- / -

- / -

- / -

Η αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης και κατ’ επέκταση και της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HbF), μέσω ενεργοποίησης με φαρμακολογικούς παράγοντες ή μεταφοράς του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, αποτελούν σημαντικές στρατηγικές για την θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής και μεσογειακής αναιμίας. Καινοτομία αποτελεί η δημιουργία ενός ειδικού συνθετικού ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης, του Zif-VP64, με δομή δακτύλων ψευδαργύρου, ειδικά σχεδιασμένη για πρόσδεση σε αλληλουχία 18bp, περί την θέση -117HPFH του υποκινητή της γ-σφαιρίνης. Επιδίωξη της εργασίας αυτής ήταν η ανάπτυξη ενός μη ιϊκού, επισωματικού φορέα, που φέρει τον συνθετικό ενεργοποιητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, ικανού να λειτουργεί με επάρκεια σε κύτταρα του αιμοποιητικού ιστού. Η φορέας αυτός, Zif-VP64-Ep1, περιλαμβάνει τον ενεργοποιητή της γ-σφαιρίνης και την μεταγραφική κασέτα CMV-eGFP-S/MAR, για την εξασφάλιση της επισωματικής του κατάστασης μέσω του στοιχείου S/MAR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο φορέας Zif-VP64-Ep1: i. διαμολύνει επιτυχώς, K562 κύτταρα σε ποσοστό 45% παραμένοντας σε επισωματική κατάσταση και υποστηρίζοντας έκφραση του διαγονιδίου για τουλάχιστον 200 γενεές, προγονικά κύτταρα μυελού τον οστών ποντικού β-YAC BMCs σε ποσοστό 23% και CD34+ κύτταρα περιφερικού αίματος κινητοποιημένου υγιούς δότη σε ποσοστό 22,5%. ii. ο φορέας Zif-VP64-Ep1 υποστηρίζει σημαντική αύξηση των επιπέδων της γ-σφαιρίνης κατά 3.3±0.2 φορές σε Κ562 και 3.0±1 φορές σε CD34+ κύτταρα, και ενεργοποίηση του ανενεργού γονιδίου γ-σφαιρίνης σε κύτταρα β-YAC BMCs. Επιτυγχάνεται έτσι, για πρώτη φορά, επισωματική γονιδιακή μεταφορά του ενεργοποιητή Zif-VP64 και trans-ενεργοποίηση του γ-γονιδίου σε επίπεδο θεραπευτικής σημασίας. / The increase of HbF through activation of gamma-globin gene is a valid strategy for the treatment of hemoglobinopathies. Zif-VP64 is a selective, synthetic gamma-globin activator, containing a zinc-finger DNA protein that binds the gamma-globin promoter -117HPFH area and a transcription inducer that induces gamma globin gene in K562 cells, after viral transfer. We report the study of an episomal vector of this activator, which is based on a Scaffold/Matrix attachment region (S/MAR) that supports retention of episomes in the nucleus of the host cell. We constructed an episomal vector, Zif-VP64-Ep1, containing the activator Zif-VP64, the reporter gene cassette CMV-eGFP and the S/MAR element. Gene transfer into cells was done by electroporation or nucleofection. Expression of eGFP was documented by Florescent Microscopy and Flow Cytometry, while the fate of vector molecules in the cells was studied by Southern Blot and plasmid rescue experiments. Real time PCR, Western blotting and Intracellular Flow Cytometry were used to investigate gamma-globin mRNA, gamma-globin protein and HbF protein levels respectively. Binding specificity of the activator was determined by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Gene transfer was done in K562 cells producing long term stable cell lines; murine beta-YAC cells, where the YAC contains the complete human, beta-globin gene locus; and human progenitor hemopoietic CD34+ cells from healthy, mobilized individuals, with transfection efficiencies of 65%, 25% and 23% respectively. In K562 cells, gamma-globin mRNA levels showed an increase of 250%, gamma-globin protein of 350% and HbF protein of 165%, as compared to the corresponding levels in the untransfected K562 cells, at least 200 generations post-transfection. Interestingly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to mediate the activation of expression of the silent, human gamma-globin gene of the murine beta-YAC cells, at a level matching the (active) human beta-globin gene of the YAC, as well as the murine beta-globin gene, showing that it can efficiently activate the gamma-globin gene from within a heterochromatic region. Finally and most significantly, vector Zif-VP64-Ep1 was able to transfect the human, hemopoietic progenitor CD34+ cells and to mediate a 3.0±1 fold increase of gamma globin mRNA, compared to untrasnfected CD34+ cells, as estimated in cultures of 7-8 days after transfection. In conclusion, activation of human gamma-globin by episomal gene transfer of a synthetic activator, in three different hemopoietic cells, is documented, including the CD43+ cells, that are the target cells for gene therapy of the Hemoglobinopathies. This is the first time that an S/MAR based episomal vector is used for gene transactivation in a cell line and progenitor cells, aiming at specific gene therapy.

