A sílica nanoestruturada SBA-15 é um polímero que devido à suas propriedades físico-químicas apresenta grande potencial como adjuvante de mucosas. A imunização pela via oral de camundongos com a vacina contra Hepatite A ou gama globulina humana adsorvida a SBA-15 revelou aumento nos títulos de anticorpos específicos IgG e IgA, comprovando que a sílica não interfere na polarização da resposta imunológica dos tipos TH1 ou TH2. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a SBA-15 atuou no recrutamento de fagócitos e no aumento dos números de linfócitos B e T nas placas de Peyer e linfonodos mesentéricos de animais imunizados, sugerindo a proliferação de células imunocompetentes. A administração subcutânea de SBA-15 em camundongos geneticamente selecionados para máxima [AIRMAX] ou mínima [AIRMIN] resposta inflamatória aguda confirmou o baixo potencial inflamatório e a não toxicidade dessa nanopartícula. Os resultados comprovam que a SBA-15 é um adjuvante seguro e eficiente, especialmente nas imunizações pela via oral. / The nanostructured SBA-15 silica is a polymer that due to its physicochemical properties shows great potential as a mucosal adjuvant. Immunization by the oral route of mice with Hepatitis A vaccine or human gama globulin adsorbed/encapsulated in SBA-15 revealed increases in the IgG e IgA specific antibody titers and showed that this silica does not interfere in the polarization of TH1 or TH2 immune responses. Flow cytometry assays demonstrated that SBA-15 was efficient in the recruitment of phagocytes and in the increasing numbers of B and T lymphocytes in Peyer´s patches and mesenteric lymph nodes of immunized mice, promoting the proliferation of immunocompetent cells. Subcutaneous administration of SBA-15 in the genetically selected mice for high [AIRMAX] or low [AIRMIN] acute inflammatory responses indicated the low inflammatory potential and the non-toxicity of this nanoparticle. Results ascertain that SBA-15 silica is an effective and safe adjuvant especially in immunizations by the oral route.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada por fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides - P. brasiliensis ou P. lutzii. A alta incidência da PCM no Brasil, somada à gravidade que o quadro clínico pode assumir e ainda à ausência de um antifúngico de baixa toxicidade para tratamento de curta duração, motivaram a avaliação de adjuvantes e caracterização dos componentes antigênicos de P. brasiliensis em um modelo imunoterapêutico de PCM. Assim, inicialmente, avaliou-se o efeito de monofosforil lipídeo A (MPLA) de Salmonella minnesota, PAM3CSK4, hidróxido de alumínio e AS04 em camundongos cronicamente infectados com P. brasiliensis. Quando camundongos da linhagem BALB/c foram infectados pela via intratraqueal com 3 × 105 leveduras de P. brasiliensis, tratados no dia 20 após a infecção com um dos adjuvantes e analisados 30 dias após a administração do tratamento, observou-se que MPLA, ao contrário dos outros adjuvantes, induziu (1) uma redução significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC), (2) uma expressiva diminuição no número de granulomas e células fúngicas no tecido pulmonar e (3) uma resposta imunológica protetora (Th1) quando comparado aos animais controle tratados com PBS. Quanto ao rastreamento de antígenos de P. brasiliensis candidatos a agentes terapêuticos, evidenciou-se que as frações proteicas da preparação de exoantígenos (ExoAg) eram as mais promissoras. Dentre essas frações, a que continha o ExoAg majoritário diidrolipoil desidrogenase induziu maior porcentagem de proliferação de linfócitos T CD3+ esplênicos de camundongos infectados e tratados com MPLA. O gene de diidrolipoil desidrogenase foi clonado em vetor de expressão e a proteína recombinante produzida, purificada e utilizada no protocolo terapêutico da PCM experimental. Surpreendentemente, a administração terapêutica de diidrolipoil desidrogenase recombinante induziu uma redução significativa na contagem de UFC dos animais infectados cronicamente com P. brasiliensis, mesmo na ausência de adjuvantes, o que não foi observado quando foi administrada a preparação de ExoAg nos animais. A localização subcelular de diidrolipoil desidrogenase, por microscopia eletrônica de transmissão, utilizando