As teorias neurobiológicas defendem que a esquizofrenia é essencialmente causada por alterações bioquímicas e estruturais do cérebro. A importância que os aminoácidos tem com a fisiopatologia da esquizofrenia e, por este envolvimento encontrar-se pouco esclarecido é que esta pesquisa teve como propósito desenvolver e validar uma metodologia analítica para a análise simultânea dos aminoácidos: glutamato, aspartato, serina, glicina, arginina e lisina em plasma de pacientes com diagnóstico de esquizofrenia, utilizando para isto a cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência. Os analitos foram inicialmente extraídos através do processo de precipitação protéica, com o solvente orgânico acetonitrila. Para que pudessem ser detectados por fluorescência os aminoácidos foram derivatizados empregando orto-ftalaldeído na presença de B-mercaptoetanol. O tempo total de separação foi de 18 minutos em coluna analítica LiChroCART® RP-18 (Merck, 125mm, 4mm d.i., 5m) no modo de eluição gradiente com tampão acetato de sódio 0,1 mol/L (pH 7,0, A) e acetonitrila e água (B), na proporção 70:30, respectivamente, para posterior detecção por fluorescência (excitação 340 nm, emissão 450 nm). O método foi validado segundo os critérios estabelecidos pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). A resposta do detector encontrou-se linear na faixa de 9,6 a 192 pmol/mL para todos os aminoácidos. O limite de detecção estabelecido foi de 7,68 pmol/mL e o limite de quantificação foi de 9,6 pmol/mL. A recuperação foi superior a 70%. A precisão e exatidão intra-ensaio variou de 3,6% a 5,3% e 3,1% a 8,3%, respectivamente. A precisão e exatidão interensaio variou de 3,6% a 7,1% e 3,1% a 11,4%, respectivamente. A especificidade foi determinada para os seguintes interferentes: lorazepam, diazepam, clonazepam, alprazolam, haloperidol, levomepromazina, propranolol, ranitidina, fluoxetina, olanzapina, carbamazepina, diclofenaco, amiodarona, sulfametoxazol e, ainda, plasma hemolisado, normal e lipêmico. O método desenvolvido e validado mostrou ser eficiente na determinação simultânea de aminoácidos podendo ser aplicado em amostras de pacientes esquizofrênicos a fim de investigar seu envolvimento com esta desordem psiquiátrica tão intrigante. / Schizophrenia is primarily caused by structural and biochemical changes in the brain according to the main neurobiological theory, including the amino acids concentrations in the human plasma. The relation between these amino acids concentrations and the schizophrenia needs more clarification. Therefore, an analytical tool is necessary to provide which of these amino acids are related with this mental disease. The aim of this research was to develop and to validate an analytical methodology using High Performance Liquid Chromatography with fluorescence detection for simultaneous analysis of the main human amino acids, which are: glutamate, aspartate, serine, glycine, arginine and lysine in plasma of schizophrenic patients. Protein precipitation was the extraction technique chosen for the amino acids determination using acetonitrile as organic solvent. The derivatization was conducted by the reaction between the amino acids and ortho-phthalaldehyde in the presence of B-mercaptoethanol. The separation was achieved using the analytical column LiChroCART® RP-18 (Merck, 125mm, 4mm ID, 5mm) by gradient elution in 18 minutes. The mobile phase was composed by sodium acetate buffer 0.1 mol / L (pH 7.0; A) and acetonitrile: water (B) (70:30, v/v). The detection was performed by fluorescence (excitation 340 nm, emission 450 nm). The method was validated according to criteria established by the regulatory agency (ANVISA). The detector response was found linear in the range 9.6 to 192 pmol / mL for all amino acids. The detection limit was set at 7.68 pmol / mL and the limit of quantification was 9.6 pmol / mL. The recovery was above 70%. The precision and accuracy intra-assay ranged from 3.6% to 5.3% and 3.1% to 8.3%, respectively. The precision and accuracy inter-assay ranged from 3.6% to 7.1% and 3.1% to 11.4%, respectively. The specificity was determined for the following possible interferents: lorazepam, diazepam, clonazepam, alprazolam, haloperidol, levomepromazine, propranolol, ranitidine, fluoxetine, olanzapine, carbamazepine, diclofenac, amiodarone, trimethoprim. Plasma hemolyzed, lipemic and normal were evaluated. This method was adequate to simultaneous determination of amino acids, therefore it can be applied to samples of schizophrenic patients and consequently, providing information of the main amino acids involvement with this psychiatric disorder.

