Orientador: José Joaquim Titton Ranzani / Co-orientador: Adriana Camargo Ferrasi / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Rejane Maria Tommasini Grotto / Resumo: Introdução: A E-caderina é uma proteína transmembranosa, codificada pelo gene CDH1, que desempenha um papel importante na adesão intercelular de tecidos epiteliais. A perda da função ou expressão diminuída de E-caderina pode implicar em metástases e progressão do câncer. Nas neoplasias mamárias, metástases pulmonares ocorrem com maior frequência, porém as metástases oculares, especialmente na coroide, são relativamente comuns, mas pouco diagnosticadas clinicamente. Metodologia: Vinte e oito cadelas de diferentes raças, não-castradas, com idade superior a 5 anos, com diagnóstico de carcinoma mamário ao exame citopatológico, sem metástases pulmonares e/ou oculares, foram submetidas à mastectomia radical e ovariosalpingohisterectomia (OSH), sendo reavaliadas após três e seis meses de pós-operatório. O padrão de expressão relativa do gene CDH1 em tecidos tumorais e normais, foi avaliado pelo sistema TaqMan Universal PCR Master Mix; o padrão de metilação foi realizado utilizando-se a técnica de MSP-PCR; o sequenciamento do DNA, análise das mutações e polimorfismos foram realizados a partir do sangue periférico, utilizando-se a técnica de reação de terminação em cadeia pelo kit BigDye Terminator v.3 Cycle Sequencing. Análises imunohistoquímicas foram realizadas para avaliar a expressão da E-caderina. Resultados: Nenhuma das 28 cadelas estudadas apresentou metástase ocular ou pulmonar com três ou seis meses de pós-operatório. Em 57,1% dos casos uma menor expressão relativa do gene CDH1 foi identificada. Em 100% dos casos verificou-se o status metilado para o gene CDH1, reafirmando a hipótese de que células não-tumorais podem contribuir para estes resultados. Em 46,5% dos casos identificou-se expressão reduzida de E-caderina pela técnica de imunohistoquímica. Foram identificados 3 histotipos tumorais: carcinoma complexo, tubulopapilífero e carcinoma em tumor misto. Em 100% dos casos de carcinoma... / Abstract: Introduction: E-cadherin is a transmembrane protein, encoded by CDH1 gene, that has an important role in intercellular adhesion of epithelial tissues. Loss of function or decreased expression of E-cadherin may lead to cancer progression and metastasis. In mammary epithelial neoplasms, lung metastases occur more frequently, but the ocular metastasis, especially in the choroid, are relatively common but underdiagnosed clinically. Methods: Twenty-eight dogs of different breeds, non-castrated, older than five years, diagnosed with breast cancer by cytopathological examination, without pulmonary and/or ocular metastasis, have undergone to radical mastectomy and ovariosalpingohisterectomy (OSH), and re-evaluated after three and six months postoperatively. The pattern of relative expression of CDH1 gene in normal and tumor tissues was assessed by TaqMan Universal PCR Master Mix system; the pattern of methylation was performed using MSP-PCR; DNA sequencing analysis of mutations and polymorphisms were performed from peripheral blood using the termination chain reaction technique with BigDye Terminator v.3 Cycle Sequencing kit. Immunohistochemical analyzes were performed to evaluate the expression of E-cadherin. Results: None of the 28 dogs studied had ocular or pulmonary metastasis with 3 or 6 months postoperatively. In 57,1% of cases a decreased relative expression of CDH1 gene was identified. In 100% of cases there was methylated status for the CDH1 gene, confirming the hypothesis that non-tumor cells can contribute to these results. In 46,5% of the cases reduced E-cadherin expression by immunohistochemistry was identified. Three tumor histotypes were identified: complex carcinoma, tubulopapillary, and carcinoma in mixed tumor. In 100% of cases of tubulopapillary carcinoma was identified a reduced gene expression of CDH1 by both qPCR and by immunohistochemistry. The sequencing of the gene, 6 animals (21,4%) had silent mutations in exons 3, 7 ... / Mestre

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:54:43Z : No. of bitstreams: 1 000858239.pdf: 1069135 bytes, checksum: cd8c808bc197da8ee3c265e8f3ff186a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A E-caderina é uma proteína transmembranosa, codificada pelo gene CDH1, que desempenha um papel importante na adesão intercelular de tecidos epiteliais. A perda da função ou expressão diminuída de E-caderina pode implicar em metástases e progressão do câncer. Nas neoplasias mamárias, metástases pulmonares ocorrem com maior frequência, porém as metástases oculares, especialmente na coroide, são relativamente comuns, mas pouco diagnosticadas clinicamente. Metodologia: Vinte e oito cadelas de diferentes raças, não-castradas, com idade superior a 5 anos, com diagnóstico de carcinoma mamário ao exame citopatológico, sem metástases pulmonares e/ou oculares, foram submetidas à mastectomia radical e ovariosalpingohisterectomia (OSH), sendo reavaliadas após três e seis meses de pós-operatório. O padrão de expressão relativa do gene CDH1 em tecidos tumorais e normais, foi avaliado pelo sistema TaqMan Universal PCR Master Mix; o padrão de metilação foi realizado utilizando-se a técnica de MSP-PCR; o sequenciamento do DNA, análise das mutações e polimorfismos foram realizados a partir do sangue periférico, utilizando-se a técnica de reação de terminação em cadeia pelo kit BigDye Terminator v.3 Cycle Sequencing. Análises imunohistoquímicas foram realizadas para avaliar a expressão da E-caderina. Resultados: Nenhuma das 28 cadelas estudadas apresentou metástase ocular ou pulmonar com três ou seis meses de pós-operatório. Em 57,1% dos casos uma menor expressão relativa do gene CDH1 foi identificada. Em 100% dos casos verificou-se o status metilado para o gene CDH1, reafirmando a hipótese de que células não-tumorais podem contribuir para estes resultados. Em 46,5% dos casos identificou-se expressão reduzida de E-caderina pela técnica de imunohistoquímica. Foram identificados 3 histotipos tumorais: carcinoma complexo, tubulopapilífero e