anticorpos policlonais de camundongos contra essa proteína, mostrou que a mesma está localizada na mitocôndria e também no citoplasma. A análise da expressão gênica diferencial de diidrolipoil desidrogenase em P. brasiliensis mostrou que essa proteína é significativamente mais expressa em leveduras em comparação a hifas e formas de transição. Em conclusão, nossos resultados mostram os efeitos benéficos de MPLA na PCM experimental e sugerem que diidrolipoil desidrogenase é um alvo terapêutico potencial para o tratamento da PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides - P. brasiliensis and P. lutzii. The high incidence of PCM in Brazil, added to the severity of the disease and the absence of an antifungal that brings together low toxicity and short-term treatment, led us to evaluate adjuvants and characterize antigenic components of P. brasiliensis that could be used as immunotherapy in an experimental model of PCM. In this work, firstly, we evaluated monophosphoryl lipid A (MPLA) from Salmonella minnesota, PAM3CSK4, aluminum hydroxide and AS04 in mice chronically infected with P. brasiliensis. When mice were infected intratracheally with 3 × 105 P. brasiliensis yeasts, treated with one of the adjuvants or vehicle on day 20 postinfection, and analyzed 30 days after the treatment, we observed that MPLA, unlike other adjuvants, induced (1) a significant reduction in the number of colony forming units (CFU) in the lungs of the mice, (2) an expressive decrease of granulomas and yeast cells in lung tissue, and (3) a more protective immune response (Th1) when compared with the control mice. Concerning to detection of antigens for PCM therapy, we noticed that among the fractions of a preparation of exoantigens (ExoAg), the one containing the protein identified as dihydrolipoyl dehydrogenase induced a high percentage of proliferation of splenic CD3+ T lymphocytes from mice infected and treated with MPLA. The gene of dihydrolipoyl dehydrogenase was cloned into expression plasmid vector, and the recombinant protein produced, purified and used in the therapeutic protocol of experimental PCM. Surprisingly, the therapeutic administration of recombinant dihydrolipoyl dehydrogenase, but not ExoAg preparation, induced a significant reduction in fungal load in the animals chronically infected with P. brasiliensis, even in the absence of adjuvants. Immunogold labeling and transmission electron microscopy revealed that the dihydrolipoyl dehydrogenase is localized in mitochondria and cytoplasm of P. brasiliensis. The differential expression of dihydrolipoyl dehydrogenase gene in P. brasiliensis showed that yeast had an expression more significant than hyphae, with an intermediate level of gene expression in the transitional forms. In conclusion, our results show that MPLA and dihydrolipoyl dehydrogenase are potential therapeutic targets for the treatment of PCM due to their beneficial effects in a therapy model of PCM.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:46:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mattos_IvesBernardellide_M.pdf: 15060536 bytes, checksum: 32a633419d15c105fec735cb5753d5b2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada / Abstract: The abstract is available with the full electronic document when available / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:47:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_DaniloAntonini_M.pdf: 4789463 bytes, checksum: cb7f3cabfd7df63e9dc00316cb7c8a10 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Vesículas da membrana externa ou outer membrane vesicles (OMV) são nanopartículas liberadas no meio de cultura durante o crescimento bacteriano resultantes de evaginações da membrana externa. A OMV é composta por antígenos presentes na membrana externa bacteriana, como porinas e lipo-oligossacarídeos - LOS, proporcionando a estas estruturas um efeito imuno-estimulatório, sendo alvo potencial para a produção de vacinas. Este trabalho teve como objetivo analisar a utilização de OMV de Neisseria meningitidis IAL 2443, linhagem pertencente ao sorogrupo B causadora de meningites no estado de São Paulo, com nanopartículas de sílica mesoporosa SBA-15 e SBA-16 no processo de imunização vacinal. Utilizou-se o processo fermentativo em