Highbush blueberry (Vaccinium corymbosum L.) has one of the highest antioxidant capacities and flavonoid concentrations of any fruit or vegetable, and regular consumption of blueberries has been connected to a wide range of health benefits. A diversity of flavonoids (flavonols, anthocyanins, proanthocyanidins) are likely responsible for many of the health benefits, and these compounds also significantly contribute to the organoleptic properties of ripe blueberries. Despite the potential importance of these flavonoids in diet, there has been little investigation into the molecular genetics of blueberry flavonoid biosynthesis. Therefore, I developed a real-time quantitative PCR protocol to monitor expression of flavonoid genes throughout development and ripening. Following evaluation of five reference genes, expression profiling of biosynthetic genes revealed that flavonoid synthesis is tightly controlled at the transcriptional level in a biphasic developmental pattern. These results are discussed in relation to flavonoid metabolite accumulation profiles, which were produced as part of a collaboration. Finally, in conjunction with a second group of collaborating scientists, some promising preliminary evidence is provided suggesting that the hormone abscisic acid might have a role in regulating ripening initiation in blueberry. / Graduate

[Truncated abstract] Wheat is the main crop in Australia and there are stringent quality requirements. Preharvest sprouting induced by rainfall between maturity and harvest lowers grain quality from premium to feed grades and reduces yield. Wheat production has expanded into the southern Western Australian region where preharvest sprouting occurs in ~1 in 4 seasons and development of more preharvest sprouting tolerant genotypes is required. The main mechanism for improving preharvest sprouting tolerance is grain dormancy. There is genetic variation for dormancy based in the embryo and seed coat but dormancy is complex and is influenced by environmental conditions during grain filling and maturation. Screening and selecting for preharvest sprouting tolerance is problematic and the level of tolerance needed for regions which differ in the level of dormancy they impose, requires clarification. The research presented here aims to answer the underlying question for breeders of how much dormancy is required for preharvest sprouting tolerance in contrasting target environments of the central and coastal wheat belt regions of Western Australia. In the central and coastal wheat belt regions, field trials with modified environments were used to determine the environmental influence on dormancy. Water supply (without directly wetting the grain) and air temperature were modified during grain development in a range of genotypes with different mechanisms of dormancy to determine the influence of environment on dormancy. ... Genotypes with embryo dormancy were consistently the most preharvest sprouting tolerant, even though this dormancy was influenced by the environmental conditions in the different seasons. Pyramiding the embryo component with the specific seed coat component and/or awnless head trait removed some of the environmental variation in preharvest sprouting tolerance, but this was generally considered excessive to the environmental requirements. The methods developed here, of field imposed stresses may provide a valuable tool to further understand the influence of environment on the regulation of dormancy, as different phenotypes can be made with the same genotype. Moisture stress, sudden changes in water supply or high temperatures during the late dough stages influenced dormancy phenotype and should be considered and avoided if possible when selecting locations and running trials for screening for genetic differences in preharvest sprouting tolerance. In the Western Australian context, the embryo component of dormancy appeared to be sufficient and should be adopted as the most important trait for breeding for preharvest sprouting tolerance.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O Ãcido abscÃsico (ABA) à um fitohormÃnio que desempenha papÃis crÃticos na regulaÃÃo das respostas das plantas ao crescimento e desenvolvimento. O vacÃolo de plantas superiores à uma organela que ocupa a maior parte da cÃlula. A condiÃÃo de acidez à mantida por duas bombas de prÃtons distintas, V-ATPase e V-PPase. Sabe-se que estas bombas de prÃtons desempenham um papel essencial nas respostas das plantas Ãs mudanÃas ambientais. O gradiente eletroquÃmico promovido por essas enzimas à a forÃa motriz para o acÃmulo de Ãons e outros solutos no vacÃolo, sendo importante para manter a homeostase citosÃlica de Ãons e o metabolismo celular. As enzimas antioxidantes constituem um sistema de defesa contra as espÃcies reativas de oxigÃnio, que podem provocar danos ao desenvolvimento das plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o efeito do Ãcido abscÃsico nos parÃmetros de crescimento e fisiolÃgicos, bem como o efeito na atividade hidrolÃtica e na expressÃo de transcritos das bombas de prÃtons vacuolares e na atividade de enzimas antioxidantes de plantas de Vigna unguiculata. As sementes de V. unguiculata foram