de astrócitos hipotalâmicos e a resposta antioxidante à diferentes condições de hidratação: euhidratação, 24 e 48 horas de privação hídrica. Nós observamos que a inibição da formação central de CO reduziu o aumento das concentrações plasmáticas de AVP e OT induzido pela privação hídrica, bem como inibiu a atividade NOS nos grupos hidratado e desidratado por 48 horas (PH 48); enquanto a razãoe p-p38 MAPK/p38 MAPK ratio foi aumentada pela doação central de CO em todas as condições de hidratação analisadas. Além do mais, nós demonstramos a expressão de HO-1, p38 MAPK e p-p38 MAPK em astrócitos hipotalâmicos. Em relação à resposta antioxidade, observamos que camundongos silenciados para Nrf2 no SON tem a resposta à desidratação prejudicada. Esses dados indicam o papel do CO como uma molécula neuromodulatória nas respostas neuroendócrinas à desidratação onde pode exercer sua função via resposta antioxidante em tempo mais curto de restrição hídrica e via sistema do NO em tempo mais prolongado / Carbon monoxide plays important roles in animal physiology including synaptic plasticity, learning and memory processes, inflammation and hypothalamic neuropeptide release. Recently it has been demonstrated that the AVP and OT release in response to changes in hydromineral balance can be modulated by this gaseous neuromodulator; however, the mechanisms by which this modulation occurs need to be elucidated. In order to answer this questioning, we evaluated the CO effect on neuroendocrine responses, SON magnocellular neurons passive membrane properties, p38 MAPK signaling, NO/NOS system and astrocytes participation in rats during control or 24/48 WD conditions. We observed that CO formation inhibition reduced the water deprivation-induced increase in plasma AVP and OT concentration and NOS activity in basal and 48 WD groups; while p-p38 MAPK/p38 MAPK ratio was increased by central CO donation in both euhydrated and dehydrated conditions. Furthermore, we demonstrated HO-1, p38 MAPK and p-p38 MAPK expression in MBH astrocytes. These data indicate the CO role as neuromodulatory molecule in neuroendocrine responses to dehydration where it might play its biological functions through p38 MAPK phosphorylation and NOS activity in a water restriction longer period

Peptídeos de defesa do hospedeiro antimicrobiano (PDHA) são componentes do sistema imune inato podem ser expressos constitutivamente ou induzidos por componentes bacterianos, citocinas, ou a combinação de ambos. Estes peptídeos possuem ação direta sobre microrganismo e são potentes imunomoduladores de células de mamíferos. A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre, originário do aracnídeo Tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com massa molecular de 10 204 Da. Este peptídeo possue atividade bacteriostática sobre Micrococcus luteus, mas sem atividade microbicida sobre E. coli e Candida albicans. Neste trabalho foi analisado o efeito direto da microplusina em cultura de macrófagos derivados de medula óssea (MDM) tratados ou não com LPS ou IFN-&#947. Foi demonstrado que este peptídeo não teve efeito citotóxico para macrófagos, não estimulou a síntese de NO e IL-1&#946, mas aumentou a produção de TNF-&#945 e IL-6 após estímulo. O pré-tratamento dos macrófagos com microplusina, antes da adição do LPS, não modificou o nível de nitrito, TNF-&#945 ou IL-6 em resposta ao LPS. Quando os macrófagos foram pré-tratados com microplusina e posteriormente incubados com IFN-&#947 houve aumento significativo da produção de NO e TNF-&#945, confirmando a natureza pró-inflamatória deste peptídeo. Isto indica que a microplusina é um agente imunomodulador da resposta imune inata e pode auxiliar no controle de infecções por microrganismos patogênicos. / Antimicrobial host defense peptides are components of the innate immune system. They are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines or the combination of both are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines, or a combination of both. These peptides have direct action on microorganisms and are potent immunomodulators in mammalian cells. Microplusin is a copper II-chelating antimicrobial peptide from the Tick Rhipicephalus ( Boophilus) microplus, with a molecular mass of 10 204 Da. This peptide has a bacteriostatic activity against Micrococcus luteus, but no activity against E. coli and Candida albicans. The aim of the present work was to analyze the direct effect of microplusin in the culture of murine bone marrow derivated macrophages (BDM) treated or not with LPS or IFN-&#947. Our data showed that microplusin had no cytotoxic effect on macrophages, did not stimulate the synthesis of NO and IL-1&#946, but increased the production of TNF-&#945 and IL-6 after stimulation. The pre-treatment of macrophages with microplusin before LPS addition did not change the level of nitrite, TNF-&#945 or IL-6 in response to LPS. If the microplusin pre-treated macrophages were incubated with IFN-&#947 there was evidence that microplusin led to significant increase of NO and TNF-&#945 production confirming the pro-inflammatory characteristic of microplusin and its potential against pathogenic microorganisms. This indicates microplusin to be a potential immunomodulating agent of innate immunity and may help to control infections by pathogenic microorganisms.