estado semi-sólido para o crescimento bacteriano e um processo de ultracentrifugação para isolamento da OMV. Comparou-se a produção de OMV de linhagens de N. meningitidis selvagens IAL 2443 e C2135 e mutante knock-out para o gene responsável pela produção de pilina - C2135_pilE. A atividade imunológica foi verificada por meio da imunização em camundongos Swiss e a verificação da citotoxicidade foi realizada em cultura celular utilizando células VERO e NHI 3T3. Os resultados mostraram que as diferentes linhagens de N. meningitidis possuem cinéticas de produção de OMVs distintas em tempo e quantidade. A não expressão de pilE também afeta a cinética da produção dessas estruturas. O uso de adjuvantes de sílica mesoporosa SBA- 15 e SBA- 16 com a OMV IAL 2443 aumenta o reconhecimento pelo sistema imunológico, consequentemente elevando o número de anticorpos específicos frente a mesma cepa bacteriana e a outras linhagens do mesmo sorotipo e sorotipos diferentes. O teste de citotoxicidade em células VERO e NHI 3T3 demonstrou inocuidade nas preparações com SBA- 15 e SBA- 16, atestando a segurança no uso destas preparações como adjuvantes vacinais. O estudo demonstrou que a metodologia utilizada para produção de OMV é vantajosa do ponto de vista quantitativo e econômico e o uso de SBA- 15 e SBA- 16 apresenta potencial como adjuvante em vacinas baseadas em OMV / Abstract: Outer membrane vesicles or OMV are nanoparticles released into the culture medium during bacterial growth resulting from evaginations of the outer membrane. The OMV consists of antigens present in the bacterial outer membrane, like porins and lipooligosaccharides - LOS, these structures provide an immuno-stimulatory effect, and potential target for vaccine production. This study aimed to analyze the use OMV of Neisseria meningitidis IAL2443, belonging to serogroup B strain causing meningitis in São Paulo, as vaccine using the mesoporous silica SBA-15 and SBA-16 in the immunization process. Fermentation process was used in semi-solid state for bacterial growth and a process of ultracentrifugation for the isolation these OMV. It was compared to OMV production of strains of N.meningitidis strains IAL 2443 and C2135, and knock-out mutant for the gene responsible for producing pilin - C2135_pilE. The immunological activity was measured by immunization in Swiss mice and verification of cytotoxicity was performed in cell culture using VERO cells and NIH 3T3. The results showed that different strains of N. meningitidis have OMVs kinetics of production of different time and quantity. The expression does not pile also affects the kinetics of production of these structures. The use of adjuvants mesoporous silica SBA-15 and SBA-16 with the IAL2443 OMV increases the recognition by the immune system, thus bringing the number of specific antibodies against the same bacterial strain and other strains of the same serotype and different serotypes. The cytotoxicity test in NIH 3T3 cells showed VERO and safety in preparation adjuvanted with SBA-15 and SBA-16, confirming the safe use of these preparations as vaccine adjuvants. The study showed that the methodology used for the production of OMV is advantageous from the point of view of quantity and cost and use of SBA-15 and SBA-16 has potential as an adjuvant in vaccines based on OMV / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_katia_leston_bacelo.pdf: 1389207 bytes, checksum: b5ad0bea30c73a3ecb9d5b196b2a8b64 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / A major challenge for the development of vaccines based on purified or recombinant protein subunits, and synthetic peptides resides in the fact that these are poorly immunogenic and mobilize insufficient immunoprotective response. Adjuvants are often used in association with these subunits in order to amplify and direct the immune response induced. Nowadays, there is a wide range of compounds that demonstrate adjuvant activity, however, few are approved for human use, and these often fail to induce appropriate immune response against a particular pathogen. Thus, there is a need to develop new adjuvants that are safe, effective and represent an alternative to currently available. In the present study, we used as a model antigen the non- identical portion of