Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν σήμερα την πρώτη αιτία θανάτου στις αναπτυγμένες χώρες. Οι αιτίες που τις προκαλούν συνδέονται πολύ συχνά με τις ιδιότητες και την γενική κατάσταση των τοιχωμάτων των μεγάλων αρτηριών. Η υπερηχητική απεικόνιση των τελευταίων είναι εξαιρετικά σημαντική για τη διάγνωση πιθανών παθολογικών καταστάσεων, καθώς χαρακτηρίζεται από χαμηλό κόστος και ελάχιστη επιβάρυνση για τον οργανισμό του ασθενούς, ενώ μπορεί να πραγματοποιείται σε πραγματικό χρόνο. Επιπλέον, οι υπερηχητικές τεχνικές απεικόνισης επιτρέπουν την παρακολούθηση της κίνησης των αρτηριακών τοιχωμάτων, από την οποία μπορούν να εξαχθούν αρκετά ασφαλή συμπεράσματα για την κατάστασή τους. Για την παρακολούθηση της κίνησης των αρτηριακών τοιχωμάτων έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι, με κυριότερες αυτές που βασίζονται στο φαινόμενο Doppler (Tissue Doppler Imaging), τις διαφορικές μεθόδους οπτικής ροής και τις μεθόδους ταύτισης περιοχών (block matching). Οι μέθοδοι Doppler είναι εξαιρετικά ακριβείς, μόνο όμως κοντά στη διεύθυνση της υπερηχητικής δέσμης. Οι μέθοδοι οπτικής ροής μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διδιάστατες απεικονίσεις με αρκετά ικανοποιητική ακρίβεια, αδυνατούν ωστόσο να παρακολουθήσουν μεγάλες μετατοπίσεις. Από την άλλη πλευρά, οι μέθοδοι ταύτισης περιοχών δεν παρουσιάζουν τα παραπάνω προβλήματα, υστερούν όμως σε ακρίβεια. Μια σχετικά νέα τεχνική με ευρεία εφαρμογή στην ιατρική απεικόνιση είναι τα ενεργά περιγράμματα (active contours). Πρόκειται για παραμετρικές καμπύλες που κινούνται στο επίπεδο της εικόνας έτσι ώστε να ελαχιστοποιείται ένα ενεργειακό συναρτησιακό και επιτρέπουν την ανίχνευση αντικειμένων στην εικόνα. Στις κλασικές μεθόδους των ενεργών περιγραμμάτων, η αρχική καμπύλη πρέπει να ορίζεται κοντά στο προς ανίχνευση αντικείμενο. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος αυτού έχουν προταθεί διάφορες βελτιώσεις του κλασικού μοντέλου των ενεργών περιγραμμάτων, όπως η εισαγωγή της λεγόμενης «δύναμης μπαλονιού». Τα ενεργά περιγράμματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για παρακολούθηση κίνησης σε ακολουθίες εικόνων, καθώς μπορούν να προσαρμόζονται στα εξέχοντα χαρακτηριστικά των κινούμενων δομών. Ωστόσο, στην υπερηχητική απεικόνιση των αρτηριακών τοιχωμάτων, η περιπλοκότητα της κίνησής τους και ο έντονος θόρυβος καθιστούν ιδιαίτερα δύσκολη την άμεση εφαρμογή των ενεργών περιγραμμάτων για την παρακολούθηση κίνησης. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι ο συνδυασμός των ενεργών περιγραμμάτων και των μεθόδων ταύτισης περιοχών για την αυτοματοποίηση της παρακολούθησης κίνησης σε ακολουθίες εικόνων των τοιχωμάτων αρτηριών (συγκεκριμένα της καρωτιδικής και της βραχιακής) και για τη βελτίωση της επαναληψιμότητας των σχετικών μετρήσεων. Αρχικά, εφαρμόστηκαν οι μέθοδοι ταύτισης περιοχών ενός επιπέδου (Single Level Block Matching) και πολλών επιπέδων (Multilevel Block Matching) για την παρακολούθηση της κίνησης των αρτηριακών τοιχωμάτων από ακολουθίες εγκάρσιων τομών της καρωτιδικής και της βραχιακής αρτηρίας. Μια κλειστή καμπύλη ορίστηκε από το χρήστη στο πρώτο πλαίσιο της ακολουθίας, έτσι ώστε να αντιστοιχεί κατά προσέγγιση στο περίγραμμα των ορίων του αρτηριακού τοιχώματος και καταγράφηκε η επιφάνεια που περικλείεται από την καμπύλη αυτή κατά τη διάρκεια ενός καρδιακού κύκλου. Η μετατόπιση των σημείων της καμπύλης από πλαίσιο σε πλαίσιο εκτιμήθηκε με τις μεθόδους ταύτισης περιοχών. Η μορφή της γραφικής παράστασης της επιφάνειας αυτής σε συνάρτηση με το χρόνο (δηλαδή τον αριθμό του πλαισίου) αποτελεί έναν πολύ καλό δείκτη της κατάστασης της αρτηρίας. Η αυτοματοποίηση της διαδικασίας λήψης των παραπάνω μετρήσεων μπορεί να επιτευχθεί αν η επιλογή της αρχικής κλειστής καμπύλης δεν βασίζεται στην εκτίμηση του χρήστη αλλά στην ανίχνευση των τοιχωμάτων με ενεργά περιγράμματα. Το κλασικό μοντέλο των ενεργών περιγραμμάτων και το μοντέλο της «δύναμης μπαλονιού» εφαρμόστηκαν για αυτό το σκοπό στο πρώτο πλαίσιο των ακολουθιών εικόνων των αρτηριών. Διαπιστώθηκε ότι το μοντέλο της δύναμης μπαλονιού δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα ανίχνευσης των αρτηριακών