Os argilominerais são empregados na área farmacêutica e cosmética tanto como excipientes quanto ingredientes ativos. Esses compostos inorgânicos são inertes quimicamente, apresentam estruturas definidas e alta estabilidade térmica, o que contribui para o uso nessas áreas. Atualmente a indústria farmacêutica busca modificações no sistema de entrega de drogas (melhorias no tempo, local e taxa de liberação), objetivando um aumento na estabilidade das drogas e a prevenção e diminuição de efeitos colaterais. Nesse sentido, surge a necessidade de desenvolver novas formulações farmacêuticas, novos métodos de preparação e novos materiais. Considerando o fato dos argilominerais incorporarem espécies diversas entre suas lamelas, é interessante explorar a possibilidade de uso dessas matrizes inorgânicas como carregadores de espécies bioativas. O principal objetivo do presente trabalho foi preparar e caracterizar argilas de uso farmacêutico e/ou cosmético intercaladas com espécies que apresentam potencial terapêutico. Para tanto, usou-se duas argilas esmectitas naturais do tipo montmorilonita (Cloisita Sódica e Veegum HS) e uma esmectita sintética do tipo hectorita (Laponita RD). Os aminoácidos L-lisina, L-arginina e L-ornitina, e o dipeptídeo L-carnosina foram imobilizados em argilas catiônicas, por meio de reação de troca iônica. Na preparação dos materiais híbridos, alguns parâmetros experimentais foram avaliados: concentração hidrogeniônica (pH) da suspensão de reação, proporção argila/aminoácido e tempo de reação. As argilas precursoras e os materiais híbridos obtidos foram caracterizados por difratometria de raios X, espectroscopia vibracional na região do infravermelho e Raman, análise termogravimétrica acoplada à espectrometria de massas e análise química de carbono. Os valores de distância interlamelar (d(001)) dos materiais sugerem que a cadeia carbônica das espécies orgânicas se orienta paralelamente em relação às lamelas de baixa densidade de carga dos argilominerais. Nos espectros vibracionais na região do infravermelho há predominância das bandas características da estrutura inorgânica, mas as bandas entre 1800 e 1400 cm-1 relativas aos grupos funcionais do aminoácido permitem inferir sobre o seu grau de protonação no material híbrido. A acidez de Brönsted gerada pela polarização das moléculas de água associadas à argila foi observada para as montmorilonitas empregadas neste estudo. Amostras preparadas em suspensões nas quais o valor do pH era maior que o valor da primeira constante ácida (pKa1) dos aminoácidos apresentam bandas atribuídas ao estiramento C=O de grupo carboxilato protonado. Os espectros Raman foram obtidos apenas para a argila sintética, uma vez que as naturais apresentam luminescência. O espectro Raman da L-carnosina imobilizada em Laponita indica a presença preponderante da espécie zwitteriônica; o deslocamento das bandas atribuídas aos grupos amida e carboxílico do dipeptídeo para região de menor energia sugere a formação de ligações de hidrogênio com os grupos silanol da Laponita. Os resultados de análise termogravimétrica acoplada à espectrometria de massas dos materiais híbridos são distintos daqueles observados para os aminoácidos livres. A temperatura de início de decomposição das espécies orgânicas não é praticamente modificada após imobilização nas argilas, mas os processos térmicos se estendem até regiões de maior temperatura, evidenciando a influência da estrutura inorgânica sobre a decomposição térmica dos aminoácidos. Através dos dados de quantidade de carbono e de água nas amostras, calculou-se a concentração de aminoácidos nos materiais híbridos (massa de aminoácido / 100 gramas de material). As maiores concentrações de aminoácido (entre seis e oito por cento) foram observadas para as amostras de Cloisita e Veegum HS, isoladas em condições nas quais predomina a interação eletrostática entre as lamelas e os aminoácidos com carga positiva. Nas condições experimentais empregadas neste trabalho