Orientador: Reginaldo Bruno Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T05:00:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mariano_FlaviaSammartino_D.pdf: 1316630 bytes, checksum: 3bee505697040431f6e2914628397cd8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Dentre os mecanismos da imunidade inata, os quais são importantes para a proteção da cavidade oral, podemos citar os peptídeos antimicrobianos e células fagocíticas como os neutrófilos. Os peptídeos antimicrobianos, LL-37 e ?-defensinas ou peptídeos de neutrófilos humanos (HNP 1-3) são produzidos por neutrófilos e têm ampla atividade contra bactérias, fungos e vírus envelopados, um mecanismo microbicida independente de oxigênio. Contudo, os neutrófilos também executam atividade antimicrobiana através da produção de óxido nítrico (NO) durante a fagocitose. Adicionalmente, estas células produzem diferentes citocinas em resposta aos patógenos. Sendo assim, os neutrófilos tornam-se importantes na resposta contra a doença periodontal, mas, não está bem descrito se há diferenças funcionais entre os neutrófilos de pacientes com periodontite e os de indivíduos saudáveis após estimulação destes com lipopolossacarídeo (LPS) de periodontopatógenos. Dessa forma, avaliamos os níveis de LL-37, HNP1-3, NO e citocinas no sobrenadante das culturas de neutrófilos de voluntários com e sem periodontite e estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis (Pg) e Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) e Escherichia coli (Ec), bem como analisamos a expressão de RNAm, para esses peptídeos e citocinas nessas células. Nossos resultados demonstraram que neutrófilos de voluntários com periodontite estimulados com LPS de Aa expressaram maiores níveis de RNAm de LL-37, HNP 1-3 e IFN- ?, bem como produziram maiores quantidades de IL-12 e IFN-_ quando comparados aos saudáveis. LPS de Pg e Ec aumentaram significativamente a expressão de HNP 1-3, IFN-? e IL-8, bem como a produção de LL-37, IL-12 e IFN-?. Em contrapartida, neutrófilos de pacientes com periodontite produziram níveis reduzidos de NO e nenhuma diferença foi observada na expressão de IL-12 e na produção de HNP 1-3 entre ambos os grupos de voluntários estudados. Estes dados permitem concluir que neutrófilos de pacientes com periodontite respondem de forma mais intensa aos estímulos de LPS de bactérias periodontopatogênicas em comparação aos neutrófilos de voluntários com periodonto saudável. / Abstract: Among the innate mechanisms, which are essential for the oral cavity protection, we can include antimicrobial peptides and phagocytic cells such as neutrophils, as a major. Antimicrobial peptides, LL-37 and ?-defensins or human neutrophil peptides (HNP 1-3) are produced by neutrophils and have broad activity against bacteria, fungi and enveloped viruses, an oxygen-independent microbicidal mechanism. However, neutrophils also do antimicrobial activity through nitric oxide (NO) production in phagocytosis. Also, neutrophils produce special cytokines against pathogens. Thus, neutrophils are central in the periodontal disease response, but is unclear the functional differences between neutrophils from periodontitis and healthy volunteers pos-stimulation with periodopathogens lipopolossacarideo (LPS). Then, we studied of LL-37, HNP1-3, NO and cytokines levels in culture supernatants of cells from volunteers with or without periodontitis post Porphyromonas gingivalis (Pg), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) and Escherichia coli (Ec) LPS. We analyzed also peptides and cytokines expression in these cells. We show that neutrophils from periodontitis volunteers cultured with Aa LPS expressed higher LL-37, HNP 1-3 and IFN-? mRNA and produced more IL-12 and IFN- ? levels as the controls. Pg and Ec LPS notably improved the HNP1-3, IFN-? and IL-8 expression and the LL-37, IL-12 and IFN- ? secretion. But, neutrophils from periodontitis patients produced low NO levels and similar IL-12 mRNA and HNP 1-3 production in both the volunteers groups studied. Briefly, we can conclude that neutrophils from periodontitis patients respond more strongly than healthy neutrophils when stimulated with LPS periodontopathic bacterias. / Doutorado / Microbiologia e Imunologia / Doutor em Biologia Buco-Dental

Orientador: Elenice Aparecida de Moraes Ferrari / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T00:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_AlineVilardaSilva_M.pdf: 2487506 bytes, checksum: ec15fc1b78bef814d6d459499276cdf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A ritmicidade circadiana, expressa na alteração do comportamento e em aspectos morfofisiológicos e moleculares ao longo das 24 horas do dia, é uma das funções básicas dos organismos vivos. Os processos comportamentais e os mecanismos moleculares no hipocampo, que estão envolvidos na aprendizagem e memória, demonstram oscilação circadiana. Vários estudos sugeriram que o condicionamento clássico aversivo é afetado pelo sistema de temporização circadiana e que a oscilação circadiana de vias moleculares específicas é requerida para a consolidação da memória aversiva. O presente trabalho investigou a oscilação circadiana da expressão da nNOS e da atividade da proteína NOS no hipocampo de pombos e as suas relações com a modulação temporal do condicionamento contextual aversivo. Na Parte I, caracterizou-se o padrão temporal da expressão da nNOS, que foi detectada por Western Blotting e o padrão temporal da atividade enzimática da NOS, determinada pela quantidade de L-citrulina produzida por minuto e por micrograma de proteína na reação. Na Parte II, nos horários de mínima e máxima atividade enzimática da proteína, pombos foram treinados e testados em condicionamento aversivo ao contexto. As sessões foram gravadas para posterior análise comportamental. Após o teste foi realizada a imunoistoquímica para marcação da nNOS em neurônios do hipocampo. Foi evidenciada ritmicidade circadiana significativa (p < 0,05) na expressão protéica da nNOS e na atividade enzimática da NOS, segundo os valores fornecidos pelo método Cosinor para caracterização do padrão temporal. As médias da densitometria óptica dos grupos com horários mais próximos da acrofase - ZT04 (10hs; 0,944 ± 0,12) e a batifase - ZT16-(22hs; 0,572 ± 0,16) foram significativamente diferentes (F5,18 p < 0,0001). Os grupos condicionados, em ambos os horários, mostraram maior duração e maior ocorrência do comportamento de congelamento do que os controles (p < 0,05). Houve uma variação dia-noite para o comportamento de congelamento nos grupos controles (p < 0,05). A marcação de células nNOS-positivas foi maior no hipocampo dos grupos condicionados sendo que o total de células nNOS-positivas na área dorsal do grupo experimental testado à noite foi maior do que aquele observado nos grupos controles e no experimental da manhã (p < 0,05). Os dados mostraram que a expressão protéica da nNOS e da atividade enzimática da NOS no hipocampo de pombos mostram uma oscilação que caracteriza um padrão temporal circadiano. Tanto no horário de máxima como no de mínima atividade da nNOS, o condicionamento contextual aversivo resultou em medo condicionado ao contexto e em expressão de células nNOS-positivas no hipocampo que foi maior nos pombos condicionados do que nos controles. Contudo, no hipocampo do grupo testado à noite houve um maior número de células nNOS-positivas. Esse dado estimula questionamento sobre se ocorreria a ativação de mecanismos compensatórios para o aumento da expressão da proteína nNOS, quanto essa é requisitada em situações de baixa disponibilidade / Abstract: The circadian rhythm, expressed in changing behavior and the morphophysiologic and molecular aspects over 24 hours of the day is one of the basic functions of living organisms. The behavioral processes and molecular mechanisms in the hippocampus, which are involved in learning and memory, show circadian oscillation. Several studies have suggested that classical fear conditioning is affected by the circadian timing system and the circadian oscillation of specific molecular pathways is required for the consolidation of aversive memory. This study investigated the circadian oscillation of nNOS expression and activity of NOS protein in the hippocampus of pigeons and their relationship with the temporal modulation of aversive contextual conditioning. In Part I, we have characterized the temporal pattern of nNOS expression, which was detected by Western blotting and temporal pattern of NOS enzyme activity, determined by the amount of L-citrulline produced per minute and per microgram of protein in the reaction. In Part II, at the times of minimum and maximum activity of the protein, pigeons were trained and tested in aversive conditioning to context. The sessions were taped for later behavioral analysis. After the test was performed immunohistochemical for labeling of nNOS in neurons in the hippocampus. Circadian rhythm was evident (p <0.05) in nNOS protein expression and enzyme activity of NOS, according to figures provided by Cosinor method to characterize the temporal pattern. The mean optical density of groups with times closer to the acrophase - ZT04 (10hrs; 0.944 ± 0.12) and nadir - ZT16-(22hs; 0.572 ± 0.16) were significantly different (F5, 18 p <0.0001 ). The groups conditioned in both schedules, showed more frequent and longer duration of freezing behavior than controls (p <0.05). There was a day-night variation for freezing behavior in control groups (p <0.05). Labeling of nNOS-positive cells was higher in the hippocampus of the groups conditioned with total nNOS-positive cells in the dorsal area of the experimental group tested at night was higher than that observed in control groups and experimental group in the morning (p <0.05). The data showed that nNOS protein expression and enzymatic activity of NOS in the hippocampus of pigeons show an oscillation that characterizes a circadian temporal pattern. Both at the time of maximum as the low activity of nNOS, the aversive contextual conditioning resulted in fear conditioning to context and expression of nNOS-positive cells in the hippocampus was higher in pigeons conditioned than in controls. However, in the hippocampus of the group tested in the evening there was a greater number of nNOS-positive cells. This fact encourages questioning of whether there would be activation of compensatory mechanisms for the increased expression of nNOS protein, as this is required in situations of low availability / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Heitor Moreno Junior / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:55:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_SilviaElainedeSousaFerreiraCarvalhode_D.pdf: 6801672 bytes, checksum: d5d157af717b53ac33305c8ec554a2d0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um mediador biológico multifuncional que serve como molécula chave em muitos processos fisiopatológicos, sintetizado nas células endoteliais em resposta a estímulos fisiológicos ou patológicos. Sua síntese se dá a partir da clivagem do terminal nitrogênio-guanidina do aminoácido L-arginina, em uma reação catalizada pela enzima óxido nítrico sintase (NOS). Há três isoformas de NOS: a NOS endotelial (eNOS), a NOS neuronal (nNOS) e a NOS induzível (iNOS). A eNOS e a nNOS são isoformas expressas constitutivamente nas células endoteliais vasculares e nas células neuronais, respectivamente; e a iNOS que a forma induzível, expressa em células inflamatórias após a indução por citocinas e outros mediadores inflamatórios. Após sua síntese o NO se difunde para as células do músculo liso vascular ativando a enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), que converte guanosina-tri-fostato (GTP) em guanosina-3¿,5¿-monofosfato cíclica (GMPc), um segundo mensageiro para seus diversos efeitos biológicos, dentre os quais o relaxamento da musculatura lisa vascular. A síntese de NO pode ser inibida por vários compostos análogos à L-arginina, como L-NMMA, L-NAA, L-NAME e L-NIO de forma dose-dependente. A inibição crônica da síntese de óxido nítrico pela administração crônica de L-NAME é um modelo complexo e bem estabelecido de hipertensão arterial e miocardiopatia hipertensiva. É caracterizado por elevação da pressão arterial (PA) de forma severa, redução na freqüência cardíaca, no fluxo coronário e débito cardíaco (DC), aumento da resistência vascular periférica total (RVPT), diminuição do relaxamento vascular e alterações na contratilidade cardíaca, hipertrofia cardíaca, aumento do tamanho cardiomiócito, remodelamento miocárdico e microvascular com fibrose perivascular, sendo que o índice peso