Flagelinas de bactérias gram-negativas ativam o sistema imune inato resultando em efeitos adjuvantes para antígenos co-administrados. No entanto, não existem relatos sobre as propriedades adjuvantes de flagelinas de bactérias gram-positivas. O objetivo do projeto foi estudar os efeitos imunomoduladores da flagelina Hag de B. subtílis. Inicialmente foi purificada a Hag e subseqüentemente avaliada sua propriedade imunológica quando administrada junto com a ovalmbumina (OVA) pelas vias intra-nasal (i.n.) ou subcutânea (s.c.) em camundongos Balb/C e C57BL/6. Os resultados demonstraram as propriedades imunomoduladoras da Hag nas duas linhagens em relação à indução de anticorpos antígeno-específicos. Não foi possível demonstrar a ativação de linfócitos TCD4+ e CD8+ antígenos-específicos em animais Balb/C imunizados com OVA e Hag tanto pela via s.c. como pela i.n.. Resultados mais promissores do efeito adjuvante frente a células T foram encontrados em animais C57BL/6. Os resultados abrem perspectivas para o estudo do potencial da flagelina Hag de B. subtilis como adjuvante vacinal. / Flagellin of gram negatives bacteria actives the innate immune system resulting in adjuvants effects against coadministrated antigens. However, there is not information about immunological properties of flagellins produced by gram positive bacteria. This study aimed the evaluation of immunomodulator effects of Hag flagellin from B. subtilis. Vaccine formulations based in purified Hag and Ovalbumine protein (OVA) were administrated intranasal (i.n.) and subcutaneously (s.c.) in Balb/C and C57BL/6 mice and then the population of B and T lymphocytes were monitored for production of antibodies and citocines and/or surface markers expression. Results showed the immunomodulatory properties of Hag in both mice lineages regarding the induction of antigen specific antibodies when immunized with OVA and Hag by i.n. and s.c. via. Most promising results concerning the adjuvant effects observed on T cells activation were found in C57BL/6 mice. The results obtained open future perspectives for the study of the potential use of B. subtilis Hag flagellin as adjuvant in vaccines.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_lilian_ferreira.pdf: 360548 bytes, checksum: 5b53738e6a0e6f27ef278c1c1b74e44c (MD5) Previous issue date: 2009-03-30 / The vaccines with multiple antigens have represented a major advance in the immunization of pets and production animals, since they represent economies of time, cost, and stress. However, the efficiency of these vaccines have sometimes been questioned and the choice of an appropriate adjuvant can mean a breakthrough in multiple immunizations. In this context, propolis, which is drawing the attention of many researchers due to its bioactive properties, emerges as a possible candidate, because many studies have demonstrated its stimulating activity on the humoral and cellular immune system. As studies have shown adjuvant activity in inactivated and monovalent vaccines, but there are no reports on its action on multiple and attenuated vaccines, this study aimed at evaluating the immunomodulatory capacity of ethanolic extract of green propolis and aqueous extract of brown propolis, against attenuate parvovirus canine (CPV) and inactivated canine coronavirus (CCoV), when associated with a vaccine composed of multiple antigens. Green propolis stimulated the production of antibodies against CPV in animals inoculated with the highest concentration of antigen (3.0 x106 TCID50) co-administered with 400 mg/dose of its ethanolic extract. The addition of 400 mg/dose of aqueous extract of brown propolis to different concentrations of commercial antigens (0.75, 1.5 e 3.0 x 106 TCID50) increased the humoral immune response against CPV in all groups. Regarding CCoV, green propolis showed no adjuvant activity. Already titration of the antibodies showed an increase in animals inoculated with 1.5 and 3.0 x106 TCID50 of antigens co-administered with aqueous extract of brown propolis. The cellular response was assessed by the expression of messenger RNA (mRNA) for interferon gamma (INFı), revealing that the green propolis showed no adjuvant activity, while the brown propolis increased the production of this cytokine against CPV in animals inoculated with 0.75 and 3.0 x106 TCID50 of antigens. The production of INF-ı specific to CCoV revealed properties immunostimulating agent of green propolis in concentrations of 0.75 and 3.0 x106 TCID50 of antigens and of brown propolis at a dose of vaccine of 3.0 x106 TCID50. The results presented in this study demonstrated that the ethanol extract of green propolis increased humoral response against CPV and cellular response against CCoV.And the aqueous extract of brown propolis has adjuvant activity on the humoral and cellular immune responses against the attenuated CPV and inactivated CCoV, when incorporated into a multiple vaccine. The use of propolis may contribute to the effectiveness of multiple vaccines due its stimulating activity to both the humoral and cellular immune responses, which justifies more research in that area. / As vacinas com antígenos múltiplos têm representado um grande avanço na imunização de animais de companhia e de produção, já que aliam economias de tempo, custo, manejo e estresse. No entanto, a eficiência dessas