germinadas em areia, onde cresceram por 15 dias, com aplicaÃÃo de soluÃÃo nutritiva de Hoagland na ausÃncia (controle) ou presenÃa de ABA 0,1 ÂM no terceiro, no sÃtimo e no dÃcimo dias apÃs a germinaÃÃo. Os efeitos do Ãcido abscÃsico (ABA) sobre o crescimento, a condutÃncia estomÃtica, a transpiraÃÃo, a fotossÃntese, a concentraÃÃo interna de CO2, a atividade e a expressÃo da subunidade A da V-ATPase e da V-PPase e a atividade de enzimas antioxidantes de Vigna unguiculata foram analisados. ABA aumentou o crescimento das plantas, mas nÃo afetou os parÃmetros fisiolÃgicos; induziu um aumento na atividade hidrolÃtica da V-ATPase em folhas e da V- PPase em raÃzes; aumentou os transcritos de VuVHA-A e de VuVHP em folhas e diminuiu os transcritos de VuVHA-A em raÃzes e, por fim, causou aumento na atividade da catalase de folhas e de raÃzes. Esses resultados sugerem que o Ãcido abscÃsico regula a atividade e a expressÃo dos genes das bombas de prÃtons vacuolares, bem como as atividades de enzimas antioxidantes, sendo portanto importantes efetores que regulam o desenvolvimento de plantas de V. unguiculata. / Abscisic acid (ABA) is a phytohormone that plays critical roles in regulating plant responses to growth and development. The vacuole of higher plants is an organelle that occupies a larger part of the cell. The acidic condition is maintained by two distinct proton pumps, VATPase and V-PPase. It is known these proton pumps play essential roles in plant responses to environmental changes. The electrochemical gradient promoted by these enzymes is the driving force for the accumulation of ions and other solutes in the vacuole, being important to maintain cytosolic ion homeostasis and cellular metabolism. Antioxidant enzymes constitute a defense system against reactive oxygen species, which can cause damage to plant development. The aim of this study was to study the effect of the abscisic acid in the growth and physiological parameters, as well as the effect on vacuolar proton pumps and antioxidant enzymes (SOD, CAT and APX) from Vigna unguiculata cv. Pitiuba. The seeds of V. unguiculata were germinated in sand and grown for 15 days, with application of Hoagland solution in the absence (control) or presence of 0.1 ÂM ABA in the third, seventh and tenth days after germination.The effects of the abscisic acid (ABA) on the growth, stomatal conductance, transpiration, photosynthesis, internal CO2 concentration, V-ATPase subunit A and V-PPase activities and expression and antioxidant enzymes activities of Vigna unguiculata were analyzed. ABA increased the plants growth but did not affect the physiological parameters; induced an increase on V-ATPase hidrolytyc activity in leaves and on V-PPase in roots; ABA increased the transcripts of VuVHA-A and VuVHP in leaves and decreased the VuVHA-A transcripts in roots; caused increase in the leaves and roots catalase activity. These results suggest that the abscisic acid regulate the activity and the genes expression of the vacuolar proton pumps, as well as the antioxidant enzymes activity, being thus important effectors that regulate the development of V. unguiculata plants.

Como organismos multicelulares complexos, as plantas requerem um extraordinário nível de coordenação entre as células para que se desenvolvam ordenadamente. Para a coordenação dessas atividades, as células devem freqüentemente ser aptas a se comunicar umas com as outras a certas distâncias. Os principais meios de comunicação intercelular são os hormônios e mensageiros químicos que carreiam as informações entre as células e assim coordenam seu crescimento e desenvolvimento. O ácido abscísico (ABA) é o hormônio envolvido nos processos fisiológicos quando as plantas são expostas a alguns tipos de estresse, como deficiência hídrica. Relativamente grandes quantidades de ABA são rapidamente sintetizadas em folhas em resposta ao estresse hídrico, onde o principal papel parece ser a regulação da abertura e fechamento estomático. No início do estresse hídrico, o ABA carreado pelo fluxo xilemático é sintetizado nas raízes que estão em contato direto com o solo seco. Devido a esse transporte poder ocorrer antes que o baixo potencial de água no solo cause qualquer mudança mensurável no estado hídrico das folhas, acredita-se que o ABA seja um sinal das raízes que ajuda a reduzir a taxa de transpiração nas folhas pelo fechamento estomático. O principal objetivo do trabalho foi determinar se o ABA sintetizado nas raízes de Lycopersicon esculentum é crucial na regulação do comportamento estomático ou se o ABA produzido pelas folhas poderia agir como sinal hormonal que permitisse a sobrevivência da planta em condições de deficiência hídrica. De forma similar, Lycopersicon pennellii, uma espécie tolerante ao estresse hídrico, foi estudada com o objetivo de determinar a possível função dos sinais químicos das raízes ou de outro mecanismo de tolerância a seca. Para tanto, plantas com 30 dias de idade obtidas de sementes de L. esculentum cv Lukullus, L. pennellii e um mutante chamando notabilis foram enxertadas umas nas outras e crescidas em casa de vegetação. Após dois meses, medidas de condutância estomática, transpiração e potencial da água na folha foram