the Leptospira LigA protein (Leptospiral immunoglobulin-like protein A), an outer membrane protein of great interest as a mediator pathogenic mechanisms, used in serological diagnosis and as experimental vaccines. This antigen was formulated with various adjuvants, and the formulations tested for their immunoprotective potential in hamsters, challenged with a virulent strain of L. interrogans serovar Copenhageni. For this, the LigAni protein was produced in recombinant form (rLigAni) using Escherichia coli as the expression system and associated to xanthan polysaccharide, in its variants xanthan pruni strains 106 (X1) and 101 (X2), commercial xanthan and also to oligodinucleotídeo CpG (CpG ODN), carbon nanotubes (CNTs) and aluminum hydroxide (Alhydrogel). Formulations containing rLigAni associated with xanthan polysaccharide and CNTs induced significant IgG antibody titers, comparable to that induced when the protein was associated with Alhydrogel. Protection against lethal challenge was observed in 100%, 100%, 67% and 50% of the hamsters immunized with rLigAni-X1, rLigAni- CpG-X1, rLigAni-Alhydrogel and rLigAni-X2, respectively (Fisher test P < 0.05). The preparations containing rLigAni associated with CNTs, although induced an antibody response, failed to confer immunoprotection. Additionally, xanthan and CNTs adjuvants were not toxic to Chinese hamster ovary (CHO) cells, in vitro. The results of this study indicate xanthan as a new adjuvant for subunit vaccines against leptospirosis, presenting the ability to potentiate the immune response against the antigen, besides biocompatibility and the possibility of reduction of number of doses required for protection. / O maior desafio para o desenvolvimento de vacinas baseadas em subunidades proteicas, recombinantes ou purificadas e peptídeos sintéticos, reside no fato destas serem pouco imunogênicas e mobilizarem uma resposta imunoprotetora insuficiente. Adjuvantes são utilizados associados a estas subunidades com o intuito de amplificar e direcionar a resposta imune induzida. Na atualidade, existe uma grande gama de compostos que demostram ação adjuvante, contudo, poucos são aprovados para uso humano, e estes muitas vezes falham em induzir resposta imune adequada contra determinado agente patogênico. Assim, existe a necessidade do desenvolvimento de novos adjuvantes que sejam seguros, efetivos e representem uma alternativa aos atualmente disponíveis. No presente estudo, utilizamos como antígeno modelo a porção não-idêntica da proteína LigA (Leptospiral immunoglobulin-like protein A) de Leptospira spp., uma proteína de membrana externa de grande interesse como mediadora de mecanismos de patogenicidade, utilizada em sorodiagnóstico e em vacinas experimentais. Esta proteína foi associada a diferentes adjuvantes, e as formulações testadas quanto ao seu potencial imunoprotetor em hamsters desafiados com cepa virulenta de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni. Para isso, a proteína LigAni foi produzida em sua forma recombinante (rLigAni) utilizando Escherichia coli como sistema de expressão e associada ao polissacarídeo xantana, em suas variantes xantana pruni cepas 106 (X1) e 101 (X2), xantana comercial, e também ao oligodinucleotídeo CpG (CpG ODN), nanotubos de carbono (CNTs) e hidróxido de alumínio (Alhydrogel). Formulações contendo rLigAni associada ao polissacarídeo xantana e aos CNTs induziram títulos de anticorpos IgG significativos e comparáveis aos induzidos quando a proteína foi associada ao Alhydrogel. Proteção contra o desafio letal foi observada em 100%, 100%, 67% e 50% dos hamsters imunizados com rLigAni-X1, rLigAni-CpG-X1, rLigAni-Alhydrogel e rLigAni-X2, respectivamente (Fisher test P < 0,05). As preparações contendo rLigAni associada aos CNTs, embora tenham induzido resposta de anticorpos, falharam em conferir imunoproteção. Adicionalmente, os adjuvantes xantana e CNTs não se mostraram tóxicos em células de ovário de hamster Chinês (CHO), in vitro. Os resultados desse estudo apontam a xantana como um novo adjuvante para vacinas de subunidade contra leptospirose, apresentando a propriedade de potencializar a resposta imune contra o antígeno, além de biocompatibilidade e a possibilidade de redução no número de doses requeridas para proteção.