cardíaco/peso corporal e peso ventricular esquerdo/peso corporal estão usualmente aumentados. As fosfodiesterases são enzimas que degradam os nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc nas suas formas inativas. São conhecidas 11 famílias de enzimas (PDE1 ¿ PDE11) que diferem com relação ao padrão distribuição, especificidade de substrato, regulação pelas PKs e proteínas ligantes. Estão envolvidas em diversos processos fisiológicos e patológicos, tais como ereção peniana, asma, hipertensão pulmonar, aterosclerose, insuficiência cardíaca e diabetes. Consequentemente, os inibidores seletivos de PDE são interessantes e promissores alvos farmacológicos. Os inibidores das PDEs inpedem a degradação do AMPc, GMPc, elevando seus níveis intracelulares. Esses inibidores mimetizam as estruturas do AMPc e GMPc, mas não são degradados. Sildenafil é um inibidor seletivo da PDE5 induzindo o e relaxamento do músculo vascular liso e têm sido utilizados com sucesso no tratamento da disfunção erétil. A base racional para este projeto é a hipótese de que o sildenafil, por inibir de forma seletiva a PDE5 e conseqüentemente aumentar a disponibilidade de GMPc, possa ter efeitos cardiovasculares benéficos na inibição crônica da síntese de NO que reduz os níveis de GMPc no músculo cardíaco e vascular. Para isso foram estudados 4 grupos experimentais divididos aleatoriamente em: CONTROLE, L-NAME, SILDENAFIL e SILDENAFIL + L-NAME, durante 8 semanas de tratamento. Analisamos as alterações hemodinâmicas através das medidas da pressão arterial média, débito cardíaco, freqüência cardíaca e resistência vascular. As análises histológicas foram feitas através de técnicas morfométricas para determinação do diâmetro de miócito, lesões miocárdicas e espessura da camada média vascular e análises imunohistológicas. Nossos resultados demonstraram que a administração crônica de sildenafil altera os padrões hemodinâmicos e histolólgicos do modelo de miocardiopatia hipertensiva induzida pela inibição da síntese de NO por L-NAME. A inibição da PDE5 restaurou parcialmente os padrões hemodinâmicos, avaliados através da PA, DC e RVPT, além de protege parcialmente o miocárdio e músculo vascular liso contra as lesões e remodelamento cardiovascular característicos deste modelo experimental. A biodisponibilidade de GMPc, nos animais do grupo L-NAME + sildenafil, foi totalmente restaurada após 8 semanas de tratamento e a expressão das enzimas PDE3 e PDE5 estavam modificadas no músculo vascular liso e nos discos intercalares dos miócitos. Dessa forma, concluimos que o sildenafil, através da inibição da PDE5, aumentando a biodisponibilidade do GMPc, resulta em um efeito cardioprotetor e antiproliferativo contra as alterações cardiovasculares descritas no modelo de miocardiopatia hipertensiva induzida pela inibição crônica da síntese de NO em ratos Wistar / Abstract: Many of the physiological responses to nitric oxide (NO) are mediated by cyclic 5'-guanosine monophosphate (cGMP), the intracellular levels of which are regulated by phosphodiesterase type 5 (PDE5). In situations of reduced NO formation, the inhibition of PDE5 by selective inhibitors such as sildenafil could be beneficial in restoring physiological functions by enhancing the intracellular levels of cGMP. In this study, we evaluated the effects of sildenafil on the hemodynamic and histological alterations induced by the chronic treatment of rats with Nw¿nitro-L¿arginine¿methyl ester (L-NAME). After 8 weeks of concomitant treatment with sildenafil and L-NAME, arterial blood pressure was significantly lower (P<0.05) than in L-NAME treated rats. The fall in blood pressure was associated with a slight reduction in the total peripheral vascular resistance (P<0.05). Sildenafil partially restored the decrease in cardiac output seen in L-NAME-treated rats. Morphologically, sildenafil reduced the total area of the myocardial lesions and attenuated the cardiomyocyte and vascular smooth muscle remodeling seen with L-NAME. These results show that sildenafil reversed the deleterious hemodynamic and morphological alterations associated with L-NAME-induced hypertension. This beneficial effect was probably mediated by an increase in cardiac and vascular cGMP levels as reflected in circulating plasma cGMP levels / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:35:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_JulianaContin_M.pdf: 1484102 bytes, checksum: 31482341aabc46ac3c7f655aead3fbd6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante as últimas décadas tem se observado um aumento surpreendente na prevalência de obesidade e diabetes mellitus em populações de várias regiões do mundo, inclusive no Brasil. Diversos estudos epidemiológicos apontam o consumo de dietas ricas em lípides como um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento dessas patologias. Em recente trabalho em nosso laboratório, foi demonstrado que a oferta de uma dieta rica em lípides leva a uma maior expressão hipotalâmica de proteínas participantes de respostas pró-inflamatórias como TNF-a, IL-2, IL-6 e IL-ß. A citocina TNFa, agindo no hipotálamo, modula a ingestão alimentar e o gasto energético através de mecanismos incompletamente elucidados. Neste trabalho exploramos a hipótese de que, para modular a sinalização anorexigênica induzida por insulina no hipotálamo, o TNFa deve requerer a síntese de óxido nítrico. O TNFa ativa sinalização intracelular canónica no hipotálamo, com pico na concentração de 10-8 M. Esse efeito é acompanhado pela indução da expressão das formas neuronal e induzível da enzima NOS, em ambos os casos com pico em 10-12 M. Em adição, TNFa estimula a atividade catalítica de NOS. O pré-tratamento com TNFa em baixa dose (10-12 M) inibe a sinalização anorexigênica insulino-dependente. Esse efeito é abolido em camundongos iNOS mas não em camundongos nNOS knockout. Portanto, o efeito inibitório exercido pela baixa dose de TNFa sob a inibição da ingestão alimentar induzida por insulina depende, pelo menos em parte, da expressão de iNOS. Embora nNOS hipotalâmica seja induzida por TNFa, esta não participa da modulação TNFa-dependente dos sinais anorexigênicos da insulina. / Abstract: Obesity has reached epidemic proportion in several regions of the world. General changes in life-style, including consumption of fat-rich food, are amongst