não foi observada a saturação das argilas com os aminoácidos, ou seja, as cargas das lamelas não foram totalmente neutralizadas pelos íons orgânicos. / Clay minerals are used as excipients or active ingredients in the pharmaceutical and cosmetic fields. These inorganic compounds are chemically inert, have defined structures and high thermal stability, which make them useful for these areas. Currently the pharmaceutical industry seeks modifications in the drug delivery systems (improvements in the time, place and rate of release), aiming an increase in the stability of the drugs and also the prevention and reduction of side effects. In this way, it is a need to develop new pharmaceutical formulations, new preparation methods and new materials. Considering the fact that clay minerals incorporate various species between their layers, it is interesting to explore the possibility of using these inorganic matrices as carriers of bioactive species. The main aim of this work was to prepare and characterize clays of pharmaceutical and/or cosmetic usage intercalated with species of therapeutic potential. Two natural smectite clays of montmorillonite type (Sodium Cloisite and Veegum HS) and one synthetic smectite of hectorite type (Laponita RD) were employed. The amino acids L-lysine, L-arginine and L-ornithine, and the L-carnosine dipeptide were immobilized on cationic clays by ion exchange reaction. Some experimental parameters were evaluated in the preparation of hybrid materials: hydrogen ion concentration (pH) of reaction suspension, clay/amino acid proportion and reaction time. Pristine clays and hybrid materials were characterized by X-ray diffraction, infrared and Raman vibrational spectroscopies, thermogravimetric analyses coupled to mass spectrometry and chemical analysis of carbon. The materials values of interlayer distance (d(001)) suggest that the carbon chain of the organic species is oriented parallel to the layers of clay minerals. The infrared vibrational spectra are dominated by the inorganic structure bands; however the bands between 1800 and 1400 cm-1 related to the functional groups of the amino acid allow to infer about the protonation degree in the hybrid material. The Brönsted acidity generated by the polarization of water molecules associated with the clay was observed for montmorillonite samples used in this study. Materials prepared in suspensions in which the pH value was greater than the value of the first acid constant (pKa1) show bands assigned to the C=O stretching of protonated carboxylate group. Raman spectra were obtained only for the synthetic clay, since the natural ones luminesce. Raman spectrum of L-carnosine immobilized on Laponita indicates the presence of mostly zwitterionic species; the displacement of bands assigned to amide and carboxylic groups of the dipeptide to the lower energy region suggests the formation of hydrogen bonds with the Laponita silanol groups. The results of thermogravimetric analyses coupled to mass spectrometry of hybrid materials are different from those observed for the free amino acids. The onset temperature of the organic species decomposition is practically unmodified after the immobilization on clays, but thermal processes are postponed up to higher temperature, revealing the inorganic structure influence on the amino acids thermal decomposition. Data on the carbon and water amounts in the samples were used to calculate the concentration of amino acids in the hybrid materials (mass of amino acid / 100 grams of material). The highest concentrations of amino acid (between six and eight percent) was observed for Cloisite and Veegum HS samples, isolated under conditions in which the electrostatic interaction between the layers and the positively charged amino acids are predominant. Under the experimental conditions employed in this study no saturation of clay with amino acids was observed, i.e. the layer charges were not completely neutralized by the organic ions.

