O Metotrexato (MTX) é um fármaco utilizado como anti-inflamatório no tratamento da artrite reumatóide (AR). O risco de doença cardiovascular em pacientes com AR é menor quando tratados com MTX. Apesar dessa evidência, há poucos relatos da utilização de MTX para o tratamento da aterosclerose. Foi desenvolvida em nosso laboratório uma nanopartícula rica em colesterol (LDE), a qual é reconhecida pelos receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDLr) após injeção na corrente sangüínea. A LDE concentra-se em células com hiperexpressão de LDLr, em processos proliferativos como a aterosclerose. Dessa maneira, a LDE pode ser utilizada como veículo para o direcionamento de fármacos contra essas células. A molécula de MTX foi latenciada e a modificação do fármaco aumentou a sua incorporação à LDE. A proposta desse estudo foi avaliar a eficácia de MTX associado à LDE (LDE-MTX) no tratamento da aterosclerose em coelhos além de investigar o efeito desse complexo na expressão de genes inflamatórios que participam do processo aterogênico. Para realização do estudo foram utilizados quatro grupos de 10 coelhos (raça New Zealand) cada, sendo que todos foram submetidos a uma dieta rica em colesterol por 8 semanas. Após as primeiras 4 semanas de dieta, os grupos foram tratados com LDE-MTX (grupo LDE-MTX), MTX comercial (grupo MTX comercial), LDE (grupo controle LDE) ou solução salina (grupo controle Salina), via endovenosa por 4 semanas. O grupo LDE-MTX não apresentou toxicidade ao longo do tratamento de acordo com os parâmetros utilizados, enquanto que o grupo MTX comercial apresentou uma queda acentuada de eritrócitos ao final do tratamento (p<0,001). A análise morfométrica macroscópica mostrou que os grupos LDE-MTX e MTX comercial reduziram as lesões ateroscleróticas quando comparados ao grupo controle Salina (66 e 76%, respectivamente) (p<0,001). Por microscopia, a camada íntima do arco aórtico e torácico foi reduzida nos grupos LDE-MTX (67% e 75%) e MTX comercial (81% e 92%, respectivamente) quando comparados com os mesmos fragmentos do grupo controle Salina (p<0,05). A presença de macrófagos na camada íntima dos grupos LDE-MTX e MTX comercial foi reduzida em 59% e 57% (p<0,001) no arco aórtico e 37% e 38% na região da aorta torácica (p=0,016) em relação ao grupo controle Salina, respectivamente. A porcentagem de MMP-9 no arco aórtico foi reduzida em 48% em ambos os grupos tratados (p=0,0003), enquanto que na aorta torácica LDE-MTX e MTX comercial diminuíram 54% e 66% (p<0,0001) respectivamente, em relação ao grupo controle Salina. Na região da aorta abdominal, a redução de MMP-9 também foi observada nos grupos LDE-MTX (68%) e MTX comercial (70%) (p=0,016). Quando se comparou ao grupo controle LDE, os dois grupos tratados tiveram porcentagens semelhantes de redução em todas as análises morfométricas. Nos estudos de expressão gênica in vivo, 5 genes inflamatórios se mostraram hipoexpressos (TNF-&#945;, MCP-1, IL-1&#946;, IL-18 e MMP-12) e um gene (IL-10) apresentou aumento de expressão no arco aórtico de coelhos tratados com LDE-MTX em relação ao grupo controle. No experimento in vitro, 5 dos 10 genes (TNF-&#945;, VAP-1, IL-1&#946;, CXCL2 e TLR2) avaliados tiveram redução da expressão e 1 (TGF-&#946;1) se mostrou hiperexpresso na linhagem de endotélio humana (HUVEC) tratada com as duas formulações de MTX. Os resultados indicam que tanto a LDE-MTX quanto MTX comercial reduzem acentuadamente as lesões ateroscleróticas em coelhos e parecem minimizar a resposta inflamatória na doença aterosclerótica. Contudo, LDE-MTX apresentou uma tolerabilidade maior ao tratamento, pois não apresentou toxicidade hematológica em comparação com MTX comercial. / Methotrexate (MTX) is the most frequently used drug for rheumatoid arthritis treatment. The incidence of vascular disease in these patients is lower when treated with MTX. However, few studies have been done using MTX for atherosclerosis treatment. In previous studies, we showed that, after injection into blood stream, a cholesterol-rich nanoparticle (LDE) binds to low density lipoprotein receptors (LDLr) and concentrates in tissues with intense cell proliferation such as atherosclerosis. LDE may thus carry drugs directed against those tissues reducing the toxicity of chemotherapeutic agents. For stable association with LDE, a lipophylic methotrexate derivative was used. The purpose of this study was to test MTX associated to LDE (LDE-MTX) in rabbits with atherosclerosis and investigate their anti-inflammatory effects on inflammatory mediators. Atherosclerosis was induced in rabbits by cholesterol rich diet during eight weeks. After 4 weeks from the introduction of the atherogenic diet, 4 groups of 10 animals were treated with LDE-MTX (LDE-MTX group), commercial MTX (commercial MTX Group), LDE (LDE control group) and saline solulion (Saline control group). MTX dose in both preparations was 4mg/kg/week during 4 additional weeks. LDE-MTX group showed superior tolerability with pronouncedly lesser hematologic toxicity in comparison to commercial MTX (p< 0.001). By morphometric analysis, both LDE-MTX and commercial MTX treatment groups showed a pronounced reduction of lesion area compared with Saline control group (66-76% respectively) (p<0001). By microscopy, intimal width at aortic arch and thoracic segments was reduced by 67% and 75% in LDE-MTX group compared to Saline control group, respectively (p<0.05). Commercial MTX group showed a reduction of 81% and 92% at aortic arch and thoracic segments compared to Saline control group, respectively (p<0.05). Presence of macrophages in intima layer at aortic arch was reduced by 59% and 57% (p<0.001) in LDE-MTX and commercial MTX groups while at thoracic segments was diminished by 37% and 38% (p=0.016) compared to Saline control group, respectively. MMP-9 percentage was diminished by 48% in both treated groups at aortic arch (p=0.0003) while at thoracic segment, LDE-MTX and commercial MTX reduced by 54% and 66% (p<0.0001) compared to Saline control group, respectively. Furthermore, MMP-9 percentage also diminished at abdominal segment in LDE-MTX group (68%) and commercial MTX (70%) when compared to Saline control group (p=0,016). When compared to LDE control group, both treated groups had similar percentage reduction in all morphometric analysis. In vivo studies, the expression of 5 inflammatory genes was downregulated (TNF-&#945;, MCP-1, IL-1&#946;, IL-18 and MMP-12) and 1 was upregulated (IL-10) when rabbits with induced atherosclerosis were treated with LDE-MTX. Besides, 5 inflammatory genes were downregulated (TNF-&#945;, VAP-1, IL-1&#946;, CXCL2 e TLR2) and 1 was upregulated (TGF-&#946;1) when human endothelial cell line (HUVEC) was treated with both MTX preparations. Therefore, MTX can be an effective drug for atherosclerosis treatment and associated to LDE, side effects of this chemotherapeutic agent can be minimized.

O Metotrexato (MTX) é um fármaco utilizado como anti-inflamatório no tratamento da artrite reumatóide (AR). O risco de doença cardiovascular em pacientes com AR é menor quando tratados com MTX. Apesar dessa evidência, há poucos relatos da utilização de MTX para o tratamento da aterosclerose. Foi desenvolvida em nosso laboratório uma nanopartícula rica em colesterol (LDE), a qual é reconhecida pelos receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDLr) após injeção na corrente sangüínea. A LDE concentra-se em células com hiperexpressão de LDLr, em processos proliferativos como a aterosclerose. Dessa maneira, a LDE pode ser utilizada como veículo para o direcionamento de fármacos contra essas células. A molécula de MTX foi latenciada e a modificação do fármaco aumentou a sua incorporação à LDE. A proposta desse estudo foi avaliar a eficácia de MTX associado à LDE (LDE-MTX) no tratamento da aterosclerose em coelhos além de investigar o efeito desse complexo na expressão de genes inflamatórios que participam do processo aterogênico. Para realização do estudo foram utilizados quatro grupos de 10 coelhos (raça New Zealand) cada, sendo que todos foram submetidos a uma dieta rica em colesterol por 8 semanas. Após as primeiras 4 semanas de dieta, os grupos foram tratados com LDE-MTX (grupo LDE-MTX), MTX comercial (grupo MTX comercial), LDE (grupo controle LDE) ou solução salina (grupo controle Salina), via endovenosa por 4 semanas. O grupo LDE-MTX não apresentou toxicidade ao longo do tratamento de acordo com os parâmetros utilizados, enquanto que o grupo MTX comercial apresentou uma queda acentuada de eritrócitos ao final do tratamento (p<0,001). A análise morfométrica macroscópica mostrou que os grupos LDE-MTX e MTX comercial reduziram as lesões ateroscleróticas quando comparados ao grupo controle Salina (66 e 76%, respectivamente) (p<0,001). Por microscopia, a camada íntima do arco aórtico e torácico foi reduzida nos grupos LDE-MTX (67% e 75%) e MTX comercial (81% e 92%, respectivamente) quando comparados com os mesmos fragmentos do grupo controle Salina (p<0,05). A presença de macrófagos na camada íntima dos grupos LDE-MTX e MTX comercial foi reduzida em 59% e 57% (p<0,001) no arco aórtico e 37% e 38% na região da aorta torácica (p=0,016) em relação ao grupo controle Salina, respectivamente. A porcentagem de MMP-9 no arco aórtico foi reduzida em 48% em ambos os grupos tratados (p=0,0003), enquanto que na aorta torácica LDE-MTX e MTX comercial diminuíram 54% e 66% (p<0,0001) respectivamente, em relação ao grupo controle Salina. Na região da aorta abdominal, a redução de MMP-9 também foi observada nos grupos LDE-MTX (68%) e MTX comercial (70%) (p=0,016). Quando se comparou ao grupo controle LDE, os dois grupos tratados tiveram porcentagens semelhantes de redução em todas as análises morfométricas. Nos estudos de expressão gênica in vivo, 5 genes inflamatórios se mostraram hipoexpressos (TNF-&#945;, MCP-1, IL-1&#946;, IL-18 e MMP-12) e um gene (IL-10) apresentou aumento de expressão no arco aórtico de coelhos tratados com LDE-MTX em relação ao grupo controle. No experimento in vitro, 5 dos 10 genes (TNF-&#945;, VAP-1, IL-1&#946;, CXCL2 e TLR2) avaliados tiveram redução da expressão e 1 (TGF-&#946;1) se mostrou hiperexpresso na linhagem de endotélio humana (HUVEC) tratada com as duas formulações de MTX. Os resultados indicam que tanto a LDE-MTX quanto MTX comercial reduzem acentuadamente as lesões ateroscleróticas em coelhos e parecem minimizar a resposta inflamatória na doença aterosclerótica. Contudo, LDE-MTX apresentou uma tolerabilidade maior ao tratamento, pois não apresentou toxicidade hematológica em comparação com MTX comercial. / Methotrexate (MTX) is the most frequently used drug for rheumatoid arthritis treatment. The incidence of vascular disease in these patients is lower when treated with MTX. However, few studies have been done using MTX for atherosclerosis treatment. In previous studies, we showed that, after injection into blood stream, a cholesterol-rich nanoparticle (LDE) binds to low density lipoprotein receptors (LDLr) and concentrates in tissues with intense cell proliferation such as atherosclerosis. LDE may thus carry drugs directed against those tissues reducing the toxicity of chemotherapeutic agents. For stable association with LDE, a lipophylic methotrexate derivative was used. The purpose of this study was to test MTX associated to LDE (LDE-MTX) in rabbits with atherosclerosis and investigate their anti-inflammatory effects on inflammatory mediators. Atherosclerosis was induced in rabbits by cholesterol rich diet during eight weeks. After 4 weeks from the introduction of the atherogenic diet, 4 groups of 10 animals were treated with LDE-MTX (LDE-MTX group), commercial MTX (commercial MTX Group), LDE (LDE control group) and saline solulion (Saline control group). MTX dose in both preparations was 4mg/kg/week during 4 additional weeks. LDE-MTX group showed superior tolerability with pronouncedly lesser hematologic toxicity in comparison to commercial MTX (p< 0.001). By morphometric analysis, both LDE-MTX and commercial MTX treatment groups showed a pronounced reduction of lesion area compared with Saline control group (66-76% respectively) (p<0001). By microscopy, intimal width at aortic arch and thoracic segments was reduced by 67% and 75% in LDE-MTX group compared to Saline control group, respectively (p<0.05). Commercial MTX group showed a reduction of 81% and 92% at aortic arch and thoracic segments compared to Saline control group, respectively (p<0.05). Presence of macrophages in intima layer at aortic arch was reduced by 59% and 57% (p<0.001) in LDE-MTX and commercial MTX groups while at thoracic segments was diminished by 37% and 38% (p=0.016) compared to Saline control group, respectively. MMP-9 percentage was diminished by 48% in both treated groups at aortic arch (p=0.0003) while at thoracic segment, LDE-MTX and commercial MTX reduced by 54% and 66% (p<0.0001) compared to Saline control group, respectively. Furthermore, MMP-9 percentage also diminished at abdominal segment in LDE-MTX group (68%) and commercial MTX (70%) when compared to Saline control group (p=0,016). When compared to LDE control group, both treated groups had similar percentage reduction in all morphometric analysis. In vivo studies, the expression of 5 inflammatory genes was downregulated (TNF-&#945;, MCP-1, IL-1&#946;, IL-18 and MMP-12) and 1 was upregulated (IL-10) when rabbits with induced atherosclerosis were treated with LDE-MTX. Besides, 5 inflammatory genes were downregulated (TNF-&#945;, VAP-1, IL-1&#946;, CXCL2 e TLR2) and 1 was upregulated (TGF-&#946;1) when human endothelial cell line (HUVEC) was treated with both MTX preparations. Therefore, MTX can be an effective drug for atherosclerosis treatment and associated to LDE, side effects of this chemotherapeutic agent can be minimized.

Submitted by LETICIA CITELLI CONTI null (leticiacitelli90@gmail.com) on 2018-04-04T03:40:45Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Leticia Citelli Conti FINAL.pdf: 2893008 bytes, checksum: e0926f9ed15f7b0c348e6f198b7f9174 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Rimoli de Oliveira null (anapaula@foa.unesp.br) on 2018-04-04T12:09:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 conti_lc_me_araca_int.pdf: 2893008 bytes, checksum: e0926f9ed15f7b0c348e6f198b7f9174 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-04T12:09:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 conti_lc_me_araca_int.pdf: 2893008 bytes, checksum: e0926f9ed15f7b0c348e6f198b7f9174 (MD5) Previous issue date: 2018-03-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A aterosclerose é uma doença cardiovascular inflamatória crônica, caracterizada pelo acúmulo de placas de gordura nos vasos sanguíneos em consequência de danos no endotélio provocada por diversos fatores de risco, dentre eles o acúmulo de lipídeos. As infecções dentárias também são doenças de caráter inflamatório, dentre elas, está a infecção endodôntica que resulta no desenvolvimento da periodontite apical. Diante dos estudos apresentados na literatura especializada, dos quais os resultados ainda carecem de comprovação científica sobre possíveis correlações entre a periodontite apical com alterações sistêmicas, o objetivo deste trabalho foi avaliar a inter-relação entre a periodontite apical e a aterosclerose. Foram utilizados 40 ratos Wistar distribuídos em 4 grupos de 10 animais: ratos controle (C); ratos com periodontite apical (AP); ratos com aterosclerose (AT); ratos com periodontite apical e com aterosclerose (AP+AT). A aterosclerose foi induzida com a administração de uma dieta com alto teor lipídico, juntamente com um procedimento cirúrgico realizado na carótida comum direita associada a uma super dosagem de vitamina D3. A periodontite apical foi induzida 30 dias após a indução cirúrgica da aterosclerose, pela exposição da polpa dentária coronária ao meio bucal, dos primeiros e segundos molares superiores e inferiores direito. O peso corporal foi obtido aos 0, 15, 45 e 75 dias e o consumo de ração foi mensurado nos períodos de 7, 15, 45 e 75 dias. Aos 45 e 75 dias, foi realizada punção cardíaca para remoção do tecido hematológico e as concentrações séricas do perfil lipídico foram mensurados. Aos 75 dias, os ratos foram eutanasiados e os órgãos: cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim e gônadas foram pesados individualmente. A maxila, a mandíbula e a carótida foram processadas para análise histológica (hematoxilina e eosina). Os resultados das diferentes análises e a relação entre os achados locais e sistêmicos foram tabulados e analisados por testes estatísticos específicos para cada caso (p<0,05). A aterosclerose foi capaz de induzir a perda de peso dos animais no período inicial do experimento, no entanto, ao final do experimento apenas o grupo AP+AT apresentou peso inferior quando comparado ao grupo controle. O consumo de ração foi semelhante entre todos os grupos. As concentrações séricas do colesterol total e do LDL-C foram, estatisticamente mais elevados nos grupos portadores de aterosclerose (AT e AP+AT) quando comparados aos outros grupos (p <0,05). Nos grupos AP e AT, a presença das doenças foram capazes de aumentar os níveis de triglicérides, comparados ao controle, sem diferença estatística entre si. (p <0,05). Já no grupo AP+AT os níveis de triglicérides foram superiores quando comparados aos grupos AP e AT. Houve aumento no peso do cérebro e redução no peso do pulmão nos grupos AP, AT, AP+AT quando comparados ao grupo C. O peso do baço no grupo AP apresentou-se elevado quando comparado aos demais grupos. Nas análises histológicas, o grupo AP+AT apresentou infiltrado inflamatório mais intenso e reabsorção óssea mais exacerbada quando comparada ao grupo AP. Foi possível detectar alterações morfológicas nas artérias carótidas dos animais portadores de aterosclerose. Conclui-se que a periodontite apical e a aterosclerose, isoladas ou associadas, influenciam no peso corporal, no metabolismo, no perfil lipídico, nas lesões periapicais e nas carótidas de ratos Wistar. / Atherosclerosis is a chronic inflammatory cardiovascular disease, characterized by the accumulation of lipid in the blood vessels, due to risk factors capable of causing injuries to the endothelium. Dental infections are also pathologies of inflammatory origin, among them is the endodontic infection that results in the development of apical periodontitis. In view of the studies presented in the specialized literature, of which the results still lack scientific evidence on possible correlations between apical periodontitis with systemic alterations, the objective of this study was to evaluate the possible interrelationship between apical periodontitis and atherosclerosis. Forty male Wistar rats were distributed in 4 groups of 10 animals: control rats (C); rats with apical periodontitis (AP); rats with atherosclerosis (AT); rats with AP and atherosclerosis (AP+AT). Atherosclerosis was induced by using a high-lipid diet together with right common carotid surgery and a super dosage of vitamin D3. Apical periodontitis was induced 30 days after the surgical induction of atherosclerosis, by exposure of the coronary tooth pulp to the oral environment, of the first and second molars, upper and lower right. Body weight was obtained at 0, 15, 45 and 75 days and food consumption was measured on 7, 15, 45, and 75 days. At 45 and 75 days, cardiac puncture was performed to remove hematological tissue and serum levels of the lipid profile were measured. At 75 days the rats were euthanized and the organs: brain, heart, lung, liver, spleen, kidney and gonads were weighed individually. The upper and lower jaws and carotid were processed for histological analysis (hematoxylin and eosin). The results of the different analyzes and the relation between the local and systemic findings were tabulated and analyzed by specific statistical tests for each case (p <0.05). Atherosclerosis induced the weight loss of the animals in the initial period of the experiment, however, at the end of the experiment only the AT+AP group presented lower weight when compared to group C. Feed consumption was similar among all groups. The levels of total cholesterol and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were statistically higher in the groups with atherosclerosis (AT and AP+AT) when compared to the other groups (p <0.05). In the AP and AT groups, the presence of infections were able to increase triglyceride levels, compared to control, with no statistical difference between them. (p <0.05). In the AT+AP group, the triglyceride levels were higher when compared to the AP and AT groups. There was an increase in brain weight and a reduction in lung weight in the AP, AT, AP+AT groups when compared to group C. The spleen weight in the AP group was elevated when compared to the other groups. In the histological analyzes, the AP+AT group presented more severe periapical inflammatory infiltrates and more exacerbated bone resorption when compared to the AP group. It was possible to detect morphological changes in the carotid arteries of animals with atherosclerosis. It is concluded that apical periodontitis and atherosclerosis, whether isolated or associated, influence body weight, metabolism, lipid profile, periapical lesions and in the carotids of Wistar rats.

A homeostase intracelular do colesterol é mantida, em células de mamíferos, por meio de uma série de mecanismos, porém pode haver uma ruptura deste balanço intracelular podendo levar ao desenvolvimento de doenças, como a lesão aterosclerótica que hoje em dia está acometendo grande parte da população mundial. A enzima HMG-CoA redutase, que possui cisteínas reativas em sua estrutura, pode ser alvo de estudos sobre o bloqueio do processo aterosclerótico, por meio de prostaglandinas da família das ciclopentenônicas (CP-PGs), particularmente a prostaglandina A2 (PGA2), que desviam completamente a síntese de novo de colesterol no sentido da síntese de fosfolípides em macrófagos/foam cells e outras preparações de macrófagos inflamatórios. Dessa forma o objetivo deste estudo foi investigar o efeito da PGA2 sobre a HMG-CoA redutase, em tipos celulares relacionados ao processo aterogênico, demonstrando seu mecanismo de ação por ligação covalente a cisteínas reativas desta enzima. Utilizaram-se macrófagos U937 que foram incubados ou não com LDL oxidada, tornando-se-os foam cells. As células foram tratadas com dose não tóxica (1 μM) de PGA2 ou com mistura controle por um período de 24 h. Outros grupos de macrófagos U937 e foam cells foram tratados com PGA2 biotinilada (com ou sem ditiotreitol, DTT 10 mM) na presença ou ausência de PGA2 (10 μM e 20 μM), por 2 h e 6 h. Foi feito também um estudo da atividade da HMG-CoA, através de kit específico e curvas de crescimentos celular em resposta PGA2. Nossos resultados mostraram aumento na imunodetecção de HMG-CoA redutase em macrófagos, quando tratados com LDL oxidada e tratados com PGA2 biotinilada por 2 h e 6 h, sendo que o tratamento com DTT produziu uma dramática redução na incorporação da mesma à enzima. A PGA2 foi capaz de reduzir a atividade da HMG-CoA em até 86,4% nas doses utilizadas. Macrófagos e foam cells tratados com PGA2 (1 μM) tiveram um aumento na proliferação celular quando comparados com aqueles que não receberam tratamento ou que foram tratadas com doses mais altas da PGA2. Nossos achados contribuem para esclarecer o mecanismo pelo qual ocorre a ação da PGA2 na reversão do processo aterosclerótico via inibição da enzima HMG-CoA redutase via ligação covalente nas cisteínas reativas desta enzima. / The intracellular cholesterol homeostasis is maintained in mammalian cells by a variety of mechanisms, although there may be intracellular breakdown of this balance that can lead to the development of diseases such as atherosclerotic lesions that are nowadays mostly affecting the population worldwide. The enzyme HMG-CoA reductase, which has critical reactive cysteines in its structure, may be target anti-atherosclerotic treatments , once cyclopentenonic prostaglandins (CP-PGs), particularly prostaglandin A2 (PGA2), which completely diverts de novo synthesis of cholesterol toward the direction of phospholipid synthesis in macrophages/foam cells in macrophage/foam cells and other inflammatory macrophage preparations. Thus the objective of this study was to investigate the effect of PGA2 on the HMG-CoA reductase in cell types related to the atherogenic process, demonstrating its mechanism of action by covalent binding to reactive cysteines of this enzyme. Macrophages U937 were used were incubated or not with LDL oxidized, making-up the foam cells. Cells were treated with non-toxic dose of PGA2 (1 μM) or with a mixture control for a period of 24 h. Other groups and U937 macrophage foam cells were treated with biotinylated PGA2 (with or without dithiothreitol, DTT, 10 mM) in the presence or absence of PGA2 (10 mM and 20 mM) for 2 h and 6 h. Was also made a study of the activity of HMG-CoA through kit specific and cell growth curves in response to PGA2. Our results showed the increase in immunodetection of HMG-CoA reductase into macrophages, when treated with LDL oxidized and treated with biotinylated PGA2 for 2 h and 6 h, and the DTT treatment produced a dramatic reduction the incorporation of the same enzyme. The PGA2 was able to reduce the activity of HMG-CoA to 86.4% at the doses used. Macrophages and foam cells treated with PGA2 (1 mM) had an increase in cell proliferation compared with those receiving no treatment or were treated with higher doses of PGA2. Our findings help to clarify the mechanism by which the action occurs in the PGA2 reversal of atherosclerosis by inhibiting the enzyme HMG-CoA reductase by way of covalent bond in the reactive cysteines of this enzyme.

A aterosclerose consiste na formação de placas que reduzem o diâmetro dos vasos sanguíneos e é a principal causa das doenças cardiovasculares. O estresse oxidativo tem sido apontado como um importante mecanismo no processo de aterogênese induzido pela hipercolesterolemia. A astaxantina (ASX) é um carotenóide presente em algas e frutos-domar, amplamente estudado por suas propriedades antioxidantes. No presente trabalho, avaliou-se a ocorrência de estresse oxidativo em diferentes estágios de hipercolesterolemia em humanos e a relação entre o estresse oxidativo e o processo inflamatório nesses indivíduos. Adicionalmente, o potencial antiaterogênico da ASX foi avaliado em coelhos hipercolesterolêmicos. No primeiro capítulo demonstramos que a peroxidação lipídica e oxidação de proteínas aumentou em indivíduos com níveis de LDL considerados de alto risco para doenças cardiovasculares (>160mg/dL), enquanto os níveis de LDLox, LDLoxAB, do marcador de processo inflamatório hs-CRP e a atividade das enzimas TrxR-1 e SOD aumentaram em indivíduos com níveis de colesterol considerados altos, mas clinicamente aceitáveis (130-160mg/dL), persistindo este aumento nos sujeitos com LDL > 160mg/dL. A enzima PON1 não teve sua atividade modificada em nenhum dos estágios de hipercolesterolemia estudados. Os resultados apresentados no capítulo I permitem concluir que o estresse oxidativo ocorre concomitantemente ao processo inflamatório durante a hipercolesterolemia. Além disso, a utilização da atividade da enzima PON1 sérica como fator de risco independente para doenças cardiovasculares necessita maiores esclarecimentos. No segundo e terceiro capítulos, observamos que a adição de colesterol (1%) na dieta de coelhos (60 dias) induziu hiperlipidemia sérica, estresse oxidativo no soro e tecido aórtico e formação de ateroma no tecido aórtico. A suplementação de ASX (50-100mg%) concomitante com o colesterol atenuou o estresse oxidativo de maneira mais acentuada no tecido aórtico do que no soro, mas não preveniu o aumento dos lipídios séricos nem a formação de ateroma nos coelhos. Estes resultados indicam que apesar da ausência de efeito hipolipidêmico e antiaterogênico da ASX, esse carotenóide exerce efeitos antioxidantes no soro e tecido aórtico de coelhos hipercolesterolêmicos. Em conjunto, os dados desta Tese indicam a ocorrência de estresse oxidativo durante a hipercolesterolemia em humanos e a ocorrência de aterosclerose e estresse oxidativo em coelhos hipercolesterolêmicos. Apesar da ASX não ter apresentado efeito antiaterogênico neste trabalho, mais estudos são necessários antes de uma conclusão definitiva sobre o potencial deste carotenóide como adjunto na prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares. / Atherosclerosis consists in the formation of plaques that reduces blood vassels diameter and it is the major cause of cardiovascular diseases. Oxidative stress has been pointed as an important mechanism in atherogenesis process induced by hypercholesterolemia. Astaxanthin (ASX) is a carotenoid present in algaes and seafoods, widely studied by its antioxidant properties. In the present study it was evaluated the ocurrence of oxidative stress at different stages of hypercholesterolemia in humans and the relathionship between oxidative stress and inflamatary process in these subjects. Additionally, the antiatherogenic potential of ASX was evaluated in hypercholesterolemic rabbits. In the first chapter, we demonstrated that lipid peroxidation and protein oxidation increased in subjects with LDL levels considered of high risk for cardiovascular diseases (>160mg/dL), while the levels of LDLox, LDLoxAB, the marker of inflamatory process hs-CRP and the activity of the enzymes TrxR-1 and SOD increased in subjects with LDL levels considered high, but clinically acceptable (130- 160mg/dL), persisting this increase in subjects with LDL > 160mg/dL. The enzyme PON1 did not have its activity modified in none of the studied stages of hypercholesterolemia. The results presented in chapter I allow to conclude that oxidative stress ocurrs concomitantly to the inflamatory process during hipercholesterolemy. Besides, the use of enzyme PON1 activity in serum as an independent risk factor for cardiovascular diseases needs more clarification. In the second and third chapters, we observed that the addition of cholesterol (1%) in the diet of rabbits (60 days) induced serum hyperlipidemia, oxidative stress in serum and aortic tissue and atheroma formation in aortic tissue. ASX supplementation (50-100mg%) concomitant with cholesterol atenuated oxidative stress in a more pronounced way in aortic tissue than in serum, but did not prevent the increase in serum lipids nor atheroma formation in rabbits. These results indicate that despite the absence of hypolipidemic and antiatherogenic effect of ASX, this carotenoid exerts antioxidant effects in serum and aortic tissue of hypercholesterolemic rabbits. Taken together, the data of this thesis indicate the ocurrence of oxidative stress during hypercholesterolemia in humans and the ocurrence of atherosclerosis and oxidative stress in hypercholesterolemic rabbits. Despite ASX not having presented antiatherogenic effect in this work, more studies are necessary before a final conclusion about the potential of this carotenoid as an adjunct in prevention and therapy of cardiovascular diseases.

Resumo não disponível

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T06:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 288714.pdf: 1529404 bytes, checksum: 691274f054853c4f49b51329f2595552 (MD5) / A aterosclerose é uma doença progressiva caracterizada pelo acúmulo de lipídios e elementos fibrosos nas artérias de médio e grande calibre. As doenças cardiovasculares decorrentes da aterosclerose, dentre elas o infarto agudo do miocárdio e o acidente vascular cerebral, são a principal causa de mortalidade e morbidade mundial. O estresse oxidativo e a deficiência da enzima glutationa peroxidase (GPx) possuem um importante papel no desenvolvimento da aterosclerose. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do disseleneto de difenila (DD), um composto orgânico de selênio, em modelos experimentais de aterosclerose, in vivo e in vitro. O tratamento com baixas doses de DD (0,1 e 1 mg/kg/dia, v.o.) por 30 dias reduziu a formação de lesões ateroscleróticas em camundongos com deleção gênica para o receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLr -/-) submetidos a uma dieta hipercolesterolêmica. Esta redução foi acompanhada por melhora na vasodilatação dependente do endotélio, diminuição da expressão de 3-nitrotirosina e malondialdeído (marcadores de estresse oxidativo), redução da razão colesterol não-HDL/HDL, diminuição da infiltração de células inflamatórias na lesão e dos níveis sistêmicos de MCP-1. Em cultura de células endoteliais de aorta bovina (BAECs), o pré-tratamento por 24 horas com DD (0,5 e 1 M) atenuou a apoptose induzida por LDL humana isolada associada à diminuição da formação de EROs e o consumo de GSH, e restabelecer o aumento do potencial de membrana mitocondrial. Os estudos em macrófagos murinos da linhagem J774 expostos a oxLDL (100 g/mL), demonstraram que o DD (1 M) reduziu significativamente a formação de células espumosas, a produção de EROs e de mediadores inflamatórios (MCP-1 e TNF- ). Este conjunto de resultados revela o potencial antiaterogênico do DD, tanto em modelos experimentais in vivo quanto in vitro. Os efeitos demonstrados pelo composto sugerem ser relacionados às suas propriedades antioxidante, mimética da GPx e anti-inflamatória.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Nutrição, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:07:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290261.pdf: 1582656 bytes, checksum: 0e1ddf393fed95a15749cc3aee11f437 (MD5) / A erva-mate (Ilex paraguariensis) espécie vegetal usada no preparo de bebidas como o chimarrão, o tererê e o chá mate tostado, possui propriedades antioxidante, hipocolesterolêmica e vasodilatadora, as quais podem ser benéficas na prevenção das doenças cardiovasculares (DCV). A paroxonase-2 (PON2) é uma enzima antioxidante cuja atividade está inversamente associada ao estresse oxidativo celular e pode ser modulada pela alimentação. Assim, o objetivo do presente estudo foi verificar se a erva-mate - verde ou tostada - possui a propriedade de modular a expressão gênica e a atividade da PON2 in vitro, em cultura de macrófagos, e in vivo, em monócitos e macrófagos obtidos após a ingestão das infusões de erva-mate por mulheres saudáveis. No estudo in vitro, células THP-1 foram incubadas com os extratos de erva-mate verde ou tostada ou com os ácidos clorogênico ou caféico, principal constituinte fenólico da erva-mate e metabólito plasmático. O estudo in vivo foi subdividido em agudo e de curta duração (sete dias). No estudo agudo, 20 voluntárias ingeriram 500 mL de infusão de erva-mate verde, tostada ou de água (controle) e amostras de sangue foram coletadas antes e 2 h após as ingestões. No estudo de curta duração, as mesmas 20 participantes consumiram as infusões de erva-mate ou de água, na dose de 330 mL três vezes ao dia, durante 7 dias, e amostras de sangue foram coletadas antes e no final do período, após jejum de 12-14 h. As diferenças foram avaliadas pelo teste t pareado de Student, teste de Wilcoxon e Mann-Whitney, considerando-se p < 0,05 como significativo. De acordo com os resultados obtidos no estudo in vitro, os extratos de erva-mate verde ou tostada (0,8 e 2,4 µg/mL, ou 1 e 3 ?M equiv. Ácido clorogênico/L) aumentaram a expressão gênica da PON2 nos macrófagos THP-1 (p < 0,05), enquanto concentrações maiores de extrato (3, 5 e 10 ?M) aumentaram a atividade. Resultados semelhantes foram encontrados para o ácido clorogênico (1 e 3 ?M), enquanto o ácido caféico aumentou somente a atividade e não a expressão da PON2. No estudo in vivo, a ingestão aguda das infusões de erva-mate verde ou tostada aumentou a expressão gênica e as atividades arilesterase e lactonase da PON2 nos monócitos do sangue periférico (p < 0,05). O consumo de erva-mate verde ou tostada durante sete dias elevou a expressão gênica da PON2 nos monócitos e nos macrófagos derivados de monócitos (p < 0,05) e aumentou de forma não significativa a atividade da PON2. A ingestão de erva-mate verde e tostada, de forma aguda ou por 7 dias, aumentou a atividade da PON1 no plasma (p < 0,05). Em geral, não houve diferença entre os dois tipos de erva-mate estudados. Com base nos resultados do presente estudo, podemos sugerir que a erva-mate verde ou tostada modulou positivamente a expressão gênica e a atividade da enzima PON2 em monócitos e macrófagos, indicando, assim, possível proteção contra o estresse oxidativo celular.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-12-15T08:24:45Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4056273 bytes, checksum: 9c116a3669be96201e207a66c64f7fcc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-15T08:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4056273 bytes, checksum: 9c116a3669be96201e207a66c64f7fcc (MD5) Previous issue date: 2013-04-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A doença arterial aterosclerótica é uma das maiores causas de morte no mundo. Medidas farmacológicas e não farmacológicas, são terapias comumente utilizadas e associadas a um decréscimo na incidência de eventos cardiovasculares. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do treinamento físico com natação e o tratamento com nebivolol no processo da aterosclerose em camundongos adultos apoE-/-. Foram utilizados 28 camundongos apoE-/- com 17 semanas de idade, submetidos a 6 semanas de treinamento com natação (60 min/sessão/dia, 5 dias/semana) e tratamento com 2,0 μmol/kg de peso corporal de nebivolol. Os animais foram divididos em 4 grupos: controle: apoE-/- sem medicamento e sem exercício (G1, n = 7); apoE-/- com medicamento e sem exercício (G2, n = 7); apoE -/- sem medicamento e com exercício (G3, n = 7); apoE -/- com medicamento e com exercício (G4, n = 7). O peso dos animais foi avaliado semanalmente. Ao final do experimento os animais foram eutanasiados e o sangue coletado foi imediatamente centrifugado para obtenção do soro para análise do perfil lipídico e enzimas indicadoras de hepatotoxidade. A aorta, parte do fígado, rim e coração foram removidos, lavados em solução fisiológica, conservados em formol neutro a 10% (pH = 7,0) e após 24 horas transferidos para uma solução de 70% de etanol para as análises histopatológicas. Na aorta também foi realizada imunofluorescência. Fragmentos do fígado e do rim foram congelados e mantidos a -80oC até a análise da atividade enzimática da catalase e superóxido dismutase. Os músculos sóleo e gastrocnêmio também foram congelados para análise da atividade da enzima citrato sintase. Não houve diferença estatística entre os grupos para desenvolvimento, perfil lipídico, aspartato aminotransferase e alanina aminotransferase, dessa forma os tratamentos não foram capazes de interferir nesses parâmetros. A fosfatase alcalina foi significativamente maior nos grupos treinados, podendo ser indicativo de alteração do metabolismo ósseo. A estenose no lúmen da raiz aórtica foi menor no G2 em relação ao G1, demonstrando que o nebivolol foi capaz de inibir a progressão da placa. Nas análises histopatológicas do fígado tanto os grupos treinados quanto os tratados com medicamento apresentaram menor porcentagem de esteatose, indicando um papel importante dos tratamentos em prevenir o acúmulo de gordura hepática. No rim, os tratamentos não demonstraram alterações no número e área dos glomérulos. G1 e G4 apresentaram um percentual maior de colágeno total no coração que os grupos G2 e G3. Em relação à razão colágeno tipo I/III, não houve diferença significativa entre os grupos. A expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) na aorta do animais de todos os grupos ocorreu essencialmente na camada adventícia da artéria, sugerindo um processo inflamatório iniciado nesta camada. A atividade da catalase (CAT) no fígado foi significativamente inferior nos grupos treinados. Já a atividade da superóxido dismutase (SOD) do grupo G3 foi inferior em relação aos grupos não treinados. Não houve diferença significativa na atividade enzimática de SOD e CAT no rim. Este trabalho sugere que o protocolo de exercício proposto não alterou positivamente o processo aterosclerótico neste modelo animal, porém o nebivolol foi capaz de reduzir a área das lesões ateroscleróticas e o conteúdo de colágeno. A expressão da iNOS ocorreu na camada adventícia da artéria de todos os grupos. Além disso, tanto o medicamento quanto o exercício foram capazes de atuar de forma positiva, diminuindo o acúmulo de gordura no fígado, e o exercício atuou reduzindo a atividade antioxidante de SOD e CAT neste órgão nos grupos treinados. / Atherosclerosis is one of the major causes of worldwide death. Pharmacological and non-pharmacological treatments, are commonly therapies used and are associated with a decreased incidence of cardiovascular events. The aim of this study was to evaluate the effects of swimming training and nebivolol treatment in atherosclerosis process of adult mice apoE-/-. Twenty-eight apoE-/- mice at the age of 17 weeks were kept on a six weeks of swimming training (60 min / session / day, 5 days / week) and treated with 2.0 mmol / kg body weight of nebivolol. The animals were randomized to the following 4 groups: control: apoE-/- without drug and sedentary (G1, n = 7), apoE-/ - with drug and sedentary (G2, n = 7), apoE-/ - without drug and exercised (G3, n = 7), apoE-/ - with drug and exercised (G4, n = 7). Animals‟ weight was measured weekly. At the end of the experiment the animals were euthanized and blood was collected immediately and centrifuged to obtain serum for lipids and hepatotoxicity enzymes analysis. The aorta, liver, kidney and heart were removed, washed in saline, preserved in 10% neutral formalin (pH 7.0) and transferred after 24 hours to a solution of 70% ethanol for histological analysis. Liver and kidney fragments were frozen and kept at -80 °C until analysis of the catalase and superoxide dismutase enzymatic activity. The soleus and gastrocnemius muscles were also frozen for analysis of the citrate synthase activity. There was no statistical difference between groups for development, lipid profile, AST and ALT, thus treatments are not capable of interfering in these parameters. The ALP was significantly higher in trained groups, that can be indicative of bone metabolism change. The lumen stenosis of the aortic root was lower in G2 compared to G1, demonstrating that nebivolol was able to inhibit the plaque progression. In histopathological analysis, the liver from trained groups and from drug treated groups showed a lower percentage of steatosis, indicating an important role of treatments in preventing hepatic fat accumulation. In the kidney, the treatments showed no changes in the number and glomeruli area. G1 and G4 had a higher percentage of total collagen in the heart than G2 and G3. Regarding collagen type I / III reason, there was no significant difference between groups. The expression of iNOS in the aorta of animals in all groups occurred primarily in the adventitia layer of the artery, suggesting an inflammatory process initiated in this layer. CAT activity in the liver was significantly lower in the trained groups. SOD activity in G3 group was lower compared to the untrained group. There was no significant difference in SOD and CAT enzymatic activity in the kidney. This study suggests that the proposed exercise protocol did not affect positively the atherosclerotic process in this animal model, but nebivolol reduce the area of atherosclerotic lesions and collagen content. iNOS expression occurred in the adventitia layer of the artery from all groups. Moreover, both drug as exercise were able to act positively, reducing fat accumulation in liver and exercise acted reducing SOD and CAT antioxidant activity in this organ in trained groups. / Não foi encontrado o cpf do autor.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014 / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:17:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 331235.pdf: 2235482 bytes, checksum: 6fcfd1f1569030434c4bc82403c13fad (MD5) Previous issue date: 2014 / As plantas Vitex montevidensis, Campomanesia xantocarpa e Allophylus edulis são espécies nativas presentes na região Sul do Brasil. Atualmente sua utilização e conhecimento vem quase que inteiramente da cultura popular, que utiliza a infusão de suas folhas para diminuição dos níveis lipídicos. Sendo assim, este estudo teve como objetivo investigar os efeitos anticolesterêmicos e antiaterogênico dos extratos e frações das plantas em camundongos geneticamente modificados tratados com dieta rica em gordura. Após realização das etapas botânica e fitoquímica, as três plantas foram submetidas a realização de testes farmacológicos onde foi possível observar que os extratos e as frações residual e n-butanol da planta Vitex montevidensis foram capazes de reduzir os níveis de colesterol total, triglicéridos e LDL-C além de diminuir a área da lesão aterosclerótica e o índice aterogênico. Além disso, o tratamento não mostrou nenhum indício de toxicidade aguda, evidenciado pela ausência de sinais clínicos relevantes, bem como ausência de morte em todo o período de observação. Através de análises fitoquímicas foi possível identificar que a planta é rica em glicoflavonóides sendo a vitexina, isovitexina, orientina e isoorientina, flavonóides presentes em grande quantidade na planta, podendo ser responsáveis pelos efeitos farmacologicos encontrados. Estes resultados suportam o potencial terapêutico do extrato da planta Vitex montevidensis para o tratamento de doenças cardiovasculares.<br> / Abstracts: The plants Vitex montevidensis, Campomanesia Xantocarpa and Allophylus edulis species are present in Southern Brazil. Currently their use and knowledge come almost entirely from popular culture, which uses the infusion of its leaves to decrease lipid levels. Therefore, this study aimed to investigate the anticholesteremic and antiatherogenic effects of the plant extract and fractions in genetically modified mice treated with high fat diet. After performing the botanical and phytochemical steps, the three plants were submitted to the pharmacological tests where it was observed that the extracts and fractions of Vitex montevidensis were able to reduce levels of total cholesterol, triglycerides and LDL besides reducing the area of atherosclerotic lesion and the atherogenic index. Moreover, this treatment showed no sign of acute toxicity, as evidenced by the absence of relevant clinical signs as well as the absence of death throughout the observation period. Through the phytochemical analysis was possible to identify that the plant is rich in glicoflavonoids being vitexin, isovitexin, orientin and isoorientin flavonoids present in large quantities in the plant, and these flavonoids may be responsible for the pharmacological effects here found. These results support the therapeutic potential of the extract of the plant Vitex montevidensis for the treatment of cardiovascular diseases.