carcinoma em tumor misto. Em 100% dos casos de carcinoma... / Introduction: E-cadherin is a transmembrane protein, encoded by CDH1 gene, that has an important role in intercellular adhesion of epithelial tissues. Loss of function or decreased expression of E-cadherin may lead to cancer progression and metastasis. In mammary epithelial neoplasms, lung metastases occur more frequently, but the ocular metastasis, especially in the choroid, are relatively common but underdiagnosed clinically. Methods: Twenty-eight dogs of different breeds, non-castrated, older than five years, diagnosed with breast cancer by cytopathological examination, without pulmonary and/or ocular metastasis, have undergone to radical mastectomy and ovariosalpingohisterectomy (OSH), and re-evaluated after three and six months postoperatively. The pattern of relative expression of CDH1 gene in normal and tumor tissues was assessed by TaqMan Universal PCR Master Mix system; the pattern of methylation was performed using MSP-PCR; DNA sequencing analysis of mutations and polymorphisms were performed from peripheral blood using the termination chain reaction technique with BigDye Terminator v.3 Cycle Sequencing kit. Immunohistochemical analyzes were performed to evaluate the expression of E-cadherin. Results: None of the 28 dogs studied had ocular or pulmonary metastasis with 3 or 6 months postoperatively. In 57,1% of cases a decreased relative expression of CDH1 gene was identified. In 100% of cases there was methylated status for the CDH1 gene, confirming the hypothesis that non-tumor cells can contribute to these results. In 46,5% of the cases reduced E-cadherin expression by immunohistochemistry was identified. Three tumor histotypes were identified: complex carcinoma, tubulopapillary, and carcinoma in mixed tumor. In 100% of cases of tubulopapillary carcinoma was identified a reduced gene expression of CDH1 by both qPCR and by immunohistochemistry. The sequencing of the gene, 6 animals (21,4%) had silent mutations in exons 3, 7 ...

O fenômeno de segregação celular ocorre tanto na estruturação inicial dos organismos (morfogênese) quanto durante a regeneração de tecidos danificados. O reordenamento celular ocorre através do agrupamento de células de um mesmo tipo. A evolução do tamanho destes agregados é objeto de experimentos e de simulações relatados na literatura há mais de vinte anos. Os resultados encontrados, no entanto, são controversos. Ao simular a segregação celular pode-se obter uma lei de potência ou uma dependência logarítmica para a evolução do tamanho desses agregados. Por outro lado, dentro de certos intervalos, os experimentos podem ser ajustados com leis de potência, mas os expoentes obtidos diferem dos sugeridos nas simulações, deixando obscura a compreensão do problema. Para entender a origem física deste fenômeno estendemos os modelos de simulações baseados em diferença de adesão para incluir as hipóteses: de diferença de velocidades, de reconhecimento celular e de motilidade de grupo. Verificamos que as proporções de células de cada tecido são determinantes na distribuição espacial final do agregado e mapeamos isto em um diagrama. Para estudar a evolução do crescimento de agregados utilizamos dois métodos: a aproximação de agregado médio e a abordagem através da equação de coagulação-fragmentação de Smoluchowski. Em ambas abordagens supomos que as células formam agregados com simetria esférica e que o mecanismo principal responsável pela segregação é a fusão binária de agregados. Usando o primeiro método obtivemos resultados analíticos que mostram os efeitos de tamanho finito tanto das células individuais quanto do tamanho do sistema sobre as leis de evolução temporal. Além disso, a partir do ajuste de dados experimentais, mostramos que os expoentes corretos das leis de potência só podem ser obtidos redefinindo-se a dependência da constante de difusão dos agregados com sua massa. Para levar em conta o efeito da flutuação de tamanho dos agregados, uma equação de Smoluchowski generalizada é proposta. A distribuição de tamanhos de agregados é obtida integrando-se esta equação e, após, esse resultado é comparado com experimentos e simulações. / The celular segregation happens both in the initial organism structuration (morphogenesis) and in tissue regeneration. Cell sorting happens by grouping of cells of the same kind. The size evolution of these cluters has been reported in experiments and simulations in the literature in the last twenty years. The results found are, nevertheless, controversial. When simulating cell segregation one may obtain a power law or a logaritmic dependency for their evolution. On the other hand, within a limited range, the experiments suggest a power law, however the exponents differ from those obtained by simulations, leaving the problem undefined. In order to understand the physical origin of this phenomenon we have extended the simulations models based on differential adhesion to include the hypotheses of diferential velocities, cell recognition and diferential group motilities. We have verified that different cell type proportions determine different final cell spatial distribution and mapped this in a diagram. In order to study the evolution of cluster growth we have used two methods: the mean cluster approach and the Smoluchowski coagulation-fragmetation equation approach. In both cases we suppose that the cells form spherical clusters and that the primary aggregating mechanism is through binary cluster fusion. Using the first method we obtain analytic results showing the effects produced by the finite size of the individual cells and of the finite syze of the system on the evolution laws. Besides, from the experimental data fitting, we have shown that the correct exponent for the power laws is obtained only if we redefine the difusion constant dependency with the cluster mass. In order to consider the cluster size fluctuation effect, a generalized Smoluchowski equation is proposed. The system cluster size distribution is obtained integrating this equation and, then, this result is compared with experiments and simulations.