τοιχωμάτων και μάλιστα με ικανοποιητική επαναληψιμότητα, καθώς το αποτέλεσμα της ανίχνευσης δεν διαφοροποιούνταν σημαντικά από την επιλογή της αρχικής κλειστής καμπύλης του ενεργού περιγράμματος, αρκεί η ακτίνα της τελευταίας να είναι τέτοια ώστε η καμπύλη να βρίσκεται εξ ολοκλήρου στο εσωτερικό της αρτηρίας. Στη συνέχεια, η καμπύλη που προέκυψε από την ανίχνευση των τοιχωμάτων χρησιμοποιήθηκε ως αρχική καμπύλη για την παρακολούθηση κίνησης με τις μεθόδους ταύτισης περιοχών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δεν διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με την περίπτωση όπου ο ορισμός της καμπύλης στο πρώτο πλαίσιο γίνεται από το χρήστη. Συνεπώς, η ανίχνευση των αρτηριακών τοιχωμάτων με ενεργά περιγράμματα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να βελτιώσει την επαναληψιμότητα των μετρήσεων για την παρακολούθηση κίνησης και να συμβάλει στην αυτοματοποίηση της διαδικασίας λήψης τους. / Cardiovascular diseases are the leading cause of death today in developed countries. Their causes are very frequently related with the status of artery walls. Ultrasonic imaging is very important for the diagnosis of possible arterial pathology, because it is of low cost, safe for the patient and can be performed in real time. Ultrasonic imaging also allows arterial wall motion tracking, which can provide critical diagnostic information. Motion tracking methods include Tissue Doppler Imaging (TDI), differential optical flow methods and block matching. Tissue Doppler Imaging offers excellent accuracy, restricted however to directions close to the direction of the ultrasonic beam. Optical flow methods can be used in two dimensions with considerable accuracy, but they fail in cases of fast moving structures. In the case of block matching, no such problems have to be dealt with, however with significant cost in accuracy. Active contours, a relatively new technique widely used in medical imaging, are parameterized curves moving on the image plane in order to minimize an energy functional and allowing object detection. Classical active contour methods require that the initial curve of the model is defined close to the object to be detected. In order to avoid this, several techniques have been proposed, such as the so-called “balloon force”. Active contours can also be used for motion tracking in series of image frames, provided that they can fit to salient features of moving structures. In arterial wall ultrasonic imaging however, motion complexity and noise obstruct motion tracking with active contours. In the current study active contours and block matching methods are combined to improve reproducibility of motion tracking measurements in series of artery wall images (namely for the carotid and brachial artery). Single level and multilevel block matching methods were used for artery wall motion tracking. A closed curve was defined by the user in the first frame of the image series, both for the carotid and brachial artery. This curve is a rough estimation of the arterial wall contour. The area enclosed by the curve is recorded throughout a cardiac cycle. Curve movement is estimated with block matching methods. The graph pattern of enclosed area versus time (i.e. frame number) is a very good indicator for the status of the artery. The above process can be automatized if the initial closed curve is produced by object detection with active contours and not by estimation. The active contours classical model and the balloon force model were used for artery wall detection in the first frame of the artery image series. The balloon force model yielded satisfactory wall detection results with considerable reproducibility. The choice of the dimensions of the initial contour of the model did not affect the final result considerably, provided that the initial contour is fully placed inside the arterial lumen. The curve that resulted from object detection was used to initialize the motion tracking process with block matching methods. In this way, similar motion tracking results can be obtained for the artery image series, but with much improved reproducibility.