the most important factors leading to an unprecedented increase in the prevalence of this disease. In a recently work on our laboratory, we showed that high fat feeding (hyperlipidic diet) induced the expression of several pro-inflammatory cytokines and inflammatory responsive proteins in hypothalamus, like TNFa, IL-2, IL-6 e IL-lß. The cytokine TNFa, acting on the hypothalamus, modulates food intake and energy expenditure through mechanisms incompletely elucidated. Here, we explored the hypothesis that, to modulate insulin-induced anorexigenic signaling in hypothalamus, TNF-a would require the synthesis of NO. TNF-a activates canonical intracellular signaling in hypothalamus, peaking at 10-8 M. This is accompanied by the induction of expression of the inducible and neuronal forms of NOS, in both cases peaking at 10-12 M. In addition TNF-a stimulates NOS catalytic activity. The pre-treatment with TNF-a at low dose (10-12 M) inhibits insulin-dependent anorexigenic signaling. This effect is abolished in iNOS but not in Nnos knockout mice. Thus, the inhibitory effect exerted by low dose TNF-a upon the insulin-induced inhibition of food intake depends, at least in part, on the expression of iNOS. Although hypothalamic nNOS is induced by TNF-a it does not participate on TNF-a-dependent modulation of the insulin anorexigenic signals. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Sonia Jancar / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Landgraf_RichardtGama_D.pdf: 1629843 bytes, checksum: d732dae7c868194b49b83ed52b21a953 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve, simultaneamente, a participação de diversos tipos celulares, citocinas e mediadores inflamatórios. Apesar do grande número de estudos sobre o papel da bradicinina e do óxido nítrico (NO) na asma, vários aspectos não foram abordados e outros são controversos. Os objetivos deste trabalho foram, em modelo murino de asma: 1) caracterizar alguns parâmetros da inflamação pulmonar como infiltrado de eosinófilos e linfócitos (CD4 +, CD8 +, B, T?d e NK1.1) no espaço aéreo, reatividade das vias aéreas à metacolina e produção de muco e avaliar o efeito de antagonistas de receptor induzível (B1) e constitutivo (B2) da bradicinina nestes parâmetros; 2) comparar o efeito da supressão aguda da síntese de NO (por tratamento com inibidores da síntese) com a ausência constitucional da iNOS (utilizando animais deficientes para este gene) nestes parâmetros; 3) avaliar a cinética da expressão da iNOS no pulmão e o tipo celular responsável pela produção de NO na fase inicial da inflamação alérgica pulmonar. Camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de ovalbumina utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante. Uma dose de reforço foi administrada após 7 dias e o desafio antigênico realizado no 14º e 21º dia por aerosol. Os antagonistas de receptores da bradicinina e os inibidores de NO foram administrados por via intraperitoneal 30 minutos antes de cada desafio antigênico. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com o antagonista do receptor induzível B1 da bradicinina (R-954) reduziu significativamente o número de eosinófilos no BAL, a hiperreatividade das vias aéreas e a secreção de muco, entretanto não alterou o número de linfócitos no BAL. Por outro lado, o tratamento com o antagonista do receptor constitutivo B2 da bradicinina (HOE-140) aumentou o número de eosinófilos e linfócitos no BAL, porém, não alterou a hiperreatividade das vias aéreas nem a secreção de muco. Estes efeitos dos antagonistas foram semelhantes nas linhagens C57Bl/6 e BALB/c. Estes resultados sugerem que, neste modelo de inflamação alérgica pulmonar, a ativação dos receptores constitutivos da bradicinina regula negativamente a inflamação enquanto que a ativação dos receptores induzíveis regula positivamente. O tratamento com os inibidores de NO, L-NAME ou aminoguanidina, diminuiu o número de eosinófilos e linfócitos no BAL, a hiperreatividade das vias aéreas e a secreção de muco. Surpreendentemente, camundongos deficientes para o gene da iNOS apresentaram inflamação das vias aéreas semelhantes aos camundongos não deficientes, e o tratamento destes camundongos com os inibidores de NO não afetou nenhum dos parâmetros avaliados. Estes dados mostram que a inibição aguda da iNOS tem efeito anti-inflamatório neste modelo de asma, enquanto que a ausência constitutiva desta enzima não tem efeito. Observamos ainda que no BAL obtido 12 horas após o desafio antigênico, as células que expressam marcador fluorescente de NO são células com núcleo polimórfico. Isto coincidiu com o pico de infiltração de neutrófilos para o BAL e com o pico de expressão da iNOS no pulmão. Estes resultados sugerem que neutrófilos do BAL produzem NO na fase inicial da asma murina. Assim, nossos estudos contribuíram para uma melhor compreensão do papel dos receptores constitutivos e induzidos da bradicinina, na asma e sugeriram que a utilização de antagonistas do receptor B1 poderia ter um efeito protetor. Além disso, a demonstração da produção de NO por neutrófilos que migraram para o BAL na fase inicial da inflamação alérgica sugere que inibidores da síntese de NO possam ter efeito protetor quando utilizados em fase precoce da estimulação antigênica / Absract: Asthma is a chronic inflammatory disease that involves simultaneously several cell types, cytokines and inflammatory mediators. Despite the large number of publications dealing with the role of nitric oxide (NO) and bradykinin in asthma, several aspects of the disease were not addressed and some are controvertial. In the present study, using a murine model of asthma, we: 1) characterized some parameters of pulmonary inflammation such as airways infiltration of eosinophil and lymphocytes (CD4 +, CD8 +, B, T?d e NK1.1), airways reactivity to methacholine and mucus secretion and evaluated the effect of antagonists of the inducible (B1) and constitutive (B2) bradikinin receptors in these parameters; 2) compared the effect of acute suppression of NO synthesis (by treatment with NO inhibitors) with the absence of iNOS (using mice deficient for this gene) on these parameters; 3) evaluated the temporal profile of iNOS expression in the lungs and the cell type responsible for lung NO production in the initial phase of lung inflammation. Mice were sensitized