Submitted by Programa de Pós-Graduação em Odontologia Saúde (mestrodo@ufba.br) on 2017-03-13T12:31:55Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO FINAL MESMO_Lia Porto_UFBA (com fotos)__CORRIGIDA 210914.pdf: 2438506 bytes, checksum: c90bea353f9f17081cb87d9108e4bbeb (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-03-23T13:04:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO FINAL MESMO_Lia Porto_UFBA (com fotos)__CORRIGIDA 210914.pdf: 2438506 bytes, checksum: c90bea353f9f17081cb87d9108e4bbeb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T13:04:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO FINAL MESMO_Lia Porto_UFBA (com fotos)__CORRIGIDA 210914.pdf: 2438506 bytes, checksum: c90bea353f9f17081cb87d9108e4bbeb (MD5) / CAPES / A transição epitelial-mesenquimal (TEM) representa o processo em que as células epiteliais perdem suas características e adquirem propriedades de células mesenquimais típicas. A dissociação das células tumorais devido à alteração na adesão célula-célula representa um dos princípios chave da invasão tumoral e da TEM. O tumor odontogênico queratocístico (TOQ) tem como características principais o seu comportamento clínico agressivo e altas taxas de recorrência. O conhecimento das características moleculares da TEM no TOQ pode fornecer marcadores úteis que auxiliem no prognóstico e na condução terapêutica individualizada desse tumor odontogênico. O presente estudo analisou a imunoexpressão das proteínas E-caderina, N-caderina, Snail, Slug e Vimentina, por estarem envolvidas no processo da TEM, em casos de TOQ em comparação com cistos radiculares (CRs) e folículo dentais (FDs) a fim de fornecer melhores perspectivas na compreensão do comportamento agressivo desses tumores. Foram utilizados 32 casos de TOQ, 15 CRs e 08 FDs para a técnica imunoistoquímica. A análise do perfil de imunoexpressão nos TOQs demonstrou expressão preservada de E-caderina na maioria dos casos, sendo que a N-caderina demonstrou um ganho de expressão em epitélio tumoral em relação ao estroma, o que esteve correlacionado com a expressão positiva de Slug em epitélio, e este por sua vez com a expressão positiva de Snail. No estroma dos TOQs, a N-caderina correlacionou-se positivamente com Slug, e a Vimentina com o Snail no epitélio. Ao comparar os três grupos estudados, a imunoexpressão das proteínas foi influenciada de forma marcante pela inflamação. As expressões aumentadas de N-caderina no epitélio e no estroma, do Slug no epitélio e da Vimentina no estroma estiveram associadas com a localização em mandíbula. A grande maioria dos casos que apresentaram localização posterior (quer isoladamente ou em conjunto com a anterior) apresentou expressão preservada de E-caderina. Estas proteínas provavelmente desempenham papéis diferenciados na mediação da invasividade local em TOQs. Apesar da expressão da E-caderina estar preservada na maioria dos TOQs, há indícios de ocorrência da TEM nesses tumores. A alta intensidade de marcação do Slug nos TOQs sugere que esta proteína é provavelmente o fator de transcrição principal envolvido na indução de TEM nos TOQs. / The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is the process where cells lose their epithelial features and acquire properties of typical mesenchymal cells. The dissociation of tumor cells due to changes in cell-cell adhesion is one of the key principles of tumor invasion and EMT. The keratocyst odontogenic tumor (KOT) has as main features its aggressive clinical behavior and high recurrence rates. Knowledge of the molecular features of EMT in KOT can provide useful markers to aid in the prognosis and individualized therapeutic management of this odontogenic tumor. The present study examined the immunoreactivity of proteins E-cadherin, Ncadherin, Snail, Slug and vimentin, as they are involved in the process of EMT, in cases of KOT compared with radicular cysts (RCs) and dental follicles (DFs) to provide better perspectives in understanding the aggressive behavior of these tumors. Thirty-two cases of KOTs, 15 RCs and 08 DFs were used for immunohistochemistry. The analysis of immunoreactivity profile in KOTs showed preserved expression of E-cadherin in most cases, and N-cadherin showed a gain of expression in tumor epithelium relative to stroma which has been positively correlated with the expression of Slug in epithelium, and this in turn with positive expression of Snail. In the stroma of KOTs, N-cadherin correlated positively with Slug and vimentin, and this with Snail in the epithelium. When comparing the three groups, the immunoreactivity of the proteins was markedly influenced by inflammation. Increased expression of N-cadherin in the epithelium and stroma, Slug in the epithelium and vimentin in the stroma were associated with the location in the jaw. The majority of patients who had tumors in posterior location (either alone or in combination with the anterior) showed preserved expression of E-cadherin. These proteins probably play different roles in mediating local invasiveness in KOTs. Despite the expression of E-cadherin being preserved in most KOTs, there is evidence of the occurrence of EMT in these tumors. The high intensity staining of Slug in KOTs suggests that this protein is probably the main transcription factor involved in induction of MET in KOTs.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-11-27T18:25:19Z No. of bitstreams: 1 Djalma Gomes Ferrão Carvalhal Um ensaio de adesao... 2001.pdf: 31649822 bytes, checksum: cea5fde124b280c0b60a4b69bc0b6cb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-27T18:25:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Djalma Gomes Ferrão Carvalhal Um ensaio de adesao... 