La thrombose est souvent liée à la survenue d’une rupture de la plaque d’athérosclérose qui expose le tissu sous endothélial thrombogène aux plaquettes sanguines circulantes. L’un des problèmes actuels est l’identification des mécanismes qui sont à l’origine de la fracture. Nous avons testé l’hypothèse que la vasoconstriction, induite par le LTC4 ou le thromboxane A2 (TXA2), joue un rôle dans la rupture de plaques d’athérosclérose et dans la formation de l’athérothrombose. Dans ce travail nous avons adapté la technique classique de la microscopie électronique pour observer les ruptures survenues sur une plaque d’athérosclérose. Avec cette méthode, nous avons montré qu’une vasoconstriction peut engendrer des ruptures de plaques, mais seulement lorsque ces plaques sont fragilisées (dites ‘vulnérables’) soit par un régime riche en graisse ou après exposition de la souris à un lipopolysaccharide extrait de membranes bactériennes. Nous avons montré aussi que la plaque produit du TXA2, et que l’absence de son récepteur chez les souris apoE-/- déficientes en TP prévient la rupture des plaques vulnérabilisées. La vasoconstriction constitue donc un élément déterminant dans la rupture des plaques vulnérables. Les résultats de ce travail identifient le TXA2 comme étant une éventuelle cible thérapeutique pour prévenir les ruptures des plaques. D’autre part, les analyses par microscopie électronique à balayage de la thrombose in vivo, et les analyses en microscopie électronique en transmission (MET) de l’ultrastructure des plaquettes agrégées in vitro, ont montré que les plaquettes activées fusionnent entre elle permettant ainsi la cicatrisation de l’endothélium lésé. / Rupture of atherosclerotic plaques exposes sub-endothelial thrombogenic material to circulating platelets, frequently leads to thrombus formation. At present, the mechanisms behind plaque ruptures are not well understood. We studied the hypothesis that vasoconstriction induced by LTC4 or thromboxane A2 (TXA2) plays an important role in plaque rupture and formation of atherothombosis. We used scanning electron microscopy to study rupture of the plaque in detail. We were able to show that vasoconstriction leads to plaque rupture, but only after plaques have been vulnerabilized by high fat diet, or by exposure of mice to lipopolysaccharide extracted from bacterial membranes. We could also show that plaques produce TXA2. As consequence the absence of TP, a receptor for TXA2 in apoE-/- mice prevented rupture of vulnerable plaques. Vasoconstriction is hence a determining factor in the rupture of vulnerable plaques. Our work has identified TXA2 as a potential therapeutic target in preventing plaque rupture. Moreover, analysis of the thrombosis in vivo by scanning electron microscopy, and the in vitro study of the ultra structure of aggregated platelets by transmission electron microscopy, showed that activated platelets fuse together to heal the injured endothelium.

Depuis plusieurs années, l’influence des pathologies parodontales sur certaines pathologies systémiques, notamment les maladies cardio-vasculaires et l’athérosclérose apparait de plus en plus évidente. Dans notre étude, nous nous sommes intéressés à l’évaluation des effets induits par Porphyromonas gingivalis, une des principales bactéries parodontopathogènes, et son lipopolysaccharide sur les cellules endothéliales, qui forment une interface entre le flux sanguin et la paroi vasculaire, d’où un rôle important dans l’initiation et le développement de la plaque d’athérome. Nous avons surtout ciblé les effets induits sur la cathepsine B, une protéase impliquée dans le développement de la plaque d’athérome, et sur l’inflammasome, un complexe impliqué dans la production d’IL-1beta. Les résultats de nos travaux montrent que l’infection par Porphyromonas gingivalis et la stimulation par son LPS sont capables d’induire une augmentation de l’activité enzymatique de la cathepsine B, ceci suivant différentes cinétiques. Dans les deux cas, ces augmentations d’activité se font sans modifications de la synthèse d’ARNm, ni de la concentration protéique de l’enzyme. Nos résultats démontrent également que l’infection par Porphyromonas gingivalis entraine une augmentation de l’expression ARN de l’inflammasome NLRP3, mais celle ci n’est pas observée au niveau protéique du fait d’un processus de protéolyse de la protéine NLRP3 suite à l’infection. Dans un deuxième temps, nous avons développé un modèle de parodontite expérimentale, fiable et reproductible, nous permettant d’envisager une expérimentation in vivo afin d’observer les interactions à distance entre maladies parodontales et athérosclérose sur dessouris apolipoprotéine-E -/-. / Periodontal diseases have been linked to systemic diseases especially cardiovascular diseases and atherosclerosis. In our study, we investigated the effects induced by an infection with Porphyromonas gingivalis, a major periodontal pathogen, and stimulation by its lipopolysaccharide on endothelial cells at the interface between the inner part of arteries and blood flow. We focused on the effects induced on cathepsin B, a protease involved in atherosclerosis and on the activation of inflammasome, an intracellular complex linked to secretion of IL-1beta. Results showed that infection with Porphyromonas gingivalis and stimulation by its lipopolysaccharide increase enzymatic activity of cathepsin B with different kinetics. These modifications are observed without any modifications of RNAm expression and protein concentration. We also showed that infection with Porphyromonas gingivalis increases RNAm expression of NLRP3 but this increase at the RNAm level is not associated with an increase of the protein concentration due to an induced proteolysis. Furthermore, we developed a reliable model of experimental periodontitis that will be used to analyze interactions between periodontitis and systemic diseases in vivo, especially in apolipoprotein-E -/- mice.