by ip injection of ovalbumin using alum as adjuvant. One booster was administered after 7 days and antigen challenge performed on day 14 and 21 by aerosol. The bradykinin receptor antagonists and the NO inhibitors were given ip, 30 min before each challenge. The results obtained show that treatment with the B1 receptor antagonist, R-954 significantly reduced the number of eosinophils in the BAL, airways hyperreactivity and mucus secretion but did not alter the number of BAL lymphocytes. Treatment with the constitutive (B2) bradykinin receptor,HOE-140), however, increased eosinophils and BAL lymphocytes number, but had no effect on airways hyperreactivity nor in mucus secretion. These effects of the antagonists were observed in both, C57Bl/6 e BALB/c mice. These results suggest that, in this model of lung inflammation, activation of constitutive bradykinin receptors would down-regulate the inflammation whereas activation of the inducible receptor would have a pro-inflammatory effect. Treatment with NO inhibitors, L-NAME or aminoguanidine, reduced eosinophils and lymphocytes in BAL, airways hyperreactivity and mucus secretion. Surprisingly, in mice deficient of iNOS gene the airways inflammation was similar to that observed in iNOS sufficient mice and treatment of the deficient mice with the NO inhibitors did not affect the parameters analyzed. These results show that acute inhibition of iNOS has anti-inflammatory effect in this model of asthma whereas the absence of this enzyme has no effect. It was also observed that in the BAL collected 12h after antigen challenge, the cells that expressed a fluorescent NO marker were cells with polymorphic nucleous. This was coincident with the peak of neutrophils infiltration to the BAL and with the peak expression of lung iNOS. These results suggest that BAL neutrophils produce NO in the initial phase of murine asthma. Thus, our studies contributed for a better understanding of the role of the constitutive and inducible bradykinin in asthma and suggest that antagonists of B1 receptor could have a beneficial effect on asthma. Moreover, the demonstration of NO production by neutrófilos that had migrated to the BAL suggests that NO synthesis inhibitors would have a beneficial effect when administered early after antigenic stimulation / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Modulation of acute and chronic stress on NOS expression levels in the rat hippocampus. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014. Cerebral response to stress involves the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. The hippocampus is associated with spatial learning, contextual memory and regulates this axis activation. Nitric oxide (NO) is considered an atypical neurotransmitter and participates in the process of memory consolidation and learning, although it is also associated with the neurotoxicity responsible for the activation of the neuronal death cascades. The aim of the present study was to evaluate the short- and long-term effects of stress on NO levels in the rat hippocampus, inducing stress by restraint. We verified that the hippocampal areas CA2 and dentate gyrus seem to be more susceptible to lesions by NO production. The dorsal region of these areas is the most expressive of NO, and possibly the one more damaged by long-term stress. We could observe that acute stress does not significantly alter the production of NO. It is likely that NO produced in the chronic stress protocol is maintained by the induced NO-synthase. Long-term stress is a determinant factor in NO production, which can be harmful to the hippocampus. / Modulação do estresse agudo e crônico sobre os níveis de expressão da NOS no hipocampo de ratos Wistar. Márcia Leite dos Santos, São Cristovão-2014. A reação cerebral ao estresse desenvolve-se ativando o eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal. O hipocampo está associado ao aprendizado espacial, memória contextual e atua regulando a atividade desse eixo. De modo que o óxido nítrico, considerado um neurotransmissor atípico, participa do processo de consolidação da memória e aprendizagem, porém tem intima relação com o processo de neurotoxicidade responsável pelo desencadeamento de cascatas de morte neuronal. O presente trabalho buscou investigar os efeitos do estresse a curto e longo prazo sobre os níveis de NO no hipocampo, utilizando o modelo experimental de contenção em ratos Wistar. Foi verificado que determinadas áreas hipocampais foram mais suscetíveis a lesões pela produção de NO, sendo elas a CA2 e o Giro Denteado. A região dorsal dessas áreas é mais expressiva junto a marcações diaforásicas e possivelmente também sofrem mais com os efeitos do estresse em longo prazo. Percebe-se que o estresse agudo não é capaz de produzir efeitos significativos sobre a produção do NO, no tocante a promover danos a homeostasia hipocampal. Provavelmente o NO produzido no estresse crônico seja mantido pela via da isoforma i-NOS. Sendo que o estresse em longo prazo é determinante para as taxas de produção de NO, deletérias ao sistema hipocampal.

Orientador: Jose Eduardo Tanus dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T02:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Syllos_RogerWilliamCruzde_M.pdf: 523113 bytes, checksum: 7a17db80334615a2d5ead89d954e6305 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Polimorfismos no gene da sintase endotelial do óxido nítrico (eNOS) têm sido associados com desenvolvimento ou severidade da retinopatia diabética em pacientes com diabetes mellitus tipo 1(DM1). Entretanto, existem poucos estudos investigando esta associação em portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Além disso, não há estudo prévio que tenha analisado a combinação de marcadores genéticos (haplótipos) e aparecimento e/ou gravidade das complicações vasculares do DM2 . Foram estudados três polimorfismos genéticos: Polimorfismo de base única (SNP) na região promotora (T 786 C), no exon 7 (Glu298Asp) e um número variável de repetições sequenciais (VNTR) no intron 4 (b/a), em 103 voluntários saudáveis e 170 pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2, classificados em diabéticos sem retinopatia (114) e com retinopatia (56). Outrossim, examinamos a associação dos haplótipos genéticos da eNOS com diabetes mellitus tipo 2 e