vacinas tem sido por vezes questionada e a escolha de um adjuvante adequado pode significar um avanço nas imunizações múltiplas. Nesse contexto, a própolis, que vem chamando a atenção de muitos pesquisadores devido as suas propriedades bioativas, surge como uma possível candidata, pois muitas pesquisas vêm demonstrando suas atividades moduladoras sobre o sistema imune humoral e celular. Como estudos já demonstraram atividade adjuvante em vacinas inativadas e monovalentes, mas ainda não existem relatos sobre sua ação em vacinas múltiplas e atenuadas, o objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade imunomoduladora de extratos etanólico de própolis verde e aquoso de própolis marrom, contra o parvovírus canino (CPV) atenuado e o coronavírus canino (CCoV) inativado, quando associados com uma vacina composta por antígenos múltiplos. A própolis verde estimulou à produção de anticorpos contra o CPV nos animais inoculados com a maior concentração dos antígenos (3,0x106 TCID50) co-administrados com 400 μg de seu extrato etanólico. A adição de 400 μg/dose de extrato aquoso de própolis marrom a diferentes concentrações dos antígenos comerciais (0,75, 1,5 e 3,0 x 106 TCID50) incrementou a resposta imune humoral contra o CPV em todos os grupos. Com relação ao CCoV, a titulação dos anticorpos não revelou atividade adjuvante da própolis verde, no entanto foi verificado aumento na resposta humoral nos animais inoculados com 1,5 e 3,0x106 TCID50 dos antígenos co-administrados com extrato aquoso de própolis marrom. A resposta celular foi avaliada pela expressão de RNA mensageiro (mRNA) para interferon gamma (INF-ı), revelando que a própolis verde não apresentou ação imunoestimulante, já a própolis marrom incrementou a produção dessa citocina contra CPV nos animais inoculados com 0,75 e 3,0x106 TCID50 dos antígenos. A produção de INF-ı específico para CCoV revelou propriedade imunoestimulante da própolis verde nas concentrações de 0,75 e 3,0 x106 TCID50 dos antígenos e da própolis marrom na dose de vacina de 3,0x106 TCID50. Os resultados apresentados nesse estudo demonstraram que o extrato etanólico de própolis verde incrementou a resposta humoral contra o CPV e a celular contra o CCoV. Já o extrato aquoso de própolis marrom apresentou atividade adjuvante sobre as respostas imunes humoral e celular, contra o CPV atenuado e o CCoV inativado, quando incorporado a uma vacina múltipla. O uso da própolis pode contribuir para a eficácia de vacinas múltiplas devido à atividade estimulante tanto sobre a resposta imune humoral como celular, justificando mais pesquisas nessa área.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_carla_pohl_sehn.pdf: 1038153 bytes, checksum: 075d58210f65d23825bbd6f9adff7315 (MD5) Previous issue date: 2010-07-29 / The association of vaccine antigens to potent immunological adjuvants is a key strategy to improve the performance of subunit vaccines. Adjuvants are components that, when used in combination with a specific antigen, induce more immunity that the antigen alone. Microbial products have been used as adjuvant, including the B subunit of the thermo labile entherotoxin of Escherichia coli (LTB), which is atoxic. LTB is known by its great efficiency as mucosal immunity adjuvant and this activity depends on the shape of the antigen combination (co-administered or fused), on the immunization route (mucosal or parentheral) and the dosage. This study aims to evaluate the adjuvant activity of recombinant LTB (rLTB), both as chimeric and coadministered orally or intramuscularly, using the major fimbrial unit type 1 (FimA) of Salmonella Enteritidis as antigen. BALB/c mice were immunized orally or intramuscularly with three doses of rLTB or PBS (controls) or rFimA, rFimA associated with Freund's incomplete adjuvant (rFimA+AI, i.m. immunized animals), co-administered or fused to LTB (chimera). The levels of total systemic antibodies, IgG1, IgG2a and IgA anti-rFimA were measured by ELISA and an animal protection assay against S. Typhimurium infection was performed. The results show that rLTB only showed adjuvant activity that resembled the commercial adjuvant when coadministered intramuscularly to rFimA and for totals antibody production. These results confirm that the action of adjuvant rLTB is influenced by the shape of binding to the antigen (fused or co-administered) and route of administration. Immunizations did not induce protection of mice challenged with S. Typhimurium, but survival time was greater among animals immunized with only the rFimA and rFimA+AI. Furthermore, the total antibody titer, IgG1 and IgG2a obtained by the chimeric form, both orally as intramuscularly, were similar to those obtained by the animal only immunized with rFimA. These results suggest that rFimA has a possibility of having an adjuvant capability rFimA. / A associação de antígenos vacinais a potentes adjuvantes imunológicos é uma estratégia fundamental para melhorar o desempenho de vacinas de subunidade. Adjuvantes são substâncias que, usadas em combinação com um antígeno específico, induzem mais imunidade que o antígeno sozinho. Produtos microbianos, como a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB), que é atóxica, têm sido utilizados com esse propósito. A LTB é reconhecida por sua grande eficiência como adjuvante da imunidade de mucosa e essa capacidade depende da forma de combinação ao antígeno (co-administrada ou fusionada), da via de imunização (mucosa ou parenteral) e da dose administrada. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade adjuvante da subunidade B recombinante da enterotoxina termolábil de Escherichia coli, fusionada ou co-administrada, por via oral (v.o.) ou intramuscular (i.m.), utilizando a subunidade fimbrial principal recombinante da fímbria tipo 1 (FimA) de Salmonella Enteritidis como antígeno. Para isso, camundongos BALB/c foram imunizados v.o. e i.m. com 3 doses de rLTB, PBS (controles) ou rFimA, ou rFimA associada a adjuvante de Freund incompleto (rFimA+AI, animais imunizados via i.m.), co-administrada ou fusionada a LTB (quimera). Os níveis de anticorpos sistêmicos totais, IgG1, IgG2a e IgA anti-rFimA foram mensurados por ELISA e um ensaio de proteção animal contra infecção por S. Typhimurium foi realizado. Os resultados obtidos demonstraram que a rLTB apresentou atividade adjuvante estatisticamente semelhante a do adjuvante comercial somente quando co-administrada i.m. a rFimA e em relação a produção de anticorpos totais. Esses resultados confirmam que a ação adjuvante da rLTB é influenciada pela forma de ligação ao antígeno (fusionada ou co-administrada) e pela via de administração. As imunizações não induziram proteção de camundongos desafiados com S. Typhimurium, porém o tempo de sobrevivência foi maior entre os animais imunizados somente com a rFimA e rFimA+AI. Além disso, os níveis de anticorpos totais, IgG1 e IgG2a obtidos pela forma quimérica imunizada tanto v.o. quanto i.m., foram semelhantes àqueles obtidos pelos animais imunizados somente com a rFimA. Os resultados obtidos apontam para uma possível atividade adjuvante da proteína rFimA.

O processo de micrencapsulação de proteínas em microesferas (MS) de PLGA [poli (ácido lactico-co-glicolico)] é fácil de fazer e é uma ferramenta útil para melhorar tanto uma formulação quanto para aumentar a atividade imunológica de vacinas de novas gerações. A MS-PLGA têm caráter adjuvante porque é um sistema particulado e, além disto, controla a liberação do antígeno. O escopo desta tese foi o de dar uma nova roupagem para um antígeno vacinal tradicional e muito bem estudado- o toxoide diftérico (Dtxd). Estudaram-se a produção de MS de tamanho desejado; os mecanismos que controlam danos nas proteínas durante o processo de micrencapsulação; a produção de microesferas com características de liberações em tempos distintos e ensaios biológicos. O tamanho de MS é um determinante fundamental para controlar a velocidade de liberação de um soluto. Para se produzir MS com tamanhos controlados usou-se um desenho fatorial experimental com três fatores distintos e três pontos centrais, para se determinar a influência das variáveis (concentração de poli álcool vinílico; velocidade de agitação e relação fase dispersa/fase contínua) na determinação do tamanho das MS. Foram obtidas MS esféricas e lisas de 4- 15 µm de diâmetro. Estes resultados abrem a possibilidade de se formular PLGA-MS com tamanhos planejados através de um mínimo de experimentos. O mecanismo de danos conformacionais nas proteínas nas várias fases do processo de produção de PLGA-MS é ainda uma questão em aberto. Usaram-se várias técnicas biofísicas (HPLC, espectroscopias no uv, fluorescência e CD) além de ELISA para se testar a interferência dos sais da série de Hofmeister sobre a solubilidade e estabilidade da proteína durante a emulsificação e do contacto com a interface água/cloreto de metileno (primeira etapa do processo de preparação de MS). Estudaram-se também a influência de oligômeros de PLGA e SDS sobre a estrutura da proteína no meio de liberação (etapa de liberação do soluto). A emulsificação de Dtxd na presença de Mg2+ induziu agregação protéica, com exposição de resíduos hidrofóbicos para o meio; variações no ângulo diédrico do S-S proteico e perda de identidade imunológica. Esta agregação foi quase abolida pelo caotrópico SCN- (toxicidade = 30 g/ homem adulto de 70 kg). A conformação \"nativa\" do Dtxd e sua atividade biológica foram protegidas pelo KSCN. Os oligômeros de PLGA e o SDS induziram uma conformação de Dtxd nova. A adição de KSCN na fase aquosa aumentou a eficiência de encapsulação de Dtxd pela PLGA-MS em 20 %. Esta foi a solução mais simples quando comparada com aquelas descritas na literatura. Produziram-se seis formulações diferentes (diferentes massas molares e carboximetilações do PLGA) com pelo menos três cinéticas de liberações distintas. Imunizaram-se camundongos com 5 µg de Dtxd encapsulado em MS-PLGA usando-se dois polímeros de 12 kDa (-COOH livre ou metilado) e um outro de 63 kDa (metilado). O padrão de resposta e a maturidade imunológicas foram medidos por titulações de IgG1 e IgG2a. Mantiveram-se os mesmos padrões de resposta humoral (desejável). Menores quantidades de antígenos foram necessárias para se obter os mesmos benefícios gerados pela vacina tradicional de Dtxd. Aumentaram-se a produção e a seletividade de anticorpos através de duas manipulações simples: a formulação e o tempo da aplicação da dose de reforço. Estes resultados colocam estas formulações na área de vacinas de sucesso uma vez que também foram obtidas memórias imunológicas. / The protein microencapsulation within microspheres (MS) of PLGA (Poly-lactide-co-glycolide) is easy to do and, it is a useful tool to enhance formulation and immunologic performances for new generation vaccines. MS-PLGA has adjuvant character because it is a particulate system and can control the antigen release. The question addressed in this thesis was to give this new dress for the traditional and well studied vaccine antigen - the diphtheria toxoid (Dtxd). The steps of MS control size production; mechanism to control protein damages; MS production with different polymers and biological assay were addressed here. MS size is a primary determinant of solute release velocity. A full factorial experimental design 23 with triplicate at the central point was used to determine the influence of variables (polyvinyl alcohol concentration, stirring velocity and the relationship between dispersed /continuous phase) on MS size. Uniformly spherical and smooth microspheres (4 - 15 µm of diameter) were obtained. These results open the possibility of formulating PLGA microspheres with custom sizes performing a minimum of experiments as required for specific applications. It stills an open question to detail the conformational mechanism of protein damages during the various steps of the PLGA microencapsulation process. Various techniques (HPLC gel filtration, ELISA, Fluorescence, UV and Circular dichroism spectroscopies) were tested on the interference of the Hofmeister ion series over protein solubility and stability during the emulsification and contact with the interface water/CH2Cl2 interface (First step on MS preparation). The interference of SDS and PLGA olygomers over protein structure in the liberation media was also studied (solute liberation step). The Dtxd emulsification in the presence of Mg2+ was followed by protein aggregation, with exposition of hydrophobic residues and changes on the dihedral S-S protein angle and loses on immunological identity. This aggregation is 95% avoided by the chaotropic and little toxic salt KSCN (30g/ adult human of 70 kg). All the \"native\" Dtxd conformation and biological properties were maintained by KSCN. MS with different liberation kinetics profile and different erosion characteristics were obtained by using six different polymers. The SDS and PLGA olygomers exerted a generation of new Dtxd molecular organization. The KSCN increased Dtxd encapsulation within PLGA-MS in more than 20 %. This was the simplest solution used to solve protein aggregation compared with others solutions used in the literature. The six different formulations produced (differing in molar mass and carboxymethylation) produced, at least, three different Dtxd liberation profiles. Mice were primed with 5 µg of Dtxd microencapsulated within MS prepared with 12 kDa (ended carboxymethylated or free PLGA) and with 63 kDa (methylated) PLGA. The response patterns and the immune maturity were measured by IgG1 and IgG2a titrations. The humoral pattern was maintained, but fewer antigens were needed to obtain the same traditional Dtxd vaccine benefits. The simple change on Dtxd-PLGA formulation and timing of the booster enhanced both, antibody production and selectivity. An immunological memory was also obtained, putting so, these formulations in the field of successful vaccine.

As proteínas de classe 3 são candidatas na preparação de uma vacina contra a doença meningocócica. O objetivo deste estudo é determinar a imunogenicidade da proteína de classe 3 purificada da cepa de Neisseria meningitidis do sorogrupo B juntamente com a capacidade adjuvante de whole cells de Bordetella pertussis. Foram imunizados camundongos BALB/c neonatos em um intervalo de 3 a 12 dias entre 1 e 4 doses da proteína de classe 3 mais adjuvante, pela via intranasal e no 21º dia pela via intramuscular com a proteína de classe 3 emulsificada com hidróxido de alumínio. Os resultados demonstraram que após 2 doses pela via intranasal e 1 dose pela via intramuscular houve rápido estímulo das células imunes nos camundongos adultos BALB/c e neonatos BALB/c e outbred. Todos os soros foram analisados por ELISA e immunoblot. O adjuvante B. pertussis administrado pelas vias intranasal ou intramuscular, aumentou a resposta imune comparada com os controles. Anticorpos bactericidas e de alta afinidade foram produzidos. / Proteins of class 3 sound candidates in the preparation of vaccine against meningococcal illness. The aim of this study was to determine the immunogenicity of class 3 proteins purified of Neisseria meningitidis of the serogroup B along with whole cells of Bordetella pertussis as adjuvant. BALB/c and outbred neonate mice between 3 and 12 days old were immunized with 1 to 4 doses of the purified class 3 proteins with or without adjuvant given by the intranasal route, and on the 21st day the animals received an intramuscular dose of the class 3 proteins with or without aluminum hydroxide. The results demonstrated that after 2 doses by the intranasal route and 1 dose intramuscular there was a rapid stimulation of the immune cells in BALB/c adult mice as well as BALB/c and outbred neonates mice. All sera were analyzed by ELISA and immunoblot. The adjuvant B. pertussis used in the present investigation and given via the intranasal or intramuscular route increased the immune response compared with the controls. High affinity and bactericidal antibodies were produced.