Le vieillissement de la population mondiale s’accompagne de l’augmentation de la prévalence des maladies non transmissibles, dont certaines liées à l’athérosclérose. Les études épidémiologiques sur l’artériopathie oblitérante des membres inférieurs (AOMI) ont été majoritairement menées dans les pays occidentaux. Peu d’entre elles sont conduites dans les pays à faible et moyen revenu, comme les pays africains alors que la rapide transition socio-économique de ces pays entraîne une modification épidémiologique importante. Le programme EPIDEMCA (Épidémiologie des Démences en Afrique Centrale), enquête épidémiologique transversale multicentrique en population générale âgée de 65 ans et plus, a été mené en zones rurales et urbaines de deux pays d’Afrique Centrale: la République Centrafricaine (RCA) et la République du Congo (RDC), entre 2011 et 2012. Durant la première phase, l’enquête épidémiologique a permis de déterminer la prévalence de l’AOMI et d’analyser les facteurs de risque associés. L’AOMI a été définie par un Index de Pression Systolique (IPS) ≤ 0,9. Parmi les 1871 participants évalués sur le plan vasculaire, la prévalence de l’AOMI a été de 14,8% et atteignant 22,2% pour les sujets âgés de 80 ans et plus. Une prévalence plus importante de l’AOMI a été retrouvée dans les zones urbaines en RDC (20,7% versus 14,4% dans la zone rurale, p=0,0114). Cette différence n’a pas été retrouvée en RCA (11,5% urbain versus 12,9%, rural p=NS). Après ajustement à tous les possible facteurs confondants, des facteurs de risque associés avec l’AOMI ont été décrits : l’âge (OR: 1,03 ; p=0,0039), l’hypercholestérolémie (OR: 1,88 ; p=0,0034), le tabac (OR: 1,78 ; p=0,0026). Plus particulièrement, cette première étude en population générale ayant analysé spécifiquement le rôle de la dénutrition (Index de Masse Corporelle <18) dans l’AOMI met en évidence une association significative (OR: 2,09; p=0,0009) et ceci autant chez les hommes que chez les femmes (OR: 2,82; p= 0,0038 et respectivement OR: 1,75; p= 0,0492). Lors de la deuxième phase de l’étude, ayant permis la confirmation de l’atteinte cognitive, nous avons analysé l’association entre l’IPS et la présence des troubles cognitifs. La prévalence des troubles cognitifs s’est avérée être de 13,6%, plus importante chez les sujets avec IPS≤0,9 et IPS≥1,4 que chez les sujets avec 0,9<IPS<1,4 (20,1% et 17% versus 12%, p=0,0024). La présence des troubles cognitifs a été significativement associée avec l’âge (OR: 1,09; p<0,0001), le sexe féminin (OR: 2,36; p<0,0001), la consommation de tabac (OR: 1,78; p=0,0026) et l’IPS <0,90 (OR: 1,52; p=0,0359). Ce travail, s’inscrivant dans le cadre du programme EPIDEMCA, contribue à une meilleure connaissance de l’épidémiologie de l’AOMI sur le continent Africain. Il souligne la haute prévalence de cette pathologie, comparable aux pays occidentaux décrit les facteurs de risque spécifiques associés et met en évidence l’importance des outils de diagnostic de l’athérosclérose (IPS), fiables, peu coûteux et d’utilisation facile dans le dépistage des sujets à risque polyvasculaire. / With the aging of the global population, the prevalence of non-communicable, including cardiovascular, diseases is increasing. While epidemiological studies on peripheral artery disease (PAD) have been mainly conducted in high-income countries, a few have been carried out in low-and middle-income countries, including in Africa. EPIDEMCA (Epidemiology of Dementia in Central Africa) is a cross-sectional population-based study in rural and urban areas of two countries of Central Africa: Central African Republic (CAR) and the Republic of Congo (ROC). Overall, its aim was to investigate the health status in aging population in Central Africa, with a special focus on cognitive disorders, PAD (Ankle-Brachial Index (ABI) ≤0.90). and cardiovascular risk factors as well as their inter-relationship. The EPIDEMCA program was carried out, among people aged 65 years and over, between 2011 and 2012. Among 2002 subjects who agreed to participate, reliable demographic and vascular data were available in 1871 subjects.Overall, the prevalence of PAD was 14.8% reachting 22.2% after the age of 80. The prevalence was higher in ROC than in CAR (17.4% vs. 12.2%, p=0.0071) and in females than males (16.6% vs. 11.9%, p=0.0122). Higher rates of PAD were found in urban area in ROC (20.7% vs. 14.4% in rural area, p=0.0114), not in CAR (11.5% vs. 12.9%, p=ns). In the multivariate analysis, PAD significantly associated factors were described: age (OR: 1.03; p=0.0039), dyslipidemia (OR: 1.88; p=0.0034), smoking (OR: 1.78; p=0.0026), and more specifically undernutrition (OR: 2.09, p=0.0009). Undernutrition was still significantly associated with PAD after adjustment to all potential confounding factors in males as well as in females (OR: 2.82, p= 0.0038 respectively OR: 1.75, p= 0.0492). As epidemiological research on the implication of atherosclerosis in the development of cognitive impairment in general population is lacking in Africa, we focused on the role of ABI as an available marker of atherosclerosis, providing independent and incremental information on subjects’ susceptibility to present cognitive disorders.The prevalence of cognitive impairment among the study participants was 13.6%, higher in subjects with ABI≤0.9 and ABI≥1.4 than those with 0.9<ABI<1.4 (20.1% and 17% vs. 12%, p=0.0024). Cognitive impairment was significantly associated with age (OR: 1.09; p<0.0001), female gender (OR: 2.36; p<0.0001), smoking (OR: 1.78; p=0.0026) and low (≤0.90) ABI (OR: 1.52; p=0.0359). The EPIDEMCA program contributes to a better understanding of PAD in general African population. It highlights the the high prevalence of PAD on the African continent, describes specifically associated risk factors and underlines the importance of an available, inexpensive marker of atherosclerosis in order to detect risk populations in these countries.