retinopatia diabética. Não foram encontradas diferenças na freqüência dos genótipos e dos alelos dos três polimorfismos entre os três grupos testados. Entretanto, um determinado haplótipo "C - Glu - b" foi mais comum no grupo de indivíduos saudáveis (24%) do que nos pacientes diabéticos (7%) (P=0.0001). Quando comparamos diabéticos com retinopatia diabética com aqueles sem retinopatia, não foi identificada diferença significativa na distribuição da freqüência dos haplótipos da eNOS (P=0,7372). Estes achados sugerem que não há associação entre retinopatia diabética e haplótipos individuais da eNOS em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2. O haplótipo "C - Glu - b" , no entanto, pode possuir algum efeito protetor contra o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 2. Novos estudos devem se conduzidos para tentar identificar uma base molecular para tal efeito / Abstract: Background: Polymorphisms in the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene have been associated with the development of diabetic retinopathy (DR) in patients with type 1 diabetes mellitus (T1DM), but not with T2DM. However, no previous study has analyzed combinations of genetic markers (haplotypes), which can be more informative. Methods: We studied three eNOS genetic polymorphisms: a single nucleotide polymorphism in the promoter region (T-786C), in exon 7 (Glu298Asp), and a variable number of tandem repeats in intron 4 (b/a) in 103 healthy controls, and in 170 patients with T2DM (without DR, N=114; with DR, N=56). We also examined the association of eNOS gene haplotypes with T2DM and with DR. Results: No differences were found in the frequencies of genotypes and alleles of the three polymorphisms among the three groups of subjects. Conversely, the "C-Glu-b" haplotype was more common in healthy controls (24%) than in T2DM patients (7%) (P=0.0001). Finally, no significant difference in the distribution of eNOS haplotypes frequencies was found when T2DM patients with or without DR were compared (P=0.7372). Conclusions: These findings suggest no association between DR and individual eNOS haplotypes in T2DM patients. The "C-Glu-b" haplotype, however, may have a protective effect against T2DM. Further studies should be conducted to address the molecular basis for such an effect / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T00:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_CatarinaRaposoDias_D.pdf: 35688895 bytes, checksum: dc0574f3ff57450c0d5ff8840699f5e9 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Venenos animais são fontes de substâncias neuroativas, algumas capazes de provocar paralisia e convulsão em mamíferos, com visível ação no sistema nervoso central (SNC). O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) é composto por neurotoxinas que causam, experimentalmente, permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE). A BHE é uma entidade tanto física, quanto molecular, composta pelos microvasos sanguíneos cerebrais, pelos pés astrocitários e pericitos adjacentes engajados no controle do tráfego de moléculas na interface sangue-cérebro. A BHE, embora imprescindível à manutenção da homeostase no SNC, pode representar um obstáculo ao acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. Nossa proposta foi investigar a ação sistêmica do PNV após 15 min, 2 e 5 h da injeção i.v. em ratos Wistar adultos através de: (1) alterações na expressão das proteínas juncionais, de efluxo e transportador de glicose da BHE; (2) alterações na expressão da proteína conexina-43 (constituinte das junções comunicantes) e da proteína fosfatase pPP2A, uma vez que a fosforilação de resíduos de tirosina das proteínas juncionais tem papel no controle da integridade paracelular; (3) ativação de vias neuronais e sua modulação pelo óxido nítrico (NO). (4) Reação inflamatória e gliose reativa de astrócitos in vivo e in vitro e sua possível modulação pelo NO, (5) Purificação e identificação de toxinas do PNV com ação na BHE. A expressão das proteínas juncionais encontrava-se diminuída aos 15 min e 2 h, porém às 5 h pós-PNV a expressão das proteínas investigadas estava total ou parcialmente recuperada, sugerindo ser esse um dos mecanismos de abertura da BHE. Igualmente, a expressão da proteína de efluxo aumentou indicando mecanismo de clearance do agente tóxico. A expressão da conexina-43, e da pPP2A estavam aumentadas aos 15 min e diminuída às 5 h da injeção do PNV, mostrando não só que as comunicações célula-célula e o mecanismo de adesão célulacélula foram afetados, mas também que as alterações podem ser transitórias. Ademais, vias neuronais foram ativadas em áreas motoras e em núcleos do hipotálamo o que explicaria o comprometimento motor (convulsão, paralisia) e os sinais neurovegetativos (sialorréia, hipertensão, estresse respiratório, edema pulmonar, anúria) vistos em animais envenenados. Muitas dessas vias apontam modulação nitrérgica dos sinais tóxicos do envenenamento, uma vez que a inibição da síntese de NO pelo 7- nitroindazol (7-NI) diminuiu a ativação neuronal em algumas áreas e exacerbou em outras. Os astrócitos incubados com PNV, corroborando com estudos in vivo, expressaram citocinas pró-inflamatórias e apresentaram gliose reativa, porém a inibição da síntese do NO atenuou esses efeitos, confirmando que o NO tem um importante papel nos efeitos do PNV. Toxinas F8a-1 e F10a-1, purificadas do PNV, foram identificadas como responsáveis pela permeabilização da BHE, embora não esteja excluída a contribuição de outros componentes. O entendimento da ação do PNV e de suas toxinas no tecido neural e na BHE pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para uso clínico e em pesquisa. / Abstract: Animal venoms are source of neuroactive substances, some of them able to provoke paralysis and convulsion in mammals, indicating action on the central nervous system (CNS). The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV) is composed of neurotoxins that cause, experimentally, blood-brain barrier (BBB) permeabilization. The BBB is both a physical and molecular entity, constituted by the cerebral microvessels and surrounding astrocytic end-feet and pericytes, all involved in the control of the traffic of molecules at the blood-brain interface. Even so the BBB presence is essential for the maintenance of CNS homeostasis; it