Enzimas, biofármacos e produtos de origem biológica de modo geral sempre foram obstáculos para o uso terapêutico. Isto em função dos riscos de reação adversa que poderiam ocasionar bem como a indução de uma resposta imunológica desejável ou não. A utilização do monometoxipolietileno glicol (mPEG) conjugado a proteínas e enzimas trouxe novas perspectivas de utilização de substâncias naturais como substâncias farmacológicas ativas, pois o fato de estarem conjugadas a um polímero inerte atribui uma nova estrutura físico-química a essas substâncias, diminuindo consideravelmente os riscos de anafilaxia e a biodegradação por formação de complexos antígeno-anticorpo. Os estudos das variáveis inseridas no fenômeno de formação da estrutura mPEG e proteína, como também os novos sistemas de fornecimento de fármaco-químicos, trouxeram subsídios para o desenvolvimento deste trabalho no que se refere ao fornecimento de antígeno para o sistema imunológico. Este trabalho demonstrou que o mPEG pode ser utilizado como adjuvante e ao mesmo tempo como indutor de mecanismos de tolerância imunológica. Esta modulação ocorre em função da concentração de mPEG conjugado a molécula protéica, de modo que baixas concentrações de aminas conjugadas levam a um mecanismo de adjuvanticidade com aumento da produção de Il-4 e IL-5 e consequentemente aumento da produção de anticorpos quando comparados ao antígeno somente. Por outro lado os mecanismos de tolerância foram demonstrados pelo aumento da produção de IL-2, INF-γ e TNF-α quando concentração de mPEG ultrapassa a de 30% das aminas livres demonstrando uma ativação de células Th1. Também ficou demonstrado que a utilização do mPEG pode ser uzadopara diminuir ou até mesmo eliminar a atividade tóxicas de venenos peçonhentos. Pois durante os experimentos realizados houve uma diminuição de no mínimo de 50% da toxicidade. / Enzymes, biopharmaceutics and biological products in general way had always been obstacles for the therapeutically use. This in function of the risks of adverse reaction that could cause as well as the induction of a desirable immunological reply or not. The use of the monomethoxypolyethylene glycol (mPEG) conjugated proteins and enzymes brought new perspectives of natural substance use as active pharmacology substances, therefore the fact to be conjugated to an inert polymer had given to a good new physical-chemistry structure of these substances, diminishing the risks of anaphylaxis and the biodegradation for of complexes antigen-antibody formation. However the new studies of the inserted variable in the phenomenon of structure mPEG and protein formation as the system of supply of pharmacology-chemistries had also brought subsidies for the development of this work as for supply of antigen for the immune system. This work demonstrated that the MPEG can be used as adjuvant and at the same time as inductive of mechanisms of immunological tolerance. This modulation occurs in function of the concentration of conjugated MPEG the protein molecule, in way that low conjugated concentrations of amine with consequence take to a mechanism of adjuvant effect with increase of the production of Il-4 and IL-5 and increase antibodies production when compared with the antigen only. On the other hand the tolerance mechanisms had been demonstrated by the increase of the IL-2 production, INF-γ and TNF-α when MPEG concentration exceeds 30% of the free amines demonstrating activation of Th1 cells. Also he was demonstrated that the use of the toxic MPEG can be used to diminish or even though to eliminate the activity of poisons. Therefore during the carried through experiments it had a reduction of at the least of 50% of the toxicity.

O crescimento da produção aqüícola e o aumento do consumo de peixe levam à intensificação dos sistemas de produção. Com a crescente conscientização da necessidade de adoção de técnicas adequadas para produção de alimento para consumo humano, torna-se necessário a adoção de Boas Práticas de Manejo (BPMs) em sistemas de produção aqüícola. Uma destas práticas consiste na redução ou não utilização de antimicrobianos durante o ciclo de produção, através da utilização de substâncias imunoestimulantes. O objetivo do presente estudo foi determinar o efeito de diferentes aditivos dietéticos (levamisol, vitamina E e mananoligossacarídeos - MOS) sobre as respostas biológicas, hematológicas e bioquímicas do pacu. Cada aditivo apresentou efeito singular sobre as variáveis analisadas, no que diz respeito ao desempenho e hematologia. O levamisol apresentou eficácia dose e tempo dependente, sendo a melhor resposta observada nos peixes suplementados com 100 mg kg-1 de levamisol na dieta durante 15 dias. A vitamina E é um nutriente essencial para obtenção de um crescimento adequado e manutenção dos parâmetros hematológicos dentro dos valores normais para o pacu. Os peixes suplementados com 87,2 mg kg-1 de vitamina E na dieta apresentaram melhor crescimento e nenhum distúrbio hematológico. A suplementação de MOS dietético não apresentou resultados consistentes, apesar da análise histológica do intestino, mesmo não sendo significativo (p>0,05), ter apresentado valores absolutos do perímetro das vilosidades maior nos peixes suplementados com relação ao controle. Porém, mais estudos são necessário para determinar o mecanismo de ação do MOS como prebiótico na dieta do pacu, assim como a ação do levamisol sobre o ganho de peso em peixes. / The growth of aquaculture production as well as fish consumption can lead to intensification of fish production systems. The growing environmental concern regarding production of fish as food has required fish farmers to conform to Best Management Practices (BPMs), and that include reduction or, preferably, complete banning antibiotics from the production cycle through the use of immunostimulants. This study was set out to determine effects of different dietary additives (levamisole, vitamin E and mannan oligosaccharides - MOS) on biological, hematological and biochemical responses of pacu. All additives affected analyzed variables regarding to growth parameters and hematology. Levamisole presented time and dose efficacy, best results presented in fish supplemented with 100 mg kg-1 of dietary levamisole for 15 days. Vitamin E supplementation is essential for growth and maintenance of normal hematological values for pacu. In the present study, fish supplemented with 82.7 mg kg-1 of dietary vitamin E presented the best growth and no hematological disturbs. Dietary MOS did not present consistent results. Although not significant (p>0,05), MOS-supplemented fish presented higher total villi perimeter, in absolute values, than fish fed control diet. However studies regarding the mode of action of MOS as prebiotic for pacu as well as the effects of levamisole on fish growth are necessary.

As moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, expressas na superfície de células dendríticas (DCs), as principais células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs), possuem participação fundamental na indução de resposta e manutenção de tolerância, motivo pelo qual são consideradas alvos terapêuticos promissores. Essas moléculas promovem o segundo sinal necessário à ativação e proliferação dos linfócitos T por meio da ligação ao receptor CD28, ou inibem a resposta por essas células por meio da ligação ao receptor CTLA-4, ambos expressos na superfície dos linfócitos. Muitos são os relatos da literatura indicando diferenças tanto quantitativas quanto qualitativas entre CD80 e CD86 na capacidade de ativação de linfócitos T, os mais relevantes apontando diferenças na capacidade de indução de diferenciação de linfócitos para os padrões Th1 e Th2 de secreção de citocinas. Porém, tais relatos são muitas vezes contraditórios, e o verdadeiro papel funcional dessas moléculas ainda está por ser estabelecido. Assim, propusemo-nos a estabelecer as metodologias necessárias para silenciar as moléculas CD80 e CD86 em células dendríticas (DCs) humanas, derivadas de monócitos do sangue periférico, por meio da tecnologia de RNA de interferência. Isso possibilitaria esclarecer o papel desempenhado por cada uma dessas moléculas na capacidade de ativação de linfócitos T. Para tanto, padronizou-se a transfecção reversa de DCs do quarto dia da cultura com siRNA fluorescente e os agentes de transfecção lipídicos siPORT e iMAX, tendo sido obtidas eficiências de transfecção de 64,7% ± 5,2 e 69,7% ± 14,5%, respectivamente. DCs do quarto dia de cultura foram transfectadas com siRNAs específicos para CD80, e o fenótipo avaliado após 48 horas da transfecção. Foi possível identificar, além do eficiente silenciamento de CD80 por dois dos três siRNAs testados, também uma diminuição, inesperada, de células CD86+. Para o silenciamento de CD86, células CD14+ selecionadas positivamente por beads magnéticas foram transfectadas com siRNAs específicos para CD86, ativadas após 24 horas da transfecção e o silenciamento avaliado após 24 horas da ativação. Embora o silenciamento conseguido por um dos dois siRNAs testados tenha sido muito pequeno, observou-se fenômeno equivalente, com diminuição de células CD80+. Embora inconclusivos, esses dados sugerem a possibilidade de modulação recíproca dessas moléculas. Assim, pudemos obter a transfecção eficiente de DCs com siRNAs de interesse e, através deles, modular a expressão de CD80 e CD86. Com estes instrumentos, portanto, podemos agora desenvolver estudos quanto ao papel de cada uma destas moléculas na fisiologia da apresentação antigênica pelas DCs. / The costimulatory molecules CD80 and CD86, expressed on surface of dendritic cells (DCs), are essential to trigger T cell activation and to maintain self tolerance, indicating that these molecules are promising therapeutic targets. They can either bind to CD28 on T cells, promoting T cell activation and leading to their proliferation and cytokine production, or to CTLA-4, which is expressed following T cell activation, and can inhibit T cell response. Though CD80 and CD86 are thought to provide equivalent T cell costimulation, a growing body of evidence suggests that there are different functional consequences of CD28 engagement by these two molecules. Many reports point to variations in their ability to stimulate different lymphocyte subsets. However, there is still controversy in the literature and the actual role of CD80 and CD86 remains to be elucidated. Therefore, the aim of this study was to establish the methodology necessary to silence, by small interfering RNAs (siRNAs), both CD80 and CD86 expression on monocyte-derived dendritic cells. These findings would be the base of studys that could better elucidate the function of these two coestimulatory molecules in T cell activation. Therefore, transfection of 4th day DCs with fluorescent siRNA and lipidic transfection agents siPORT and iMAX was established, an d transfection efficiency observed was 64,7% ± 5,2 e 69,7% ± 14,5%, respectively. 4th day DCs were transfected with specific CD80 siRNAs and phenotype was observed after 48 hours of transfection. Besides CD80 efficient silencing by two from three siRNAs tested, there was an unexpected decrease in CD86+ cells. To establish CD86 silencing, CD14+ cells were positively selected with magnetic beads and immediately transfected with CD86 specific siRNAs, activated after 24 hours of transfection, and phenotype was observed after 24 hours of activation. Despite the fact that silencing conferred by one of two siRNAs was very low, equivalent phenomenon was observed, with a decrease in CD80+ cells. Although the observed effects were inconclusive, these data suggests a possible reciprocal modulation by these two molecules. Therefore, we were able to obtain efficient DC transfection with siRNAs of interest, as well as modulate CD80 and CD86 expression. With these instruments we can now develop studies regarding the real physiological role of these two costimulatory molecules in DCs antigen presentation.

A epidemia causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) é a mais importante das ultimas décadas. A despeito dos avanços no conhecimento da patogenia do vírus e da resposta imune à infecção, até o momento não existe uma vacina eficaz contra a aquisição do HIV. Diversas linhas de evidência indicam que anticorpos neutralizantes ou ligadores, linfócitos T CD4+ e T CD8+ desempenham um papel importante na imunidade contra o HIV. Os anticorpos que são capazes de neutralizar o HIV são direcionados principalmente à glicoproteína do envelope do vírus (env), mas os candidatos vacinais baseados na proteína de envelope gp120 monomérica testados até hoje falharam em induzir proteção nos ensaios de eficácia. Avanços no entendimento da estrutura e função da glicoproteína env tem facilitado o desenvolvimento de uma nova geração de imunógenos baseada em trímeros mais estáveis e solúveis da glicoproteína gp140. Em uma formulação vacinal além da escolha do antígeno, os adjuvantes desempenham um papel fundamental. Os adjuvantes são conhecidos por aumentar a imunogenicidade das vacinas, e nos últimos anos vários compostos, incluindo agonistas de receptores do tipo Toll (TLR) e NOD (NLR) têm demonstrado eficácia em ensaios clínicos. Em estudos prévios, nosso grupo demonstrou que a imunização de camundongos com uma vacina de DNA codificando 18 epítopos para linfócitos T CD4+ do HIV-1 (HIVBr18), foi capaz de induzir resposta específica e ampla de linfócitos T CD4+ e T CD8+. Devido ao importante papel do efeito auxiliar de linfócitos T CD4+ na resposta humoral nas imunizações assistidas por diversos adjuvantes, o objetivo central do trabalho foi verificar se a imunização inicial com a vacina de DNA HIVBr18 seria capaz de aumentar a magnitude/qualidade de resposta imune humoral e celular induzida pelo trímero de gp140 na presença de diferentes adjuvantes. Para tal, camundongos BALB/c foram imunizados inicialmente com a vacina HIVBr18 ou com o vetor vazio e posteriormente com a proteína gp140 na presença dos adjuvantes: completo de Freund (ACF), poly IC, CpG ODN 1826, Monofosforil lipídeo A (MPL), Muramildipeptídeo (MDP), Imiquimod (R837), e Resiquimod (R848). Observamos que a imunização inicial com HIVBr18 foi capaz de fornecer um auxílio cognato para a proliferação específica de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e também para a produção da citocina IFNy. A análise da xx resposta humoral mostrou que a imunização inicial com a vacina HIVBr18, foi capaz de influenciar a produção das subclasses de imunoglobulinas, independente do adjuvante testado. No presente trabalho, também analisamos a influência dos adjuvantes na imunogenicidade da gp140. Os animais que receberam os adjuvantes MPL, poly IC e CpG ODN 1826 apresentaram títulos de anticorpos estatisticamente superiores quando comparados aos animais que receberam os adjuvantes Alum, MDP, R837 e R848. Observamos que os animais imunizados com a gp140 na presença dos diferentes adjuvantes desenvolveram células B do centro germinativo e células TCD4+ auxiliar foliculares. Estes resultados nos permitem concluir que a imunização inicial com HIVBr18 é capaz de alterar a qualidade da resposta humoral e celular gp140- específica. Assim, essa formulação poderia ser utilizada para auxiliar e/ou direcionar a resposta imune induzida por outros imunógenos como por exemplo o trímero de gp140. Podemos concluir também que diferentes formulações de adjuvantes que se encontram em ensaios clínicos como poly IC, CpG ODN e MPL podem ser capazes de induzir um resposta imune humoral e celular tão ou mais potente que aquela induzida pelo ACF / The epidemic caused by the human immunodeficiency virus (HIV) is the most important in the last decades. Despite advances in the knowledge about virus pathogenesis and immune response to infection, until now there is not an effective vaccine against HIV acquisition. Several evidences indicate that neutralizing or binding antibodies, CD4+ and CD8+ T lymphocytes play an important role in immunity against HIV. The antibodies that are able to neutralize HIV are primarily directed against the virus envelope glycoprotein (env), but the vaccine candidates based on monomeric gp120 envelope protein tested so far failed to induce protection in efficacy trials. Advances in understanding the structure and function of the env glycoprotein have facilitated the development of a new generation of immunogens based on trimers, a more stable and soluble form of gp140 glycoprotein. In a vaccine formulation, in addition to the antigen, adjuvants play a pivotal role. Adjuvants are known to increase the immunogenicity of vaccines and, in the last years, several compounds, including agonists of Toll-like receptors (TLR) and NOD (NLR), have presented efficacy in clinical trials. In previous work, our group demonstrated that immunization of mice with a DNA vaccine (HIVBr18) encoding 18 CD4+ T cells epitopes from HIV-1 was able to induce a broad CD4+ T and CD8+ T cells specific response.. Given the important role of CD4+ T cells in the humoral response after adjuvant-assisted immunization, the aim of the study was to verify whether an initial immunization with the DNA vaccine HIVBr18 could increase the magnitude/quality of humoral and