Les thrombopathies congénitales sont des pathologies au phénotype hémorragique hétérogène dues à des anomalies fonctionnelles des plaquettes sanguines parfois associées à des anomalies morphologiques et/ou à une thrombopénie. Les outils diagnostic disponibles permettent de corréler une anomalie fonctionnelle plaquettaire à un déficit protéique voire à une mutation d’un gène spécifique. Cependant, en 2015, au moins 50% des thrombopathies restent non étiquetées. Dans ce contexte, le laboratoire d’hémostase de l’EFS Alsace et l’unité INSERM UMR S949 travaillent de concert à l’identification et à la caractérisation de ces pathologies. Ainsi, nous avons mis en évidence trois nouvelles mutations du récepteur P2Y12 dans trois familles différentes. La mutation p.His187Gln a été entièrement caractérisée sur des plaquettes fraiches du patient et dans un modèle cellulaire adapté. La reproduction des deux autres mutations (p.Tyr259Cys et p.Phe95Ser) est en cours. Nous avons par ailleurs identifié une famille dont trois membres sont atteints d’une maladie du pool vide non syndromique et nous suspectons grâce au séquençage d’exome effectué que le transporteur de nucléotides VNUT est impliqué dans la pathologie. / Inherited platelets disorders (IPD) are pathologies associated with heterogeneous bleedingphenotypes. They are due to functional platelets deficiency that may come with morphological abnormalities and/or thrombocytopenia. Available diagnosis tools are used to link a functional deficiency to a protein defect and in some instances to a specific genetic mutation. However, in 2015 at least 50% of IPD are still not identified. In this context, the haemostasis laboratory of the EFS Alsace together with INSERM UMR S949 team are working to diagnose and characterize these pathologies. Thus, we found three new P2Y12 receptor variants in three different families. The mutation p.His187Gln has been fully characterized on blood fresh platelets coming from one patient and in an appropriate cellular model. The reproduction of the two other mutations (p.Tyr259Cys and p.Phe95Ser) is currently ongoing. We also studied a family in which three members are carrying a delta storage pool disease. The full exome sequencing analysis leads us to suspect the involvement of the nucleotides transporter VNUT in this pathology.

L’athérosclérose débute par l’accumulation de cholestérol dans les cellules des parois artérielles, formant des plaques d’athéromes. LRP1 protège contre la maladie en inhibant l’accumulation intracellulaire de cholestérol et nous avions montré qu’une signalisation Wnt5a était impliquée dans cette inhibition. Le projet de thèse consistait à caractériser les mécanismes moléculaires de cette inhibition et à vérifier l’effet athéroprotecteur de Wnt5a. Nous avons montré in vitro et in vivo que Wnt5a inhibe l’accumulation de cholestérol via la stimulation de son export et l’inhibition de sa synthèse endogène. Nous avons ensuite observé que l’invalidation de Wnt5a spécifiquement dans les CMLv de souris LDLR-/- conduit à une augmentation des lésions athéromateuses après un régime riche en cholestérol, confirmant alors son rôle athéroprotecteur. Nos travaux ont ainsi permis de révéler le potentiel de Wnt5a en tant que cible thérapeutique dans le traitement contre l’athérosclérose. / Protects against intracellular cholesterol accumulation and we identified the secreted protein Wnt5a as a partner of this inhibitory effect of LRP1. The aim of this thesis is to determine the molecular mechanisms by which the LRP1/Wnt5a signaling pathway prevents cholesterol accumulation in cells and to study the antiatherogenic potential of Wnt5a. We first showed in vitro and in vivo that Wnt5a decreases cellular cholesterol content by stimulating its efflux through the induction of cholesterol transporters expression and by down-regulating the expression of HMGCoA-reductase. Then we used mice deleted for Wnt5a specifically in smooth muscle cells, which present more atherosclerotic lesions than control mice after a high cholesterol diet. This confirms that Wnt5a protects against atherosclerosis and could be an interesting therapeutic target in the treatment of the disease.