2001.pdf: 31649822 bytes, checksum: cea5fde124b280c0b60a4b69bc0b6cb3 (MD5) Previous issue date: 2001 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O objetivo deste trabalho é desenvolver um ensaio de adesão, baseado no ensaio de Stamper- Woodruff, para o estudo das interações entre macrófagos e matriz conjuntiva. Foram induzidos bolsões inflamatórios em camundongos da linhagem BALB/c para obtenção de secções de pele inflamada, e células macrofágicas da linhagem J774G.8 foram utilizadas na padronização do ensaio. Secções de 7 i^m de espessura foram colocadas em lâminas de vidro, fixadas com acetona e bloqueadas com BSA. Foi estabelecida a concentração de 10® células/100 fil como a mais apropriada para a realização do ensaio, através de diluições seriadas. Células J774G.8 sem tratamento prévio ou tratadas com: ácido tetraacético diamino etileno, Mn++, lipopolissacarídeo, forbol miristato acetato, zimosan, os peptídios CS-1 e RGD, os anticorpos anti-CD49d ou contra a cadeia (32 de integrinas, foram adicionadas ás secções e incubadas por 30 minutos á temperatura ambiente. Como resultado, as células macrofágicas aderem preferencialmente ás áreas de inflamação. A adesão das células é dependente de cátions divalentes e pode ser modulada por substâncias que promovam a ativação celular. Além disso, a adesão mediada por integrinas pode ser inibida por peptídios RGD e CS-1 ou com anticorpos contra integrinas da família (31 e (32. A adesão das células macrofágicas é inibida mais intensivamente pela infecção com Leishmania mas não com a infecção por Mycobacterium ou por fagocitose de partículas de látex. Desta forma, o ensaio desenvolvido foi capaz de demonstrar a especificidade da adesão de células macrofágicas pela matriz conjuntiva bem como de sugerir a existência de mecanismos específicos de regulação das interações entre macrófagos e a matriz conjuntiva durante a infecção por Leishmania. / The aim of this work was to develop an adhesion assay, based on the Stamper-Woodruff’s assay to study the interactions between macrophages and the connective matrix. Inflammatory pouches were produced in BALB/c mice to obtain inflammed skin sections, and J774G.8 macrophage cell line was applied to standardize the assay. Sections of 7|im thick were placed onto glass slides, fixed with acetone and blocked with bovine serum albumin. The cell concentration of 10®/100 |xl was proved to be most appropriate for the assay, through serial dilutions. J774G.8 cells, with or without ethylene diamine tetraacetic acid, Mn'"'", Lipopolysaccharide, phorbol myristate acetate, zymosan, CS- 1, RGD peptide, antibodies anti-CD49d or against (32 chain integrin treatment, were added onto the sections and incubated for 30 minutes at room temperature. Macrophage cells adhered preferentially to inflammed areas. The adhesion of cells was dependent on divalent ions and could be modulated by substances that promote cell activation. Moreover, the adhesion mediated by integrin can be inhibited either by RGD or CS-1 peptides or by antibodies against integrins of the |31 or |32 sub-family. Adhesion of macrophage cells was intensively inhibited by infection with Leishmania and was not affected by infection with Mycobacterium or by endocytosis of latex beads. Thus, the developed assay was able to show the specific adhesion of macrophages to connective matrix, as well to illustrate a specific downregulation of macrophage adhesion to inflammed skin in Leishmania infection.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-04-27T17:39:55Z No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Estudo do efeito....pdf: 7893051 bytes, checksum: a043a24c2d08a6c835942fd381ead5a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-04-27T17:40:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Estudo do efeito....pdf: 7893051 bytes, checksum: a043a24c2d08a6c835942fd381ead5a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T17:40:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 José Geraldo Bomfim Lima Estudo do efeito....pdf: 7893051 bytes, checksum: a043a24c2d08a6c835942fd381ead5a4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / INTRODUÇÃO: A influência da autofagia em processos celulares que participam da homeostase celular, como a endocitose e a adesão celular, até o momento, foi pouco estudada. A endocitose consiste na internalização de material extracelular, quando as vesículas endocíticas são menores que 500nm é chamada de endocitose em microescala e quando as vesículas formadas são maiores que essa medida trata-se de endocitose em macroescala. Foi demonstrado que a conexão da via endocítica com a via autofágica é fundamental para a degradação de material citosólico e, subsequente, produção de energia e disponibilização de substrato para o metabolismo celular. Estudos controversos da literatura mostraram que a autofagia pode favorecer ou não interferir com a endocitose em macroescala. Além disso, alguns trabalhos demonstraram que o processo autofágico foi capaz de reduzir a reciclagem de integrinas para a membrana plasmática por alterar a endocitose em microescala envolvida na internalização desse tipo de proteína, reduzindo a capacidade de adesão e, consequentemente, a migração celular. Assim, em conjunto, esses achados evidenciam que a autofagia pode interagir e interferir com eventos celulares dependentes da participação da membrana plasmática como a endocitose e a adesão celular. OBJETIVO: No presente estudo, hipotetizamos que a prévia indução de autofagia em macrófagos é capaz de reduzir a endocitose em micro e macroescala, além de reduzir a capacidade de adesão celular. Desta forma, o objetivo desse estudo foi determinar o efeito da indução de autofagia, in vitro, sobre a endocitose e a adesão de macrófagos murino. MATERIAL E MÉTODOS: Macrófagos foram induzidos à autofagia por privação de nutrientes (starvation) ou pelo tratamento com um indutor farmacológico, a rapamicina, seguida da exposição a macromoléculas ou grandes partículas de diferentes naturezas. Além disso, após indução de autofagia, macrófagos em suspensão foram incubados em superfícies como o vidro ou uma matriz de colágeno e fibronectina para avaliação da capacidade de adesão. Os percentuais de endocitose em microescala, em macroescala e de adesão foram estimados. RESULTADOS: Mostramos que a indução de autofagia promoveu redução da capacidade fagocítica em cerca de 60% no percentual de macrófagos que internalizam grandes partículas, como levedo, sendo um mecanismo precoce