cellular immune response induced by gp140 trimer in the presence of different adjuvants. Therefore, BALB/c mice were initially immunized with the vaccine HIVBr18 or empty vector and then with gp140 in the presence of the following adjuvants: Freund\'s complete (CFA), poly IC, CpG ODN 1826, monophosphoryl lipid A (MPL), Muramyl dipeptide (MDP), Imiquimod (R837), and Resiquimod (R848). We observed that initial immunization with HIVBr18 was able to provide cognate help for specific CD4+ and CD8+ T cells proliferation and also for IFN-y production. Analysis of humoral response showed that initial immunization with the HIVBr18 vaccine was able to alter the production of immunoglobulin subclasses independent of the adjuvant tested. This work also analyzed the influence of adjuvants on the immunogenicity of gp140. Mice that received the adjuvant MPL, poly IC and CpG ODN 1826 presented higher antibody titers when compared to animals that received Alum, MDP, R837 and R848. We observed that mice immunized with gp140 in the presence of all adjuvants tested developed germinal center B cells and follicular helper T cells (TFH). We conclude that initial immunization with HIVBr18 is able to alter the quality of specific humoral and cellular immune responses.. Therefore, this formulation could be used in combination with other immunogens, such as gp140, to help/redirect the immune response. We also conclude that the adjuvants that are in clinical trials such as poly IC, MPL and CpG ODN 1826 may be able to induce stronger humoral and cellular response than CFA

Enzimas, biofármacos e produtos de origem biológica de modo geral sempre foram obstáculos para o uso terapêutico. Isto em função dos riscos de reação adversa que poderiam ocasionar bem como a indução de uma resposta imunológica desejável ou não. A utilização do monometoxipolietileno glicol (mPEG) conjugado a proteínas e enzimas trouxe novas perspectivas de utilização de substâncias naturais como substâncias farmacológicas ativas, pois o fato de estarem conjugadas a um polímero inerte atribui uma nova estrutura físico-química a essas substâncias, diminuindo consideravelmente os riscos de anafilaxia e a biodegradação por formação de complexos antígeno-anticorpo. Os estudos das variáveis inseridas no fenômeno de formação da estrutura mPEG e proteína, como também os novos sistemas de fornecimento de fármaco-químicos, trouxeram subsídios para o desenvolvimento deste trabalho no que se refere ao fornecimento de antígeno para o sistema imunológico. Este trabalho demonstrou que o mPEG pode ser utilizado como adjuvante e ao mesmo tempo como indutor de mecanismos de tolerância imunológica. Esta modulação ocorre em função da concentração de mPEG conjugado a molécula protéica, de modo que baixas concentrações de aminas conjugadas levam a um mecanismo de adjuvanticidade com aumento da produção de Il-4 e IL-5 e consequentemente aumento da produção de anticorpos quando comparados ao antígeno somente. Por outro lado os mecanismos de tolerância foram demonstrados pelo aumento da produção de IL-2, INF-γ e TNF-α quando concentração de mPEG ultrapassa a de 30% das aminas livres demonstrando uma ativação de células Th1. Também ficou demonstrado que a utilização do mPEG pode ser uzadopara diminuir ou até mesmo eliminar a atividade tóxicas de venenos peçonhentos. Pois durante os experimentos realizados houve uma diminuição de no mínimo de 50% da toxicidade. / Enzymes, biopharmaceutics and biological products in general way had always been obstacles for the therapeutically use. This in function of the risks of adverse reaction that could cause as well as the induction of a desirable immunological reply or not. The use of the monomethoxypolyethylene glycol (mPEG) conjugated proteins and enzymes brought new perspectives of natural substance use as active pharmacology substances, therefore the fact to be conjugated to an inert polymer had given to a good new physical-chemistry structure of these substances, diminishing the risks of anaphylaxis and the biodegradation for of complexes antigen-antibody formation. However the new studies of the inserted variable in the phenomenon of structure mPEG and protein formation as the system of supply of pharmacology-chemistries had also brought subsidies for the development of this work as for supply of antigen for the immune system. This work demonstrated that the MPEG can be used as adjuvant and at the same time as inductive of mechanisms of immunological tolerance. This modulation occurs in function of the concentration of conjugated MPEG the protein molecule, in way that low conjugated concentrations of amine with consequence take to a mechanism of adjuvant effect with increase of the production of Il-4 and IL-5 and increase antibodies production when compared with the antigen only. On the other hand the tolerance mechanisms had been demonstrated by the increase of the IL-2 production, INF-γ and TNF-α when MPEG concentration exceeds 30% of the free amines demonstrating activation of Th1 cells. Also he was demonstrated that the use of the toxic MPEG can be used to diminish or even though to eliminate the activity of poisons. Therefore during the carried through experiments it had a reduction of at the least of 50% of the toxicity.