La forme non musculaire de la kinase de la chaine légère de la myosine (MLCKnm) est une kinase principalement exprimée par les cellules endothéliales dont le rôle principal est de phosphoryler la chaine légère de myosine. Cette phosphorylation modifie la conformation des têtes de myosine, augmente l’interaction actine/myosine, et induit une rétraction des cellules endothéliales. Ce processus augmente la perméabilité de la barrière endothéliale. L’activation de MLCKnm permet l’infiltration de cellules inflammatoires en réponse à certains stimuli dont le lipopolysaccharide (LPS) bactérien. Dans ce modèle expérimental de sepsis, la déficience de MLCKnm dans un modèle murin protège les souris injectées avec du LPS, associée à une prévention des stress oxydant et nitrosant ainsi que de l’activation de voies de signalisation inflammatoire. Cependant les mécanismes moléculaires mis en jeu ne sont pas totalement connus. Dans le contexte inflammatoire, le syndrome d’apnées/hypopnées obstructives du sommeil, caractérisé par une obstruction des voies aériennes lors du sommeil menant à une hypoxie intermittente (HI), partage certaines caractéristiques dans l’activation inflammatoire observée lors du sepsis. L’HI modifie le métabolisme des cellules endothéliales en diminuant la biodisponibilité du monoxyde d’azote, augmentant le stress oxydant ainsi que la production de certains facteurs inflammatoires. A long terme, une réponse inflammatoire systémique est observée augmentant les risques d’athérosclérose. L’objectif de ce travail est d’étudier l’implication de MLCKnm dans l’inflammation vasculaire dans deux modèles physiopathologiques, induits par le LPS et l’HI. / Non muscular myosin light chain kinase (nmMLCK) is aprotein mainly expressed by endothelial cells whose roleis to phosphorylate myosin light chain. This phosphorylation modifies the conformation of myosin heads, increasing actin/myosin interaction, and inducing endothelial cells retraction. This process increases endothelial barrier permeability. The activation of nmMLCK increases inflammatory cell infiltration in response to several stimuli such as the bacterial lipopolysaccharide (LPS). In this experimental model of sepsis, nmMLCK deficiency in a murine model protects mice injected with LPS, associated with oxidative and nitrative stresses prevention as well as inflammatory pathway inhibition. However, molecular mechanisms are not fully known. In this inflammatory context, obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, characterized by obstruction of upper airway during sleep leading to intermittent hypoxia (IH), share several characteristics in inflammatory activation observed during sepsis. IH modifies the metabolism of endothelial cells decreasing nitric oxide bioavailability, increasing oxidative stress aswell as inflammatory mediators. Long-term, systemic inflammatory response is observed increasing atherosclerosis risk. The objective of this work is to study the implication of nmMLCK in vascular inflammation in two pathophysiological models induced by LPS and IH.

Le rétrécissement aortique calcifie (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et touche environ 2% des sujets de plus de 65 ans. Initialement considérée comme une dégénérescence passive de la valve aortique liée à l’âge, le RAC est actuellement considéré comme une pathologie complexe et hautement régulée et qui aboutit à un épaississement et à une calcification des feuillets valvulaires aortiques. A ce jour les mécanismes initiateurs et favorisant la progression du RAC ne sont pas complètement élucidés, et d’autre part, aucun traitement ne s’est avéré efficace pour ralentir ou stopper son évolution. Le remplacement valvulaire aortique (chirurgical ou percutané) reste le seul traitement en cas de rétrécissement aortique serré. D’autre part, il n’existe aucun modèle animal fiable et reproductible du RAC permettant de mieux comprendre la physiopathologie de cette valvulopathie et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le laboratoire, nous avons fait l’hypothèse que la dysfonction de l’endothélium valvulaire jouait un rôle important dans l’initiation et la progression du RAC, et nous souhaitons utiliser un modèle animal permettant d’évaluer l’effet de nouvelles thérapeutiques. Ce travail porte donc sur l’évaluation du rôle du système endothélinergique dans la sténose aortique calcifiée et le développement d’un nouveau modèle animal murin de RAC. Dans notre première étude, nous nous sommes intéressés au modèle de souris EgfrWa2/Wa2. Ce modèle est induit par la substitution du résidu amine glycine par une valine. Les souris EgfrWa2/Wa2 homozygotes pour la mutation voient leur activité tyrosine kinase diminuée de 90%. Ce modèle induit un épaississement fibreux des feuillets valvulaires avec peu de calcifications. Cependant, l’augmentation du flux transaortique n’est pas liée a un RAC mais a une insuffisance aortique (IA). Nous avons évalué dans ce modèle l’effet d’un régime enrichi en graisse et d’une supplémentation en vitamine D3. Malgré une augmentation des taux sériquesdu cholestérol, de la vitamine D3 et de la calcémie, nous n’avons pas observé d’augmentation de la calcification. Le modèle EgfrWa2/Wa2 reste essentiellement un modèle d’IA avec le développement d’un RAC qui reste rare ou absent. Dans notre seconde étude, nous avons évalué le rôle du système endothélinergique dans des cultures primaires de cellules valvulaires interstitielles (hVICs) et endothéliales (hVECs) humaines, prélevées lors d’un remplacement valvulaire aortique chirurgical chez des patients ayant un RAC serré. Les valves de patients traités par une intervention de Bentall ont