also represents an obstacle for the therapeutical drugs access into the neural microenvironment. Our proposal was to investigate acute changes (15 min, 2 and 5 h) after PNV i.v. injection in adult Wistar rats through evaluation of the: (1) alterations in the expression of the BBB-junctional proteins, -efflux proteins, and -glucose transporter; (2) alterations in the expression of connexin-43 protein (gap junctions constituent) and protein phosphatase 2A (pPP2A, since phosphorylation of tyrosine residues from junctional proteins plays a role in controlling junctional integrity); (3) activation of neuronal pathways and its modulation by the nitric oxide (NO). (4) In vivo and in vitro astrocytes inflammatory reaction and reactive gliosis after incubation with PNV and its possible modulation by NO. (5) Purification and determination of BBB-acting from toxins PNV. The expression of the junctional proteins was diminished at 15 min and 2 h post-PNV exposure; however at 5 h the expression of most of the proteins investigated was total or partially recovered, suggesting that this might be one of the BBB opening mechanisms. Similarly, the venom increased the efflux protein expression, indicating ongoing clearance of toxic agents from the neural tissue. The expression of both connexin-43 and pPP2A increased after 15 min and diminished after 5 h of PNV injection, showing not only that cell-cell communication and cell-cell adhesion mechanism were affected, but that these alterations were transitory. Activated neuronal pathways have been observed in brain motor areas and hypothalamic nucleus, explaining the motor impairment (convulsion, paralysis) and neurovegetative signs (salivation, hypertension, respiratory stress, pulmonary edema, anuria) observed in the envenomed animals. Many of these neuronal pathways point to a nitrergic modulation of the envenomed toxic signs, since that NO synthesis inhibition by 7-nitroindazol (7-NI) decreased the neuronal activation in some areas and enhanced in others. The astrocytes incubated with PNV, in agreement with in vivo studies, expressed pro-inflammatory cytokines and presented reactive gliosis, however the pretreatment with 7- NI attenuated these effects, confirming that NO have an important role in the PNV effects. The F8a-1 and F10a-1 toxins, fractionated from the crude PNV, were identified as responsible by BBB permeabilization; despite, other venom components contribution can not be discarded. The understanding of the action of the venom of Phoneutria nigriventer and its toxins in the neural tissue and BBB can contribute for the development of useful tools for clinical and research purposes. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:35:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lippe_ElianaMaraOliveira_M.pdf: 15998840 bytes, checksum: c90882b20fd79172ca6324e555698016 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: o sucesso da implantação e do desenvolvimento embrionário no útero de humanos e roedores decorre de interações íntimas entre as células de origem materna e fetal, com a intermediação de citocinas e mediadores químicos em fino balanço estabelecendo um diálogo entre as diferentes populações celulares da interface materno-fetal. Este diálogo envolve do lado fetal as células trofoblásticas e do lado materno o estroma decidualizado, vasos sanguíneos e células leucocitárias do endométrio, numa complexa rede de sinalizações cujos mecanismos são apenas parcialmente conhecidos. Desequilíbrios neste balanço de sinalizações podem resultar na interrupção da gravidez sendo particularmente intrigante a participação das células natural killer uterinas (uNK) que constituem uma população linfocitária que estão presentes em grande quantidade no ambiente uterino exclusivamente durante a gestação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão e participação das isoformas das enzimas óxido nítrico sintases (NOS) como potencial indutor do desequilíbrio da homeostasia do microambiente uterino na interface materno-fetal envolvendo a produção do óxido nítrico (NO). Foram utilizados camundongos no 8° e 10° dia de gestação (dg) normal e grupos de animais cujos embriões foram lesionados mecanicamente por intervenção cirúrgica ou inoculados com lipopolissacarídios (LPS). Amostras uterinas de sítios embrionários foram coletadas nos períodos de 1, 2 e 6 horas pós-lesão mecânica, ou, 6 horas após inoculação com LPS e processados de acordo com as técnicas rotineiras para embebição em parafina, assim como, processados para obtenção de homogeneizados teciduais da região mesometrial destes sítios embrionários. Cortes de parafina foram submetidos à reação citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) e às reações imunocitoquímicas para as isoformas iNOS, eNOS e nNOS e, para IFNa. Foram realizadas SDS-PAGE dos homogeneizados teciduais e Western-blot com os anticorpos anti-iNOS, anti-eNOS e anti-nNOS. A região mesometrial dos sítios embrionários lesionados mecanicamente apresentou hiperemia após 1 hora de lesão que evoluiu para um quadro de hemorragia nos períodos posteriores. No grupo submetido ao tratamento com LPS foi observado um quadro de hiperemia no período de 6 horas. Pela citoquímica com a lectina DBA constataram-se alterações na morfologia das células uNK destes sítios, sendo notória a perda de reatividade no conteúdo dos grânulos lisosomo-secretores. As avaliações imunocitoquímica para iNOS indicaram que as células uNK, as células deciduais e as células trofoblásticas gigantes expressam iNOS constitutivamente na gestação normal, o mesmo ocorrendo com as isoformas eNOS e nNOS. Nos sítios de lesão embrionária, as células uNK apresentam acentuada redução na marcação pela imunocitoquímica para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas, com recuperação parcial após 6 horas. Estas variações não foram constatadas em outras células da interface materno-fetal. A eNOS apresentou marcações constantes nas células uNK e nas células musculares lisas, sem variações nos grupos experimentais de lesão embrionária. Pelo Western-blot foi constatada uma redução signficativa para a iNOS e nNOS nos períodos de 1 e 2 horas pós-lesão mecânica. Estes resultados demonstraram que as células uNK respondem às alterações do ambiente uterino induzido pela lesão embrionária ou pelo LPS, com rápida