Στην εργασία διερευνάται η παρουσία και η πρόσληψης ιατρικών θεμάτων που αφορούν σε αρρώστιες και στη θεραπεία τους στο πρωτότυπο πεζογραφικό έργο του Αλέξανδρου Παπαδιαμάντη. Συγκεντρώνονται στοιχεία και καταγράφονται πρώτα συμπεράσματα, τα οποία θα μπορούσαν να οδηγήσουν στο μέλλον σε μια συστηματικότερη ανάλυση της σχέσης της λογοτεχνίας του Παπαδιαμάντη με την ιατρική. / This paper investigates the presence of medical issues relating to diseases and their treatment in the original prose of Alexander Papadiamantis. There are recorded first conclusions, which could lead to a more systematic analysis of the relationship of Papadiamantis'literature with medicine.

Ένας μεγάλος αριθμός μελετών παρατήρησης καθώς και τυχαιοποιημένων ελεγχομένων κλινικών δοκιμών έχει πλέον τεκμηριώσει την ασφάλεια, την αποτελεσματικότητα, καθώς και τις μακροπρόθεσμες επιδράσεις της θεραπείας καρδιακού επανασυγχρονισμού (ΘΚΕ) σε ασθενείς με προχωρημένη καρδιακή ανεπάρκεια, επηρεασμένη συσταλτικότητα της αριστεράς κοιλίας (ΑΚ) και ευρύ σύμπλεγμα QRS. Οι περισσότερες τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες με ΘΚΕ αναφέρουν την αποτελεσματικότητα της θεραπείας αυτής σε περίοδο 3 έως 12 μηνών. Αντίθετα, τα δεδομένα σχετικά με την μακροπρόθεσμη έκβαση, ειδικά των ασθενών με προχωρημένη καρδιακή ανεπάρκεια (λειτουργική κλάση III και IV), είναι περιορισμένα και όχι εντελώς σαφή. Σε αντίθεση με τον πλούτο των δεδομένων που αφορούν την αποτελεσματικότητα της ΘΚΕ όμως, και τα οποία έχουν προέλθει από πολλαπλές κλινικές δοκιμές, οι αναφορές σχετικά με την απόδοση της ΘΚΕ στην κλινική πράξη (εκτός δηλαδή ερευνητικών πρωτοκόλλων) είναι σχετικά περιορισμένες και οι μελέτες μακροχρόνιας παρακολούθησης είναι ακόμα λιγότερες. Οι μελέτες που έχουν ασχοληθεί ειδικά με την ηχοκαρδιογραφική ανταπόκριση μετά από ΘΚΕ είναι ως επί το πλείστον μέρος μιας μεγαλύτερης κλινικής δοκιμής. Τόσο σε μελέτες στα πλαίσια κλινικών δοκιμών όσο και σε μελέτες παρατήρησης όμως, οι έρευνες έχουν επικεντρώσει κυρίως σε περιόδους παρακολούθησης 3 έως 6 μηνών, ενώ λίγα μόνο δεδομένα υπάρχουν πέραν των 12 μηνών. Η αντίστροφη αναδιαμόρφωση της ΑΚ, κυρίως κατά την άμεση περίοδο μετά την εμφύτευση, φαίνεται να είναι και ο ισχυρότερος προγνωστικός δείκτης επιβίωσης των ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια που λαμβάνουν ΘΚΕ. Ωστόσο, καθώς η ΑΚ συνεχίζει να αναδιαμορφώνεται και μετά την εμφύτευση, είναι ασαφές κατά πόσον η βραχυπρόθεσμη ευνοϊκή ανταπόκριση που παρατηρείται στο 60% -70% των ασθενών διατηρείται μακροπρόθεσμα. Η ηχοκαρδιογραφία παραμόρφωσης έχει χρησιμοποιηθεί για την εξαγωγή δεικτών καρδιακού δυσυγχρονισμού και την εκτίμηση της λειτουργίας της ΑΚ πριν την εμφύτευση συσκευής ΘΚΕ (αμφικοιλιακού βηματοδότη με ή χωρίς δυνατότητα απινιδωτή). Η ανταπό-κριση των δεικτών παραμόρφωσης της ΑΚ μπορεί να έχει σημαντικές προγνωστικές επιπτώσεις για τους ασθενείς που υποβάλλονται σε ΘΚΕ, λαμβάνοντας υπ’ όψιν ότι οι δείκτες παραμόρφωσης πρόσφατα εδείχθησαν να έχουν ισχυρότερη συσχέτιση με την πρόγνωση των ασθενών με καρδιακή ανεπάρκεια σε σχέση με το κλάσμα εξώθησης ή άλλους κλασσικούς δείκτες της λειτουργικής κατάστασης της ΑΚ. Παρ’ όλα αυτά, ελάχιστα ηχοκαρδιογραφικά δεδομένα υπάρχουν σχετικά με την ανταπόκριση των δεικτών παραμόρφωσης μετά από θεραπεία επανασυγχρονισμού, ενώ δεν υπάρχουν καθόλου στοιχεία πέραν των 6 μηνών. Σε αυτή τη μελέτη, εκτιμήσαμε τη μακροπρόθεσμη ανταπόκριση της λειτουργίας της ΑΚ, όπως αυτή καταγράφεται ηχο¬καρδιο¬γραφικά μετά από τουλάχιστον 12 μήνες παρακολούθησης, μετά από εμφύτευση συσκευής καρδιακού επανασυγχρονισμού με δυνατότητες απινιδωτή (CRT-D). Ο πρωτογενής μας στόχος ήταν να καταγράψουμε συστηματικά, χρησιμοποιώντας συμβατικούς αλλά και νεώτερους ηχοκαρδιογραφικούς δείκτες (απεικόνιση παρα-μόρφωσης), τη μακροπρόθεσμη ανταπόκριση της λειτουργίας της ΑΚ μετά από εμφύτευση συσκευής ΘΚΕ με δυνατότητες απινιδωτή (CRT device with defibrillator capacity, CRT-D) σε ασθενείς με προχωρημένη καρδιακή ανεπάρκεια οι οποίοι λαμβάνουν βέλτιστη φαρμακευτική αγωγή. Οι δευτερογενείς μας στόχοι ήταν (α) να καταγράψουμε τη μακροπρόθεσμη (>12 μήνες) ανταπόκριση του δυσσυγχρονισμού της ΑΚ, όπως αυτή καταγράφεται με ηχοκαρδιογραφική απεικόνιση παραμόρφωσης (β) να συσχετίσουμε τους δείκτες δυσσυγχρονισμού της ΑΚ πριν από την εμφύτευση με τη μακροπρόθεσμη ανταπόκριση της λειτουργίας της ΑΚ, και (γ) να συσχετίσουμε τους συμβατικούς και νεώτερους ηχοκαρδιογραφικούς δείκτες λειτουργίας της αριστεράς κοιλίας πριν από την εμφύτευση με τη μακροπρόθεσμη ανταπόκριση της λειτουργίας της ΑΚ. / Several observational studies and randomized controlled trials (RCTs) have demonstrated the safety, efficacy, and long-term effects of cardiac resynchronization therapy (CRT) in patients with advanced heart failure, reduced left ventricular systolic function, and wide QRS complex. Most clinical trials with CRT report efficacy within a 3-to-12 month time frame. However, data on long-term effects, especially for advanced heart failure patients with NYHA class III-IV, are limited and unclear. In contrast to the wealth of data on efficacy of CRT, reports on effectiveness of CRT in clinical practice (i.e. outside the context of RCTs) are limited and data on long-term effectiveness are scarce. Studies dealing with echocardio-graphic responses come largely from sub-studies of larger RCTs. However, both these sub-studies as well as observational studies have focused on short-term echocardiographic responses, whereas very limited data exist beyond 12 months. Reverse remodeling of the left ventricle in response to CRT in the immediate post-implant period is the strongest predictor of long-term prognosis in these patients. However, as the left ventricle continues to remodel long after CRT device implantation, it is unclear whether the initial favorable response observed in 60% to 70% of CRT recipients is maintained long term. Deformation echocardiography has been used to derive ventricular dyssynchrony indices and assess left ventricular function prior to CRT device implantation (biventricular pacemaker with or without defibrillator capacity). The response of myocardial deformation indices of the left ventricle may have important prognostic implications for CRT recipients, considering that deformation parameters have been shown to have a stronger association with prognosis compared with ejection fraction or other conventional indices of left ventricular function. Nevertheless, limited echocardiographic data exist on the response of myocardial deformation indices to CRT, whereas no data exist beyond 6 months post CRT. In this study, we have evaluated the long-term echocardiographic response of left ventricle to CRT after a minimum of 12 months of follow up after implantation of a CRT device with defibrillator capacity (CRT-D). Our primary aim was to systematically record, using both conventional and novel echocardiographic indices (myocardial deformation), the long-term (12 months or longer) response of the left ventricle after CRT-D device implantation in patients with advanced heart failure receiving optimal medical therapy. Our secondary aims were to (a) record the long-term response of left ventricular dyssynchrony assessed with myocardial deformation indices in these patients; (b) correlate left ventricular dyssynchrony indices before CRT-D device implantation with long-term response of the left ventricle, and (c) correlate both conventional and novel left ventricular function indices before implantation with long-term response of the left ventricle after CRT-D device implantation.

Οι επισωματικοί φορείς αποτελούν την εναλλακτική επιλογή για την μεταφορά γονιδίων σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Διπλασιάζονται αυτόνομα χωρίς να ενσωματώνονται στα χρωμοσώματα του κυττάρου και έτσι στερούνται της σοβαρής παρενέργειας του φαινομένου της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Το ενδιαφέρον ως προς την ανάπτυξη επισωματικών φορέων για την γονιδιακή μεταφορά αυξήθηκε κατακόρυφα τα τελευταία χρόνια μετά την ανάπτυξη του φορέα pEPI-1, ο οποίος περιείχε το στοιχείο S/MAR του γονιδίου της ανθρώπινης βήτα- ιντερφερόνης. Ο φορέας αυτός είχε την ιδιότητα να διατηρείται επισωματικά χωρίς την ανάγκη μεταγραφής κάποιου ιϊκού γονιδίου. Τα στοιχεία S/MAR αποτελούν ετερογενείς περιοχές DNA οι οποίες συνδέονται στην θεμέλια ουσία του πυρήνα, συμμετέχοντας στην οργάνωση του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, στην αντιγραφή του DNA και στην ρύθμιση της μεταγραφής. Αποφασίσαμε στην μελετήσουμε την δράση του S/MAR στοιχείου σε ένα διαφορετικό περιβάλλον DNA. Ξεκινώντας από τον φορέα pCEP4 που βασίζεται στα στοιχεία OriP και EBNA-1 του ιού η EBV κατασκευάσαμε τα εξής πλασμίδια: 1) pEBS/eGFP με το S/MAR να είναι κλωνοποιημένο μετά το γονίδιο της eGFP όπως στο pEPI-1. 2) pESdER / eGFP προερχόμενο από το pEBS/eGFP με διαγραφή του γονιδίου EBNA-1 και.3) pCEP4 / eGFP (πλασμίδιο μάρτυρας). Σε αντίθεση με τις προσδοκίες μας μόνο το πλασμιδίου pCEP4 / eGFP ήταν ικανό να εγκαταστήσει σταθερές κυτταρικές σειρές Jurkat. Ο υπολογισμός της αποσταθεροποίησης υπό τάση των παραπάνω πλασμιδίων απέδειξε μια υψηλή ουδό για την αποσταθεροποίηση της περιοχής του OriP, σε αντίθεση με το μητρικό φορέα pCEP4, γεγονός που οφείλεται στον ενεργειακό ανταγωνισμό μεταξύ του OriP και της υψηλά αποσταθεροποιημένης περιοχής του S/MAR. Η αντικατάσταση του OriP στο πλασμίδιο pESdER / eGFP από την περιοχή έναρξης της αντιγραφής το γονίδιο της β-σφαιρίνης (IR) (pESdER-IR/eGFP) έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της επισωματική της κατάστασης, προσδίδοντας επιπλέον και υψηλή μιτωτική σταθερότητα χωρίς την ανάγκη ύπαρξης πίεσης επιλογής σε καλλιέργειες για χρονικό διάστημα τριών μηνών. Συμπεράνουμε ότι το δυναμικό πολλαπλασιασμού ενός επισωματικού συστήματος που περιέχει ένα στοιχείο S/MAR εξαρτάται από την ύπαρξη μιας δεύτερης υψηλά αποσταθεροποιημένης έννοιες περιοχής ικανής να ξεπεράσει την σταθεροποιητική δράση της αλληλουχίας S/MAR. Το γεγονός αυτό προσδίδει μια νέα διάσταση στη σχεδίαση αυτόνομων επισωματικών φορέων, που περιέχει τον υπολογισμό της αποσταθεροποίησης της διπλής έλικας DNA υπό τάση. Η ευρεία χρήση των ρετρο-ιϊκών φορέων ως συστήματα γονιδιακής μεταφοράς σε κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας έφερε στην επιφάνεια την ανάγκη για μια ακριβή εκτίμηση της ασφάλειας των δοκιμών αυτών όσον αφορά το φαινόμενο της μεταλλαξιγένεσης μέσω ενσωμάτωσης. Στην εργασία αυτή αναφέρεται μια νέα μέθοδος για την ανίχνευση των θέσεων ενσωμάτωσης των ρετρο-ιϊκών φορέων που έχει κλινικό προσανατολισμό και ονομάζεται DSCP-PCR( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR). Η μέθοδος αυτή έχει αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα, δεδομένου ότι δεν εξαρτάται από στάδια κατάτμησης με ένζυμα περιορισμού και αντιδράσεις λιγάσης που αποτελούν μέρος των υπαρχόντων μεθόδων (όπως η LAMPCR). Η μείζονα διαφορά ανάμεσα στην DSCP-PCR και στις προηγούμενες PCR μεθόδους συνιστάται στο στάδιο της σύνδεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας του DNA όπου χρησιμοποιείται ένας εκκινητής που το ένα άκρο του είναι εκφυλισμένο ενώ το άλλο αποτελείται από διπλή έλικα DNA. Η σχεδίαση αυτή τον καθιστά ικανό να προσδένεται μόνο στο άκρο οποιασδήποτε μονής αλυσίδας. Η μέθοδος αυτή παράγει ένα υψηλά πληροφοριακό σύνολο δεδομένων για τον χαρακτηρισμό των θέσεων ενσωμάτωσης των φορέων. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση του προφίλ των κλώνων που συμμετέχουν στην αιμοποίηση σε κάποια χρονική περίοδο. Η παρακολούθηση το προφίλ αυτού μέσα στον χρόνο δίνει ενδείξεις για την κινητική της αιμοποίησης και κατά συνέπεια της εμφάνιση νέων κλώνων. / Episomal vectors have been considered valid alternatives to viral vectors for gene therapy applications, as they are replicating extrachromosomally and are devoid of the adverse effect of insertional mutagenesis. Interest in the episomal systems was boosted by the development of the pEPI-1 vector, containing the scaffold matrix attachment region (S/MAR) element of the human beta-interferon gene, which confers to it stable episomal status, without the need for transcription of any viral element. S/MARs are heterogeneous DNA regions that attach to the nuclear matrix, participating in the organization of the eukaryotic genome, initiation of DNA replication and regulation of transcription. We decided to study the performance of the S/MAR element in a completely different vector DNA context. Starting from vector pCEP4 (Invitrogen) based on OriP EBV and EBNA-1 latent retention system, we constructed plasmids: (1) pEBS/eGFP with SMAR element cloned after eGFP gene as in pEPI-1. (2) pESdER/eGFP derived from pEBS/eGFP by deletion of EBNA-1 gene and (3) pCEP4/eGFP as reporter plasmid. Contrary to expectations, only plasmid (3) was able to establish stable Jurkat cell line cultures. Calculation of stress-induced duplex destabilization of the above plasmids demonstrated a high threshold for the destabilization of the OriP region, unlike the parental vector pCEP4, caused by the energy competition of OriP with the highly destabilized S/MAR region. Substitution of OriP in plasmid (2) with the β-globin initiation region (IR) (pESdER-IR/eGFP) results in the restoration of episomal status, providing high mitotic stability without selection pressure for up to 3 months of culture. We deduce that the replication potential of an episomal system carrying an S/MAR element depends on the existence of highly destabilized vector sequences, sufficient to counteract the S/MAR effect of stabilization on vector’s DNA backbone molecule and maintain the plasmid’s accessibility to the cellular replication machinery. Thus emerges the concept of including the calculation of stress-induced duplex destabilization in the design of self-replicative extrachromosomal units. The widespread use of retroviral-based vectors as gene transfer systems in the context of gene therapy clinical trials has emerged the need for accurately assessing their safety profile in order to identify the potential risks of insertional mutagenesis. Here we report a new PCR - based method, DSHP-PCR ( partially Double stranded, Sterically Hindered Primer – PCR), a clinically orientated method for analysing the integration sites with high sensitivity and reliability, devoid of the restriction digestion and cloning bias present in the existing methods. The difference between DSHP-PCR and previous PCR-based methods (such as LAM-PCR) consists in the step of second strand synthesis where the use of a partially double stranded –degenerated primer that binds at the end of the DNA single strands bypasses the need for the restriction digestion step that inserts a bias in integration site detection and for the cassette ligation step that renders the whole procedure inefficient. This method generates a highly informative integration site library used for the sequencing of the human genomic – retroviral junctions, by creating a PCR product pool that contains a high percentage of specific fragments of similar length that can be subcloned with the same efficiency in a sequencing vector. It can also be used for the creation of the clonal composition profile of patient’s each cell lineage in time allowing the monitoring of clonal kinetics of the haematopoietic or immune system by detecting the emergence of new clones that contribute to haematopoiesis.

Τα επισωματικά οχήματα γονιδιακής μεταφοράς αποτελούν ελκυστική εναλλακτική πειραματική προσέγγιση της γονιδιακής θεραπείας σε σχέση με τα ιϊκά οχήματα. Στην παρούσα εργασία και στο πλαίσιο της ανάπτυξης επισωματικών οχημάτων για την γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών, μελετάται το όχημα hβ-SMAR(Α), ένα κυκλικό πλασμίδιο, που φέρει το γονίδιο της ανθρώπινης β-σφαιρίνης και το μLCR και βασίζεται σε ανθρώπινα χρωμοσωμικά στοιχεία, το S/MAR στοιχείο από την περιοχή 5’ του γονιδίου της ανθρώπινης ιντερφερόνης β. Διαπιστώθηκε ότι το hβ-SMAR(Α) συγκρατήθηκε εντός της διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς MEL για περισσότερες από 300 γενιές με διαπιστωμένη την επισωματική του κατάσταση για τουλάχιστο 180 γενιές. Επιπλέον, διατήρησε υψηλά επίπεδα έκφρασης του διαγονιδίου, τα οποία θα αντιστοιχούσαν σε θεραπευτικά επίπεδα, αν αναπαράγονταν in vivo. / Episomal vehicles for gene transfer are an attractive alternative experimental approach to gene therapy in the place of viral vectors. The vehicle hβ-SMAR(Α) studied here, within the context of developing efficient episomal vectors for the gene therapy of hemoglobinopathies, is a circular plasmid bearing the human β globin gene and the μLCR and is based on human chromosomal elements, the S/MAR element from the region 5’ of the human interferon β gene. It was established that hβ-SMAR(Α) was retained within the transfected MEL cell line for more than 300 generations, with its episomal state ascertained for at least 180 generations. Furthermore, it retained high level expression of the transgene, which would be therapeutic, if reproduced in vivo.

Η συγκόλληση των αιμοπεταλίων προάγεται από το ινωδογόνο, μια εξωκυττάρια πρωτεΐνη, η οποία δεσμεύεται εκλεκτικά στον υποδοχέα GP IIb/IIIa. Το τριπεπτίδιο RGD (Arg-Gly-Asp) συνιστά τη μικρότερη αλληλουχία, η οποία είναι απαραίτητη για την αναγνώριση και πρόσδεση του ινωδογόνου στον υποδοχέα και απαντάται και σε άλλες συγκολλητικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι παρούσες στον εξωκυττάριο χώρο και στο αίμα, όπως η ινοσυνδετίνη, το κολλαγόνο, ο παράγοντας Von Willebrand, κτλ. Η αντιπηκτική θεραπεία έχει βασιστεί σε δύο διαφορετικές προσεγγίσεις του προβλήματος. Η μία προσέγγιση αφορά την εμπόδιση της πρωταρχικής διέγερσης των αιμοπεταλίων από διάφορους αγωνιστές, όπως θρομβίνη, επινεφρίνη, κολλαγόνο, κτλ. Η άλλη προσέγγιση περιλαμβάνει την διακοπή του μηχανισμού μεταγωγής σήματος, ο οποίος ακολουθεί την πρόσδεση του αγωνιστή στην επιφάνεια των αιμοπεταλίων. Η ασπιρίνη, παράγωγο του σαλικυλικού οξέος, αναστέλλει το πρώτο βήμα στη βιοσύνθεση της θρομβοξάνης Α2 από αραχιδονικό οξύ μέσω ακετυλίωσης του ενζύμου κυκλοοξυγενάση 1. Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση γραμμικών και κυκλικών αναλόγων του τριπεπτιδίου RGD με ενσωματωμένο σαλικυλικό οξύ ή παράγωγά του. Τα διάφορα ανάλογα συντέθηκαν με κλασικές μεθόδους πεπτιδικής σύνθεσης σε υγρή και στερεά φάση. Τη σύνθεση των αναλόγων ακολούθησε καθαρισμός τους (HPLC) και προσδιορισμός της δομής τους με (ESI-MS). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε in vitro με φωτομετρική μέθοδο στους 37C και συνεχή καταγραφή της διερχόμενης ακτινοβολίας με ειδικό όργανο (Dual Channel Aggregometer) η ανασταλτική τους δράση στη συγκολλητικότητα των αιμοπεταλίων του ανθρώπου. Προς περαιτέρω επιβεβαίωση των πειραμάτων συσσώρευσης και μελέτη της πρόσδεσης των αναλόγων στις ιντεγκρίνες χρησιμοποιήθηκε η κυτταρομετρία ροής με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των υποδοχέων Gp Ia, Gp IIb/IIIa, Gp IIIa και GMp 140. Αναλύοντας τα αποτελέσματα των βιολογικών μελετών, τόσο της αναστολής της συσσωμάτωσης των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro όσο και της κυτταρομετρίας ροής σε ενεργοποιημένα αιμοπετάλια για τα δραστικά πεπτίδια, οδηγούμαστε στα επόμενα συμπεράσματα: 1. Από τη σειρά των RGD γραμμικών αναλόγων που μελετήθηκαν, βρέθηκαν δραστικά μόνο στην περίπτωση που τα πεπτίδια έχουν στο C-τελικό τους άκρο αμίδιο. 2. Η σύζευξη του σαλικυλικού οξέος στο τριπεπτίδιο - αμίδιο RGD ενισχύει την αντισυγκολλητική του δράση έναντι των αιμοπεταλίων in vitro. Από αυτά τα ανάλογα 26 (IC50= 50μΜ), 27 (38μΜ) και 28 (53μΜ) (ενσωματωμένο σαλικυλικό οξύ στο τριπεπτίδιο) έχουν την ισχυρότερη δράση, ενώ μόνο το τριπεπτίδιο 23 έχει IC50= 540μΜ 3. Η προστασία του β-καρβοξυλίου του Asp με βενζυλομάδα αυξάνει τη δράση του πεπτιδίου σε σχέση με την ύπαρξη ελεύθερου β-καρβοξυλίου. Αυτό διαπιστώνεται από το γεγονός ότι όλα τα βιολογικώς δραστικά ανάλογα έχουν το β-καρβοξύλιο προστατευμένο με βενζυλομάδα και αυτό έρχεται σε συμφωνία με βιβλιογραφικά δεδομένα άλλων ερευνητών περί αναγκαιότητας ύπαρξης λιπόφιλης ομάδας στο C-τελικό άκρο του πεπτιδίου. 4. Αντίθετα, η ενσωμάτωση σαλικυλο-παραγώγων (βρώμο-, χλώρο-, νίτρο-, άμινο-, κτλ) στα ανάλογα δίνει πολύ μικρή αντισυγκολλητική δράση στα αιμοπετάλια του ανθρώπου in vitro σε σχέση με το σαλικυλικό οξύ. 5. Από τα συντεθέντα κυκλικά ανάλογα μόνο το ανάλογο 61, που φέρει δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ της κυστεΐνης και του θειοσαλικυλικού οξέος, επέδειξε ισχυρή αντισυγκολλητική δράση έναντι των αιμοπεταλίων του ανθρώπου in vitro με τιμή IC50= 8μΜ, που είναι και η καλύτερη τιμή IC50 για όλα τα ανάλογα που συντέθηκαν (γραμμικά και κυκλικά). 6. Και στην περίπτωση των κυκλικών πεπτιδίων, τα ανάλογα με το προστατευμένο β-καρβοξύλιο εμφανίζουν ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι εκείνων που φέρουν το β-καρβοξύλιο ελεύθερο. 7. Από όλα τα γραμμικά ανάλογα που περιέχουν παράγωγα του σαλικυλικού οξέος το ανάλογο 39 που περιέχει το 5-χλωρο σαλικυλικό οξύ εμφανίζει ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι του υποδοχέα Gp Ib. 8. Τέλος, θα πρέπει να αναφερθεί ότι είναι η πρώτη φορά που συνθετικά πεπτιδικά ανάλογα του RGD εμφανίζουν ισχυρή πρόσδεση στον υποδοχέα Gp Ib, o οποίος ευθύνεται για την προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο κυτταρικό τοίχωμα. / Integrins constitute a large family of heterodimeric cell-surface, transmembrane receptors, which play a major role in cell/cell and cell/matrix adhesive interactions. The Arg-Gly-Asp (RGD) sequence is known to be the integrin recognition site of many extracellular matrix proteins such as fibronectin, osteopontin, collagen, fibrinogen, von Willebrand factor, laminin, etc. On the other hand, it is well known that low doses of aspirin (acetyl salicylic acid) decrease platelet aggregation by causing an inhibitory effect on thromboxane A2 production by platelets. Several antiplatelet strategies have already been developed and are under preclinical or clinical investigation. In the present thesis, the synthesis of linear and cyclic RGD analogs incorporating salicylic acid derivatives is reported. The syntheses of the new analogs were carried out by using classic methods of peptide synthesis in liquid or solid phase. The synthesized compounds were purified by RP-HPLC and lyophilised to give fluffy solid, identified by ESI-MS spectra. These compounds were tested for inhibitory activity on human platelet aggregation in vitro, by adding common aggregation reagents to citrated platelet rich plasma (PRP). The aggregation was determined using a dual channel electronic aggregometer by recording the increase of light transmission. Their specificity for the Gp receptors was checked by using flow cytometry with monoclonal antibodies against Gp Ib, Gp IIb/IIIa, Gp IIIa and GMP140 receptors. Based on the results of the biological studies we could report the next inferences: 1. From the studied synthetic RGD analogs only peptides – amides are active against human platelet aggregation in vitro. 2. The coupling of salicylic acid with the RGD peptides enforces the antiplatelet activity in vitro of the single tripeptide. From the above peptides, the analog 26 (tripeptide incorporating salicylic acid) shows strong antiplatelet activity (IC50=50 μΜ), whereas the analog 23 (only tripeptide) has IC50= 540μΜ. 3. The protection of the β-carboxy group of Asp as benzylester increases the activity of the peptides in comparison with those having the β-carboxy group unprotected. Thus, our results ensure the theory of necessity of the existence a lipophile center on the C-terminal side of the peptide. 4. The incorporation of salicylic acid derivatives in the RGD peptide does not increase further the antiplatelet activity than the incorporation of salicylic acid does. 5. Among the cyclic RGD peptides only the analog 61, having the disulfide bridge between the cysteine and the thiosalicylic acid, shows strong antiplatelet activity in vitro (IC50= 8μΜ). 6. Most of the analogs show high binding affinity for the Gp Ib receptor. The cyclic analog 61 shows special selectivity for this receptor at concetrations of 110 μΜ. 7. The analog 39, although it shows low antiplatelet activity, has high binding affinity for the Gp Ib receptor. Probably, this activity is due to the atom of Cl at the 5 position of aromatic ring of salicylic acid. 8. According to the literature data, it is the first time that synthetic RGD peptides show strong binding affinity for the Gp Ib receptor, which is responsible for the platelet adhesion to the subenthothelium.

Η ποσοτική ή ποιοτική ανεπάρκεια του λυσοσωματικού ενζύμου γλυκοκερεβροσιδάση οδηγεί στην παθολογία της νόσου Gaucher με κεντρικό το ρόλο της συσσώρευσης του υποστρώματός της, του γλυκοκερεβροσιδίου, στα μακροφάγα. Για περισσότερες από δύο δεκαετίες χρησιμοποιούνται γ-ρετροϊικά οχήματα στην ερευνητική προσέγγιση της διόρθωσης του ελλείμματος μέσω γονιδιακής μεταφοράς του γονιδίου της γλυκοκερεβροσιδάσης. Όπως έχει αναδειχθεί και σε κλινικό επίπεδο, είναι επιτακτική η ανάγκη για το σχεδιασμό γ ρετροϊικών οχημάτων, τα οποία θα είναι όχι μόνο αποτελεσματικά αλλά και ασφαλή, με κύριο στόχο τον περιορισμό της πιθανότητας εξαλλαγής του κυττάρου από τις συνέπειες της ενσωμάτωσης («μεταλλαξιγένεση κατά την ενσωμάτωση»). Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας νέων και θεωρητικά ασφαλέστερων σε σχέση με προηγουμένως χρησιμοποιηθέντα σε προκλινικό και κλινικό επίπεδο γ-ρετροϊικών οχημάτων για τη γονιδιακή μεταφορά του γονιδίου της γλυκοκερεβροσιδάσης σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του ανθρώπου. Στο πρώτο μέρος παρουσιάζεται η μελέτη έξι νέων και θεωρητικά ασφαλέστερων γ ρετροϊικών οχημάτων με το γονίδιο της γλυκοκερεβροσιδάσης, τα οποία είναι Self Inactivating (SIN) οχήματα και φέρουν αλληλουχίες για τη βελτίωση της ολοκλήρωσης της μεταγραφής, είτε από τον ιό WHV (WPRE, Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional Regulatory Element) είτε από τον ιό SV40 (2xSV40 USE, Simian Virus 40 Upstream Sequence Element σε δύο διαδοχικά αντίγραφα). Καταδεικνύεται ότι αυτά τα νέα SIN γ ρετροϊικά οχήματα είναι ικανά να μεταφέρουν ένα ενεργό φυσιολογικό γονίδιο γλυκοκερεβροσιδάσης σε CD34+ ανθρώπινο πρωτογενή προγονικό αιμοποιητικό κυτταρικό πληθυσμό. Τα οχήματα αυτά εμφάνισαν διαφορές στην αύξηση της ενζυμικής δραστικότητας, που προέκυψε από τη διαγονιδιακή έκφραση, οι οποίες οφείλονταν εν μέρει σε διαφορές στην αποδοτικότητα της διαμόλυνσης. Το δεύτερο μέρος της μελέτης περιλαμβάνει τέσσερα νέα SIN γ-ρετροϊικά οχήματα με το γονίδιο της γλυκοκερεβροσιδάσης με αντίστοιχο αριθμό οχημάτων-μαρτύρων, τα οποία είναι σχεδιασμένα με στόχο την κυτταροειδική έκφραση στα μονοκύτταρα / μακροφάγα, ώστε να περιοριστούν οι κυτταρικοί πληθυσμοί που εκτίθενται στην πιθανότητα ενεργοποίησης πρωτογκογονιδίων από τη δραστικότητα ενός εσωτερικού υποκινητή. Τα οχήματα φέρουν τους υποκινητές των ανθρώπινων γονιδίων CD11b και CD68 σε αλληλουχίες που είχαν επιδείξει στο παρελθόν μυελοειδοειδική έκφραση σε πειράματα γονιδιακής μεταφοράς. Τα νέα αυτά οχήματα ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητά τους να παρουσιάζουν ισχυρότερη έκφραση του διαγονιδίου μετά από μονοκυτταρική / μακροφαγική διαφοροποίηση διαμολυσμένου CD34+ ανθρώπινου πρωτογενή προγονικού αιμοποιητικού κυτταρικού πληθυσμού σε σχέση με την έκφραση σε ένα λιγότερο διαφοροποιημένο διαμολυσμένο κυτταρικό πληθυσμό. Τα αποτελέσματα του δεύτερου μέρος της μελέτης σε συνδυασμό με τα ήδη υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνηση του υποκινητή του CD68 στο πλαίσιο των προσπαθειών για μυελοειδοειδική γονιδιακή μεταφορά του γονιδίου της γλυκοκερεβροσιδάσης, χωρίς να ενθαρρύνουν την περαιτέρω διερεύνηση του υποκινητή του CD11b. / Quantitative or qualitative deficiency of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase results in the accumulation of its substrate, glucocerebroside, in macrophages, leading to the pathology of Gaucher disease. For more than two decades of research, gammaretroviral vectors have been used for gene transfer of the glucocerebrosidase gene for the correction of the enzyme’s deficit. It has been shown, even on clinical level, that the design of efficient as well as safe gammaretroviral vectors, aiming mainly at eliminating “insertional mutagenesis”, is an imperative need. The present study aims at the determination of the efficiency of new and theoretically safer, gammaretroviral vectors, compared to previously used ones on preclinical and clinical level, for the gene transfer of the glucocerebrosidase gene into human hematopoietic progenitor cells. In the first part of the study, six new and theoretically safer gammaretroviral vectors of the glucocerebrosidase gene have been evaluated. All six vectors are Self-Inactivating (SIN) and bear sequences for the improvement of transcriptional termination. These are either the WPRE (“Woodchuck hepatitis virus Post-transcriptional Regulatory Element”) from the virus WHV or the 2xSV40 USE (two copies of “Simian Virus 40 Upstream Sequence Element” in tandem repeat) from the virus SV40. It is shown that these new gammaretroviral vectors are efficient in transferring an active wild type glucocerebrosidase gene copy into a CD34+ human primary hematopoietic progenitor cell population. All six vectors showed increased enzyme activity, as compared to the untransduced cells, albeit with differences amongst them, partly due to differences in the transduction efficiency. The second part of the study focuses on the analysis of four new SIN gammaretroviral vectors of the glucocerebrosidase gene and the corresponding number of control vectors, designed for cell-specific expression in monocytes / macrophages. The aim is to thus limit the range of cell populations to be exposed to possible proto-oncogene activation from the internal promoter activity. In these vectors the expression of a glucocerebrosidase gene is driven by one of the promoters of the human genes for CD11b and CD68, which have exhibited myeloid specific expression in gene transfer experiments in the past. These new vectors were studied for their effectiveness in leading to stronger transgene expression after monocytic / macrophagic differentiation of a transduced CD34+ human primary hematopoietic progenitor cell population, compared to a less differentiated transduced cell population. The results of this study, taken together with the current bibliographical data, are encouraging for further study mainly of the CD68 promoter in the context of the research approach to myeloid specific gene transfer of the glucocerebrosidase gene.