été utilisées comme groupe contrôle. Nous avons tout d’abord observé, par RT-PCR quantitative, que les hVECs issues de valves sténosées présentaient une augmentation non significative de l’ARNm codant pour l’endothéline et une augmentation significative de l’ARNm codant pour le récepteur ET-B, ainsi qu’une diminution significative de l’enzyme de conversion de l’endothéline dans les hVECs par rapport aux hVECs issues de valves contrôles. Le récepteur ET-B était également surexprimé dans les hVICs par rapport aux valves contrôles. En revanche, nous n’avons pas retrouvé de variation d’expression du récepteur ET-A dans les hVICs. Nous avons ensuite évalué l’effet de l’endotheline-1 (ET-1) dans les hVICs. Nous avons retrouvé que les hVICs calcifient lorsqu’elles sont en présence d’ET-1. Ces données suggèrent une implication du système endothélinergique dans la calcification valvulaire aortique. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre son implication, notamment en évaluant l’effet d’antagoniste des récepteurs de l’endothéline dans des cultures de hVICs puis dans un modèle animal fiable mimant cette pathologie. / Aortic stenosis (AS) is the most common valvulopathy in Western countries and affects approximately 2% of subjects over 65 years of age. Originally considered a passive age-related degeneration of the aortic valve, AS is currently considered a complex and highly regulated pathology that results in thickening and calcification of aortic valve leaflets. To date the mechanisms initiating and promoting the progression of AS are not completely understood and secondly, no treatment has been effective to slow or stop its evolution. Aortic valve replacement (surgical or percutaneous) remains the only treatment for severe aortic stenosis. On the other hand, there is no reliable and reproducible animal model of AS to better understand the pathophysiology of this valvulopathy and to test new therapeutic targets. In the laboratory, we hypothesized that valvular endothelial dysfunction plays an important role in the initiation and progression of AS and we wish to use an animal model to evaluate the effect of new therapeutics. This work focuses on assessing the role of the endothelinergic system in AS and the development of a novel mouse animal model of AS. First, we used the EgfrWa2/Wa2 mouse model. This model is induced by the substitution of the amino glycine residue by a valine. The EgfrWa2/Wa2 mice homozygous for the mutation have their tyrosine kinase activity decreased by 90%. This model induces fibrous thickening of the leaflets with little calcification, but the increase in transaortic flow is not related to AS but to aortic regurgitation (AR). In this model we evaluated the effect of a fat-enriched diet and vitamin D3 supplementation. Despite increased serum levels of cholesterol, vitamin D3 and serum calcium, we did not observe an increase in calcification. The EgfrWa2/Wa2 model remains essentially a model of AR whereas AS remains rare or absent. Second, we evaluated the role of the endothelinergic system in primary cultures of human interstitial valvular (hVICs) and endothelial (hVECs) cells, obtained from AS patients treated by surgical aortic valve replacement. The valves of patients treated by a Bentall procedure were used as a control group. We first observed, by quantitative RT-PCR, that stenotic valves showed an increase in mRNA encoding endothelin and for its ET-B receptor and a decrease in the endothelin converting enzyme in the hVECs compared to the control valves. The ET-B receptor was also overexpressed in the hVICs compared to the control valves. We did not find any variation in expression of its ET-A receptor in hVICs. We then assessed the effect of endothelin-1 (ET-1) in the hVICs. We found that hVICs calcify when they are in the presence of ET-1. These data suggest involvement of the endothelinergic system in aortic valve calcification. Further studies are needed to better understand its involvement, notably by evaluating the effect of endothelin receptor antagonist in hVICs cultures and then in a reliable animal model mimicking this pathology

La diminution de la biodisponibilité de la sérotonine (5-HT) en inhibant sa biosynthèse peut représenter un traitement complémentaire efficace de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Nous avons évalué cette hypothèse en utilisant LP533401, qui inhibe la tryptophane hydroxylase 1 (TPH1), enzyme limitante de la biosynthèse de la sérotonine, exprimée dans l'intestin et les poumons, sans inhiber Tph2 exprimée dans les neurones. Méthodes et résultats - Les souris traitées à plusieurs reprises avec LP533401 (30-250 mg / kg par jour) ont présenté une diminution marquée du contenu en 5-HT dans le tube digestif, dans les poumons et dans le sang, mais pas dans le cerveau. Après une seule dose LP533401 (250 mg / kg), le contenu en 5-HT du poumon et l'intestin a diminué de 50%, tandis que les niveaux 5-HT sanguins sont restés inchangés, suggérant une synthèse de 5-HT dans l'intestin et des poumons. Le traitement par l'inhibiteur du transporteur de la 5-HT (5-HTT), le citalopram, a diminué le contenu en 5-HT dans le sang et les poumons, mais pas dans l'intestin. En transgénique, les souris SM22-5-HTT+, surexprimant 5-HTT dans les cellules musculaires lisses, développent spontanément de l'HTAP. Le traitement par 250 mg / kg par jour de LP533401 ou 10 mg / kg de citalopram par jour pendant 21 jours diminue nettement les taux de 5-HT dans les poumons et dans le sang, ainsi que la pression systolique du ventricule droit (VD), l'hypertrophie du VD, la muscularisation distale de l'artère pulmonaire et les cellules Ki67-positives (P< 