Weed plants are currently one of the main factors to restrain crop yield worldwide. The mycoherbicides are considered an important alternative to aim weed plants management, because of its efficiency of control and low environmental impact. The aim of the present study was to evaluate the herbicidal effect of secondary metabolites of the fungus Diaporthe sp. isolated from Solanum americanum plant to the control of different species of weeds and crops. In this sense, bioassays were carried with pre-emergence application (primary assessment) and post-emergency aplication (secondary assessment) plants in laboratory and greenhouse. Secondary metabolites were obtained through a process of submerged fermentation in a benchtop bioreactor. Assessment was carried out in the laboratory by means of germination tests on seeds for the species Glycine max, Cucumis sativus, Sorghum halepense, Oryza sativa, Triticum aestivum and Lolium multiflorum. To this, polyethylene boxes were used, which contained germitest role as substrate, previously soaked in 10 mL of secondary metabolites. In each box were equidistantly allocated 25 seeds, and right after capped and sealed with parafilm and taken to a germination chamber for a period of seven days. As for the secondary assessment two experiments were carried in a greenhouse. Experiment 1 was composed by applying different doses of secondary metabolites (0, 1 / 4D 1 / 2D, D, 2D, 4D and 8D) on the aerial part of the plants species Glycine max, Conyza sp., Oryza sativa, Echinochloa sp., Triticum aestivum and Lolium multiflorum. To the experiment 2 these same plant species were used. However, the treatments consisted of mix between commercial herbicides and secondary metabolites to assess a possible synergism caused by the mixture of the compounds. In addition, an adjuvant was added together with the secondary metabolites to verify any improvement on the herbicide effect. For both experiments were evaluated the dry mass weight of the aerial part, phytotoxicity and control efficiency. The results obtained in the primary evaluation demonstrated that the secondary metabolites applied at pre emergency inhibited germination for the species used in the study at a rate of 100%. On the secondary assessment for the experiment 1, the highest dose resulted in a weight reduction of plants aerial dry mass for the species Glycine max and Conyza sp. At Experiment 2 no synergism was found for the mixture of secondary metabolites and commercial herbicides to any of the plant species. The addition of an adjuvant to secondary metabolites resulted in better action against the species Glycine max, Echinochloa sp. and Lolium multiflorum. / As plantas daninhas são atualmente um dos principais fatores que limitam a produtividade das culturas agrícolas no mundo. Os bioherbicidas são considerados como uma importante alternativa para auxiliar no manejo de plantas daninhas, em função de propiciarem eficiente controle e do baixo impacto ambiental. Desta maneira o presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito herbicida dos metabólitos secundários do fungo Diaporthe sp. isolado da planta Solanum americanum no controle de distintas espécies de plantas daninhas e de culturas agrícolas. Para isto foram realizados bioensaios em pré-emergência (avaliação primária) e pós-emergência (avaliação secundária) de plantas em laboratório e em casa de vegetação. Os metabólitos secundários foram obtidos, por meio de um processo de fermentação submersa do microrganismo em um biorreator de bancada. A avaliação primária foi realizada em laboratório, por meio de testes germinativos de sementes para as espécies glycine max, Cucumis sativus, Sorghum halepense, Oryza sativa, Triticum aestivum e Lolium multiflorum. Para isto foram utilizadas caixas de polietileno do tipo gerbox, as quais continham papel germitest como substrato, previamente embebidos em 10 mL dos metabólitos secundários. Em cada caixa foram alocadas 25 sementes de forma equidistante, sendo as mesmas, logo em seguida tampadas e seladas com Parafilm e então levadas para uma câmara de germinação pelo período de sete dias. Já para na avaliação secundária foram realizados dois experimentos em casa de vegetação. O experimento 1 foi composto pela aplicação de diferentes doses dos metabólitos secundários (0, 1/4D, 1/2D, D, 2D, 4D e 8D) via parte aérea de plantas para as espécies glycine max, Conyza sp., Oryza sativa, Echinochloa sp., Triticum aestivum e Lolium multiflorum. Para o experimento 2 foram utilizadas estas mesmas espécies de plantas. Todavia, os tratamentos foram compostos pela mistura entre herbicidas comercias e metabólitos secundários para avaliar um possível sinergismo ocasionado pela mistura entre os compostos. Além disto, realizou-se a adição de um adjuvante junto aos metabólitos secundários para verificar uma melhora na ação herbicida dos mesmos. Para os dois experimentos foram realizadas avaliações para, o peso da massa seca da parte aérea das plantas, bem como também, fitotoxicidade e controle de plantas. Os resultados obtidos para avaliação primária demonstraram que os metabólitos secundários aplicados de forma pré-emergente inibiram a germinação para as espécies utilizadas no estudo na ordem de 100%. Na avaliação secundária para o experimento 1, as maiores doses resultaram em uma redução do peso da massa seca da parte aérea das plantas para as espécies Glycine max e Conyza sp. Já para o experimento 2 não verificou-se sinergismo para a mistura dos herbicidas comercias e metabólitos secundários para nenhuma das espécies de plantas. A adição de um adjuvante aos metabólitos secundários resultou em melhor ação dos mesmos para as espécies de Glycine max, Echinochloa sp. e Lolium multiflorum.

Peptídeos de defesa do hospedeiro antimicrobiano (PDHA) são componentes do sistema imune inato podem ser expressos constitutivamente ou induzidos por componentes bacterianos, citocinas, ou a combinação de ambos. Estes peptídeos possuem ação direta sobre microrganismo e são potentes imunomoduladores de células de mamíferos. A microplusina é um peptídeo antimicrobiano quelante de cobre, originário do aracnídeo Tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus, com massa molecular de 10 204 Da. Este peptídeo possue atividade bacteriostática sobre Micrococcus luteus, mas sem atividade microbicida sobre E. coli e Candida albicans. Neste trabalho foi analisado o efeito direto da microplusina em cultura de macrófagos derivados de medula óssea (MDM) tratados ou não com LPS ou IFN-&#947. Foi demonstrado que este peptídeo não teve efeito citotóxico para macrófagos, não estimulou a síntese de NO e IL-1&#946, mas aumentou a produção de TNF-&#945 e IL-6 após estímulo. O pré-tratamento dos macrófagos com microplusina, antes da adição do LPS, não modificou o nível de nitrito, TNF-&#945 ou IL-6 em resposta ao LPS. Quando os macrófagos foram pré-tratados com microplusina e posteriormente incubados com IFN-&#947 houve aumento significativo da produção de NO e TNF-&#945, confirmando a natureza pró-inflamatória deste peptídeo. Isto indica que a microplusina é um agente imunomodulador da resposta imune inata e pode auxiliar no controle de infecções por microrganismos patogênicos. / Antimicrobial host defense peptides are components of the innate immune system. They are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines or the combination of both are expressed constitutively or induced by bacterial components, cytokines, or a combination of both. These peptides have direct action on microorganisms and are potent immunomodulators in mammalian cells. Microplusin is a copper II-chelating antimicrobial peptide from the Tick Rhipicephalus ( Boophilus) microplus, with a molecular mass of 10 204 Da. This peptide has a bacteriostatic activity against Micrococcus luteus, but no activity against E. coli and Candida albicans. The aim of the present work was to analyze the direct effect of microplusin in the culture of murine bone marrow derivated macrophages (BDM) treated or not with LPS or IFN-&#947. Our data showed that microplusin had no cytotoxic effect on macrophages, did not stimulate the synthesis of NO and IL-1&#946, but increased the production of TNF-&#945 and IL-6 after stimulation. The pre-treatment of macrophages with microplusin before LPS addition did not change the level of nitrite, TNF-&#945 or IL-6 in response to LPS. If the microplusin pre-treated macrophages were incubated with IFN-&#947 there was evidence that microplusin led to significant increase of NO and TNF-&#945 production confirming the pro-inflammatory characteristic of microplusin and its potential against pathogenic microorganisms. This indicates microplusin to be a potential immunomodulating agent of innate immunity and may help to control infections by pathogenic microorganisms.

Atualmente várias substâncias estão sendo avaliadas quanto à sua possível atividade adjuvante, apresentando alta potência, mas também alta toxicidade, que os impede de serem introduzidos numa rotina clínica, como o lipopolissacarídio (LPS), componente da parede celular das bactérias Gram negativas. Estudos têm estimulado o desenvolvimento de derivados de LPS com propriedades potencialmente úteis, um dos exemplos mais conhecidos é o monofosforil lipídio A (MPL), desenvolvido como adjuvante para a aplicação em vacinas de uso humano. O objetivo deste estudo foi caracterizar um sub-produto do LPS de Bordetella pertussis (BpLipídioA), através do desenvolvimento e padronização de testes de controle de qualidade, visando a posterior utilização deste sub-produto como adjuvante vacinal. O conhecimento adquirido sobre o produto durante as fases de pesquisa e desenvolvimento conduziu à seleção de testes físico-químicos, biológicos e microbiológicos, bem como sua faixa de aceitação e limites de detecção. A atividade adjuvante deste produto foi realizada com a Vacina de Hepatite B Recombinante e apresentou resultados promissores. O BpLipídioA foi formulado em emulsão óleo em água, onde foi verificada a estabilidade deste composto. A utilização deste produto em emulsão ou suspensão apresentou-se possível e permite a redução da quantidade de antígeno na dose vacinal, o que aumenta a capacidade de produção das vacinas. / Currently a number of substances are being evaluated for possible adjuvant activity, with high power but also high toxicity, which prevents them from being introduced into clinical routine, such as lipopolysaccharide (LPS), cell wall component of Gram negative bacteria. The aim of this study was to characterize a byproduct of Bordetella pertussis LPS (BpLipídioA), through the development and standardization of quality control tests in order to later use this sub-product as an adjuvant vaccine. The knowledge about the product during all phases of research and development led to the selection of optimal physico-chemical, biological and microbiological tests as well as its acceptable range and detection limits. The adjuvant activity of this product was performed with the recombinant hepatitis B vaccine, which showed promissory results. Using this product in emulsion or suspension forms had to be possible to reduce the amount of antigen in the vaccine dose, which increases the installed production capacity of vaccines.

A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Foi avaliado o potencial adjuvante da flagelina FliCi de Salmonella enterica sorovar Thyphimurium na indução de resposta imunoprotetora em uma formulação vacinal acelular composta pela proteína LigAc e por seis prováveis lipoproteínas de membrana externa recombinantes de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni como alternativa profilática. Grupos de hamsters imunizados com LigAc co-administrada com o pool das proteínas acrescidas de FliCi ou Al(OH)3 apresentaram altos títulos de anticorpos contra as proteínas recombinantes e foram protegidos do desafio letal (86-100%). Grupos imunizados com vacina comercial, bacterina ou pool+LigAc+FliCi apresentaram redução na colonização renal (0-28%). Dados sugerem aumento da expressão dos genes das citocinas de resposta Th1/Th2. Os resultados demonstram que novas formulações vacinais, compostas por proteínas recombinantes e flagelina FliCi como adjuvante, é um caminho promissor. / Leptospirosis is a global zoonotic disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. In the present study, we evaluated the adjuvant activity of Salmonella enterica FliCi flagellin in the protective immunity induced by the LigAc and also by six other novel recombinant leptospiral outer membrane lipoproteins (OMP) of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Immunization of hamsters with LigAc or LigAc coadministered with OMPs cocktail, both with FliCi or Al(OH)3, induced robust antibody responses against recombinant proteins, and conferred protection after challenge (86-100%). Moreover, only groups inoculated with the commercial vaccine, bacterin or LigAc coadministered with OMPs cocktail and FliCi as adjuvant showed reduced bacterial load in kidneys (0-28%) with significant enhancement of gene expression of both Th1 and Th2 cytokines. Taken together, our data pave the way for the development of novel vaccine formulations against leptospirosis, using recombinant proteins and FliCi as adjuvant.

O processo de micrencapsulação de proteínas em microesferas (MS) de PLGA [poli (ácido lactico-co-glicolico)] é fácil de fazer e é uma ferramenta útil para melhorar tanto uma formulação quanto para aumentar a atividade imunológica de vacinas de novas gerações. A MS-PLGA têm caráter adjuvante porque é um sistema particulado e, além disto, controla a liberação do antígeno. O escopo desta tese foi o de dar uma nova roupagem para um antígeno vacinal tradicional e muito bem estudado- o toxoide diftérico (Dtxd). Estudaram-se a produção de MS de tamanho desejado; os mecanismos que controlam danos nas proteínas durante o processo de micrencapsulação; a produção de microesferas com características de liberações em tempos distintos e ensaios biológicos. O tamanho de MS é um determinante fundamental para controlar a velocidade de liberação de um soluto. Para se produzir MS com tamanhos controlados usou-se um desenho fatorial experimental com três fatores distintos e três pontos centrais, para se determinar a influência das variáveis (concentração de poli álcool vinílico; velocidade de agitação e relação fase dispersa/fase contínua) na determinação do tamanho das MS. Foram obtidas MS esféricas e lisas de 4- 15 &#181;m de diâmetro. Estes resultados abrem a possibilidade de se formular PLGA-MS com tamanhos planejados através de um mínimo de experimentos. O mecanismo de danos conformacionais nas proteínas nas várias fases do processo de produção de PLGA-MS é ainda uma questão em aberto. Usaram-se várias técnicas biofísicas (HPLC, espectroscopias no uv, fluorescência e CD) além de ELISA para se testar a interferência dos sais da série de Hofmeister sobre a solubilidade e estabilidade da proteína durante a emulsificação e do contacto com a interface água/cloreto de metileno (primeira etapa do processo de preparação de MS). Estudaram-se também a influência de oligômeros de PLGA e SDS sobre a estrutura da proteína no meio de liberação (etapa de liberação do soluto). A emulsificação de Dtxd na presença de Mg2+ induziu agregação protéica, com exposição de resíduos hidrofóbicos para o meio; variações no ângulo diédrico do S-S proteico e perda de identidade imunológica. Esta agregação foi quase abolida pelo caotrópico SCN- (toxicidade = 30 g/ homem adulto de 70 kg). A conformação \"nativa\" do Dtxd e sua atividade biológica foram protegidas pelo KSCN. Os oligômeros de PLGA e o SDS induziram