A disfunção de músculos esqueléticos (DME) é comum na síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) causada por infecções (sepse). Tal disfunção é relacionada à presença de citocinas, espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO). Contudo, não existem dados sobre a ocorrência de DME durante SIRS causada por isquemia e reperfusão intestinal (IRI). Assim, este trabalho teve como objetivo analisar a presença de algumas citocinas, marcadores da produção de ROS e NO em músculo diafragma (DIAF) e tibial anterior (TA) de ratos após reperfusão (R) de 2 e 6 h. Avaliamos também o consumo de oxigênio (CO) e a função contrátil (FC) do DIAF em após 2 h de R. Os resultados mostram que a IRI aumenta a expressão de citocinas, altera a via L-arginina-NO e causa danos oxidativos em lipídeos e proteínas em DIAF e TA, porém de forma dependente do tecido e do tempo de R. Ainda, o CO estimulado por malato está aumentado após 2 h de R. Estas alterações não afetam a FC do DIAF após 2 h de R, mas podem ser importantes para o desenvolvimento de DME em tempos posteriores. / Skeletal muscle dysfunction (SMD) is common during systemic inflammatory response syndrome (SIRS) caused by infection (sepsis). SMD is associated with increased production of cytokines, nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS). However, there are no data concerning its occurrence during SIRS caused by intestinal ischemia and reperfusion (IIR). Then, our objectives were to analyze the presence of some cytokines, NO and markers of ROS production in diaphragm (DIA) and in tibialis anterior (TA) from rats submitted to 2 and 6 h of reperfusion (R) after ischemia. We also evaluated oxygen consumption (OC) and contractile force (CF) of DIA after 2 h of R. Results show that IIR increases inflammatory cytokines, causes oxidative damages in lipids and proteins, and changes L-arginine-NO pathway. Both DIA and TA are affected but in different patterns and depending on R period. Moreover, OC stimulated by malate was increased. These alterations did not affect CF of DIA after 2 h of R, but must be important to the development of SMD in more prolonged periods of R.

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As células endoteliais são capazes de converter o estímulo mecânico em sinais intracelulares e produzir fatores vasoativos como o óxido nítrico (oNO). Evidências recentes sugerem que as beta-arrestinas desempenham um papel importante não somente na dessensibilização e internalização de receptores acoplados à proteína G (GPCR) como também na mecanotransdução. Nós testamos a hipótese de que células endoteliais submetidas ao shear stress (SS) produzem oNO por meio da ativação da via de sinalização dependente de beta-arrestina. Para tal, células endoteliais de veia safena (hSVEC) foram transfectadas com siRNA contra as isoformas 1 e 2 da beta-arrestina e, posteriormente, submetidas ao SS (15 dinas/cm2) durante 10 min. Nós encontramos que as SVEC silenciadas para a beta-arrestina 1/2 (70%) exibiram uma menor produção de nitrito no meio de cultura em resposta ao SS (166±17 vs. 326±44% comparado com hSVEC transfectadas com siRNA controle). Além disso, o silenciamento da beta-arrestina 1 e 2 preveniu os níveis de fosforilação da Akt no resíduo de serina 473 e a fosforilação da eNOS no resíduo de serina 1177, enquanto que a fosforilação da ERK 1/2 manteve-se inalterada. Curiosamente, análises de imunoprecipitação mostraram que a beta-arrestina interage com caveolina-1, um mecanossensor do shear stress, mas não é influenciado pelo SS. Além disso, na situação estática, a beta-arrestina encontra-se em uma localização perinuclear e, após o SS, adquiriu um padrão mais difuso no citosol. Coletivamente, esses dados sugerem que a beta-arrestina e a sinalização downstream Akt/ eNOS são necessárias para a produção de oNO induzido por shear stress em células endoteliais vasculares humana / Endothelial cells are capable of converting mechanical stimuli into intracellular signals generating vasoactive factors such as nitric oxide (oNO). Recent evidence suggests that beta-arrestins play a role not only on G protein-coupled receptors (GPCR) desensibilization but also in mechanotransduction. We tested the hypothesis that beta-arrestin and its downstream signaling influence laminar shear stress (SS)-induced oNO production by endothelial cells. Towards this end, human saphenous vein endothelial cells (hSVEC) transfected with siRNA against beta-arrestins isoforms 1 and 2 were subjected to SS (15 dynes/cm2, 10 minutes). We found that the SS-induced production of nitrite in the cell culture medium from down-expressed beta-arrestin 1/ 2 (70%) SVEC decreased (166±17 vs. 326±44% compared to wild-type hSVEC; P < 0.001). The beta-arrestin 1 and 2 down-regulation in SVEC also inhibited the phosphorylation levels of Akt at the serine residue 473 and the phosphorylation levels of eNOS at the serine residue 1177, whereas ERK phosphorylation remained unchanged. Interestingly, immunoprecipitation analysis showed that beta-arrestin interacts with caveolin-1, a shear stress mechanosensor, which is not influenced by SS despite the fact that the static perinuclear localization of beta-arrestins changed to the cytosol upon SS. Collective these data suggest that beta-arrestin and Akt/eNOS downstream signaling are required for shear stress-induced nitric oxide production in human vascular endothelial cells

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A aplicação tópica do hidrogel Pluronic F-127 (poli(óxido de etileno)99-poli(óxido de propileno)65-poli(óxido de etileno)99, PEO99-PPO65-PEO99) contendo um doador de óxido nítrico, a S-nitrosoglutationa (GSNO) é conhecida por exercer efeitos benéficos no reparo tecidual cutâneo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da aplicação tópica do hidrogel Pulronic F-127 contendo um doador de óxido nítrico no reparo tecidual de lesões isquêmicas. Ratos Wistar machos foram submetidos a duas lesões incisionais paralelas no dorso, a pele foi separada do tecido subjacente, as incisões foram suturadas e uma lesão excisional foi feita entre elas para criar uma condição isquêmica ao redor da lesão. Os animais foram separados em grupo controle, que recebeu a aplicação apenas do hidrogel sem doador de óxido nítrico e grupo tratado, que recebeu a aplicação do hidrogel contendo o doador de óxido nítrico. Os animais foram tratados por 7 dias consecutivos com uma aplicação diária dos hidrogéis. O grupo tratado apresentou taxas mais altas de contração e re-epitelização, menor quantidade de células inflamatórias, um aumento na densidade e organização de fibras colágenas e uma diminuição na neovascularização 14 dias após a lesão, comparado ao grupo controle. Esses resultados indicam que a aplicação tópica do gel doador de óxido nítrico é eficaz no tratamento de lesões isquêmicas em ratos, levando a uma melhora significativa na cicatrização. Consequentemente, a aplicação tópica de um hidrogel contendo doador de óxido nítrico poderá ter, futuramente, potencial para o tratamento terapêutico de úlceras venosas e decorrentes de diabetes. / Topical application of Pluronic F-127 hydrogel (poly(ethylene oxide)99-poly(propylene oxide)65-poly(ethylene oxide)99, PEO99-PPO65-PEO99) containing the NO donor S-nitrosoglutathione (GSNO) is known to exert beneficial effects on cutaneous wound healing. The aim of this study was to evaluate the effect of topical application of GSNO on the healing of ischemic wounds. Wistar rats were submitted to two parallels incisions on their back, the skin was separated from the underlying tissue, the incisions were sutured and an excisional wound was done between the parallel incisions to create an ischemic condition surrounding the wound. The animals were separated into a control group, which received a hydrogel vehicle without GSNO and a GSNO-treated group, which received a GSNO-containing hydrogel. The animals were treated for 7 days consecutively with daily application. The GSNO-treated group displayed higher rates of wound contraction and re-epithelization, lower amount of inflammatory cells, an increase in collagen fiber density and organization and a decrease in the neovascularization 14 days after wounding, compared to control. These results show that topical application of GSNO is effective in the treatment of ischemic wounds, leading to a significant improvement in the wound healing. Therefore, in the future, topical GSNO-containing hydrogel will have potential for the therapeutic treatment of ischemic diabetic and venous ulcers.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A obesidade é um distúrbio metabólico de etiologia multifatorial e elevada prevalência no Brasil, que pode ser definida por um índice de massa corporal (peso em quilogramas dividido pela altura em metros ao quadrado) maior ou igual a 30 kg/m2, e que está associada de forma independente a um elevado risco de morbidade e mortalidade cardiovascular devido aos eventos aterotrombóticos. O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula gasosa, é produzido através da conversão do aminoácido catiônico L-arginina em L-citrulina e NO em uma reação catalisada por uma família de enzimas denominadas NO-sintases (NOS), e funciona como um protetor cardiovascular modulando por exemplo o relaxamento do músculo liso vascular e a função plaquetária. O objetivo desta tese foi avaliar a via L-arginina-NO, bem como investigar a função plaquetária, o estresse oxidativo, e a atividade da arginase em pacientes com obesidade. O transporte de L-arginina, a produção de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), a atividade e a expressão das isoformas da NOS (iNOS e eNOS), a atividade da arginase, o estresse oxidativo (produção de espécies reativas de oxigênio EROs; atividade da superóxido dismutase SOD; e atividade da catalase), bem como a função plaquetária foram medidos nas plaquetas dos pacientes com obesidade. Nas hemácias, foram medidos o transporte de L-arginina e a atividade da NOS e da arginase. Os níveis de aminoácidos e de marcadores inflamatórios (fibrinogênio e proteína C reativa) também foram medidos sistemicamente. Os resultados demonstram que o influxo de L-arginina via sistema y+L, a atividade da NOS e a produção de GMPc estão diminuídos nas plaquetas dos pacientes obesos em relação aos controles saudáveis, enquanto que não houve diferença na atividade da arginase. Além disso, a expressão das isoformas da NOS bem como a agregação plaquetária em plaquetas de pacientes com obesidade mostrou-se aumentada em relação aos controles. Nas hemácias destes pacientes, observou-se elevado influxo de L-arginina via sistema y+ e y+L e atividade da NOS, e nenhuma diferença na função da arginase. A concentração plasmática de L-arginina não foi afetada pela obesidade, mas já os marcadores inflamatórios estavam significativamente aumentados. A produção de EROs e a atividade da catalase nas plaquetas não estava alterada em pacientes com obesidade, enquanto que a atividade da SOD mostrou-se diminuida. Assim, apesar do aumento da produção de NO pelas hemácias, é possível que a baixa produção plaquetária de NO, além do estado inflamatório e um possível estresse oxidativo, estejam contribuindo para a elevada atividade plaquetária observada na obesidade. As descobertas aqui apresentadas contribuem para uma melhor compreensão dos eventos cardiovasculares presentes na obesidade. / Obesity is a metabolic disorder of multifactorial etiology and high prevalence in Brazil, which can be defined as a body mass index (weight in kilograms divided by height in square meters) greater than or equal to 30 kg/m2, and that is independently associated with a high risk of cardiovascular morbidity and mortality due to atherothrombotic events. Nitric oxide (NO), a small gaseous molecule, is produced through the conversion of the cationic amino acid L-arginine to L-citrulline and NO in a reaction catalyzed by a family of enzymes called NO synthases (NOS) and it acts as a cardiovascular protector modulating, for example, the relaxation of vascular smooth muscle and the platelet function. The aim of this thesis was to assess the L-arginine-NO pathway, as well as to investigate platelet function, oxidative stress, and the arginase activity in patients with obesity. The L-arginine transport, the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), the activity and expression of NOS isoforms (eNOS and iNOS), the arginase activity, oxidative stress (production of reactive oxygen species - ROS; superoxide dismutase activity - SOD, and catalase activity), and platelet function were evaluated in platelets from patients with obesity. In erythrocytes, the L-arginine transport and the activity of NOS and arginase were investigated. Systemic levels of amino acids and inflammatory markers (fibrinogen and C-reactive protein) were also investigated. The results demonstrated that L-arginine influx via y+L system, NOS activity, and cGMP levels were decreased in platelets from obese subjects compared to healthy controls, whereas no difference was observed in arginase activity. In addition, the expression of NOS isoforms and platelet aggregation in platelets from patients with obesity was increased in relation to controls. In erythrocytes from these patients, there were a higher influx of L-arginine via y+ and y+L system, and NOS activity, and no difference in arginase function. The plasma concentration of L-arginine was not affected by obesity, whereas the concentration of inflammatory markers was significantly increased. The production of ROS and catalase activity in platelets were not altered in patients with obesity, whereas SOD activity was reduced. Thus, despite the increased NO production by erythrocytes, it is possible that the low platelet production of NO, in addition to a possible inflammatory state and oxidative stress, are contributing to the elevated platelet activity observed in obesity. These findings may contribute to a better understanding of the cardiovascular events seen in obesity

Os mastócitos (MCs) estão presentes tanto no periodonto normal quanto inflamado, em diferentes quantidades e em vários locais. Nos últimos anos, a eficácia e a contribuição dos MCs em eliminar bactérias, através de sua atividade microbicida intracelular, estão se tornando cada vez mais reconhecidas. Assim, a partir de MCs murinos desafiados in vitro com o periodontopatógeno Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29523) por 3, 5, 10 e 24 horas, o presente estudo teve como objetivo investigar a capacidade microbicida intracelular de MCs, e comparar com a capacidade microbicida de macrófagos peritoneais murinos (MPs), considerados fagócitos profissionais, por meio da contagem das unidades formadoras de colônias. Além disso, avaliou-se a produção e liberação de mediadores microbicidas, óxido nítrico (NO) e peróxido de hidrogênio (H2O2), por meio do método colorimétrico de Griess e pela degradação de substratos fluorescentes, respectivamente. Para a análise estatística, foram utilizados os testes estatísticos ANOVA Fatorial seguido do teste de Tukey e teste de correlação de Pearson (p<0.05). Nossos resultados revelaram que os MCs foram capazes de eliminar eficientemente o periodontopatógeno, principalmente após 10h de desafio intracelular. Comparando-se a atividade microbicida dos dois tipos celulares, verificou-se, nos períodos de 3h e 5h de desafio, um menor percentual de colônias viáveis no interior de MPs, em comparação aos MCs. Inversamente, nos períodos de 10h e 24h, observaram-se menores valores percentuais de colônias intracelulares nos MCs em relação aos MPs. Além disso, a produção/liberação de NO bem como, em menor proporção, de H2O2 pelos MCs foram concordantes com a sua capacidade microbicida. Este é o primeiro estudo que demonstra a eficiente ação microbicida intracelular de MCs murinos contra Aggregatibacter actinomycetemcomitans, com produção e liberação de substâncias potencialmente bactericidas, e de forma mais eficaz que os macrófagos. Esses resultados sugerem a importância dessas células nos mecanismos de defesa presentes na doença periodontal induzida por placa dentobacteriana. / Mast cells (MCs) are present in both normal and inflamed periodontal tissues, in varying amounts and locations. Recently, MCs contribution in eliminating bacteria and its effectiveness, through its intracellular microbicidal activity, have been increasingly recognized. Thus, this study aimed to investigate the intracellular microbicide capacity of MCs, and compare it with the microbicide capacity of murine peritoneal macrophages (MPs), considered professional phagocytes, by counting the colony forming units. Both cell types were challenged in vitro with periodontopathogen Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 29523) by 3, 5, 10 and 24 hours. Additionally, the production and release of microbicidal agents, nitric oxide (NO) and hydrogen peroxide (H2O2) were evaluated by means of colorimetric Griess method and by the degradation of fluorescent substrates, respectively. Statistical analysis was performed by ANOVA Factorial test followed by Tukey and Pearson\'s correlation test (p <0.05). Our results revealed that MCs are able to efficiently eliminate periodontopathogen, mainly after 10 hours of intracellular challenge. The microbicidal activity of both cell types, in 3 and 5 hours of challenge showed a lower percentage of viable colonies inside MPs, compared to MCs. Contradictorily, in 10 and 24 hours a lower percentage of intracellular colonies in MCs was observed in relation to MPs. Moreover, the production/release of NO and, in minor proportion, of H2O2 by MCs was in agreement with its microbicidal capacity. Therefore, this is the first report to describe the intracellular microicidal activity of murine MCs against Aggregatibacter actinomycetemcomitans, concerning production and release of potentially bactericidal substances, which is more effective than macrophages. These results suggest the importance of these cells in pathogenesis and defense mechanisms of biofilm-associated periodontal disease.