mobilização das isoformas iNOS e nNOS possivelmente na produção do NO. O NO liberado por estas células pode ser a causa da alteração da permeabilidade ou lesão vascular da região mesometrial provocando a hiperemia e hemorragia. A mobilização da atividade da iNOS nas células uNK não parece ser dependente do IFN-a. e portanto não ocorre o envolvimento das células dendríticas nesta via de sinalização / Abstract: The successful embryo implantation and development in human and rodents uteri is dependent of intimate interaction between maternal and fetal cells, with intervening of fine balance of cytokines and chemical mediators on cross-talks between cells in the maternal-fetal interface. This dialogue involves the cells of decidualized stroma, blood vessels and leukocytes from endometrium of maternal side and the trophoblast cells from embryo in a complex signaling network which mechanism is only partially understood. Unbalance of these signals could outcome in miscarriage being intriguing the participation of uterine natural killer cells (uNK) that com pose lymphocyte population accumulate in the uterine environment specifically during pregnancy. The aim of this work was to evaluated the participation of nitric oxide synthase (NOS) enzymes isoforms which arise in nitric oxide (NO) production, as potential inducer of unbalance of homeostasis in the uterine environment. It was used normal pregnant mice on 8° and 10° gestational days and groups of animais which embryos were surgically lesioned or inoculated with lipopolyssacharide (LPS). Uterine samples were colleted after 1, 2 and 6 hs of embryo lesion or 6hs after LPS inoculation and processed for conventional paraffin embedding, as so as, for tissue homogenates of mesometrial region from this uterine sites. Paraffin sections were processed for Dolichos biflorus (DBA) lectin cytochemistry and immunocytochemistry for iNOS, eNOS, nNOS and IFN-a. SDS-PAGE and Western blot were performed with tissue homogenates using anti-iNOS, anti-eNOS and antinNOS. The mesometrial region of embryo lesioned uterine sites showed hyperemia after 1 hr lesion and increased to hemorrhage after that. In the LPS treated animais was seen hyperemia after 6hr. The DBA cytochemistry showed morphological changes in the uNK cells found in this embryo lesioned sites being noticeable the lost of reactivity in the secretory-Iysosome granules contents. The immunocytochemical for iNOS pointed out the uNK, decidual and trophoblast cells expressing iNOS constitutively in the normal pregnancy, as did the eNOS and nNOS. In the embryo damaged sites the uNK cells showed remarkable reduction in the iNOS and nNOS labeling after 1 and 2 hr with partial recuperation after 6 hr. These variations were not seen in other cells. The eNOS showed constant labelling on uNK cells and smooth muscle cells without changes in the experimental groups of embryo lesion or treated with LPS. By Western blot, it was noted significant lowering for iNOS and nNOS in the periods of 1and 2 hr after lesion. These results showed acute response of uNK cells against the changes of uterine environment induced by embryo lesion and LPS treatment, with fast mobilization of iNOS and nNOS isoforms possibly in the production of NO. The NO released from these cells could be the cause of changes on vascular permeability or even lesion of blood vessels localized in the mesometrial region wich results in hyperemia and hemorrhage. The iNOS activation of uNK cells does not seem dependent of IFN-a and therefore without commitmentof dendritic cells in this signaling pathway / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T18:10:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AleksandraAlves_M.pdf: 835795 bytes, checksum: 33a3294673868ddb2965c3532c08b534 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As óxido nítrico sintases (NOS) são divididas em dois grandes grupos de enzimas, NOS induzível (iNOS) e NOS constitutivas (cNOS). Embora o óxido nítrico (NO) seja um importante mediador de defesa do organismo, a produção excessiva de NO está envolvida na patogênese de muitas doenças inflamatórias e metabólicas. Alguns estudos demonstram que o óxido nítrico exógeno e o NO produzido pela iNOS pode induzir resistência à insulina em músculo e desempenha um papel importante na hiperglicemia de jejum. Este estudo teve como objetivo sintetizar e investigar o efeito de um potente e seletivo inibidor de atividade da iNOS, o Iodato de S-Metilisotiouréia (I-SMT) 5 mg/kg por dia, na hiperglicemia de jejum e na resistência à insulina em um modelo de obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Foram observados os parâmetros metabólicos e de sinalização celular da Proteína quinase B/Akt (Akt) e os resultados fornecem evidências de que o grupo tratado com I-SMT foi protegido contra o desenvolvimento de resistência à insulina, e intolerância à glicose induzida por dieta hiperlipídica. Portanto, propomos que potentes inibidores farmacológicos, com seletividade significativa pela iNOS podem representar uma nova abordagem terapêutica para o tratamento da resistência à insulina e suas complicações como o diabetes tipo 2. / Abstract: Nitric oxide synthase (NOS) has been divided into two major sub-enzymes, inducible NOS (iNOS) and constitutive NOS (cNOS). Although nitric oxide (NO) is an important defense mediator, the excessive production of NO has been involved in the pathology of many inflammatory and metabolic diseases. Some studies demonstrate that exogenous nitric oxide (NO) and the NO produced by iNOS can induce insulin resistance in muscle and plays an important role in fasting hyperglycemia. This study investigates the effect of a potent and selective iNOS activity inhibitor, the S-Methylisothiourea Iodide (SMT-I) 5 mg/kg per day, in fasting hyperglycemia and insulin resistance in diet-induced obesity model. We observed the metabolic parameters and Akt signalization and these findings provide evidence that the SMT-I treated group are protected against the development of insulin resistance, glucose intolerance and diet-induced obesity. Therefore, we propose that highly selective inhibitors of iNOS activity may represent a novel therapeutic approach for the therapy of insulin resistance and its complications as type 2 diabetes. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica