H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη διερεύνηση της σχέσης του οξειδωτικού στρες με τη σκληρωτιακή διαφοροποίηση και την παραγωγή αφλατοξίνης του μύκητα Aspergillus flavus. Ο μύκητας αυτός έχει σπουδαία αγροτική σημασία διότι μπορεί να επιμολύνει αποθηκευμένους καρπούς. Επίσης μπορεί να αποτελεί παθογόνο μικροοργανισμό για τον άνθρωπο που σχετίζεται με ασπεργιλλώσεις των πνευμόνων και άλλες λοιμώξεις. Πολλά στελέχη παράγουν μεγάλες ποσότητες αφλατοξίνης, μιας καρκινογόνου και εξαιρετικά τοξικής ένωσης. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε ο ρόλος κεντρικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες όπως η λιπιδική και πρωτεϊνική υπεροξείδωση, η θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση αλλά και συγκεκριμένων αντιοξειδωτικών ενζύμων, καθώς και η επίδραση συγκεκριμένων αντιοξειδωτών στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση ενός στελέχους αγρίου τύπου σε σύγκριση με ένα μεταλλαγμένο μη σκληρωτιογόνο και μη αφλατοξινογόνο στέλεχος (ΔveA). Για την ολοκλήρωση αυτής της διατριβής χρειάστηκε η ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών για την ποσοτικοποίηση στους μύκητες της ολικής πρωτεΐνης, και εξειδικευμένων θειολικών και λιπιδικών παραμέτρων του οξειδωτικού στρες. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν μια σαφή συσχέτιση του οξειδωτικού στρες με τη διαφοροποίηση των σκληρωτιογόνων μυκήτων, αφού το αγρίου τύπου στέλεχος εμφανίζεται περισσότερο στρεσαρισμένο οξειδωτικά σε σύγκριση με το αδιαφοροποίητο μεταλλαγμένο στέλεχος. Η χορήγηση αντιοξειδωτών ανέστειλε πλήρως (με εξαίρεση το ασκορβικό οξύ) τη σκληρωτιογένεση του αγρίου τύπου στελέχους επιδρώντας διαφορετικά στις παραμέτρους του οξειδωτικού στρες, ενώ μείωσε έως ανέστειλε πλήρως τη βιοσύνθεση αφλατοξίνης, αποκαλύπτοντας τη συμμετοχή του οξειδωτικού στρες σε αυτές τις διαδικασίες. Τα αποτελέσματα της διατριβής εκτός από επιστημονικό ενδιαφέρον έχουν και πρακτική σημασία εξαιτίας της παθογένειας του συγκεκριμένου μύκητα τόσο στον άνθρωπο όσο και στα φυτά. / The present thesis aims to elucidate the relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation and aflatoxin production of the fungus Aspergillus flavus. This fungus has great agricultural importance because it can infect stored grains. It can also be a human pathogen, associated with aspergillosis of the lungs and other infections. Many strains produce significant quantities of aflatoxin, a carcinogenic and acutely toxic compound. In particular, the role of central parameters of oxidative stress such as lipid and protein peroxidation, thiol redox state and antioxidant enzymes, and the influence of certain related exogenous antioxidants were studied on the biosynthesis of aflatoxin, on the biogenesis of sclerotia in a wild type in comparative relationship with a non-sclerotiogenic and non-aflatoxigenic mutant strain (ΔveA). The experimental needs of this thesis necessitates the development of new methodologies for the precise quantification of certain thiol and lipid markers of oxidative stress and protein concentration. The results show a clear relationship between oxidative stress and sclerotial differentiation since the wild type strain is more oxidatively stressed than the mutant non-differentiating strain. Administration of certain antioxidants completely inhibited sclerotiogenesis in the wild type strain (with the exception of ascorbic acid), and decreased or even halted the biosynthesis of aflatoxin, thus revealing an implication of oxidative stress on these processes. The results besides having scientific interest, have also practical importance since this fungi is both human and plant pathogen.

Η σήψη αποτελεί μια από τις σημαντικότερες αιτίες νοσηλείας και θνησιμότητας στον ανεπτυγμένο κόσμο, όπου σχεδόν τα δύο - τρίτα του πληθυσμού υποφέρουν από παχυσαρκία. Σαν αποτέλεσμα, η συνύπαρξη των δύο αυτών καταστάσεων έχει γίνει όλο και συχνότερη στην κλινική πράξη και ένας συνεχώς αυξανόμενος αριθμός κλινικών μελετών προσπαθεί να προσεγγίσει την πιθανή επίδραση της παχυσαρκίας στην νοσηρότητα και θνησιμότητα των ασθενών με σήψη, με έως τώρα αντιφατικά αποτελέσματα. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνήσει τον τρόπο με τον οποίο η παχυσαρκία επηρεάζει την ανοσιακή απάντηση των σηπτικών ασθενών, εκτιμώντας τον αριθμό και την κατάσταση ενεργοποίησης των μακροφάγων του λιπώδους ιστού, τα επίπεδα του TNFα στον ορό και στον λιπώδη ιστό και δείκτες οξειδωτικού stress στο πλάσμα. Ασθενείς και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 106 ασθενείς, οι οποίοι χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (Ελέγχου n=26, Παχυσαρκίας n=27, Σήψης n=27, Σήψης & Παχυσαρκίας n=26). Ο αριθμός των μακροφάγων στο υποδόριο και ενδοκοιλιακό λίπος και οι υπότυποί τους (M1 και M2) αναγνωρίστηκαν με ανοσοϊστοχημική τεχνική υπό μικροσκόπηση. Τα επίπεδα του TNFα mRNA στο υποδόριο και ενδοκοιλιακό λίπος μετρήθηκαν με real-time reverse transcription-PCR. Στον ορό τα επίπεδα του TNFα μετρήθηκαν με sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Το οξειδωτικό stress στο πλάσμα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας επιλεγμένους βιοδείκτες [TBARS (thiobarbituric acid-reactive substances), Πρωτεϊνικά Καρβονύλια, TAC (total antioxidant capacity)]. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε ότι η σήψη αυξάνει τον ολικό αριθμό και τον Μ2 υπότυπο των μακροφάγων στο ενδοκοιλιακό λίπος, ενώ η παχυσαρκία δεν φάνηκε να επηρεάζει τη συγκέντρωση των μακροφάγων στο λίπος. Η παχυσαρκία βρέθηκε ότι αυξάνει τα επίπεδα του TNFα mRNA (P<0.05) στο ενδοκοιλιακό λίπος καθώς επίσης και τα επίπεδα των TBARS (P<0.001) και Πρωτεϊνικών Καρβονυλίων (P<0.001) στο πλάσμα των σηπτικών ασθενών. Τα επίπεδα της TAC στο πλάσμα βρέθηκε ότι μειώνονται και τα επίπεδα TNFα στον ορό ότι αυξάνονται με τη σήψη, ενώ δεν επηρεάζονταν από την παχυσαρκία. Συμπεράσματα: Η παχυσαρκία σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή TNFα στον λιπώδη ιστό και αύξηση του οξειδωτικού stress, προάγοντας την προ-φλεγμονώδη απάντηση στους σηπτικούς ασθενείς. / Sepsis is one of the most important causes of mortality in the developed world, where almost two thirds of the population suffer from obesity. Therefore, the coexistence of both conditions has become frequent in clinical practice and a growing number of clinical studies attempts to examine the potential effect of obesity on sepsis with controversial results up to now. The present study investigates how obesity influences the immune response of septic patients, by assessing the number and activation state of adipose tissue macrophages, serum and adipose tissue tumor necrosis factor-alpha (TNFα) levels and plasma oxidative stress markers. Subjects/methods: The study included 106 patients, divided into four groups (control n = 26, obesity n = 27, sepsis n = 27 and sepsis and obesity n = 26). The number of macrophages in subcutaneous and visceral adipose tissue (SAT and VAT) and their subtypes (M1 and M2) were defined with immunohistochemical staining techniques under light microscopy. TNFα mRNA levels were determined in SAT and VAT using real-time reverse transcription-PCR. Serum levels of TNFα were determined with sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Plasma oxidative stress was evaluated using selective biomarkers [thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), protein carbonyls and total antioxidant capacity (TAC)]. Results: Sepsis increased the total number of macrophages and their M2 subtype in VAT, whereas obesity did not seem to affect the concentration of macrophages in fat. Obesity increased TNFα mRNA levels (P < 0.05) in VAT as well as the plasma TBARS (P < 0.001) and protein carbonyls (P < 0.001) in septic patients. The plasma TAC levels were decreased and the serum TNFα levels were increased in sepsis although they were not influenced by obesity. Conclusions: Obesity is associated with elevated TNFα adipose tissue production and increased oxidative stress biomarkers, promoting the proinflammatory response in septic patients.

Το οξειδωτικό στρες θεωρείται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη παθογένεση πολλών εκφυλιστικών νόσων, όπως τα καρδιαγγειακά νοσήματα, ο καρκίνος και οι νευροεκφυλιστικές διαταραχές. Πολλές μελέτες μέχρι τώρα έχουν δείξει τη σημαντική επίδραση της διατροφής στην εξουδετέρωση των ελευθέρων ριζών. Η Ελληνική χλωρίδα είναι πλούσια σε πηγές φυσικών αντιοξειδωτικών, στις οποίες ανήκουν και τα φυτά του γένους Sideritis. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της πόσης, για 40 ημέρες, ενός αφεψήματος (4% κ.ό.), που παραδοσιακά καταναλώνεται στην Ελλάδα, του είδους Sideritis clandestina subsp. cyllenea, σε βιοχημικές παραμέτρους εγκεφαλικών περιοχών ενηλίκων μυών. Το ανωτέρω φυτό, που φύεται στα βουνά της Β. Πελοποννήσου, επιλέχθηκε μετά από προσδιορισμό της πολυφαινολικής σύστασης και των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων υδατικών εκχυλισμάτων από διάφορους πληθυσμούς του είδους Sideritis clandestina. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των εγκεφαλικών περιοχών στα ζώα-μάρτυρες παρουσίασε διαφορές (φλοιός>παρεγκεφαλίδα>μεσεγκέφαλος). Η κατανάλωση του αφεψήματος μετέβαλε την αντιοξειδωτική ικανότητα των εγκεφαλικών περιοχών με ιστοειδικό τρόπο. Ο φλοιός και η παρεγκεφαλίδα επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη βιοχημικών παραμέτρων αυτών, με ανάλυση του μεταβολικού τους προφίλ, μεταβολομική, πριν και μετά την κατανάλωση του αφεψήματος, με τη χρήση αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GCMS). Από την ανάλυση αυτή ταυτοποιήθηκαν μέχρι τώρα αρκετοί μεταβολίτες, η βιοχημική αξία των οποίων είναι σημαντική. Τα ανωτέρω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πόση του αφεψήματος επηρεάζει τις εγκεφαλικές λειτουργίες, παρατήρηση που χρήζει περαιτέρω διερεύνηση. / Oxidative stress is considered to play a pivotal role in the pathogenesis of many degenerative diseases, such as cardiovascular disease, cancer and neurodegenerative disorders. Until recently many studies have shown the important effect of diet in the destruction of free radicals. Hellenic flora is very rich in sources of natural antioxidants, including the plants of the genus Sideritis. The aim of this study was to investigate the effect of consumption for 40 days, of a beverage (4% w/v) that is traditionally consumed in Greece, of species Sideritis clandestina subsp. cyllenea, on biochemical parameters of adult mice brain regions. This plant that grows on the mountains of North Peloponnesus was chosen after determination of the polyphenolic content and the antioxidant properties of water extracts of various Sideritis clandestina populations. The antioxidant activity of the brain areas of the control mice differed (cerebral cortex>cerebellum>midbrain). The consumption of the beverage altered the antioxidant activity of the brain regions in a tissue-specific manner. The cerebral cortex and cerebellum were chosen for further study of their biochemical parameters, analyzing their metabolic profile, (metabolomics) before and after the beverage consumption, using a gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) technology. Many metabolites, of high biochemical value, have identified with that analysis, until now. Consequently, the above results indicate that the consumption of this beverage can influence various brain functions, an observation that needs further delineation.

Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης όπως εκφράζεται στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum και S. minor σε σχέση με τη θειολική οξειδοαναγωγική κατάσταση (ΘΟΚ), αλλά και με το οξειδωτικό στρες, στo πλαίσιο της θεωρίας της οξειδωτικώς επαγόμενης σκληρωτικής διαφοροποίησης (που προτάθηκε από το εργαστήριό μας το 1997). Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Στη διαμόρφωση της ΘΟΚ συμμετέχουν πολλά μη πρωτεϊνικά, πρωτεϊνικά και μεικτά θειολικά και δισουλφιδικά συστατικά, ανάμεσα στα οποία η γλουταθειόνη θεωρείται ο κύριος συνδετικός κρίκος. Επειδή στη διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον υπολογισμό όλων των παραγόντων της ΘΟΚ για την εκπλήρωση του στόχου της μελέτης, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες σε όλους τους οργανισμούς. Παράλληλα, αναπτύχθηκε και μια νέα μέθοδος για την εξειδικευμένη ποσοτικοποίηση του μικρο-κατακερματισμένου DNA, καθώς στη διεθνή βιβλιογραφία οι περισσότερες υπάρχουσες μέθοδοι ήταν ποιοτικές και όχι εξειδικευμένες ως προς το μέγεθος των θραυσμάτων DNA. Επιπρόσθετα, η εκτίμηση των οξειδωτικών βλαβών στο DNA έγινε και με τη μέτρηση ενός γενικού δείκτη αυτών των βλαβών (εγκοπές και σπασίματα) με υπάρχουσα μέθοδο ύστερα από σημαντική τροποποίησή της. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της ειδικής ενεργότητας των βασικών ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ και της σχετιζόμενης με τη ΘΟΚ ενδογενούς βιταμίνης C, καθώς και η ποσοτικοποίηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένοι εξωγενείς τροποποιητές της ΘΟΚ. Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης των νέων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση των παραμέτρων της ΘΟΚ και των οξειδωτικών βλαβών στο DNA ως προς την εξαγωγή πιο ασφαλών συμπερασμάτων για τη συσχέτιση της ΘΟΚ με το οξειδωτικό στρες. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι η σχετιζόμενη με αυτό ΘΟΚ μεταβάλλεται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Το συμπέρασμα αυτό βασίστηκε στη διαπίστωση (α) της ύπαρξης διαφορετικών για κάθε μορφή διαφοροποίησης ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και αντιοξειδωτικών ενζύμων και (β) διαφορετικών προφίλ-διαβαθμίσεων των συγκεντρώσεων των παραμέτρων της ΘΟΚ και των δεικτών οξειδωτικού στρες. Επιπρόσθετα, ο άμεσος αντιοξειδωτικός ρόλος των ενδογενών μη πρωτεϊνικών θειολικών (με –SH ομάδα) παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση επιβεβαιώθηκε και από τη μείωση της τελευταίας κατά την τεχνητή αύξηση αυτών των παραμέτρων ύστερα από τη χορήγηση τροποποιητών της ΘΟΚ, γεγονός που θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξ αυτών αύξηση της ενδογενούς γλουταθειόνης και της κυστεΐνης. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται και από την ανάλογη αντιοξειδωτική επίδραση των χορηγούμενων θειολών-τροποποιητών της ΘΟΚ Ν-ακετυλοκυστεΐνη (που ανιχνεύτηκε και ενδοκυτταρίως) και γλουταθειόνη και της μη πρωτεϊνικής θειολικής ουσίας-μάρτυρα διθειοθρεϊτόλη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που τα επίπεδα της ενδογενούς γλουταθειόνης και του δισουλφιδίου της καθώς και η μεταξύ τους αναλογία συσχετίζονται συνήθως με το οξειδωτικό στρες στη διεθνή βιβλιογραφία, στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι δεν συμβαδίζουν με τους αποδεδειγμένους δείκτες του οξειδωτικού στρες υπεροξείδωση των λιπιδίων και οξειδωτικές βλάβες του DNA. Έτσι, ο ρόλος των ενδογενών θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ στη σκληρωτιακή διαφοροποίηση αποδεικνύεται περίπλοκος, ένεκα του ότι δεν δρουν μόνο ως άμεσοι αντιοξειδωτές αλλά και ως υποστρώματα των βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ΘΟΚ. Τέλος, και στους τέσσερις τύπους σκληρωτίων ανιχνεύθηκαν υψηλές συγκεντρώσεις θειολικών παραμέτρων της ΘΟΚ και βιταμίνης C, καθώς και ενζύμων που μετέχουν στη ρύθμιση της ΘΟΚ, υποδηλώνοντας ότι ο πιθανός στόχος της συσσώρευσης όλων των παραπάνω παραμέτρων της ΘΟΚ στα σκληρώτια είναι η αξιοποίησή τους για αντιοξειδωτική προστασία των υφών του μυελού του πυρήνα τους κατά το χρονικό διάστημα της αναπτυξιακής τους στασιμότητας, μέχρι να βρεθούν σε κατάλληλες συνθήκες για βλάστηση. / The aim of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to thiol redox state (TRS) and oxidative stress under the theory of the oxidative induction of sclerotiogenesis (proposed by our lab in 1997). Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. TRS is known to be comprised of many non-protein, protein and mixed thiol and disulfide components, with glutathione being the central component. Since there was not available any appropriate method for the determination of all TRS components, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. Additionally, another new method was developed for the quantification of small-sized fragmented DNA, since the existing methods were qualitative and not discriminating DNA size. Complementarily, oxidative damage of DNA was also estimated by a general DNA damage (nicks and fragments) marker by a published method that was significantly modified. TRS was also evaluated by the measurement of the specific activity of certain enzymes that regulate it, by the quantification of the TRS-related antioxidant vitamin C, as well as by the determination of oxidative damage on membrane lipids. Certain exogenous TRS modulators were also used. The results of this study verified the need for the development of the new methods for the determination of TRS parameters and oxidative damage of DNA, since their use allowed a more accurate estimation of the relation of TRS with oxidative stress. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that TRS components are variously formed and dependent on the type of sclerotial differentiation. This conclusion was based on (a) the existence of different (for each type of sclerotial differentiation) endogenous TRS thiol parameters and TRS-related antioxidant enzymes and (b) the different profiles-concentration gradients of TRS parameters and oxidative markers. Moreover, the direct antioxidant role of the endogenous TRS non-protein thiol parameters in sclerotial differentiation was verified by the decrease of the latter during the endogenous increase of those parameters after administration of the specified TRS-modulating substances. This could be attributed to the resulting by those substances increase of the endogenous glutathione and cysteine. This result was also supported by the antioxidant effect of the administered TRS-modulating thiol substances N-acetylcysteine (which was traced also intracellularly) and glutathione, and of the non-protein control-thiol dithiothreitol. It is worth noting that in spite of the fact that endogenous glutathione, its disulfide, and their resulting ratio are usually considered as oxidative stress markers, it was found that in this study these markers are not in accordance with the specific markers of oxidative stress lipid peroxidation and DNA damage in the evaluation of the role of oxidative stress and TRS in sclerotial differentiation. Thus, the role of the thiol parameters of TRS in sclerotial differentiation is very complicated in light of the fact that they do not act only as direct antioxidants but also as substrates of the studied TRS-related enzymes. Finally, in all sclerotial types have been found high levels of intracellular thiol parameters of TRS and vitamin C as well as enzymes that participate to TRS regulation, implying that their possible role is to provide antioxidant protection of the hyphae of the sclerotial medulla until the environmental conditions become appropriate for their germination.

Οι ασθενείς µε αποφρακτικό ίκτερο, ιδιαίτερα όταν εκτίθενται στο επιπρόσθετο stress ενός επεµβατικού διαγνωστικού ή θεραπευτικού χειρισµού, είναι επιρρεπείς στην ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και νεφρικής δυσλειτουργίας που οδηγούν σε υψηλά ποσοστά νοσηρότητας και θνητότητας. Πειραµατικές και κλινικές µελέτες έχουν δείξει ότι ο αποφρακτικός ίκτερος προκαλεί δυσλειτουργία του βλεννογόνιου εντερικού φραγµού, οδηγώντας σε ενδοτοξιναιµία, η οποία φαίνεται να διαδραµατίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των επιπλοκών αυτών. Η απουσία χολής µεταβάλλει τη λειτουργία του εντερικού φραγµού χωρίς να διασπά τη συνέχεια του επιθηλίου. Οι µοριακοί µηχανισµοί που ενέχονται στο φαινόµενο αυτό δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρεί να διερευνήσει την επίδραση του πειραµατικού αποφρακτικού ικτέρου στην έκφραση της αποφραξίνης, δοµικού συστατικού των αποφρακτικών ενώσεων, στον εντερικό βλεννογόνο, στην απόπτωση και στον πολλαπλασιασµό των επιθηλιακών κυττάρων στις κρύπτες και στα επίπεδα οξειδωτικού stress στο έντερο. Επιπλέον, σε µια προσπάθεια θεραπευτικής παρέµβασης, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος των ρυθµιστικών εντερικών πεπτιδίων bombesin (BBS) και neurotensin (NT) στις ανωτέρω παραµέτρους, καθώς και στην ιστολογία και στα επίπεδα οξειδωτικού stress στο ήπαρ. Προηγούµενες µελέτες έχουν δείξει ότι τα πεπτίδια αυτά εξασκούν ένα ευρύ φάσµα δράσεων στον εντερο-ηπατικό άξονα και βελτιώνουν την ακεραιότητα του γαστρεντερικού βλεννογόνου έπειτα από την επίδραση διαφόρων βλαπτικών παραγόντων. Η απουσία χολής ενδοαυλικά, αποστερεί τον εντερικό βλεννογόνο από τις βακτηριοστατικές, αντι-ενδοτοξινικές και τροφικές της ιδιότητες, οδηγώντας σε αύξηση των βακτηριδίων και της ενδοτοξίνης ενδοαυλικά και σε εντερική ατροφία. Οι µεταβολές αυτές προάγουν τη µετακίνηση βακτηρίων και ενδοτοξινών στην πυλαία φλέβα και ακολούθως, µέσω µιας κατασταλµένης εκκαθαριστικής ικανότητας των κυττάρων Kupffer εξαιτίας της χολόστασης, στη συστηµατική κυκλοφορία. Η συστηµατική ενδοτοξιναιµία ενεργοποιεί τη συστηµατική φλεγµονώδη απάντηση, η οποία σχετίζεται µε τη δυσλειτουργία που αναπτύσσεται σε αποµακρυσµένα όργανα, ενώ συνεισφέρει και στην περαιτέρω επιδείνωση της λειτουργίας του εντερικού φραγµού και της ηπατικής βλάβης. Τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης επιβεβαίωσαν την παρουσία πυλαίας και συστηµατικής ενδοτοξιναιµίας σε εξωηπατική απόφραξη των χοληφόρων. Η προκαλούµενη από τον αποφρακτικό ίκτερο ατροφία του εντερικού βλεννογόνου τεκµηριώθηκε µε µορφοµετρική ανάλυση και µε µετρήσεις του DNA και της πρωτεΐνης. Ένας πιθανός µηχανισµός προαγωγής της ατροφίας του εντερικού βλεννογόνου είναι η διαταραχή της ισορροπίας µεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασµού και κυτταρικού θανάτου στις κρύπτες, µε αύξηση της απόπτωσης και µείωση της µιτωτικής δραστηριότητας. Επίσης, ο αποφρακτικός ίκτερος οδήγησε σε αύξηση του οξειδωτικού stress στο έντερο, όπως τεκµηριώνεται από την αύξηση της υπεροξείδωσης των λιπιδίων, της οξείδωσης των πρωτεϊνών, της οξειδωµένης γλουταθειόνης (GSSG), των ολικών µη πρωτεϊνικών µεικτών δισουλφιδίων (NPSSR), και των πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (PSSP), ενώ µειώθηκε το αντιοξειδωτικό µόριο της ανηγµένης γλουταθειόνης (GSH). Η ενδοτοξιναιµία και οι αυξηµένες συγκεντρώσεις χολικών αλάτων αποτελούν σηµαντικούς διεγέρτες της παραγωγής δραστικών µεταβολιτών οξυγόνου. Η παρουσία οξειδωτικού stress στο έντερο συνεισφέρει στην προαγωγή της αποπτωτικής διεργασίας και στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασµού στις κρύπτες, οδηγώντας σε ατροφία του βλεννογόνου. Ένα άλλο πρωτότυπο εύρηµα αυτής της µελέτης είναι η διαταραχή του παρακυττάριου φραγµού του εντέρου στα πειραµατόζωα µε αποφρακτικό ίκτερο, η οποία τεκµηριώνεται µε την απώλεια της έκφρασης της αποφραξίνης περίπου στο 50% των επιθηλιακών κυττάρων στο κορυφαίο τµήµα της λάχνης. Συνεπώς, το άνοιγµα της παρακυττάριας οδού φαίνεται να είναι ένας σηµαντικός παράγων στη διαφυγή ενδοτοξίνης από τον εντερικό αυλό στην πυλαία κυκλοφορία. Η ενδοτοξιναιµία, η απελευθέρωση στη συστηµατική κυκλοφορία µεσολαβητών φλεγµονής και η παρουσία οξειδωτικού stress στο έντερο πιθανώς σχετίζονται µε τη µεταβολή της έκφρασης της αποφραξίνης στον εντερικό βλεννογόνο. Επιπλέον, στον αποφρακτικό ίκτερο ανεβρέθηκε µια διαβάθµιση της έκφρασης της αποφραξίνης κατά µήκος της λάχνης, µε µεγαλύτερη απώλεια της έκφρασής της στο άνω τριτηµόριο, µικρότερη στο µέσο και ακόµα µικρότερη στην κρύπτη. Μια πιθανή εξήγηση αυτής της διαβάθµισης της απώλειας της έκφρασης της αποφραξίνης είναι ότι, δεδοµένου ότι η ανανέωση του επιθηλίου γίνεται από την κρύπτη προς την κορυφή, τα κύτταρα της κορυφής της λάχνης έχουν εκτεθεί για περισσότερο χρονικό διάστηµα στις συνθήκες οξειδωτικού stress που επικρατούν στο έντερο. Τα ρυθµιστικά εντερικά πεπτίδια, BBS και ΝΤ, δρώντας είτε άµεσα, µέσω ειδικών υποδοχέων των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου, είτε έµµεσα, βελτιώνοντας τη µικροκυκλοφορία του εντέρου, αποκατέστησαν την έκφραση της αποφραξίνης στον εντερικό βλεννογόνο, µείωσαν σηµαντικά την απόπτωση και το οξειδωτικό stress και ανέστρεψαν την εντερική ατροφία. Η πρόληψη, από τα ρυθµιστικά πεπτίδια, των επαγόµενων από τον αποφρακτικό ίκτερο κυτταρικών και βιοχηµικών µεταβολών του εντερικού βλεννογόνου, οδήγησε σε σηµαντική µείωση της πυλαίας και συστηµατικής ενδοτοξιναιµίας. Επιπλέον, η BBS και η ΝΤ, εξασκώντας αντιοξειδωτική δράση και στο ήπαρ, προστατεύουν από δυο µείζονες παράγοντες ηπατικής βλάβης κατά τη χολόσταση, που είναι το οξειδωτικό stress και η ενδοτοξιναιµία, οδηγώντας σε βελτίωση των ιστολογικών αλλοιώσεων της αποφρακτικής χολαγγειοπάθειας. Συµπερασµατικά, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης δείχνουν ότι η δυσλειτουργία του εντερικού φραγµού στον αποφρακτικό ίκτερο σχετίζεται µε την επαγωγή κυτταρικών και βιοχηµικών µεταβολών στον εντερικό βλεννογόνο, οι οποίες χαρακτηρίζονται από κατά τόπους απώλεια της έκφρασης της αποφραξίνης, πρόκληση οξειδωτικού stress και επαγωγή της απόπτωσης. Τα ρυθµιστικά εντερικά πεπτίδια BBS και ΝΤ προλαµβάνοντας τις µεταβολές αυτές του εντερικού βλεννογόνου µειώνουν σηµαντικά την πυλαία και συστηµατική ενδοτοξιναιµία. Επίσης, εξασκούν προστατευτική δράση εναντίον του οξειδωτικού stress στο ήπαρ και διαφυλάσσουν την αρχιτεκτονική του πυλαίου διαστήµατος. Η συνδυασµένη ευεργετική επίδραση των ρυθµιστικών πεπτιδίων, τόσο στη δυσλειτουργία του εντερικού φραγµού και την ενδοτοξιναιµία, που ευθύνονται για την ανάπτυξη σηπτικών επιπλοκών και βλάβης αποµακρυσµένων οργάνων, όσο και στο οξειδωτικό stress και την ιστολογία του ήπατος, εισηγούνται µια νέα θεραπευτική προσέγγιση στον αποφρακτικό ίκτερο. Όπωσδήποτε απαιτούνται περαιτέρω µελέτες για τη διευκρίνιση των µηχανισµών δράσης και πιθανών παρενεργειών της BBS και της ΝΤ πριν την εφαρµογή τους στην κλινική πράξη. / Patients with obstructive jaundice, especially when exposed to the additional stress of an invasive diagnostic or therapeutic procedure, are prone to septic complications and renal dysfunction contributing to high morbidity and mortality rates. Experimental and clinical studies have shown that obstructive jaundice compromises intestinal barrier function resulting in endotoxemia, which appears to play a key role in the development of these complications. Lack of bile alters intestinal epithelial barrier function without disrupting epithelial continuity. The molecular mechanisms implicated in this phenomenon are poorly understood. This study was undertaken to investigate the influence of experimental obstructive jaundice on the expression of the key tight junction-associated protein occludin in the intestinal epithelium, epithelial cell apoptosis and proliferation in crypts and intestinal oxidative stress. In addition, in an attempt for therapeutic intervention in obstructive jaundice, we have explored the potential positive effect of gut regulatory peptides bombesin (BBS) and neurotensin (NT) on the above-described parameters and on liver histology and oxidative stress. These factors exert a wide spectrum of actions on the gut-liver axis and they improve gastrointestinal mucosa integrity after various injurious insults. The results of our study showed that experimental obstructive jaundice results in portal and aortic endotoxaemia. In jaundiced rats, there was total loss of occludin expression in numerous enterocytes and this effect was most profound at the upper third of the villi, while a gradient of positivity existed from crypt to tip. Intestinal cell apoptosis in crypts was significantly increased, while mitotic activity was reduced. This imbalance of cell proliferation and death in crypts was accompanied by induction of mucosal atrophy, as evidenced by morphometrical analysis and decreased DNA and protein content. Moreover, obstructive jaundice induced intestinal oxidative stress demonstrated by increased lipid peroxidation, protein oxidation, GSSG, NPSSR, PSSP and reduction of GSH. Administration of BBS or NT significantly reduced portal and systemic endotoxaemia. These agents restored occludin expression in the intestinal epithelium to the control state, significantly reduced apoptosis and oxidative stress and reversed mucosal atrophy. Moreover, both agents significantly ameliorated liver injury, as demonstrated by improvement of obstructive cholangiopathy, reduction of hepatic oxidative stress and prevention of neutrophilic accumulation in portal tracts. Absence of intraluminal bile deprives the gut from its bacteriostatic, endotoxin-neutralizing and mucosal-trophic effect leading to increased intestinal bacterial and endotoxin load and mucosal atrophy. These alterations promote bacterial and endotoxin translocation into portal circulation and subsequently, through a decreased clearance capacity of Kupffer cells because of cholestasis, into systemic circulation. Systemic endotoxemia activates a systemic inflammatory response, which is associated with dysfunction of remote organs, while it further aggravates intestinal barrier dysfunction and cholestatic liver injury. Endotoxin and bile acids represent important sources of reactive oxygen species formation. We have demonstrated increased intestinal oxidative stress in obstructive jaundice, which possibly contributes to induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation in intestinal crypts, leading to mucosal atrophy. Another novel finding of this study is that the intestinal paracellular barrier in jaundiced rats is disrupted, as evidenced by loss of expression of the key tight junction-associated protein occludin in approximately 50% of enterocytes at the upper third of the villi. Therefore, the opened paracellular route may significantly contribute to the escape of endotoxin from the intestinal lumen into portal circulation. Endotoxemia, systemic release of inflammatory mediators and intestinal oxidative stress are possibly associated with decreased occludin expression. A possible explanation for the gradient of occludin expression from crypt to tip is that the cells at the tip of the villi have been exposed for a longer duration to the oxidative intestinal environment of jaundiced rats since epithelial renewal takes place from crypt to tip. Gut regulatory peptides, BBS and NT, acting either directly, through specific receptors located in intestinal epithelial cells, or indirectly, through improvement of intestinal microcirculation, prevent the above-described cellular and biochemical alterations of the intestinal mucosa, leading to lower portal and systemic endotoxin concentrations. Moreover, exerting an antioxidant effect on the liver as well, they prevent two major factors in the promotion of cholestatic liver injury, oxidative stress and endotoxemia, leading to significant amelioration of obstructive cholangiopathy. In conclusion, the results of the present study show that obstructive jaundice-induced gut barrier dysfunction is associated with regional loss of occludin expression in the intestinal epithelium, increased intestinal oxidative stress and induction of apoptosis / inhibition of proliferation in crypts leading to intestinal atrophy. Gut regulatory peptides BBS and NT exerting beneficial effects on these cellular and biochemical alterations of the intestinal mucosa prevent portal and systemic endotoxaemia. Moreover, these factors exert a protective action on portal tract architecture and hepatic oxidative stress. The combined beneficial effects of regulatory peptides on intestinal barrier dysfunction and endotoxemia, which account for septic complications and dysfunction of remote organs, and on liver oxidative status and histology, provide a novel therapeutic approach for obstructive jaundice. However, further investigation to elucidate the details of the functional mechanisms and possible side effects of BBS and NT are needed before any clinical application.

Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και του ικτέρου στα θηλαστικά in vivo, χρησιμοποιώντας ένα πειραματικό μοντέλο αποφρακτικού ικτέρου στους αρουραίους, καθώς επίσης και στο αίμα ανθρώπων με τον αποφρακτικό ίκτερο κακοήθους προέλευσης. Ειδικότερα, το οξειδωτικό στρες αξιολογήθηκε άμεσα με τη μέτρηση του σχηματισμού της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου (του κεντρικού παράγοντα του οξειδωτικού στρες) και έμμεσα από την υπεροξείδωση λιπιδίων στις διαφορετικές περιοχές εγκεφάλου και σε ορισμένα εσωτερικά όργανα των αρουραίων (έντερο, συκώτι, καρδιά και νεφρό) και στο πλάσμα των ανθρώπων με τον αποφρακτικό ίκτερο. Διαπιστώθηκε ότι η ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου αυξάνεται στον εγκεφαλικό φλοιό 67%, τον μεσεγκέφαλο 37%, το συκώτι 75%, το νεφρό 87%, το έντερο 124% και στο ανθρώπινο αίμα 33%, ενώ τα λιπιδικά υπεροξείδια αυξήθηκαν στο νεφρό 30%, το έντερο 15% και το αίμα 128%. Η αύξηση στην ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου στο ανθρώπινο αίμα αποδόθηκε στην οξειδάση της ξανθίνης επειδή μειώθηκε στα επίπεδα των μαρτύρων όταν προεπωάστηκε με τον ειδικό αναστολέα της, την αλλοπουρινόλη. Η μελέτη είναι σημαντική όχι μόνο επειδή αποκαλύπτει τον κεντρικό ρόλο της ελεύθερης ρίζας του σουπεροξειδίου στους παθολογικές καταστάσεις όπως ο ίκτερος, αλλά και επειδή εισάγει την ελεύθερη ρίζα του σουπεροξειδίου ως έναν νέο κλινικό δείκτη στους ανθρώπους. / The aim of the present study is to investigate the relationship between oxidative stress and jaundice in mamals in vivo, using an experimental obstructive jaundice model in rats, as well as in the blood of humans with obstructive jaundice of malignant origin. In particular, oxidative stress was assessed directly by measuring the rate of formation of superoxide radical (the central factor of oxidative stress), and indirectly by lipid peroxidation in different brain areas and in certain internal organs of rats (gut, liver, heart and kidney) and in plasma of humans with obstructive jaundice. It was found that superoxide radical was elevated in the cerebral cortex 67%, midbrain 37%, liver 75%, kidney 87%, gut 124% and in human blood 33%, while lipid peroxides were elevated in kidney 30%, gut 15% and blood 128%. The increase of superoxide radical in human blood was attributed to xanthine oxidase because it was decreased to control levels by its specific inhibitor allopurinol. The study is important not only because it uncovers the central role of superoxide radical in pathological conditions such as jaundice, but also because it introduces superoxide radical as a new clinical marker in humans.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της σκληρωτιακής διαφοροποίησης στις τέσσερις βασικές μορφές της στους μυκηλιακούς μύκητες S. rolfsii, S. sclerotiorum, R. solani και S. minor σε σχέση με το οξειδωτικό στρες. Ως μάρτυρες για τους υπό μελέτη μύκητες χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχα μη σκληρωτιογόνα στελέχη. Τα πιο σημαντικά υπεροξείδια που συμβάλλουν στην δημιουργία οξειδωτικού στρες είναι: α) η ρίζα του σουπεροξειδίου (O2•-), που είναι το πρωταρχικό αίτιο του οξειδωτικού στρες, β) το υπεροξείδιο του υδρογόνου (H2O2), που κυρίως προκύπτει από την ένωση δύο μορίων O2•- (αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής) και γ) τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (LOOH), που είναι από τα πρώιμα αποτελέσματα του οξειδωτικού στρες, λόγω της προσβολής των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Επειδή λοιπόν στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπήρχε κατάλληλη μεθοδολογία για τον προσδιορισμό του O2•-, αναπτύχθηκε μια νέα μέθοδος εφαρμόσιμη εκτός από τους υπό μελέτη μύκητες, σε όλους τους οργανισμούς. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η ποσοτικοποίηση της συγκέντρωσης των βασικών ενζύμων που σχετίζονται με τα προαναφερθέντα υπεροξείδια τα οποία είναι: α) η δισμουτάση του O2•- (SOD), που επιταχύνει την αντίδραση αυτοοξειδοαναγωγής, β) η καταλάση (CAT), που καταναλώνει το H2O2, γ) οι μη εξειδικευμένες υπεροξειδάσες (NSPX) που χρησιμοποιούν το H2O2 και τα LOOH σαν υπόστρωμα για να οξειδώνουν άλλα μόρια και δ) η οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ), που ανιχνεύεται για πρώτη φορά σε μύκητες και είναι υπεύθυνη μεταξύ άλλων και για την παραγωγή του O2•- και H2O2 στους οργανισμούς. Ακόμη, έγινε εκτίμηση της οξειδωτικής καταστροφής των μεμβρανικών λιπιδίων με τη μέτρηση των αλδεϋδικών παραγώγων της υπεροξείδωσης των λιπιδίων (MDA). Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εξωγενείς τροποποιητές των παραπάνω μορίων: α) μιμητές της SOD β) H2O2 γ) υδροϋπεροξείδιο του κουμενίου (λιπιδικό υδροϋπεροξείδιο) και δ) αμινοτριαζόλη (αναστολέας της CAT). Τα αποτελέσματα της μελέτης επιβεβαίωσαν την αναγκαιότητα της ανάπτυξης της νέας μεθόδου ποσοτικοποίησης του O2•-. Συγκεκριμένα, δείχθηκε ότι οι τέσσερις μορφές σκληρωτιακής διαφοροποίησης εξαρτώνται άμεσα από το οξειδωτικό στρες, και ότι οι σχετιζόμενοι με αυτό παράγοντες που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη μεταβάλλονται με διαφορετικό τρόπο σε κάθε μορφή σκληρωτιακής διαφοροποίησης. Τα βασικότερα συμπεράσματα αυτής της μελέτης είναι: α) το O2•- φαίνεται ότι παίζει έμμεσο ρόλο στην έναρξη της σκληρωτιογένεσης των μυκήτων S. rolfsii και S. sclerotiorum και άμεσο στων μυκήτων R. solani και S. minor και κύρια πηγή παραγωγής του O2•- είναι τα μιτοχόνδρια και δευτερευόντως η ΧΟ β) η SOD που υπάρχει σε όλους τους μύκητες χρησιμοποιείται από αυτούς για τη μετατροπή του O2•- σε H2O2 γ) η ΧΟ που μέχρι σήμερα δεν ήταν γνωστή η ύπαρξή της στους μύκητες, καθώς και η EC-SOD αλλά και το EC-H2O2, δεν σχετίζονται με τη διαφοροποίηση και ως γνωστόν μπορεί να εμπλέκονται στην προσβολή των φυτών ξενιστών από τους μύκητες αυτούς δ) το H2O2 επάγει την έναρξη της σκληρωτιογένεσης δρώντας σαν παράγοντας σημειακού κυτταρικού πολλαπλασιασμού ε) η CAT που υπάρχει σε όλους τους μύκητες στο αδιαφοροποίητο μόνο στάδιο, μάλλον χρησιμοποιείται από αυτούς ώστε ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός να μην γίνεται σε μεγάλη ένταση και αναστείλλει την σημειακή διαφοροποίηση ζ) οι NSPX που εντοπίζονται σε όλους τους μύκητες φαίνεται ότι ελέγχουν τα επίπεδα του H2O2 κυρίως στο διαφοροποιημένο στάδιο η) τα LOOH φαίνεται να δρουν στις μεμβράνες των μυκήτων και σχετίζονται με διαδικασίες μεταβίβασης κυτταρικών μηνυμάτων που επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο θ) οι μιμητές της SOD Tiron και Tempol, που είχαν ανασταλτική δράση στην διαφοροποίηση θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως μη τοξικά αντιμυκητιακά παρασκευάσματα. / The purpose of this dissertation was the study of sclerotial differentiation, represented by four basic sclerotial types expressed by the filamentous fungi S. rolfsii, R. solani, S. sclerotiorum and S. minor in relation to oxidative stress. Non-sclerotium producing fungi were used as controls of the corresponding wild type strains. The most important peroxides that are responsible for oxidative stress are: a) superoxide radical (O2•-), the primary cause element of oxidative stress, b) hydrogen peroxide (H2O2), produced by the reaction between two O2•- (dismutation reaction), and c) lipid hydroperoxides (LOOH), the primary consequences of oxidative destruction due to free radical attack to polyunsaturated fatty acids. Since there was not available any appropriate method for the quantification of O2•-, a new method was developed for the purpose of this study and its applicability was extended to any organism. In addition, the estimation of the concentration of certain enzymes that regulate the levels of the peroxides mentioned above was also used. These enzymes are a) superoxide dismutase (SOD), which catalyzes the dismutation reaction, b) catalase (CAT), which destroys H2O2, c) non-specific peroxidases (NSPX), which use either H2O2 or LOOH as substrates in order to oxidize other molecules and d) xanthine oxidase (XO), which was detected for the first time in fungi and is responsible, among other functions, for the production of O2•- in organisms. Furthermore, the aldehydic adducts of lipid peroxidation (MDA) were measured in order to evaluate the oxidative destruction of membrane lipids. Finally, specific externally added modulators of the above molecules were used, like: a) SOD mimetics b) H2O2 c) cumene hydroperoxide (lipid hydroperoxide) and d) aminotriazole (CAT inhibitor). The results of this study verified the need for the development of the new method for the quantification of O2•-. Specifically, it was found that the four studied types of sclerotial differentiation are directly related with oxidative stress, and that its components, tested in this study, are formed and changed variously, depending on the type of sclerotial differentiation. The most important conclusions of this study are: a) O2•- plays an indirect role in the initiation of sclerotiogenesis in fungi S. rolfsii and S. sclerotiorum, while in R. solani and S. minor its role is direct, and the main source that produces it in all four fungi are mitochondria and secondarily the ΧΟ enzyme, b) SOD is used by these fungi in order to convert O2•- to H2O2 via the dismutation reaction, c) ΧΟ which was found for the first time in fungi as well as EC-SOD and EC-H2O2, are not related with differentiation and possibly they are involved in tha attack of target plants by these fungi, d) H2O2 induces the initiation of sclerotiogenesis acting as a cell proliferating factor, e) CAT which was found in all fungi only in the undifferentiated stage, is probably used by them in order to control cell proliferation so as to avoid inhibition of sclerotiogenesis, f) NSPX are possibly used by these fungi in order to control H2O2 concentration mainly in the differentiated stage, g) LOOH appear to act on cell membrane and are related to signal transduction processes which affect cell cycle and h) SOD mimetics Tiron and Tempol, which reduced differentiation could be used as non-toxic fungicides.

Τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ) χαρακτηρίζονται από μη αποδοτική αιμοποίηση, αναστολή ωρίμανσης των προγονικών κυττάρων του μυελού και αυξημένη ενδομυελική απόπτωση. Η συσχέτιση του ΜΔΣ με την παρουσία αυξημένου οξειδωτικού στρες και οξειδωτικά τροποποιημένων πρωτεϊνών στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού έχει προηγουμένως αναφερθεί. Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα δηλώνουν τη δυνατότητα διάκρισης δύο υποπληθυσμών της μυελικής σειράς βάσει σκεδαστικών χαρακτηριστικών και της έκφρασης του CD45, CD45dim (Neutrophil granulocytic subpopulation-1, NGS1) και CD45high (Neutrophil granulocytic subpopulation-2, NGS2). Ο υποπληθυσμός CD45dim φέρει άωρα κύτταρα, που στην πλειοψηφία τους δεν ωριμάζουν έως τελικού σταδίου[1]. Ο πλήρης χαρακτηρισμός των πληθυσμών αυτών, καθώς επίσης, και η συμμετοχή τους στη μη αποδοτική αιμοποίηση των ΜΔΣ και στην εξέλιξη της νόσου είναι στοιχεία άγνωστα. Σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση δεικτών απόπτωσης και οξειδωτικού φορτίου (ελεύθερες ρίζες οξυγόνου-ROS) στους υποπληθυσμούς της μυελικής σειράς CD45dim και CD45high. Μελετήθηκαν 17 δείγματα μυελού ασθενών με ΜΔΣ μετά από ανάλυση συνδυασμού 5 χρωμάτων με κυτταρομετρία ροής, για τους δείκτες CD11b/CD16, annexin-V/7-AAD και 2,7-dichlorodihydrofluo-rescein-diacetate(DCF). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του κατάλληλου προγράμματος με μη παραμετρικά κριτήρια (Wilcoxon & Mann-Whitney). Το ποσοστό των αποπτωτικών 7-AAD/annexin-V+ κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένο στα CD45high/ CD11b+/CD16+ της μυελικής σειράς συγκριτικά με τα CD45dim/CD11b+/CD16- κύτταρα. Τα CD45dim και CD45high κύτταρα μυελού με τη χρήση του ειδικού ανιχνευτή των επιπέδων των ελεύθερων ριζών οξυγόνου DCF αναλύθηκαν σε ROSLow και ROSHigh πληθυσμούς. Η ανάλυση με τη χρήση των παραπάνω κριτηρίων έδειξε σημαντική αύξηση του ποσοστού των ROSHigh κυττάρων στα CD45high κύτταρα, συμπεραίνοντας έτσι ότι ο υποπληθυσμός CD45dim έχει χαμηλότερα επίπεδα ενδοκυττάριων ROS εν συγκρίσει με τον CD45high υποπληθυσμό. Ο CD45high υποπληθυσμός της μυελικής σειράς χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερα ποσοστά έκφρασης αποπτωτικών δεικτών καθώς επίσης και από τη παρουσία αυξημένου οξειδωτικού φορτίου συγκριτικά με τα CD45dim κύτταρα. Η περεταίρω διερεύνηση του ρόλου των πληθυσμών αυτών στις διαδικασίες ανάπτυξης του ΜΔΣ και στην εξέλιξη της νόσου είναι υπό εξέλιξη. / --

Το αιμορραγικό shock (H/S) έχει δειχθεί πως προκαλεί οξειδωτικό stress (OS) σε διάφορους ιστούς λόγω της υπερπαραγωγής ελευθέρων ριζών οξυγόνου στη φάση της επαναιμάτωσης και επίσης σχετίζεται με την ανάπτυξη ενδοτοξιναιμίας. Επίσης, το είδος της καταστολής που χρησιμοποιείται στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ) έχει επίπτωση στη νοσηρότητα και τη θνητότητα των ασθενών. Η κλονιδίνη, ένας α2-αδρενεργικός αγωνιστής, που έχει χρησιμοποιηθεί τόσο περιεγχειρητικά όσο και για καταστολή στη ΜΕΘ, φαίνεται πως ασκεί προστατευτική δράση σε μοντέλα ισχαιμίας/επαναιμάτωσης. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση της επίδρασης της προχορήγησης κλονιδίνης στο οξειδωτικό φορτίο στο έντερο, το ήπαρ και τους πνεύμονες και στην ανάπτυξη ενδοτοξιναιμίας στην πυλαία και συστηματική κυκλοφορία σε επίμυες που υποβλήθηκαν σε σημαντικού βαθμού H/S. Υλικό και Μέθοδος: Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε 64 επίμυες και αποτελείται από δύο σκέλη: ένα για τον προσδιορισμό του οξειδωτικού φορτίου και ένα για τη μέτρηση της ενδοτοξίνης. Σε κάθε σκέλος, τα ζώα μοιράστηκαν σε 4 ομάδες: (1) ομάδα ελέγχου (Sham), όπου τα ζώα καθετηριάστηκαν χωρίς να πραγματοποιηθεί αφαίμαξη, (2) ομάδα H/S (H/S) και δύο ομάδες στις οποίες προχορηγήθηκε κλονιδίνη, (ομάδα 3,Clonidine) και (ομάδα 4, Clonidine-H/S). Το H/S, διάρκειας μίας ώρας, στόχευε σε τιμές μέσης αρτηριακής πίεσης 30-40mmHg και ολοκληρώθηκε με επαναχορήγηση του απολεσθέντος αίματος. Τρεις ώρες μετά την αναζωογόνηση, το οξειδωτικό φορτίο εκτιμήθηκε με δύο μεθόδους: (α) τη μέτρηση των οργανικών υδροϋπεροξειδίων (LOOHs) και (β) τη μέτρηση της ρίζας του υπεροξειδίου (O2.-) στο έντερο, στο ήπαρ και τους πνεύμονες ενώ για τη μέτρηση της ενδοτοξίνης, ελήφθησαν δείγματα αίματος από την πυλαία φλέβα και την αορτή. Αποτελέσματα: Οι επίμυες που υπεβλήθησαν σε H/S παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αύξηση του οξειδωτικού φορτίου σε όλα τα όργανα. Η προχορήγηση κλονιδίνης προκάλεσε μείωση της παραγωγής LOOHs μετά από H/S στο έντερο (Ρ<0.001), στο ήπαρ (Ρ<0.05) και τους πνεύμονες (Ρ<0.05), σε σχέση με την ομάδα H/S. Επίσης, η ομάδα Clonidine-H/S παρουσίασε μειωμένο ρυθμό παραγωγής του O2.- σε σχέση με την ομάδα H/S, στο έντερο (P< 0.001), στο ήπαρ (P< 0.001) και τους πνεύμονες (Ρ<0.005). Τέλος, όσον αφορά τα επίπεδα ενδοτοξίνης, βρέθηκαν στατιστικά σημαντικά αυξημένα μετά από H/S τόσο στην πυλαία (Ρ<0.05), όσο και στη συστηματική (Ρ<0.001) κυκλοφορία, ενώ η προχορήγηση κλονιδίνης οδήγησε σε μείωση της ενδοτοξίνης και στις δύο κυκλοφορίες (πυλαια: Ρ<0.05 και συστηματική: Ρ<0.001) σε σχέση με την ομάδα H/S. Συμπέρασμα: Στην παρούσα μελέτη βρέθηκε για πρώτη φορά ότι η κλονιδίνη ασκεί αντιοξειδωτική δράση στο έντερο, στο ήπαρ και στους πνεύμονες όταν χορηγείται προ του H/S, το οποίο, ως γνωστόν, προκαλεί σημαντικού βαθμού OS σε αυτά τα όργανα. Μάλιστα, αυτό εκτιμήθηκε για πρώτη φορά σε μοντέλο H/S με την εφαρμογή μιας νέας άμεσης και ποσοτικής μεθόδου προσδιορισμού του O2.-. Τα αποτελέσματα αυτά αποκτούν ιδιαίτερη σημασία, καθώς το επαγόμενο από σοβαρή αιμορραγία OS ενέχεται στην παθογένεια του MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome). Επιπλέον, η κλονιδίνη περιόρισε την επαγόμενη από το H/S ενδοτοξιναιμία, γεγονός που μπορεί να αποδοθεί, τουλάχιστον μερικώς στην αντιοξειδωτική της δράση στον εντερικό βλεννογόνο. Αυτή η παρατηρούμενη μείωση της ενδοτοξιναιμίας, ενδέχεται να συμβάλλει με τη σειρά της στο μειωμένο OS στα όργανα. Αν και τα αποτελέσματα πειραματικών μελετών σε ζώα δεν μπορούν πάντα να αναχθούν σε συμπεράσματα που αφορούν τους ανθρώπους, αυτή η μελέτη συνηγορεί υπέρ της χρήσης της κλονιδίνης σαν συμπληρωματικό αναισθητικό παράγοντα εκλογής σε ασθενείς επιρρεπείς σε απώλεια αίματος, με στόχο την άμβλυνση των παθοφυσιολογικών επιπτώσεων του H/S που μπορούν να οδηγήσουν σε MODS. / Hemorrhagic shock (H/S) leads to the development of oxidative stress (OS) as a result of the excessive production of reactive oxygen species (ROS) in various tissues during reperfusion. Likewise, ischemia and ROS are believed to compromise the integrity of the intestinal barrier, resulting in endotoxemia. Moreover, it is now clear that the choice of sedation in ICU (Intensive Care Unit) patients affects their outcome. The a2-adrenergic agonist clonidine that is used as an adjunct to anesthesia, as well as in the ICU setting, has been shown to exert protective effects in models of ischemia/reperfusion injury. Aim of the study: To test the effect of clonidine pre-treatment of rats in the H/S-induced OS in the gut, liver and lung tissues and endotoxemia as well. Materials and Methods: The study consisted of two arms (64 rats): one for the measurement of the oxidative load in the organs and one for the measurement of endotoxin. Four animal groups (n=8 per group) were used for each arm (Sham, Clonidine, H/S and Clonidine-H/S group). The duration of Η/S was one hour, targeting to a mean arterial pressure of 30-40mmHg, at the end of wich rats were rescusitated by reinfusion of the shed blood. Three hours after rescusitation, the oxidative load was estimated with the measurement of lipid hydroperoxides (LOOHs) and superoxide radical (O2.- ) production in the liver, gut and lungs of the animals, while the levels of endotoxin were determined in both the systemic and portal circulation. Results: Rats subjected to H/S exerted increase in the oxidative load in all the tested organs. Clonidine pre-treatment resulted in a statistically significant reduction of LOOHs production after H/S in the gut (P < 0.001), liver and lungs of the rat (P < 0.05). Rats in the Clonidine-H/S group exhibited a statistically significant reduction (P< 0.001) in the production of O2.- in the gut and liver, and to a lesser extent in the lungs ( P < 0.05) compared to H/S group. H/S induced endotoxemia in the portal and systemic circulation, whereas clonidine pre-treatment reduced the amount of endotoxin detected both in the portal (P<0.05) and systemic (P<0.01) circulation compared to H/S. Conclusion: This study documents for the first time that clonidine pre-treatment prior to H/S results in a significant reduction of the OS observed in the gut, liver and lungs of the rat. Moreover, this antioxidant effect was estimated for the first time in a model of H/S with a new, direct and quantitative method of O2.- production. These results are of great value, since the H/S-induced OS is implicated in the pathogenesis of MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome). Furthermore, clonidine prevented H/S induced endotoxemia in both portal and systemic circulations, probably due to its antioxidant effect on the intestinal epithelium. The reduced endotoxemia after clonidine pre-treatment may contribute to the decreased OS observed in the liver and lungs. Although laboratory results on animals should not be easily extrapolated to humans, we believe that clonidine merit consideration as an adjunctive sedative agent of choice in patients susceptible to develop H/S, as it may prevent the development of MODS, improving likewise their outcome.

Το σελήνιο (Se) είναι σημαντικό συστατικό πολλών αντιοξειδωτικών ενζύμων. Σε μεγάλες ποσότητες, ωστόσο, είναι ιδιαίτερα τοξικό και καρκινογόνο. Σύμφωνα με προηγούμενες in vitro και in vivo μελέτες του εργαστηρίου μας, το εκχύλισμα των στύλων του Crocus sativus (κρόκος Κοζάνης) εμφανίζει σημαντική αντιοξειδωτική δράση. Σκοπός της εργασίας μας ήταν η μελέτη της επίδρασης της χορήγησης υψηλών συγκεντρώσεων σεληνιώδους νατρίου (Na2SeO3) καθώς και της χορήγησης μεθανολικού εκχυλίσματος κρόκου σε επιμέρους εγκεφαλικές περιοχές (φλοιός, μεσεγκέφαλος, παρεγκεφαλίδα) αναπτυσσόμενων επίμυων. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες (n=6/ομάδα): “Se”: 20 μmol Na2SeO3/kg (υποδορίως -10η ημέρα μετά τη γέννηση τους), “CrSeCr”: 60 mg εκχυλίσματος κρόκου/kg (ενδοπεριτοναϊκώς - 9η ημέρα) 20 μmol Na2SeO3/kg (υποδορίως - 10η ημέρα)/60 mg εκχυλίσματος/kg (ενδοπεριτοναϊκώς - 12η ημέρα), “SeCrCr”: 20 μmol Na2SeO3/kg (υποδορίως - 10η ημέρα)/60 mg εκχυλίσματος κρόκου/kg (ενδοπεριτοναϊκώς - 11η και 12η ημέρα), μάρτυρες: ενέσιμα φυσιολογικός ορός στις αντίστοιχες ημέρες. Το σωματικό βάρος των ζώων καταγραφόταν ανά τακτά διαστήματα. Στους υπό μελέτη ιστούς προσδιορίστηκαν, φθορισμομετρικά, τα επίπεδα της λιπιδικής υπεροξείδωσης και φωτομετρικά η ενεργότητα της καταλάσης, η σουπεροξειδική δισμουτάση και η ικανότητα αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος. Το σωματικό βάρος των ζώων όλων των ομάδων ήταν στατιστικώς σημαντικά μειωμένα (Se: 13,21%, CrSeCr: 13.83%, SeCrCr: 10,69%) συγκριτικά με τους μάρτυρες. Όσον αφορά στη λιπιδική υπεροξείδωση, στα ζώα που έλαβαν το Na2SeO3 τα επίπεδα της MDA αυξήθηκαν (34,83%) στον φλοιό σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Στις ομάδες που χορηγήθηκε το εκχύλισμα του κρόκου η λιπιδική υπεροξείδωση ήταν σημαντικά ελαττωμένη (CrSeCr: 29,62%) σε σχέση με τους μάρτυρες στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκέφαλου. Στο ήπαρ η χορήγηση του σεληνιώδους νατρίου προκάλεσε στατιστικώς σημαντική μείωση της υπεροξείδωσης λιπιδίων σε ποσοστό 47.78%, της ενεργότητας της καταλάσης και αύξηση της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος. Επιπλέον, με την χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus παρατηρήθηκαν κάποιες μικρές αλλά σημαντικές αλλαγές, ιδιαίτερα στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας. Συγκεκριμένα, στην παρεγκεφαλίδα η χορήγηση του εκχυλίσματος του Crocus sativus προκάλεσε στατιστικώς σημαντική αύξηση της δραστικότητας της σουπεροξειδικής δισμουτάσης, της ικανότητας αναγωγής του σιδηρι-κατιόντος και μείωση της ενεργότητας της καταλάσης. Συμπερασματικά, η χορήγηση του Na2SeO3 στους αναπτυσσόμενους επίμυες επηρέασε αρνητικά την ανάπτυξή τους και επέδρασε στην οξειδοαναγωγική ισσοροπία με ιστοειδικό τρόπο θετικά στο ήπαρ και αρνητικά στον εγκεφαλικό φλοιό. Η χορήγηση κρόκου δεν άμβλυνε αυτές τις αλλαγές ενώ επηρέασε σημαντικά παραμέτρους στην παραγκεφαλίδα του εγκεφάλου. / Selenium (Se) is an important constituent of many antioxidant enzymes. In large quantities, however, it is highly toxic and carcinogenic. According to previous in vitro and in vivo studies in our laboratory, the extract from Crocus sativus (saffron) stigmas shows significant antioxidant cerebral protection of adult and aged rodents. In this study, our aim was to study the effect of administration of high concentrations of sodium selenite (Na2SeO3) and also of the co-administration of the saffron extract in individual brain regions (cortex, midbrain, cerebellum) in developing rats, an established model of cataractogenesis. The rats were divided into four groups (n = 6/group): "Se": 20 μmol Na2SeO3/kg (subcutaneous-10th day after birth), "CrSeCr": 60 mg dry saffron extract/kg (intraperitoneally - day 9)/20 μmol Na2SeO3/kg (subcutaneous - day 10)/60 mg extract/kg (intraperitoneally – day 12), "SeCrCr": 20μmol Na2SeO3/kg (subcutaneous - day 10)/60 mg saffron extract/kg (intraperitoneally on 11th and 12th day). Control animals received normal saline injections on the respective days. The animal body weight was recorded at regular intervals. Levels of lipid peroxidation (malondialdehyde, MDA) were determined fluorimetrically and the activity of catalase, superoxide dismutase and ferric-reducing antioxidant power spectometrically in tissue homogenates. The weight of animals in all treated groups was significantly lower (Se: 13.21%, CrSeCr: 13.83%, SeCrCr: 10.69%) than that of controls. MDA levels were significanly increased (34,83%) in the cortex of the animals that received Na2SeO3 compared to controls. In the groups treated with saffron extract, the lipid peroxidation was significantly reduced (CrSeCr: 29.62%) only in the cerebellum compared with controls. In the liver the administration of sodium selenite caused statistically significant reduction of lipid peroxidation in percentage of 47.78% with concomitant decrease of catalase activity. Moreover, the administration of the saffron extract caused some small but significant changes, especially in the cerebellum. Significant increase of superoxide dismutase activity, increase of the ferric-reducing antioxidant power and decrease of catalase activity. In conclusion, administration of Na2SeO3 to developing rats negatively affected their development and affected the redox equilibrium in a region-specific way, positively in liver and negatively in the cerebral cortex. The administration of the saffron extract did not affect these changes while it beneficially changed in the cerebellum of the brain.