Os cereais representam importantes fontes de proteína para alimentação humana e animal. Entretanto, são caracterizados pela baixa qualidade nutricional de suas proteínas devido à composição desbalanceada de aminoácidos, causada pelo excesso dos aminoácidos prolina e glutamina e deficiência de lisina, treonina e triptofano. As proteínas de reserva prolaminas constituem 50% do conteúdo total de proteínas no endosperma e são as principais responsáveis por tais características nos cereais. As informações sobre o metabolismo de lisina e o acúmulo de proteínas de reserva no endosperma vêm sendo utilizadas para desenvolver e aplicar estratégias em programas de melhoramento de plantas que visam suprir a deficiência de lisina encontrada nos cereais. Lange e colaboradores (2007) relataram a produção de linhagens transgênicas de cevada com padrão de proteínas de reserva alterado e que apresentaram incremento no teor de lisina e outros aminoácidos essenciais. O presente trabalho teve como objetivo identificar os mecanismos responsáveis pelas alterações observadas. Para tanto, avaliou-se a atividade das enzimas envolvidas na síntese e degradação de lisina, além da caracterização das proteínas de reserva e sua composição de aminoácidos. Observou-se redução na fração protéica das prolaminas (5,91 a 18,34%) e incrementos compensatórios na fração protéica das glutelinas (2,16 a 6,52%). As demais frações apresentaram respostas variáveis dependendo do evento avaliado. Além disso, a composição de aminoácidos foi alterada nas diferentes frações protéicas. As prolaminas exibiram incrementos nos teores de lisina (1,79 a 49,13%), treonina (5,04 a 22,60%) e metionina (13,57 a 45,38%), enquanto que as globulinas aumentaram principalmente o conteúdo de metionina (32,30 a 142,56%). Para os aminoácidos solúveis, foram observados incrementos na ordem de duas a três vezes de histidina, lisina, fenilalanina e metionina. A análise das enzimas envolvidas no metabolismo de lisina revelou que ocorreram alterações nas três principais enzimas da via do ácido aspártico. A enzima aspartato quinase (AK) apresentou aumentos na atividade (4,44 a 47,27%), entretanto, foi mais sensível a inibição causada por lisina. A enzima dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) também apresentou incremento na atividade (1,50 a 66,32%), mas diferente da AK, foi menos sensível à inibição causada por lisina. A enzima homoserina desidrogenase (HSDH), a qual compete o substrato ASA com a enzima DHDPS, exibiu redução na atividade (3,36% a 28,80%) (exceto um evento de transformação) e foi menos sensível a inibição causada por treonina. Embora as enzimas envolvidas na degradação de lisina também foram alteradas, os resultados foram variáveis para os diferentes eventos. Para aqueles que foram observados redução na atividade da enzima lisina cetoglutarato redutase (LOR), foi também verificado para enzima sacaropina desidrogenase (SDH), mas na ordem de duas vezes, sendo válido para aqueles que apresentaram incremento. Este trabalho mostrou que a alteração no padrão de proteínas de reserva ocasionou mudanças no metabolismo de aminoácidos, neste caso a lisina, para suprir a demanda necessária para incorporação em proteínas de reserva / Cereals represent an important source of protein to human food and animal feed. However, they are characterized by low nutritional quality of proteins due to the unbalanced composition of amino acids, caused by the excess of the amino acids proline and glutamine and deficiency of lysine, threonine and tryptophan. The prolamin storage proteins constitute 50% of the total protein content in the endosperm and is primarily responsible for these characteristics in cereals. Information on the metabolism of lysine and accumulation of storage proteins in endosperm have been used to develop and implement strategies in plant breeding programs that aim to address the deficiencies found in cereals. Lange and coworkers (2007) reported the production of transgenic lines of barley with a pattern of storage proteins that showed altered and increase in the levels of lysine and other amino acids. This study aimed to identify what were the mechanisms responsible for observed changes. For this, we evaluated the activity of enzymes involved in synthesis and degradation of lysine, besides