e reversível. Ao passo que a indução de autofagia por privação de aminoácidos ou farmacológica não interferiu na endocitose em microescala. A indução de autofagia não alterou a endocitose de transferrina (endocitose mediada por receptores) e endocitose de BSA (endocitose de fase fluida). Em contraste, a indução de autofagia promoveu redução em aproximadamente 70% da quantidade de macrófagos que aderem a matriz de colágeno e fibronectina. Uma possível explicação para a redução da endocitose em macroescala pode estar relacionada à autofagia diminuir a disponibilidade de grandes extensões de membrana necessárias à internalização de partículas maiores que 500nm. Alternativamente, a indução de autofagia pode estar levando a célula a uma indisponibilidade de receptores na membrana plasmática que justificaria a redução da capacidade fagocítica e de adesão do 11 macrófago murino. CONCLUSÕES: A indução de autofagia diminui a capacidade fagocítica e a capacidade de adesão do macrófago murino. / INTRODUCTION: The influence of autophagy on cellular processes that participate in cellular homeostasis, such as endocytosis and cell adhesion has been poorly evaluated. Endocytosis consists in the internalization of extracellular material and includes microscale endocytosis, when endocytic vesicles are smaller than 500nm, and macroscale endocytosis, when the formed vesicles are larger than this measure. It has been shown that the connection between the endocytic and the autophagic pathways is essential for degradation of cytosolic material and, subsequently, power generation and provision of substrate for cellular metabolism. Controversial studies showed that autophagy can improve or do not interfere with macroscale endocytosis. Furthermore, some studies demonstrated that the autophagic process reduced integrin recycling to the plasma membrane through the modulation of microscale endocytosis involved in the internalization of this protein, reducing cell adhesion and migration. Taken together, these findings show that autophagy can interact and interfere with cellular events that depend on plasma membrane participation, such as endocytosis and cell adhesion. OBJECTIVES: In the present study, we hypothesized that prior autophagy induction in macrophage reduces micro and macroscale endocytosis, as well as cell adhesion. Thus, the aim of this study was to determine the effect of autophagy induction, in vitro, on endocytosis and adhesion of murine macrophages. MATERIAL AND METHODS: Autophagy by nutrient deprivation (starvation) or by treatment with an inducer drug, rapamycin, was induced in macrophages, followed by exposure to macromolecules or large particles of different natures. Furthermore, after autophagic induction, macrophages were plated on different surfaces like glass or collagen-fibronectin matrix to evaluate cell adhesiveness. After that, the percentage of endocytosis in micro and macroscale and adhesion were determined. RESULTS: We showed that autophagy induction decreases phagocytic ability to 60% in macrophages that internalized large particles like yeast. This is a reversible mechanism that occurs at early stages after autophagy induction. On the other hand, autophagy by amino acid deprivation or pharmacological induction does not interfere with the microscale endocytosis. The autophagy induction doesn’t alter transferrin endocytosis (receptor-mediated endocytosis) and BSA endocytosis (fluid-phase endocytosis). By contrast, the autophagy induction leads to a reduction of approximately 70% in macrophages adhesion on a collagen-fibronectin matrix. The reduction of macroscale endocytosis may be related to the decreased availability of large areas of membrane required for internalization of particles larger than 500nm caused by autophagy. Alternatively, autophagy induction may be leading to receptors unavailability in plasm membrane, which would explain the reduction of the phagocytic and adhesion ability. CONCLUSIONS: autophagy induction reduces

O fenômeno de segregação celular ocorre tanto na estruturação inicial dos organismos (morfogênese) quanto durante a regeneração de tecidos danificados. O reordenamento celular ocorre através do agrupamento de células de um mesmo tipo. A evolução do tamanho destes agregados é objeto de experimentos e de simulações relatados na literatura há mais de vinte anos. Os resultados encontrados, no entanto, são controversos. Ao simular a segregação celular pode-se obter uma lei de potência ou uma dependência logarítmica para a evolução do tamanho desses agregados. Por outro lado, dentro de certos intervalos, os experimentos podem ser ajustados com leis de potência, mas os expoentes obtidos diferem dos sugeridos nas simulações, deixando obscura a compreensão do problema. Para entender a origem física deste fenômeno estendemos os modelos de simulações baseados em diferença de adesão para incluir as hipóteses: de diferença de velocidades, de reconhecimento celular e de motilidade de grupo. Verificamos que as proporções de células de cada tecido são determinantes na distribuição espacial final do agregado e mapeamos isto em um diagrama. Para estudar a evolução do crescimento de agregados utilizamos dois métodos: a aproximação de agregado médio e a abordagem através da equação de coagulação-fragmentação de Smoluchowski. Em ambas abordagens supomos que as células formam agregados com simetria esférica e que o mecanismo principal responsável pela segregação é a fusão binária de agregados. Usando o primeiro método obtivemos resultados analíticos que mostram os efeitos de tamanho finito tanto das células individuais quanto do tamanho do sistema sobre as leis de evolução temporal. Além disso, a partir do ajuste de dados experimentais, mostramos que os expoentes corretos das leis de potência só podem ser obtidos redefinindo-se a dependência da constante de difusão dos agregados com sua massa. Para levar em conta o efeito da flutuação de tamanho dos agregados, uma equação de Smoluchowski generalizada é proposta. A distribuição de tamanhos de agregados é obtida integrando-se esta equação e, após, esse