uma conformação de Dtxd nova. A adição de KSCN na fase aquosa aumentou a eficiência de encapsulação de Dtxd pela PLGA-MS em 20 %. Esta foi a solução mais simples quando comparada com aquelas descritas na literatura. Produziram-se seis formulações diferentes (diferentes massas molares e carboximetilações do PLGA) com pelo menos três cinéticas de liberações distintas. Imunizaram-se camundongos com 5 &#181;g de Dtxd encapsulado em MS-PLGA usando-se dois polímeros de 12 kDa (-COOH livre ou metilado) e um outro de 63 kDa (metilado). O padrão de resposta e a maturidade imunológicas foram medidos por titulações de IgG1 e IgG2a. Mantiveram-se os mesmos padrões de resposta humoral (desejável). Menores quantidades de antígenos foram necessárias para se obter os mesmos benefícios gerados pela vacina tradicional de Dtxd. Aumentaram-se a produção e a seletividade de anticorpos através de duas manipulações simples: a formulação e o tempo da aplicação da dose de reforço. Estes resultados colocam estas formulações na área de vacinas de sucesso uma vez que também foram obtidas memórias imunológicas. / The protein microencapsulation within microspheres (MS) of PLGA (Poly-lactide-co-glycolide) is easy to do and, it is a useful tool to enhance formulation and immunologic performances for new generation vaccines. MS-PLGA has adjuvant character because it is a particulate system and can control the antigen release. The question addressed in this thesis was to give this new dress for the traditional and well studied vaccine antigen - the diphtheria toxoid (Dtxd). The steps of MS control size production; mechanism to control protein damages; MS production with different polymers and biological assay were addressed here. MS size is a primary determinant of solute release velocity. A full factorial experimental design 23 with triplicate at the central point was used to determine the influence of variables (polyvinyl alcohol concentration, stirring velocity and the relationship between dispersed /continuous phase) on MS size. Uniformly spherical and smooth microspheres (4 - 15 &#181;m of diameter) were obtained. These results open the possibility of formulating PLGA microspheres with custom sizes performing a minimum of experiments as required for specific applications. It stills an open question to detail the conformational mechanism of protein damages during the various steps of the PLGA microencapsulation process. Various techniques (HPLC gel filtration, ELISA, Fluorescence, UV and Circular dichroism spectroscopies) were tested on the interference of the Hofmeister ion series over protein solubility and stability during the emulsification and contact with the interface water/CH2Cl2 interface (First step on MS preparation). The interference of SDS and PLGA olygomers over protein structure in the liberation media was also studied (solute liberation step). The Dtxd emulsification in the presence of Mg2+ was followed by protein aggregation, with exposition of hydrophobic residues and changes on the dihedral S-S protein angle and loses on immunological identity. This aggregation is 95% avoided by the chaotropic and little toxic salt KSCN (30g/ adult human of 70 kg). All the \"native\" Dtxd conformation and biological properties were maintained by KSCN. MS with different liberation kinetics profile and different erosion characteristics were obtained by using six different polymers. The SDS and PLGA olygomers exerted a generation of new Dtxd molecular organization. The KSCN increased Dtxd encapsulation within PLGA-MS in more than 20 %. This was the simplest solution used to solve protein aggregation compared with others solutions used in the literature. The six different formulations produced (differing in molar mass and carboxymethylation) produced, at least, three different Dtxd liberation profiles. Mice were primed with 5 µg of Dtxd microencapsulated within MS prepared with 12 kDa (ended carboxymethylated or free PLGA) and with 63 kDa (methylated) PLGA. The response patterns and the immune maturity were measured by IgG1 and IgG2a titrations. The humoral pattern was maintained, but fewer antigens were needed to obtain the same traditional Dtxd vaccine benefits. The simple change on Dtxd-PLGA formulation and timing of the booster enhanced both, antibody production and selectivity. An immunological memory was also obtained, putting so, these formulations in the field of successful vaccine.