0,001). Le traitement combiné avec les deux médicaments était plus efficace dans l'amélioration des paramètres hémodynamiques que chacun des médicaments seuls. Un traitement par LP533401 ou par citalopram empêche partiellement le développement de l'HTAP chez les souris de type sauvage exposées à l'hypoxie chronique. Le niveau de 5-HT dans les poumons et dans le sang était plus faible dans les souris hypoxiques que dans souris normoxiques et est encore diminué après traitement par LP533401 ou par citalopram. / Decreasing the bioavailability of serotonin (5-HT) by inhibiting its biosynthesis may represent a useful adjunctive treatment of pulmonary hypertension (PH). We assessed this hypothesis using LP533401, which inhibits the rate-limiting enzyme tryptophan hydroxylase 1 (Tph1) expressed in the gut and lung, without inhibiting Tph2 expressed in neurons. Mice treated repeatedly with LP533401 (30–250 mg/kg per day) exhibited marked 5-HT content reductions in the gut, lungs, and blood, but not in the brain. After a single LP533401 dose (250 mg/kg), lung and gut 5-HT contents decreased by 50%, whereas blood 5-HT levels remained unchanged, suggesting gut and lung 5-HT synthesis. Treatment with the 5-HT transporter (5-HTT) inhibitor citalopram decreased 5-HT contents in the blood and lungs but not in the gut. In transgenic SM22-5-HTT+ mice, which overexpress 5-HTT in smooth muscle cells and spontaneously develop PH, 250 mg/kg per day LP533401 or 10 mg/kg per day citalopram for 21 days markedly reduced lung and blood 5-HT levels, right ventricular (RV) systolic pressure, RV hypertrophy, distal pulmonary artery muscularization, and vascular Ki67-positive cells. Combined treatment with both drugs was more effective in improving PH-related hemodynamic parameters than either drug alone. LP533401 or citalopram treatment partially prevented PH development in wild-type mice exposed to chronic hypoxia. Lung and blood 5-HT levels were lower in hypoxic than in normoxic mice and decreased further after LP533401 or citalopram treatment. These results provide proof of concept that inhibiting Tph1 may represent a new therapeutic strategy for human PH.

La rigidité artérielle et la fibrose ont une valeur prédictive dans le développement des maladies cardiovasculaires (CV). Ces 2 phénotypes impliquent les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) notamment des récepteurs membranaires et les protéines du cytosquelette. Les objectifs ont été d’étudier : (i) l’influence du récepteur minéralocorticoïde (MR) sur la réactivité vasculaire, (ii) le rôle de l’intégrine αvβ3 dans le développement de la rigidité artérielle et la fibrose vasculaire, et (iii) l’impact de la vimentine et la synémine sur la structure et la fonction artérielle. Ces trois études ont utilisées des souris avec invalidation génétiques des protéines d’intérêt. Résultats : l’absence du MR diminue la réactivité vasculaire en altérant le couplage contraction/relaxation des CMLVs via des mécanismes Ca2+- et NO-dépendants (une diminution de la vasoconstriction en réponse au Ca2+ extracellulaire et une altération de la vasorelaxation endothélium-dépendante en réponse à l’acétylcholine). L’invalidation de la sous-unité αv prévient la fibrose en réponse à l’administration d’angiotensine II. L’absence de la vimentine et non celle de la synémine augmente la rigidité artérielle via des changements des adhésions focales des CMLVs mais aussi des cellules endothéliales. En conclusion, les récepteurs membranaires et protéines intracellulaires étudiées influencent la fonction et la structure des artères grâce à des actions spécifiques sur le tonus musculaire, la mécanotransduction et l’organisation ultra-structurale des CMLVs. Ces études montrent au niveau cellulaire et moléculaire le déterminisme plurifactoriel des phénotypes de rigidité-fibrose de la paroi artérielle. Ces résultats nécessitent des travaux plus mécanistiques pour affirmer l’implication de ces protéines dans les maladies CV liées au vieillissement / Arterial stiffness and fibrosis have a predictive value in the development of cardiovascular diseases (CV). These two phenotypes involve vascular smooth muscle cells (VSMCs) including membrane receptors and cytoskeletal proteins. The objectives were to examine: (i) the influence of the mineralocorticoid receptor (MR) on vascular reactivity, (ii) the role of avb3 integrin in the development of arterial stiffness and vascular fibrosis, and (iii) the impact of vimentin and synemin on arterial structure and function. The mice with genetic invalidation of the proteins of interest were used in these three studies. Results: the absence of MR decreased vascular reactivity by altering the contraction/relaxation coupling of VSMC through Ca2+- and NO-dependent mechanisms (a decrease of vasoconstriction in response to extracellular Ca2+ and impaired endothelium-dependent vasorelaxation in response to acetylcholine). The invalidation of the αv subunit prevented fibrosis in response to the administration of angiotensin II. The absence of vimentin, and not that of the synemin, increased arterial stiffness via changes in focal adhesions of VSMCs as well as endothelial cells. In conclusion, the studied membrane receptors and intracellular proteins that influenced the structure and function of arteries through specific actions on muscle tone, the mechanotransduction and the ultra-structural organization of VSMCs. These studies show the multifactorial dependency of the stiffness-fibrosis phenotypes of the arterial wall at the cellular and molecular levels. These results require more mechanistic work to determine the role of these proteins in CV diseases related to aging