resultado é comparado com experimentos e simulações. / The celular segregation happens both in the initial organism structuration (morphogenesis) and in tissue regeneration. Cell sorting happens by grouping of cells of the same kind. The size evolution of these cluters has been reported in experiments and simulations in the literature in the last twenty years. The results found are, nevertheless, controversial. When simulating cell segregation one may obtain a power law or a logaritmic dependency for their evolution. On the other hand, within a limited range, the experiments suggest a power law, however the exponents differ from those obtained by simulations, leaving the problem undefined. In order to understand the physical origin of this phenomenon we have extended the simulations models based on differential adhesion to include the hypotheses of diferential velocities, cell recognition and diferential group motilities. We have verified that different cell type proportions determine different final cell spatial distribution and mapped this in a diagram. In order to study the evolution of cluster growth we have used two methods: the mean cluster approach and the Smoluchowski coagulation-fragmetation equation approach. In both cases we suppose that the cells form spherical clusters and that the primary aggregating mechanism is through binary cluster fusion. Using the first method we obtain analytic results showing the effects produced by the finite size of the individual cells and of the finite syze of the system on the evolution laws. Besides, from the experimental data fitting, we have shown that the correct exponent for the power laws is obtained only if we redefine the difusion constant dependency with the cluster mass. In order to consider the cluster size fluctuation effect, a generalized Smoluchowski equation is proposed. The system cluster size distribution is obtained integrating this equation and, then, this result is compared with experiments and simulations.

O fenômeno de segregação celular ocorre tanto na estruturação inicial dos organismos (morfogênese) quanto durante a regeneração de tecidos danificados. O reordenamento celular ocorre através do agrupamento de células de um mesmo tipo. A evolução do tamanho destes agregados é objeto de experimentos e de simulações relatados na literatura há mais de vinte anos. Os resultados encontrados, no entanto, são controversos. Ao simular a segregação celular pode-se obter uma lei de potência ou uma dependência logarítmica para a evolução do tamanho desses agregados. Por outro lado, dentro de certos intervalos, os experimentos podem ser ajustados com leis de potência, mas os expoentes obtidos diferem dos sugeridos nas simulações, deixando obscura a compreensão do problema. Para entender a origem física deste fenômeno estendemos os modelos de simulações baseados em diferença de adesão para incluir as hipóteses: de diferença de velocidades, de reconhecimento celular e de motilidade de grupo. Verificamos que as proporções de células de cada tecido são determinantes na distribuição espacial final do agregado e mapeamos isto em um diagrama. Para estudar a evolução do crescimento de agregados utilizamos dois métodos: a aproximação de agregado médio e a abordagem através da equação de coagulação-fragmentação de Smoluchowski. Em ambas abordagens supomos que as células formam agregados com simetria esférica e que o mecanismo principal responsável pela segregação é a fusão binária de agregados. Usando o primeiro método obtivemos resultados analíticos que mostram os efeitos de tamanho finito tanto das células individuais quanto do tamanho do sistema sobre as leis de evolução temporal. Além disso, a partir do ajuste de dados experimentais, mostramos que os expoentes corretos das leis de potência só podem ser obtidos redefinindo-se a dependência da constante de difusão dos agregados com sua massa. Para levar em conta o efeito da flutuação de tamanho dos agregados, uma equação de Smoluchowski generalizada é proposta. A distribuição de tamanhos de agregados é obtida integrando-se esta equação e, após, esse resultado é comparado com experimentos e simulações. / The celular segregation happens both in the initial organism structuration (morphogenesis) and in tissue regeneration. Cell sorting happens by grouping of cells of the same kind. The size evolution of these cluters has been reported in experiments and simulations in the literature in the last twenty years. The results found are, nevertheless, controversial. When simulating cell segregation one may obtain a power law or a logaritmic dependency for their evolution. On the other hand, within a limited range, the experiments suggest a power law, however the exponents differ from those obtained by simulations, leaving the problem undefined. In order to understand the physical origin of this phenomenon we have extended the simulations models based on differential adhesion to include the hypotheses of diferential velocities, cell recognition and diferential group motilities. We have verified that different cell type proportions determine different final cell spatial distribution and mapped this in a diagram. In order to study the evolution of cluster growth we have used two methods: the mean cluster approach and the Smoluchowski coagulation-fragmetation equation approach. In both cases we suppose that the cells form spherical clusters and that the primary aggregating mechanism is through binary cluster fusion. Using the first method we obtain analytic results showing the effects produced by the finite size of the individual cells and of the finite syze of the system on the evolution laws. Besides, from the experimental data fitting, we have shown that the correct exponent for the power laws is obtained only if we redefine the difusion constant dependency with the cluster mass. In order to consider the cluster size fluctuation effect, a generalized Smoluchowski equation is proposed. The system cluster size distribution is obtained integrating this equation and, then, this result is compared with experiments and simulations.