realizadas em três condições de água no solo: bem irrigado, estresse hídrico e reirrigação. Os valores de condutância estomática e transpiração mostraram que o comportamento estomático foi determinado pelo genótipo da parte aérea das plantas enxertadas. Também verificou-se que a tolerância a seca em L. pennellii não foi determinada exclusivamente por caracteres morfo-anatômicos da parte aérea. / Multicellular plants are complex organisms and their orderly development requires an extraordinary measure of coordination between cells. In order to coordinate their activities, cells must be able to communicate with each other, often at some distance. The principal means of intercellular communication are the hormones, chemical messengers that carry information between cells and thus coordinate their growth and development. Abscisic acid (ABA) is the hormone involved in physiological processes when plants are exposed to some sort of stress: water deficiency, for example. Relatively large amounts of ABA are rapidly synthesized in leaves in response to water stress, where it appears to play a major role in regulating stomatal opening and closure. As water stress begins, some of the ABA carried out by the xylem stream is synthesized in roots that are in direct contact with the drying soil. Because this transport can occur before the low water potential of the soil causes any measurable change in the water status of the leaves, ABA is believed to be a root signal that helps reduce the transpiration rate in the leaves by closing stomata. The main objective of the work was to determine if ABA synthesized in the roots of Lycopersicon esculentum is crucial in regulation stomata behavior or ABA produced by the leaves could act as hormone signal to improve plant survival under water shortage conditions. In a similar way, Lycopersicon pennellii, a water stress tolerant specie, was studied in order to determine the possible role of chemical root signals or any other mechanism. For that, 30 d-old plants obtained from seeds of L. esculentum cv Lukullus, L. pennellii and a mutant named notabilis were grafted to each other and grown in greenhouse conditions. Two months later, measurements of stomatal conductance, transpiration and leaf water potential were carried out. These measurements were done under three soil water conditions: plenty, stress and reirrigation. The values of stomatal conductance and transpiration showed that stomatal behavior was influenced by the genotype of the aerial part of grafted plants. It was also verified that the drought tolerance of L. pennellii was not only determined by morpho-anatomical characteristics of plant shoot.

A aplicação de ar quente em videiras foi primeiramente realizada na fazenda do Sr. Florenzo Lazo, localizada no Chile, onde havia a necessidade de combater os efeitos negativos das freqüentes geadas que resultava em severos danos à lavoura. Por este motivo o Sr. Florenzo inventou uma máquina que aplicava ar quente com baixa umidade e tinha por objetivo dispersar o ar frio proveniente das geadas. Após certo tempo, foi observado pelo produtor que no local onde a máquina havia operado com maior frequência as plantas apresentavam-se com uma coloração mais escura e com sinais de maior vitalidade. Seguindo estas observações, relacionamos estes efeitos a um possível aumento nos fito-hormônios relacionados ao estresse vegetal e à SAR (Systemic Resistence Adquired), como o ácido salicílico (AS), ácido jasmônico (AJ) e ácido abscísico (ABA), além de fazer uma correlação com alguns resultados de pós-colheita importantes para a comercialização, como: Sólidos solúveis, firmeza e coloração. Para isso foi montado um experimento que foi conduzido em duas parcelas, sendo uma com tratamento TPC e outra apenas com o tratamento convencional com distância padronizada em 3,2 metros entre linhas por 2,0 metros entre planta. As amostras eram coletadas diariamente e devidamente acondicionadas. Ao final da safra, as amostras foram transportadas para o laboratório de estresse e neurofisiologia da universidade de São Paulo (LEPSE), onde foram novamente armazenadas em um Ultra-freezer - 86ºC. As analises fisiológicas de pós-colheita foram realizadas no departamento de pós-colheita da universidade de São Paulo onde foram analisados os teores de sólidos solúveis, coloração e firmeza das bagas de uva. As amostras de folhas foram maceradas e uniformizadas no LEPSE e enviadas para o laboratório de ecotoxicologia do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA) onde foram mensurados os teores dos fito-hormônios pelo método de espectrometria de massa. Para ambas as analises foram feitos testes estatísticos utilizando o programa SAS®. Não houve alteração de SS e firmeza entre os dois tratamentos para as características fisiológicas de póscolheita. Entretanto foi notado uma redução na coloração avermelhada para os cachos tratados com TPC seguindo o sistema de colorimetria proposto pelo CIE. Não houve alterações significantes para as variáveis ABA, AJ e AS para o efeito tratamento e para a analise de correlação. Entretanto notou-se significância entre o efeito dias para as variáveis ABA e AJ. Não foi notada significância para o efeito dias para a variável AS. Por se tratar de um estresse rápido, a TPC parece não causar estresse imediato nas plantas, entretanto notou-se indução de estresse ao longo do tempo, possivelmente devido à resposta lenta de ABA que aparentemente está envolvida com RNA e à síntese de proteínas S e R- ABA que são igualmente efetivas. Já para o AJ sugere-se que houve a produção de H2O2 por derivados de oligogalacturonideos, liberados por ação da enzima poligalacturonase, e um segundo mensageiro que ativam genes defensivos (genes tardios). O aumento na biossíntese do ABA e do AJ parece ter suprimido genes envolvidos na biossíntese do AS. / The application of hot air in grapevines was first held on the farm of Mr. Florenzo Lazo, located in Chile, to combat the negative effects of frequent frosts that resulted in severe damage to the crop. For this reason Mr. Florenzo invented a machine that applied hot air with low humidity and aimed to disperse the cold air from the frost. After a while, it was observed by the producer that where the machine had operated more frequently plants showed up with a darker and more signs of vitality. Following these observations, these effects relate to a possible increase in phytohormones related to plant stress and SAR (Systemic Resistance Adquired), such as salicylic acid (AS), jasmonic acid (AJ) and abscisic acid (ABA), besides making a correlation with results of some important postharvest for marketing, such as soluble solids, firmness and color. For this experiment was created that was conducted in two installments, the first one was treated with TPC and second one was applied only conventional treatment with standardized distance of 3.2 meters between lines by 2.0 meters between plant . The samples were collected daily and properly packed. At the end of the season, samples were transported to the laboratory stress and neurophysiology from the University of São Paulo (LEPSE), where they were again stored in an Ultra-freezer - 86 degrees. The physiological analyses of post-harvest were performed at the Department of Postharvest in University of Sao Paulo where we analyzed the levels of soluble solids, firmness and color in grape berries. The leaf samples were uniform macerated at LEPSE and sent to the laboratory of ecotoxicology in the Center for Nuclear Energy in Agriculture (CENA) where we measured the levels of the phytohormones by the method of mass spectrometry. For both analyzes were performed statistical tests using SAS ® program. There wasn`t change between the two treatments on physiological post-harvest characteristics. There was no change of SS and firmly between the two treatments for the physiological of post-harvest characteristics. However it was noted a reduction in red color for bunches treated with TPC following the colorimetry system by CIE. There were no significant changes to the variables ABA, AJ and AS for the treatment effect and to analyze the correlation. However significance was noted between the effect variables ABA days and AJ. No significant effect was noted for days variable for AS. Since it is a stress fast TPC does not seem to cause immediate stress in plants but it was noticed induction of stress over time, possibly due to slow response to ABA which apparently is involved in the synthesis of RNA and proteins S and R-ABA that are equally effective. As for AJ suggests that there was the production of H2O2 by derivatives of oligogalacturonides, released by action of the enzyme polygalacturonase, and a second messenger that activates defensive genes (late genes). The increase in ABA biosynthesis and AJ appears to have deleted genes involved in the biosynthesis of AS.

Este estudo avaliou os efeitos de extratos de culturas líquidas de Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) cultivada sob condições de estresse osmótico e na presença de inibidores da rota não-mevalonato (MEP/DOXP) de síntese de pigmentos isoprenóides, na germinação de sementes de alface. Também avaliou a relação entre o efeito tóxico dos extratos e a produção de pigmentos pela bactéria. Os extratos foram obtidos do sobrenadante de culturas de Lxx usando acetato de etila como solvente. Ensaios com sementes de alface embebidas nos extratos indicaram uma ação inibitória na germinação das sementes e no alongamento das radículas quando a bactéria foi cultivada na presença de 7% de PEG 6000 ou 100 mM de NaCl. O extrato foi submetido a vários tratamentos térmicos (temperatura ambiente; 30, 60 e 90oC em banho-maria e 121oC por autoclavagem) e sua ação inibitória em sementes mostrou-se termoestável. A presença de pigmentos isoprenóides de células cultivadas com PEG ou NaCl e de células incubadas sem estes agentes estressantes foi avaliada por espectrofotometria após extração dos pigmentos com metanol. Em células cultivadas na ausência de estresse, notou-se um pico de absorbância bem definido no comprimento de onda de 400 nm, ao passo que este pico foi sensivelmente reduzido em células cultivadas sob estresse. Esse efeito foi mais pronunciado na presença de PEG. Para confirmar a natureza isoprenóide do composto, Lxx foi cultivada na presença de fosmidomicina ou difenilamina, que são inibidores da rota metabólica não-mevalonato destes compostos em Microbacteriaceae. Ambas as substâncias reduziram o pico de absorbância no espectro em relação a células cultivadas sem adição destes antibióticos, confirmando a natureza do composto e sua via de síntese. No entanto, a redução foi mais acentuada no caso da fosmidomicina. Por fim, a fosmidomicina foi utilizada com a finalidade de verificar seu efeito na toxidez dos extratos. Foi observado que o efeito tóxico do extrato foi reduzido quando Lxx foi cultivada na presença do inibidor. Ao se avaliar o conteúdo das células, notou-se também redução expressiva no conteúdo relativo de compostos isoprenóides, como esperado. Os resultados indicaram que a bactéria secreta um produto cuja ação é similar à do ABA e que há uma correlação entre a produção do mesmo e a síntese de pigmentos isoprenóides. Em conjunto, o estudo dá suporte à hipótese levantada anteriormente por Monteiro- Vitorello et al. (2004) com base em análise in silico do genoma de Lxx, segundo a qual a bactéria estaria apta a secretar um composto análogo ao ácido abscísico (ABA). / This study evaluated the effects of extracts of liquid cultures of Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) grown under osmotic stress and in the presence of inhibitors of the non-mevalonate pathway (MEP/DOXP) of synthesis of isoprenoid pigments on the germination of lettuce seeds. The relationship between the extracts toxic effect and the production of pigments was evaluated as well. The extracts were obtained from the supernatant of Lxx cultures using ethyl acetate as a solvent. Essays with lettuce seeds soaked in the extracts indicated an inhibitory action on germination and on the elongation of the radicles when the bacterium was cultivated in the presence of 7% PEG 6000 or 100 mM NaCl. The extract was submitted to different thermal treatments (room temperature; 30, 60 and 90oC water bath and 121oC autoclaving) and its inhibitory action was shown to be thermostable. The presence of isoprenoid pigments in cells cultivated with PEG, NaCl or in the absence of these stressing agents was evaluated by spectrophotometry after extracting the pigments with methanol. In cells incubated in the absence of stress, a well-defined absorbance peak at 400 nm wavelength was noted, whereas this peak was sensibly reduced in cells cultivated under stress. This effect was more pronounced in the presence of PEG. To confirm the isoprenoid nature of the compound, Lxx was incubated in the presence of fosmidomycin and diphenylamine, which are inhibitors of the nonmevalonate metabolic pathway of these compounds in Microbacteriaceae. Both substances reduced the absorbance peak in the spectrum compared to cells cultivated in the absence of these antibiotics, confirming the nature of the compound and its synthesis pathway. Moreover, the peak reduction was more accentuated in the presence of fosmidomycin. Lastly, fosmidomycin was used to evaluate its effect on the toxicity of the extracts. It was observed that the toxic effect of the extract was reduced when Lxx was cultivated in the presence of this inhibitor. When the cell content was evaluated, an expressive reduction on the relative content of carotenoid compounds has also been noticed, as expected. The results indicated that the bacterium secretes a compound whose action is similar to ABA and that there is a correlation between the production of this compound and the synthesis of isoprenoid pigments. The results support the hypothesis proposed earlier by Monteiro-Vitorello et al. (2004) based upon an in silico analysis of the genome of Lxx, according to which the bacterium would be able to secrete a compound analogous to abscisic acid (ABA)

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duarte_GustavoTurqueto_D.pdf: 11219627 bytes, checksum: b885f7a08525b694c5783c91f122c6c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: As plantas, sendo organismos sésseis, desenvolveram um conjunto de mecanismos que possibilitam a adaptação a condições ambientais adversas visando à manutenção da homeostase energética para o desenvolvimento e propagação. Tais respostas valem-se da integração entre a biossíntese de hormônios, ativação de vias gênicas de resposta a estresse e um balanço adequado do uso da energia disponível. Os açúcares, além de serem fontes de carbono e energia, também atuam como moléculas sinalizadoras podendo agir conjuntamente com sinais hormonais na adaptação a estresses bióticos e abióticos e no controle do desenvolvimento. Nesse contexto, diversos estudos apontam para uma importante relação entre o ácido abscísico (ABA), um dos principais hormônios relacionados à resposta a estresses, e a glicose. A sinalização por ABA, além de atuar sobre a regulação da transcrição, é conhecida por envolver fatores de controle de estabilidade do RNAm. Contudo, a participação destes mecanismos em respostas mediadas por glicose ainda é pouco explorada. Num primeiro momento, o presente trabalho visou avaliar o potencial das participações de regulações pós-transcricionais em resposta a ABA e glicose em Arabidopsis thaliana, através da determinação do perfil de expressão de RNAm após a inibição da transcrição. Um modelo experimental com condições de inibição de transcrição otimizadas foi estabelecido e utilizado para análise de transcriptoma por microarranjos CATMA em resposta à glicose e ABA. Um total de 962 genes foi identificado como diferencialmente expresso após os tratamentos, sugerindo uma possível regulação pós-transcricional por glicose sobre 204 transcritos, por ABA sobre 245 e pela combinação dos dois sinais sobre 513 transcritos. Esses genes foram classificados de acordo com o Gene Ontology, sugerindo uma relação importante com respostas adaptativas a condições de estresse. Aparentemente, as respostas mediadas por glicose e ABA seguem estratégias opostas, sendo que as respostas pós-transcricionais por ABA podem também atuar como um mecanismo rápido de retro-regulação negativa sobre a via central de sinalização desse hormônio, uma forma de dessensibilizar e reiniciar as respostas da via. Na segunda parte deste trabalho, levando em consideração as evidências do envolvimento do controle de estabilidade de RNAm na sinalização por glicose, foi avaliada a participação da via de regulação por microRNAs (miRNAs) em respostas mediadas por esses sinal durante os estágios iniciais de desenvolvimento da planta. Os mutantes ago1-25 e hyl1-2, deficientes em atividade e biossíntese de miRNAs, respectivamente, apresentaram hipossensibilidade à glicosedurante um determinado período do desenvolvimento da planta, entre a germinação e o estabelecimento. Tal resultado levanta a possibilidade de que a via dos miRNAs participa do atraso do desenvolvimento mediado por glicose. Visando compreender quais miRNAs poderiam estar envolvidos, análise de expressão em larga escala por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) de 200 precursores de miRNAs (pri-miRs) em resposta a glicose foi conduzida, apontando para uma potencial regulação sobre 38 deles, vários dos quais já são conhecidos por participarem direta ou indiretamente do controle de desenvolvimento da planta. Aparentemente, a deficiência na maquinaria de miRNAs leva a um desbalanço nas regulações de genes responsivos à glicose durante os primeiros estágios de desenvolvimento / Abstract: Plants, as sessile organisms, have developed a set of mechanisms that allow efficient adaptation to adverse environmental conditions. These processes rely on the integration of hormone biosynthesis, activation of stress-responsive pathways and on a balanced use of the available energy. Sugars, besides their role as carbon and energy sources, may also function as signaling molecules that may act together with hormonal signals to trigger adaptive responses to biotic and abiotic stresses. In this context, several studies have indicated an important relation between abscisic acid (ABA), one of the major hormones related to abiotic stresses responses, and glucose. ABA signaling, besides its function over transcription control, is known to involve factors regulating the stability of mRNAs. However, the importance of glucose-mediated mRNA decay control is essentially unknown. Our work intended to evaluate the potential of the participation of post-transcriptional regulations in response to ABA and glucose in Arabidopsis thaliana, by determining mRNA profile alteration in response to these signals after transcription inhibition. An experimental model which optimizes the conditions for transcription inhibition was established and used for transcriptome profiling with CATMA microarrays. A total of 962 genes were found to be differentially expressed after the treatments, suggesting a possible post-transcriptional control acting upon 204, 245 and 513 transcripts in response to glucose, ABA and the combination glucose + ABA, respectively. The genes were classified by their functions according to Gene Ontology, suggesting a close relation with adaptive response to stress conditions. Apparently, ABA- and glucose-mediated control of mRNA stability follows two opposite strategies, while ABA post-transcriptional responses may also act as a fast negative feedback mechanism over its own core signaling pathway, as a way to desensitize and reset the pathway responses. The second part of this work focused on the participation of microRNAs (miRNAs) pathway in responses mediated by glucose during plant early developmental stages. The mutants ago1-25 and hyl1-2, which are deficient in miRNA activity and biogenesis, respectively, showed hyposensitivity to glucose during a narrow time window of early plant development, between germination and seedling establishment. Such result raises the possibility that miRNA pathway may be involved in the glucose-mediated delay of early seedling development. To obtain further evidences about which miRNAs could be involved, the expression profile of 200 pri-miRs was evaluated by large-scale quantitative real-timepolymerase chain reaction (qRT-PCR) profiling, indicating that 38 pri-miRNA are potentially regulated by glucose, several of which are known to participate directly or indirectly in plant development. The data indicate that deficiency in miRNA machinery leads to an imbalance on glucose control over gene expression during early seedling development / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

[ES] La ubiquitinación inducida por hormonas desempeña un papel crucial en la vida media de los reguladores negativos clave de la propia señalización hormonal. En la señalización por ABA, los reguladores negativos clave son las PP2Cs del clado A, como PP2CA o ABI1, y su degradación es un mecanismo complementario a la inhibición de su actividad mediada por PYR/PYL/RCAR. El ABA promueve la degradación de ABI1 a través de las E3 ligasas PUB12/13, y PP2CA a través de las E3 ligasas RGLG1/5. Sin embargo, se predice que otras E3 ligasas no identificadas también regularán la vida media de las PP2Cs del clado A. En pasos posteriores de la señalización por ABA, el ABA también induce la regulación positiva de los niveles de transcrito y proteína de las PP2Cs como un mecanismo de retroalimentación negativa. Por lo tanto, restablecer la señalización de ABA también requiere la degradación de las PP2Cs para evitar su acumulación excesiva inducida por el propio ABA. En este trabajo identificamos las proteínas BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadores del sustrato de las E3 ligasas multiméricas CULLIN3-RING E3 (CRL3), como proteínas que interactúan con las PP2Cs. BPM3 y BPM5 interactúan en el núcleo con PP2CA, así como con ABI1, ABI2 y HAB1. Además, BPM3 y BPM5 aceleran la degradación de las PP2Cs de una manera dependiente del ABA y su sobreexpresión conduce a una mayor sensibilidad al ABA. Además, las plantas mutantes bpm3 bpm5 mostraron una mayor acumulación de PP2CA, ABI1 y HAB1, lo que conduce a una sensibilidad global disminuida al ABA. Finalmente, utilizando ensayos bioquímicos y genéticos, demostramos que las BPM aumentaban la ubiquitinación de PP2CA. Dado que la formación de los complejos ternarios receptor-ABA-fosfatasa se ve notablemente afectada por la abundancia de sus componentes proteicos y la concentración de ABA, revelamos que las BPM y las E3 ligasas multiméricas CRL3 son moduladores importantes de los niveles del correceptor PP2C para regular la señalización temprana de ABA, así como durante los consiguientes pasos de restablecimiento. Al contrario que con PUB12/13, no se sabe cómo el ABA aumenta la degradación de PP2CA a través de RGLG1/5. En el caso de RGLG1, esta proteína se encuentra predominantemente en la membrana plasmática, mientras que PP2CA se encuentra predominantemente en el núcleo. Nosotros demostramos que el ABA modifica la localización subcelular de RGLG1, promoviendo la interacción nuclear con PP2CA. En primer lugar, encontramos que RGLG1 está miristoilado in vivo, lo que facilita su unión a la membrana plasmática, sin embargo, el ABA inhibe esta miristoilación. El ABA también regula negativamente a N-myristoyltransferase 1, la enzima activa y central en la miristoilación de proteínas, esto puede ayudar a promover la translocación de RGLG1 al núcleo. Allí, RGLG1 puede interactuar con ciertos receptores monoméricos del ABA, como PYL8. El reclutamiento nuclear de la E3 ligasa también fue promovido por el aumento de los niveles de proteína PP2CA y por la formación de complejos RGLG1-PYL8-PP2CA en presencia de ABA. Además, nosotros encontramos que RGLG1Gly2Ala, mutada en el sitio de miristoilación N-terminal, muestra localización nuclear constitutiva y provoca una respuesta más sensible al ABA y al estrés salino y osmótico. En resumen, proporcionamos evidencia de que una ligasa E3 puede reubicarse dinámicamente en respuesta al ABA, el estrés salino y osmótico, y el aumento de los niveles de su sustrato, lo que revela un mecanismo para explicar cómo el ABA mejora la interacción RGLG1-PP2CA y, por lo tanto, la degradación de PP2CA. / [CAT] L' ubiquitinació induïda per hormones té un paper crucial en la vida mitjana dels reguladors negatius clau de la pròpia senyalització hormonal. En la senyalització per ABA, els reguladors negatius clau són les PP2Cs del clado A, com PP2CA o ABI1, i la seva degradació és un mecanisme complementari a la inhibició de la seva activitat mediada per PYR/PYL/RCAR. El ABA promou la degradació de ABI1 a través de les E3 lligases PUB12/13, i PP2CA per mitja de les E3 lligases RGLG1/5. No obstant això, es prediu que altres E3 lligases no identificades també regularan la vida mitjana de les PP2Cs del clado A. En passos posteriors de la senyalització per ABA, l'ABA també indueix la regulació positiva de nivells de transcrit i proteïna de les PP2Cs com un mecanisme de retroalimentació negativa. Per tant, restablir la senyalització d'ABA també requereix la degradació de les PP2Cs per evitar la seva acumulació excessiva induïda pel propi ABA. En aquest treball identifiquem les proteïnes BTB/POZ AND MATH DOMAIN (BPM), adaptadors del substrat de les E3 lligases multimèriques CULLIN3-RING E3 (CRL3), com proteïnes que interactuen amb les PP2Cs. BPM3 i BPM5 interactuen en el nucli amb PP2CA, així com amb ABI1, ABI2 i HAB1. A més, BPM3 i BPM5 acceleren la degradació de les PP2Cs d'una manera dependent del ABA i la seva sobreexpressió porta a una major sensibilitat al ABA. A més, les plantes mutants bpm3 bpm5 van mostrar una major acumulació de PP2CA, ABI1 i HAB1, el que porta a una sensibilitat global disminuïda a ABA. Finalment, utilitzant assajos bioquímics i genètics, aconseguint que les BPM augmentaven l' ubiquitinació de PP2CA. Atès que la formació dels complexos ternaris receptor-ABA-fosfatasa es veu notablement afectada per l'abundància dels seus components proteics i la concentració d'ABA, revelem que les BPM i les E3 lligases multimèriques CRL3 són moduladors importants dels nivells del coreceptor PP2C per regular la senyalització primerenca de ABA, així com durant els consegüents passos de restabliment. Al contrari que amb PUB12/13, no se sap com el ABA augmenta la degradació de PP2CA a través d'RGLG1/5. En el cas de RGLG1, aquesta proteïna es troba predominantment en la membrana plasmàtica, mentre que PP2CA es troba predominantment en el nucli. Nosaltres vam demostrar que l'ABA modifica la localització subcelular de RGLG1, promovent la interacció nuclear amb PP2CA. En primer lloc, trobem que RGLG1 està miristoilado in vivo, el que facilita la seva unió a la membrana plasmàtica, però, el ABA inhibeix aquesta miristoilación. El ABA també regula negativament N-myristoyltransferase 1, l' enzim actiu i central en la miristoilación de proteïnes, això pot ajudar a promoure la translocació de RGLG1 al nucli. Allà, RGLG1 pot interactuar amb certs receptors monomèrics de l'ABA, com PYL8. El reclutament nuclear de l'E3 lligasa també va ser promogut per l'augment dels nivells de proteïna PP2CA i per la formació de complexos RGLG1-PYL8-PP2CA en presència d'ABA. A més, nosaltres trobem que RGLG1Gly2Ala, mutada en el lloc de miristoilació N-terminal, mostra localització nuclear constitutiva i provoca una resposta més sensible al ABA i l'estrès salí i osmòtic. En resum, proporcionem evidència que una ligasa E3 pot reubicar dinàmicament en resposta al ABA, l'estrès salí i osmòtic, i l'augment dels nivells de la seva substrat, el que revela un mecanisme per explicar com el ABA millora la interacció RGLG1-PP2CA i, per tant, la degradació de PP2CA. / [EN] Hormone-induced ubiquitination plays a crucial role to determine the half-life of key negative regulators of hormone signaling. In case of ABA signaling, the key negative regulators are the clade-A PP2Cs, such as PP2CA or ABI1, and their degradation is a complementary mechanism to PYR/PYL/RCAR-mediated inhibition of their activity. ABA promotes the degradation of ABI1 through the PUB12/13 E3 ligases, and PP2CA through the RGLG1/5 E3 ligases. However, other unidentified E3 ligases are predicted to regulate clade A PP2Cs half-life as well. At later steps of ABA signaling, ABA also induces upregulation of PP2C transcripts and protein levels as a negative feedback mechanism. Therefore, resetting of ABA signaling also requires PP2C degradation to avoid excessive ABA-induced accumulation of PP2Cs. In this work we identified BTB/POZ AND MATH DOMAIN proteins (BPMs), substrate adaptors of the multimeric CULLIN3-RING E3 ligases (CRL3s), as PP2C-interacting proteins. BPM3 and BPM5 interact in the nucleus with PP2CA as well as with ABI1, ABI2 and HAB1. Additionally, BPM3 and BPM5 accelerate the turnover of PP2Cs in an ABA-dependent manner and their overexpression leads to enhanced ABA sensitivity. Moreover, bpm3 bpm5 mutant plants showed increased accumulation of PP2CA, ABI1 and HAB1, which leads to global diminished ABA sensitivity. Finally, using biochemical and genetic assays we demonstrated that BPMs enhance the ubiquitination of PP2CA. Given the formation of receptor-ABA-phosphatase ternary complexes is markedly affected by the abundance of protein components and ABA concentration, we reveal that BPMs and multimeric CRL3 E3 ligases are important modulators of PP2C co-receptor levels to regulate early ABA signaling as well as the subsequent resetting steps. In contrast to PUB12/13, it was not known how ABA enhances the degradation of PP2CA by RGLG1/5. RGLG1 is predominantly found in the plasma membrane whereas PP2CA is predominant in the nucleus. We demonstrate that ABA modifies the subcellular localization of RGLG1, promoting nuclear interaction with PP2CA. Firstly, we found that RGLG1 is myristoylated in vivo, which facilitates its attachment to the plasma membrane, nevertheless, ABA inhibits its myristoylation. ABA also downregulates N-myristoyltransferase 1, the central active enzyme of protein myristoylation, which may help to promote RGLG1 translocation to the nucleus. There, RGLG1 can interact with certain monomeric ABA receptors, as PYL8. Enhanced nuclear recruitment of the E3 ligase was also promoted by increasing PP2CA protein levels and the formation of RGLG1-PYL8-PP2CA complexes in the presence of ABA. Additionally, we found that RGLG1Gly2Ala protein, mutated at the N-terminal myristoylation site, shows constitutive nuclear localization and causes an enhanced response to ABA and salt and osmotic stresses. In summary, we provided evidence that an E3 ligase can dynamically relocalize in response to ABA, salt and osmotic stress, and increased levels of its target, which reveals a mechanism to explain how ABA enhances RGLG1-PP2CA interaction and hence PP2CA degradation. / Julián Valenzuela, J. (2020). Regulation of ABA signaling through degradation of clade A PP2Cs by the RGLG1 and CRL3 BPM E3 ligases [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137777 / TESIS

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