the characterization of storage proteins and their amino acid composition. There was a reduction in the prolamin protein fraction (5.91 to 18.34%) and compensatory increases in the glutelin fractions (2.16 to 6.52%). The other fractions had variable responses depending on the event evaluated. Moreover, the amino acid composition was changed in the different protein fractions. Prolamins exhibited increases in levels of lysine (1.79 to 49.13%), threonine (5.04 to 22.60%) and methionine (13.57 to 45.38%), whereas increases were mainly globulins content of methionine (32.30 to 142.56%). With respect to soluble amino acids, increases were observed in the order of 2-3 fold of histidine, lysine, phenylalanine and methionine. Analysis of enzymes involved in lysine metabolism showed that changes in three key enzymes of the pathway of aspartic acid. The enzyme aspartate kinase (AK) showed increase in activity (4.44 to 47.27%), however, was more sensitive to inhibition by lysine. The enzyme dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) also showed increased activity (from 1.50 to 66.32%), but unlike the AK, was less sensitive to inhibition by lysine. The enzyme homoserine dehydrogenase (HSDH) that competes for the substrate ASA with the DHDPS, exhibited reduced activity (3.36% to 28.80%) (an exception one transgenic line) and was less sensitive to inhibition by threonine. The enzymes involved in degradation of lysine were also changed, though the results varied for different events. Those who observed decreased activity of the enzyme lysine ketoglutarate reductase (LOR) was also found for enzyme saccharopine dehydrogenase (SDH), but the order of twice, which was valid for those who had increased. This study showed that the change in the pattern of storage proteins produced changes in amino acid metabolism, in this case lysine, to supply the demand needed for incorporation into storage proteins.

Foi isolada uma sub-fração de microsomas, constituída por membranas do retículo endoplasmático, através do tratamento do sobrenadante pós-mitocondrial por detergente. Em testes de microscopia eletrônica e ultracentrifugação analítica, esta preparação de membranas apresentou-se livre de contaminação por outras organelas celulares. Quando incubada em condições adequadas, a fração de membranas incorpora vários aminoácidos em um produto insolúvel em TCA a quente. O tratamento do material incorporado com enzimas proteolíticas acarreta a perda de cerca de 60% da radioatividade derivada de aminoácidos marcados. Não há liberação de radioatividade por tratamento com RNase, DNase, lecitinase ou α-amilase. A remoção de aminoácidos terminais não implica em diminuição considerável de radioatividade. As melhores condições de pH e concentração de Mg para o processo são próximas às fisiológicas. O requerimento de ATP e enzima pH 5 no meio de incubação não é absoluto, mas sua adição estimula o processo. Há indicações de que a independência de fornecimento externo de GTP para o processo resulta de um conteúdo endógeno da partícula. o processo de incorporação é inibido em parte por RNase, NaF, puromicina e anisomicina. / Not available

Dissertação apresentada para obtenção do grau de Doutor em Engenharia Química, na Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto, sob a orientação da Prof. Doutora Maria Arminda Costa Alves

El objetivo general fue la construcción de una inmunoglobulina reportera y su expresión en plantas a fin de evaluar la factibilidad de generar un reportero funcional. Los objetivos específicos fueron: Objetivo 1: Diseñar y construir una fusión del gen codificante para la cadena liviana del anticuerpo 14D9 a proteínas fluorescentes (kappa-PF). Objetivo 2: Estudiar la síntesis y localización subcelular de la fusión Kappa-PF por expresión temporal. Objetivo 3: Estudiar la síntesis y localización subcelular de la fusión Kappa-PF en presencia de la cadena pesada.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-03Bitstream added on 2014-06-13T20:00:51Z : No. of bitstreams: 1 portella_cg_dr_jabo.pdf: 619272 bytes, checksum: 967fa2a2ecd78204650d28b2592f3a8e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Macrobrachium amazonicum e Macrobrachium rosenbergii são espécies de camarão de água doce de grande importância econômica e como fontes de alimento de alto valor nutritivo. Existem poucas informações a respeito da composição química do camarão de água doce produzido no Brasil. O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição química das duas espécies e determinar o perfil de aminoácidos de M. amazonicum. Exemplares provenientes de cultivo foram lavados e limpos (retirada cefalotórax e exoesqueleto) para a determinação dos teores de umidade, proteína, cinzas, lipídeos e aminoácidos totais. Os teores de umidade foram 76,55 e 78,39g/100g, cinzas de 1,34 e 1,31g/100g, proteína de 21,49 e 18,48g/100g e lipídeo de 1,48 e 1,17g/100g, para M. amazonicum e M. rosenbergii, respectivamente. O conteúdo total de M. amazonicum foi 20,60g/100g. Os aminoácidos mais representativos foram ácidos glutâmico e aspártico, arginina, alanina e glicina. Estes dados podem ser utilizados futuramente como informação nutricional aos consumidores e para análises em estudos de nutrição e no processamento. / Species of freshwater prawn Macrobrachium amazonicum and Macrobrachium rosenbergii are species of freshwater prawn of great importance and that may be utilized as source of high nutritional value food. There are few data about the chemical composition of freshwater prawns produced in Brazil. The aim of this study was evaluate the chemical composition of both species and determinate the amino acids profile of M. amazonicum and M. rosenbergii. Samples from culture were washed and have peeled tails. They were determined moisture, protein, ash, lipid and total amino acids contents. The values of moisture were 76.55 and 78.39g/100g, ash 1.34 and 1.31g/100g, protein 21.49 and 18.48g/100g and lipid 1.48 and 1.17g/100g to M. amazonicum and M. rosenbergii, respectively. The total amino acid content of M. amazonicum were 20.60g/100g. The most abundant amino acids were glutamic and aspartic acids, arginine, alanine, and glycine. These data may use as nutritional information for consumers and for future analysis on nutrition and processing.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-03Bitstream added on 2014-06-13T20:27:53Z : No. of bitstreams: 1 gravena_ra_dr_jabo.pdf: 287804 bytes, checksum: bebfb1bcacf298c5f88a581718ef7583 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Avaliou-se o desempenho, a qualidade de ovos, o metabolismo de nitrogênio e os níveis de aminoácidos plasmáticos de poedeiras comerciais alimentadas com rações formuladas à base de milho e farelo de soja com a inclusão de farinha de carne e ossos e diferentes relações de isoleucina:lisina e valina:lisina digestíveis. Foram utilizadas 640 poedeiras da linhagem Isa Brown com 40 semanas de idade distribuídas em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 3x3+1, sendo 0,55; 0,62 e 0,70% de isoleucina e 0,60; 0,67 e 0,75% de valina digestíveis (dietas basais com 15,09% de proteína bruta e 0,75% de lisina digestível) e, o tratamento controle com 17,55% de proteína bruta, totalizando 10 tratamentos com oito repetições e oito aves por parcela. O peso dos ovos das aves alimentadas com dieta controle foi maior em relação ao peso dos ovos das aves que receberam os outros tratamentos, a unidade Haugh dos ovos das aves que receberam 0,70% de isoleucina na dieta foi menor do que os ovos provenientes de aves alimentadas com dietas contendo 0,62% de isoleucina. As dietas contendo 0,55% de isoleucina, independentemente do nível de valina, proporcionaram menor porcentagem de albúmen e maior porcentagem de gema. As aves alimentadas com ração controle ingeriram e excretaram maior quantidade de nitrogênio em relação aos outros tratamentos. De acordo com os níveis plasmáticos obtidos, a isoleucina demonstrou efeito antagônico com a valina e metionina, e o aumento da suplementação com isoleucina e valina elevaram os níveis plasmáticos destes aminoácidos. Conclui-se que o peso dos ovos, a ingestão e excreção de nitrogênio são influenciados pelo nível de proteína bruta da dieta e, os níveis de isoleucina afetam a qualidade dos ovos e exercem efeito antagônico com outros aminoácidos / We evaluated the performance, egg quality, the metabolism of nitrogen and amino acid plasma levels of laying hens fed diets based on corn and soybean meal with the inclusion of meat and bone meal and different relations isoleucine to lysine and valine to lysine digestible. A total of 640 Isa Brown hens strain at 40 weeks old, were distributed in a completely randomized in a factorial 3x3 +1, being 0.55, 0.62 and 0.70% of isoleucine and 0.60, 0.67 and 0 75% of digestible valine (basal diets with 15.09% crude protein and 0.75% lysine) and the control treatment with 17.55% crude protein, totaling 10 treatments with eight replicates of eight birds plot. The weight of the eggs of birds fed the control diet was higher in relation to the weight of the eggs of birds fed the other treatments, Haugh unit of eggs from birds fed 0.70% dietary isoleucine was lower than the eggs of birds fed diets containing 0.62% isoleucine. Diets containing 0.55% isoleucine, valine regardless of level, reduced the percentage of albumen and yolk percentage higher. The birds fed the control diet ingested and excreted larger amounts of nitrogen relative to other treatments. According to the plasmatic levels obtained, showed an antagonistic effect with isoleucine to valine and methionine and increased supplementation isoleucine and valine increased the plasma levels of these amino acids. We conclude that the eggs weight, intake and nitrogen excretion are influenced by the levels of crude protein in the diet and levels of isoleucine affect egg quality and exert antonistic effect with other amino acids

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

O objetivo deste trabalho foi investigar, in vitro, os efeitos do jejum de 15 dias e da subsequente realimentação por 72, 96 e 120 horas, sobre o metabolismo de aminoácidos no hepatopâncreas e no músculo do caranguejo Neohelice granulata previamente alimentado com uma dieta rica em carboidratos (HC) ou proteínas (HP). Para isso, foram realizados os seguintes procedimentos experimentais - captação de [U14C]-MeAIB (ácido metil-aminoisobutírico); síntese de 14Cproteínas a partir de [U14C]-leucina; síntese de 14C-lipídios, formação de 14CO2 e síntese de 14Cglicose a partir de [U14C]-glicina; atividade da Na+-K+-ATPase e atividade e expressão do gene da enzima fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK). Foram também determinadas as concentrações de proteínas no músculo mandibular e de glicogênio e de proteínas no hepatopâncreas. A composição da dieta, o jejum e a realimentação não modificaram a concentração de proteínas no tecido muscular. No hepatopâncreas, a concentração de proteínas foi maior nos animais do grupo controle HP. Os teores de glicogênio foram maiores no hepatopâncreas do grupo controle HC. A síntese de proteínas a partir de 14C-leucina e a oxidação da 14C-glicina foram maiores no músculo do grupo controle HC. No músculo e no hepatopâncreas, a síntese de glicose a partir de 14C-glicina foi maior nos animais controle HC. Nos animais mantidos com a dieta HP foi constatada uma alta atividade da PEPCK muscular e hepatopancreática. No músculo dos animais controle HC, os aminoácidos constituíram substratos para a síntese de lipídios, de proteínas e de glicose. No hepatopâncreas desses animais a 14C-glicina constituiu um importante substrato gliconeogênico. O padrão de ajuste no metabolismo de aminoácidos em resposta ao jejum utiliza diferentes vias segundo a composição da dieta previamente oferecida ao caranguejo. No músculo dos animais HP, os aminoácidos seriam utilizados como substratos energéticos durante o jejum e, no hepatopâncreas desses animais, o glicogênio e os aminoácidos seriam importantes substratos energéticos no período de jejum. Após a realimentação por 72 h, a glicina parece ser utilizada na síntese de lipídios no hepatopâncreas dos animais HC e, nesse mesmo período, a síntese de proteínas e de lipídios parecem ser as principais vias metabólicas para os aminoácidos no hepatopâncreas dos animais HP. Após 120 h de realimentação, a gliconeogênese e a síntese de proteínas constituíram as principais vias metabólicas para os aminoácidos no hepatopâncreas dos animais HC e, para o hepatopâncreas dos animais HP, a via gliconeogênica. Esses resultados demonstram importantes alterações no fluxo de carbono dos aminoácidos entre as diferentes vias metabólicas no músculo e no hepatopâncreas do caranguejo N. granulata. Tais mudanças constituem estratégias utilizadas durante o jejum e a realimentação conforme a composição da dieta previamente oferecida ao caranguejo.