Orientadores: José Dirceu Ribeiro, Edson Antunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T08:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Grotta_MilenaBaptistella_D.pdf: 2330139 bytes, checksum: 5a69a2a222d3f7028574efcf65a49676 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução: A prevalência da obesidade e da asma tem aumentado muito durante as últimas décadas. Investigações atuais sugerem que a obesidade está associada à asma em numerosos estudos. Os mecanismos pelos quais a obesidade interfere nos sintomas da asma ainda são controversos. Objetivo: avaliar o efeito da obesidade na atividade eosinofílica através da quimiotaxia e adesão em crianças e adolescentes asmáticos e não asmáticos em associação a dosagem das adipocinas séricas. Método: Incluídos 32 asmáticos obesos (AO) e não obesos (ANO), 5 não asmáticos obesos (NAO) e 5 não asmáticos não obesos (NANO). Colhido sangue periférico para isolamento de eosinófilos através do gradiente de Percolll seguido de separação imunomagnética. Para quimiotaxia utilizada câmara de microquimiotaxia com 48 poços em triplicata com MEM (espontânea), eotaxina, PAF (fator de ativação plaquetária) e RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted). Leitura através de filtro com contagem em microscópio óptico. A adesão foi realizada com placas de fibronectina em triplicata com MEM e eotaxina. Leitura através da absorbância das amostras desconhecidas com as da curva padrão de células. Feito dosagem de leptina e adiponectina por ELISA. Resultado: A quimiotaxia espontânea foi maior entre os AO e ANO (p=0,02) e entre os AO e NANO (p=0,03). Com eotaxina houve aumento para o grupo AO em relação aos ANO e aos NANO, e do grupo dos NAO em relação aos ANO e NANO (p<0,0001). Para o PAF, o grupo AO mostrou-se maior do que NANO (p=0,02). O RANTES apresentou significância entre os NAO em relação aos ANO e NANO (p=0,01). Na adesão espontânea dos eosinófilos a fibronectina, não foi encontrado relevância entre os grupos. Com eotaxina, houve maior adesão para os AO em relação aos NANO (p=0,04). Maior concentração de leptina no grupo dos AO e NAO (p=0,0001). Não foi encontrado diferença entre os grupos para adiponectina total. Conclusão: Este é o primeiro estudo a demonstrar uma maior atividade eosinofílica (quimiotaxia e adesão) em crianças e adolescentes obesos asmáticos atópicos em relação aos não obesos e aos voluntários saudáveis com associação ao aumento de leptina sérica / Abstract: Background: The prevalence of obesity and asthma has increased over the past several decades. Recent investigations suggest relationship between asthma and obesity in many studies, but the mechanisms are unclear. The aim of this study was evaluate the obesity effect in eosinophil activity by chemotaxis and adhesion in asthmatic and non-asthmatic children and adolescents in association with serum adipokines measurement Method: 32 asthmatic obese (AO) and asthmatic non obese (ANO), 5 non asthmatic obese (NAO) and 5 non asthmatic non obese (NANO) were included. Peripheral blood was collected and eosinophils were purified using a Percoll gradient followed by immunomagnetic cell separator. Chemotaxis was performed with microchemotaxis chamber in triplicate with MEM (spontaneous), eotaxin, PAF (platelet-activating factor) and RANTES (regulated on activation, normal T cell expressed and secreted). The measurement was done by optical microscope count. The adhesion was performed by fibronectin plates in triplicate with MEM and eotaxin. Eosinophilic adhesion was calculated by comparison between absorbance of unknown samples with the standard curve. Leptin and adiponectin were quantified by ELISA. Results: spontaneous chemotaxis was higher between AO and ANO (p=0.02) and between AO and NANO (p=0.03).With eotaxin, the increased was between AO and ANO and between AO and NANO, and between ANO and NANO (p<0.0001).With PAF, AO was higher than NANO (p=0.02). RANTES was increased among NAO and ANO and NANO (p=0.01). In spontaneous adhesion, there was no difference between groups. With eotaxin, the adhesion was higher between AO and NANO (p=0.04). Leptin was higher in AO and NAO than the others (p=0.0001). There was no difference among groups for total adiponectin. Conclusion: This is the first study that showed higher eosinophilic activity (chemotaxis and adhesion) in atopic obese asthmatic children and adolescents in relationship to asthmatic non obese and healthy volunteers / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T11:46:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiasJunior_PedroPaulo_M.pdf: 932681 bytes, checksum: a8ceae0940e26759a4abe344de43b8f4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A resposta vascular inflamatória envolve a interação complexa entre células. A adesão dos neutrófilos aos sítios inflamatórios é constituído de várias etapas que envolvem a interação das moléculas de adesão com os neutrófilos, intermediado pela L-selectina (CD62L) e pelas integrinas ?2, LFA-1 e Mac-1 (CD11a/CD18 e CD11b/CD18) com ligantes sobre o endotélio. Os eritrócitos podem aderir ao endotélio vascular usando as moléculas de adesão CD 36 e integrina VLA-4 entre outras moléculas de adesão. O mecanismo de adesão das plaquetas envolve o sequestro celular no local da lesão tecidual através da interação de quatro receptores sinérgicos: a glicoproteína GPIb/IX (CD42b/CD42a), a integrina ?2?1 (GPIa/IIa; CD49b/CD41a), a integrina ?IIb?3 (GPIIb/IIIa; CD41a/CD61), e a integrina ?5?1 (GPIc/IIIa; CD51/CD61). Em doenças associadas com a inflamação vascular, tais como a doença falciforme e aterosclerose, alterações na adesão de leucócitos à parede vascular desempenham um papel central na fisiopatologia da doença. O CD40L e o LIGHT são proteínas citocinas pertencente ao fator de necrose tumoral (TNF), tendo como receptores o CD40L, LTBR e o HVEM, respectivamente. Diante disso, este estudo objetivou avaliar os efeitos das proteínas inflamatórias CD40L e LIGHT nas propriedades adesivas dos neutrófilos, hemácias e plaquetas. Os neutrófilos, hemácias e plaquetas foram separados do sangue periférico e foram realizados ensaios de adesão estática e citometria de fluxo após estimulo destas células com as proteínas recombinantes, CD40L e LIGHT. Após incubação com CD40L ou LIGHT, os neutrófilos e hemácias da circulação periférica apresentaram alterações quanto às propriedades adesivas em relação aos neutrófilos e hemácias não estimulados. As plaquetas estimuladas com as citocinas não demonstraram alteração nas propriedades adesivas. Neutrófilos incubados com anticorpos bloqueadores das integrinas Mac-1 e LFA-1 apresentaram uma reversão no aumento das propriedades adesivas após estimulo com CD40L ou LIGHT. Os neutrófilos estimulados com as citocinas apresentaram uma diminuição na expressão proteíca de CD62L, característica de ativação celular. Nao foi observado nenhuma diferença quanto a expressão das integrinas Mac-1 e LFA-1 nos neutrófilos após estímulo com as citocinas. Esses resultados sugerem que essas proteínas inflamatórias podem aumentar as propriedades adesivas de neutrofilos (intermediado por um aumento na afinidade das integrinas) e hemácias. A presença de altas concentrações destas citocinas na circulação, como encontrados em algumas patologias caracterizadas por inflamação vascular, pode resultar em conseqüências importantes, como a indução da adesão dos leucócitos e hemácias à parede vascular / Abstract: The vascular inflammatory response involves a complex interaction between cells. The adhesion of neutrophils to inflammatory sites is composed of several stages involving the interaction of adhesion molecules on neutrophils and on the endothelium. These interactions are mediated by Lselectin (CD62L) and the ?2 integrins, LFA-1 and Mac-1 (CD11a/CD18 and CD11b / CD18, respectively) with ligands on the endothelium. The red cells may adhere to vascular endothelial adhesion molecules using CD 36 and the VLA-4 integrin and other adhesion molecules. The mechanism of adhesion of platelets involves the adhesion of these cells at the site of tissue injury through the interaction of four synergistic receptors: glycoprotein GPIb/IX (CD42b/CD42a), integrin ?2?1 (GPIa/IIa; CD49b/CD41a), integrin ?IIb?3 (GPIIb / IIIa, CD41a/CD61), and integrin ?5?1 (GPIC/ IIIa; CD51/CD61). In diseases associated with vascular inflammation, such as sickle cell disease and atherosclerosis, changes in leukocyte adhesion to the vascular wall plays a central role in the pathophysiology of the disease. The CD40L and LIGHT cytokines are proteins belonging to the tumor necrosis factor (TNF) family, and interact with the receptors, CD40L, LTBR and HVEM, respectively. Thus, this study aimed to evaluate the effects of the inflammatory proteins, CD40L and LIGHT, on the adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets. Neutrophils, erythrocytes and platelets were separated from peripheral blood and static adhesion assays and flow cytometry were performed after stimulation of these cells with the recombinant proteins, CD40L and LIGHT. After incubation with CD40L or LIGHT, neutrophils and red blood cells from the peripheral circulation showed alterations in adhesive properties compared to unstimulated neutrophils and erythrocytes. Platelets stimulated with cytokines showed no changes in adhesive properties. Neutrophils incubated with antibodies that block the functions of integrins Mac-1 and LFA-1 reversed the increase in adhesive properties after stimulation with CD40L or LIGHT. Neutrophils stimulated with cytokines showed a decrease in the protein expression of CD62L, a characteristic of cellular activation. No difference was observed in the expression of the integrins Mac-1 and LFA-1 on neutrophils after stimulation with cytokines. These results suggest that these inflammatory proteins can increase the adhesive properties of neutrophils (mediated by an increase in the affinity of the integrin) and erythrocytes. The presence of high concentrations of these cytokines in the circulation, as found in certain vascular diseases characterized by inflammation, can result in important consequences, such as the induction of the adhesion of leukocytes and red blood cells to the vascular wall / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas