A alta taxa de replicação celular no tumor, aumenta a demanda de ácidos graxos para composição de membrana e de nucleotídeos para síntese de DNA. Visto que a síntese de ambos depende de intermediários do ciclo de Krebs e que no tumor a maior parte da glicose disponível é convertida a ácido lático (e não a acetil-coA, como ocorre na célula normal), a glutamina passa a ser a principal fonte de intermediários do ciclo de Krebs para síntese de ácidos graxos e de nucleotídeos. Além da glutamina, outros aminoácidos têm seu metabolismo alterado no tumor. Assim, os objetivos do trabalho foram comparar o perfil de ácidos graxos e de aminoácidos em tecido tumoral e tecido normal adjacente de pacientes com carcinoma espinocelular de mucosa de cabeça e pescoço, quantificar lipídeos totais nas amostras e avaliar o estado nutricional dos pacientes. Participaram da pesquisa pacientes internados junto ao Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. As amostras de tecido tumoral e de tecido normal foram coletadas durante procedimento cirúrgico, após excisão do tumor. A extração dos lipídeos e dos aminoácidos livres foi realizada pelo método de Folch. A determinação de ácidos graxos livres e totais foi realizada por cromatografia gasosa/espectrometria de massa. A análise de aminoácidos foi realizada por cromatografia gasosa com detector de chama. A avaliação nutricional incluiu: aferição de peso, estatura, dobras cutâneas e exame de impedância bioelétrica para estimativa de composição corporal, além de avaliação da ingestão alimentar por questionário de freqüência alimentar. Não foi verificada diferença na concentração de lipídeos totais e dos ácidos palmítico, esteárico e oléico. Quanto à análise de aminoácidos, apenas a alanina, metionina e a lisina não mostraram diferença entre tecido tumoral e normal. Os demais aminoácidos apresentaram-se aumentados no tumor em relação à margem. A extração de aminoácidos a partir do método de Folch (desenvolvido para extração de lipídeos) possibilita a determinação de ácidos graxos e de aminoácidos livres em fragmentos bastante reduzidos de tecido, como, por exemplo, material obtido a partir de biópsia. O estado nutricional dos pacientes variou de eutrofia a sobrepeso, predominando excesso de gordura corporal, avaliado por impedância bioelétrica. A ingestão alimentar de macronutrientes mostrou-se adequada na maior parte da população avaliada. / Due to its rapid growth, tumor cells need more fatty acids for membrane composition and nucleotides for DNA synthesis. Both fatty acids and nucleotides synthesis depends on Krebs cycle intermediates. As most of glucose available is converted to lactic acid (and not to acetyl-CoA, as occur in normal cells), glutamine is used as major source for Krebs cycle intermediates for fatty acids and nucleotides synthesis. Not only metabolism of glutamine is altered in tumor cells, but also other amino acids. The aims of the study were to compare fatty acid and amino acid profiles in tumoral and adjacent normal tissue of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck, to quantify total lipids in tissue samples and to asses nutritional status of patients. The study included patients diagnosed with squamous cell carcinoma of the head and neck, scheduled for cancer operation within Head and Neck Surgery Service of Clinics Hospital of Ribeirao Preto - University of Sao Paulo. Samples were collected immediately after tumor removal. Lipids and free amino acids were extracted using Folch method. Free and total fatty acids analyses were performed by gas chromatography/mass spectrometer. Amino acids analysis was performed by gas chromatography with flame ionization detector. Nutritional assessment included: weight, height and skinfold measurements, bioelectric impedance exam for estimative of body composition and dietetic assessment through food frequency questionnaire. We observed no difference in total lipids and of palmitic, stearic and oleic fatty acids concentrations in tumor and normal tissues. Only alanine, methionine and lysine showed no difference in tumor and normal tissues. Other amino acids concentrations were higher in tumor compared to normal tissue. Amino acids extraction through Folch method (created for lipid extraction purpose) enables the determination of fatty acid and amino acid in small slices of tissue, as that obtained from biopsy. Nutritional status of patients ranged from eutrophic to overweight, with excess of body fat, assessed by bioelectric impedance. Food intake was adequate in most of patients studied.

A prolina é convertida em glutamato através de dois passos de oxidorredução. Primeiro, prolina é oxidada em D1-pirrolina-5-carboxilato (P5C) que é convertido em glutamato pela TcP5CDH. Neste trabalho demonstrou-se que a enzima TcP5CDH catalisa a oxidação irreversível de gGSA formando glutamato e NADH/NADPH. A TcP5CDH forma um hexâmero que interage com a membrana interna mitocondrial. Os elétrons a partir de NADH abastecem a cadeia transportadora de elétrons para a síntese de ATP. Além disso vimos que a TcP5CDH é regulada positivamente nos estágios infectivos do parasita e, quando esta é induzida pela inserção de uma cópia ectópica, os mutantes apresentam mudanças morfológicas e alterações na expressão da TcGP82. O DSF, reportado como inibidor de aldeído desidrogenasses, interfere na atividade da TcP5CDH, bem como exibiu um efeito tripanocida. Ensaios de RNAi para a TbP5CDH e a análise da expressão desta enzima nas formas do parasita presentes na mosca tsé-tsé também foram discutidos. Os nossos dados reforçam a relevância bioquímica da via prolina-glutamato em T. cruzi, e constituem as primeiras evidências sobre a ocorrência do metabolismo de P5C nessas espécies de tripanossomatídeos. / Proline is converted into glutamate through two oxidorreduction steps. First, prolina is oxidized into D1-pyrroline-5-carboxylate (P5C), which is further converted in glutamate by TcP5CDH. In this work we demonstrate that TcP5CDH catalyzes irreversibly the oxidation of gGSA rendering glutamate and NADH/NADPH. The TcP5CDH undergoes a hexameric conformation interacting with inner mitochondrial membranes. Electrons from NADH fed electron respiratory chain for ATP synthesis. Moreover, we show that TcP5CDH is up regulated in infective stages (M e T). When an additional copy of TcP5CDH was ectopically introduced into parasites, mutant cells exhibited morphological changes and alterations in TcGP82. O DSF, reported as inhibitor of aldehyde dehydrogenases, interferes with TcP5CDH, as well as exhibited a trypanocidal effect. RNAi silencing assays for TbP5CDH and developmental expression of this enzyme throughout main insect stages within tsetse fly were also addressed. Our data support biochemical relevance of proline-glutamate pathway in T. cruzi, and constitute first evidences regarding occurrence of P5C metabolism over these trypanosomatid species.

A produção de tomate (Solanum lycopersicum L.) no estado de São Paulo é de grande importância para a produção brasileira, pois representa 21,5 % da produção total e é o principal estado produtor de tomate de mesa. O tomate de mesa é cultivado por tutoramento das plantas e o cultivo em casas de vegetação é uma prática crescente no Brasil, trazendo muitas vantagens a produção, como proteção às chuvas e pragas. Porém em muitos casos, dependendo da estrutura utilizada, pode ocorrer aumento da temperatura interna das casas de vegetação. O tomateiro é uma planta sensível as altas temperaturas, e alterações dos níveis ótimos podem causar danos no metabolismo e consequentemente na produtividade da cultura. Altas temperaturas no cultivo de tomate são prejudiciais ao seu desenvolvimento, pois alteram a homeostase celular e desregulam funções vitais das plantas, como fotossíntese, gerando em excesso espécies reativas de oxigênio (EROs) como os radicais superóxidos, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxilas, que são tóxicos às plantas e causam estresse oxidativo, levando até a sua morte. Plantas estressadas acumulam solutos osmoprotetores, entre eles a L-prolina, que auxiliam na proteção das estruturas celulares, na eliminação das EROs e também ativam o metabolismo antioxidante das plantas. Além da acumulação endógena de L-prolina, a aplicação exógena desse aminoácido pode trazer vantagens ao alívio do estresse térmico. Esse estudo teve por objetivo avaliar a eficiência da L-prolina nas doses de 0, 50, 100, 200, 400, 800 e 1600 mg/L na nutrição foliar, parâmetros fotossintéticos, enzimas do sistema antioxidante, malonaldeído e peróxido de hidrogênio, produtividade e características pós colheita dos frutos. Os dados climáticos durante o cultivo do tomateiro evidenciaram a ocorrência de temperaturas elevadas durante o ciclo de produção. Assim, foi possível observar que a aplicação exógena de L-prolina nas doses de 50 e 100 mg/L aumentaram a eficiência do uso da água, diminuíram o conteúdo de malonaldeído e aumentaram a produtividade comercial e total de frutos por planta. O uso de 50 mg/L desse aminoácido também proporcionou aumento do número de frutos comerciais por planta. A aplicação de L-prolina, independente da dose, proporcionou diminuição no conteúdo de peróxido de hidrogênio e elevou a atividade das enzimas do sistema antioxidante, além de melhorar a qualidade do fruto, diminuindo a acidez e aumentando a relação SST/ATT. Dessa maneira, constatou-se o efeito positivo do uso exógeno da L-prolina no alívio dos danos causados por altas temperaturas, principalmente em plantas tratadas com 50 e 100 mg/L. / The production of tomato (Solanum lycopersicum L.) in the state of São Paulo is of great importance for the Brazilian production, it represents 21.5% of total production and is the main state table tomato producer. The fresh tomato is grown by staking of plants and cultivation in greenhouses is a growing practice in Brazil, bringing many benefits to production, as protection of rain and pests. However, in many cases, depending on the structure used, there may be an increase in the internal temperature of the greenhouse. The tomato is a plant sensitive to high temperatures, and changes in optimal levels can cause damage to metabolism and consequently crop productivity. High temperatures in tomato cultivation are detrimental to their development, as they alter cellular homeostasis and deregulate vital plant functions, such as photosynthesis, generating in excess reactive oxygen species (ROS) such as superoxide radicals, hydrogen peroxide and hydroxyl radicals, which are toxic to plants and cause oxidative stress, leading to their death. Stressed plants accumulate osmoprotective solutes, including proline, which help protect cell structures, eliminate ROS and also activate plant antioxidant metabolism. In addition to the accumulation of endogenous proline, exogenous application of this amino acid can bring advantages to the relief of heat stress. The objective of this study was to evaluate the efficiency of L-proline at doses of 0, 50, 100, 200, 400, 800 and 1600 mg / L by foliar spray, in photosynthetic parameters, antioxidant system enzymes, malonaldehyde and hydrogen peroxide, productivity and post-harvest characteristics of fruits. The climatic data during tomato cultivation evidenced the occurrence of high temperatures during the production cycle. Thus, it was possible to observe that the exogenous application of L-proline at doses of 50 and 100 mg / L increased the efficiency of water use, decreased malonaldehyde content and increased commercial and total fruit yield per plant. The use of 50 mg / L of this amino acid also provided an increase in the number of commercial fruits per plant. The application of L-proline, regardless of the dose, resulted in a decrease in the hydrogen peroxide content and increased the activity of the antioxidant system enzymes, besides improving fruit quality, decreasing the acidity and increasing the SST/ATT ratio. Thus, there was the positive effect of the exogenous use of L-proline in alleviating the damage caused by high temperatures, especially in plants treated with 50 and 100 mg / L.

INTRODUÇÃO: O destreinamento físico está relacionado com alterações moleculares associadas à perda de massa muscular, rápido acréscimo da massa adiposa, ganho de peso e resistência à insulina. Estudos apontam que a restrição calórica reduz a gordura corporal, contudo, associada com a inatividade física, altera o metabolismo proteico acelerando o catabolismo muscular. Nesse sentido, estudos com suplementação de aminoácidos essenciais, em especial a leucina, observam aumento na síntese proteica e redução da degradação proteica em situações de restrição ou recuperação nutricional. Dessa forma sugere-se que a restrição calórica associada à suplementação com leucina poderia atenuar os efeitos desencadeados pelo destreinamento físico. OBJETIVO: Investigar a influência da suplementação crônica de leucina na via de sinalização da síntese proteica e degradação proteica no tecido muscular a partir de parâmetros moleculares em ratos destreinados, submetidos à restrição calórica. MÉTODOS: Foram utilizados 64 ratos Sprague-Dawley machos e adultos, inicialmente distribuídos em 2 grupos: Controle (CON) (n = 16) representados pelos animais sedentários, e Treinamento (TREIN) (n = 48) que foram submetidos ao treinamento em esteira ergométrica durante oito semanas. Após esse período, os animais foram redistribuído em 6 grupos: Sedentário (SED), Treinamento (TREIN), Destreinamento (DT), Destreinamento + Leucina (LEU), Destreinamento + Restrição Calórica (DTRC) e Destreinamento + Restrição Calórica + Leucina (DTRC + LEU). Foram analisados massa corporal, consumo da ração, composição corporal, sensibilidade a insulina bem como os marcadores de inflamação (IL-6; IL-10; MCP-1; TNF-α; 1L-1α; PAI-1; leptina; adponectina) e parâmetros moleculares como genes e proteínas envolvidas na via de sinalização da síntese protéica (mTOR, P-4EBP1, P-s6K1 e eIF4E); degradação proteica (MAFBx e MURF) além de transportadores de aminoácidos (LAT-1 e SNAT 2 e CD98). ESTATÍSTICA: Os valores foram expressos em média e desvio padrão. As comparações entre os grupos após o período de destreinamento físico foram avaliadas por meio de análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey. Em todas as análises foi considerado nível de significância de 5%. A análise estatística foi realizada no software SPSS versão 17.0. RESULTADOS: Em relação à composição corporal, foi observada diferença estatisticamente significativa na gordura corporal e massa livre de gordura entre os grupos DTRC e DTRC+LEU, em relação aos demais grupos experimentais. Porém não houve diferença estatística entre o DTRC e DTRC+LEU. No entanto não foi observada diferença estatisticamente significativa quando avaliado a proteína da carcaça. Em relação aos parâmetros moleculares, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos, quando avaliada a expressão de proteínas relacionadas com a via de sinalização de síntese proteica (mTOR, P-4EBP1, P-s6K1 e eIF4E) e transportadores de leucina (LAT- 1;SNAT-2;CD(98). Quanto avaliada a expressão gênica da via de degradação, foi observada uma menor expressão do gene MURF quando suplementado com leucina, porém sem diferença estatisticamente significativa. CONCLUSÃO: A restrição calórica associada com a suplementação com leucina foi efetiva na redução da gordura corporal, e aumento da massa livre de gordura, porém não houve diferença estatisticamente significante entre os dois grupos DTRC e DTRC+LEU, tampouco quando avaliada a proteína da carcaça desses animais. Dessa forma, pode-se concluir que a suplementação crônica com leucina não reverteu os efeitos desencadeados pelo destreinamento físico, e, além disso, não foi suficiente para alterar os parâmetros moleculares envolvidos na via de sinalização de síntese e degradação proteica desses animais. / INTRODUCTION: Physical detraining is related to molecular changes associated with loss of muscle mass, rapid increase in fat mass, weight gain and insulin resistance. Studies show that caloric restriction reduces body fat; however, associated with physical inactivity, it alters protein metabolism accelerating muscle catabolism. Accordingly, studies with supplementation of essential amino acids, particularly leucine, observed increase in protein synthesis and reduced protein degradation in situation of nutritional restriction or recovery. Thus, it is suggested that caloric restriction associated with leucine supplementation could attenuate the effects triggered by physical detraining. OBJECTIVE: To investigate the influence of chronic leucine supplementation in the signaling pathway of protein synthesis and degradation in muscle tissue from molecular parameters in detrained rats, subjected to caloric restriction. METHODS: Sixty-four adult male and female Sprague-Dawley rats were used, initially divided into 2 groups: Control (CON) (n = 16) represented by sedentary animals, and Trained (TRAIN) (n = 48) who underwent treadmill training for eight weeks. After this period, the animals were re-distributed into 6 groups: Sedentary (SED), Trained (TRAIN), Detrained (DT), Detrained + Leucine (LEU), Detrained + Caloric Restriction (DTRC) and Detrained + Caloric Restriction + Leucine (DTRC + LEU). Body mass, food consumption, body composition, insulin sensitivity were analyzed, as well as inflammation markers (IL-6; IL-10; MCP-1; TNF-α; 1L-1α; PAI-1; leptin; adiponectin) and molecular parameters, such as genes and proteins involved in signaling pathways of protein synthesis (mTOR, P-4EBP1, P-s6K1 and eIF4E); protein degradation (MAFBx and MURF) and also amino acid transporters (LAT-1, SNAT 2 and CD98). STATISTICAL ANALYSIS: Values were expressed as mean and standard deviation. Analysis of variance (ANOVA) was used for comparisons between groups after physical detraining, followed by Tukey\'s test. A 5% significance level was considered in all analyses. Statistical analysis was performed using SPSS software, version 17.0. RESULTS: In relation to body composition, a statistically significant difference was observed in body fat and fat free mass between groups DTRC and DTRC+LEU, compared with other experimental groups. However, there was no statistical difference between groups DTRC and DTRC+LEU. Nevertheless, no statistically significant difference was found when carcass protein was assessed. In relation to molecular parameters, no statistically significant difference was observed between groups, when protein expression related to the signaling pathway of protein synthesis (mTOR, P-4EBP1, P-s6K1 and eIF4E) and leucine transporters (LAT-1;SNAT-2;CD(98) was assessed. When gene expression of the degradation pathway was investigated, a lower expression of gene MURF was found with leucine supplementation; however, this was not statistically different. CONCLUSION: Caloric restriction associated with leucine supplementation was effective in reducing body fat, and increasing fat free mass; however, no statistically significant difference was found between groups DTRC and DTRC+LEU, nor when carcass protein of these animals was assessed. Therefore, it was concluded that chronic leucine supplementation did not reverse the effects triggered by physical detraining and, in addition, it was not sufficient to change the molecular parameters involved in the signaling pathway of protein synthesis and degradation of these animals.

Este estudo teve como objetivo avaliar relações de valina:lisina digestíveis em dietas com teor reduzido de proteína bruta e os efeitos desta redução sobre desempenho e rendimento de carcaça em frangos de corte. Foram utilizados 1200 pintos machos de um dia de idade, seguindo modelo inteiramente casualizado, com seis tratamentos de seis repetições (exceto controle, com 10 repetições), compostos por 30 aves cada. O tratamento controle (T1) foi formulado seguindo os níveis de proteína bruta (PB) e aminoácidos (AAs) recomendados e os demais tratamentos (T2 a T6) tiveram seus níveis de PB reduzidos (4% em relação ao controle) e variaram em função da relação valina:lisina digestíveis, com 5 níveis equidistantes com intervalos de 0,07:1, variando de 0,63:1 e 0,91:1 em dietas até 21 dias, e 0,64:1 e 0,92:1 em dietas após 21 dias, respectivamente. Foram mensurados as seguintes características de desempenho: ganho de peso, consumo de ração, conversão alimentar, viabilidade criatória e índice de eficiência produtiva. Aos 46 dias de idade seis animais por repetição foram abatidos para determinação de rendimento de carcaça e de cortes comerciais. A cama também foi colhida no começo e final do experimento e seus níveis de nitrogênio analisados para determinação do nitrogênio excretado. As diferentes relações valina:lisina digestíveis não influenciaram o desempenho dos animais (P>0,05), porém afetaram o rendimento de peito, com relação ótima de valina:lisina digestíveis de 0,75. A redução proteica piorou o desempenho dos animais (P≤0,05) durante as primeiras três semanas de criação. Porém após este período tal prejuízo no desempenho não é visualizado. / This study aimed to evaluate relationships valine: lysine in diets with reduced content of crude protein and the effects of this reduction on performance and carcass yield of broiler chickens. Male chicks were used in 1200 than a day old, following complete randomized design with six treatments with six replications (except control, with 10 repetitions), composed of 30 chicks each. The control treatment (T1) was formulated following levels of crude protein (CP) and amino acids (AAs) and other recommended treatments (T2 to T6) had reduced levels of CP (4% compared to control) and varied according the ratio valine: lysine with 5 levels of 0,07:1 equidistant intervals ranging from 0,63:1 and 0,91:1 in the diet up to 21 days, and 0.92 0,64:1: 1 after 21 days on diets, respectively. We measured the following performance characteristics: weight gain, feed intake, feed conversion, viability and productive efficiency. At 46 days of age six animals per replicate were slaughtered for determination of carcass and commercial cuts. The bed was also collected at the beginning and end of the experiment and their levels of nitrogen analyzed for nitrogen excreted. The different relationships valine: lysine did not affect animal performance (P> 0.05), but they affected breast yield, compared with optimal valine: lysine 0.75. Reducing protein worsened performance of animals (P ≤ 0.05) during the first three weeks of creation. But after this period such impairment in performance is not displayed.

Apesar da rápida expansão das aplicações da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em química clínica, a análise de metabólitos de baixo peso molecular e alta polaridade em matrizes biológicas ainda permanece como um grande desafio analítico. Dentre os compostos de grande importância no diagnóstico de doenças metabólicas que ainda carecem de melhores alternativas bioanalíticas destacam-se os aminoácidos. O presente estudo descreve o desenvolvimento e a validação de um novo método para a quantificação de 24 aminoácidos em plasma explorando a cromatografia líquida acoplada a espectrômetros de massas em tandem. Foi construído um método de detecção baseado em SRM (múltiplas reações selecionadas) com duas transições de massas para cada um dos 24 aminoácidos e os 19 padrões internos marcados com isótopos estáveis. Foram avaliadas três estratégias de separação cromatográfica e o melhor desempenho foi obtido com fase reversa com octadecilsilano (C18) com pareamento iônico com o ácido perfluoropentanoico. O método cromatográfico final permitiu a separação dos 24 aminoácidos, com resolução completa dos isômeros: leucina, isoleucina e allo-isoleucina, em 11 minutos incluindo o tempo de re-estabilização da coluna cromatográfica. Os limites de quantificação variaram em 113 fmol a 6 pmol injetados na coluna cromatográfica. A imprecisão obtida nos níveis testados para todos os aminoácidos foi inferior a 14%. O método apresentou linearidade para os intervalos testados chegando a 1,5 mmol.L-1 para vários compostos. Os ensaios de arraste mostraram que os limites máximos obtidos na linearidade não geram nenhuma interferência subsequente. A exatidão do método foi avaliada com amostras provenientes do programa de referência interlaboratorial European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) e com o material de referência certificado do National Institute of Standards and Technology (NIST). Todos os analitos mostraram equivalência estatística com o método desenvolvido. / Despite the widespread use of liquid chromatography coupled to mass spectrometry applications in clinical chemistry, the analysis of low molecular weight and high polar metabolites in biological matrices remains as a major analytical challenge. Notwithstanding the key role played by amino acids in the diagnosis of metabolic diseases, there is still need for improvements in bioanalytical process of these analytes. The present study describes the development and validation of a new method for quantification of 24 amino acids in plasma based on liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Detection and quantification were achieved building a selected reaction monitoring method two mass transitions for each 24 amino acids and 19 stable isotope internal standards. Three chromatographic strategies for separation were evaluated, and best performance was achieved using reversed-phase octadecylsilane with perfluropentanoic acid as ion pairing agent. The separation method allowed separation of 24 amino acids with full resolution for isomers leucine, isoleucine and alloisoleucine in 11 minutes, including column equilibration time. The limits of quantification ranged from 113 fmol to 6 pmol (on column injection). Imprecisions for all evaluated levels and amino acids were less than 14%. The method is linear in all clinical intervals and extending up to 1.5 mmol.L-1. Carryover evaluation demonstrated absence of interference in the following injection throughout the analytical interval. Method accuracy was evaluated analyzing reference samples from European Research Network for evaluation and improvement of screening, Diagnosis and treatment of Inherited disorders of Metabolism (ERNDIM) and National Institute of Standards and Technology (NIST). Statistical equivalence was demonstrated for all analytes using the present method.

The error free repair of DNA double strand breaks through the homologous recombinational repair pathway is essential for organisms of all types to sustain life. A detailed structural and mechanistic understanding of this pathway has been the target of intense study since the identification of bacterial recA, the gene whose product is responsible for the catalysis of DNA strand exchange, in 1965. The work presented here began with defining residues that are important for the assembly and stability of the RecA filament, and progressed to the identification of residues critical for the transfer of ATP-mediated allosteric information between subunits in the protein's helical filament structure. My work then evolved to investigate similar mechanistic details concerning the role of ATP in the human RecA homolog, Rad51. Results from non-conservative mutagenesis studies of the N-terminal region of one subunit and the corresponding interacting surface on the neighboring subunit within the RecA protein, led to the identification of residues critical for the formation of the inactive RecA filament but not the active nucleoprotein filament. Through the use of specifically engineered cysteine substitutions we observed an ATP-induced change in the efficiency of cross subunit disulfide bond formation and concluded that the position of residues in this region as defined by the current crystal structure may not accurately reflect the active form of the protein. These ATP induced changes in positioning led to the further investigation of the allosteric mechanism resulting in the identification of residue Phe217 as the key mediator for ATP-induced information transfer from one subunit to the next. In transitioning to investigate homologous mechanisms in the human pathway I designed a system whereby we can now analyze mutant human proteins in human cells. This was accomplished through the use of RNA interference, fluorescent transgenes, confocal microscopy and measurements of DNA repair. In the process of establishing the system, I made the first reported observation of the cellular localization of one of the Rad51 paralogs, Xrcc3, before and after DNA damage. In addition we found that a damage induced reorganization of the protein does not require the presence of Rad51 and the localization to DNA breaks occurs within 10 minutes. In efforts to characterize the role of ATP in human Rad51 mediated homologous repair of double strand breaks we analyzed two mutations in Rad51 specifically affecting ATP hydrolysis, K133A and K133R. Data presented here suggests that, in the case of human cells, ATP hydrolysis and therefore binding, by Rad51 is essential for successful repair of induced damage.

O aspartato é o precursor comum dos aminoácidos essenciais lisina, treonina, metionina e isoleucina. Devido à deficiência em lisina, a via metabólica do ácido aspártico tem sido estudada em cereais e os resultados obtidos indicaram a importância da aspartato quinase (AK), da homoserina desidrogenase (HSDH) e da dihidrodipicolinato sintase (DHDPS) como enzimas chave na regulação da síntese de lisina. Considerando-se a importância do milho e da quinoa como fontes de proteínas para humanos e animais, os objetivos deste trabalho foram: i) estudar as enzimas AK e HSDH nas sementes dos mutantes B77xB79o5; B37o7; W22o10, W22o11 e W22o13 e de seus respectivos tipos selvagens; ii) caracterizar a enzima DHDPS e analisar a composição de aminoácidos solúveis e incorporados nas proteínas das sementes dos mutantes Oh43o1, Oh43o2, Oh43fl1, Oh43fl2 e no respectivo tipo selvagem; iii) estudar nas sementes as enzimas AK, HSDH e DHDPS e alguns aspectos envolvidos na assimilação de nitrogênio e o perfil de aminoácidos de quinoa. Quando os mutantes B77xB79o5; B37o7; W22o10, W22o11 e W22o13 foram estudados, as análises demonstraram importantes variações nas atividades da AK e da HSDH entre os genótipos quando comparados com os respectivos tipos selvagens. A atividade da DHDPS foi fortemente inibida por lisina e não foram observadas variações significativas entre os genótipos Oh43o1, Oh43o2, Oh43fl1 e Oh43fl2, quando comparados com o genótipo Oh43+. A composição de aminoácidos revelou as maiores concentrações de lisina solúvel e incorporada em proteínas no mutante Oh43o2. Os estudos com quinoa demonstraram a presença de pelo menos duas isoenzimas da AK, uma sensível à inibição por lisina e a outra por treonina, duas isoenzimas da HSDH, uma resistente e a outra sensível à inibição por treonina e uma isoenzima da DHDPS sensível à inibição por lisina. As sementes de quinoa também apresentaram altas concentrações de lisina solúvel e incorporada em proteínas. / Aspartate is the common precursor of the essential amino acids lysine, threonine, methionine and isoleucine. Due to the deficiency in lysine, the aspartate metabolic pathway has been studied in cereal crops and the results obtained have indicated the importance of aspartate kinase (AK), homoserine dehydrogenase (HSDH) and dihydrodipicolinate synthase (DHDPS) as the key enzymes involved in the synthesis of lysine. Considering the importance of maize and quinoa as sources of protein for humans and animals, the objectives of this work were: i) to study the enzymes AK and HSDH in the seeds of the maize mutants B77xB79o5; B37o7; W22o10, W22o11 and W22o13 and their respective wild type; II) to characterize the enzyme DHDPS and to analyze the composition of soluble and amino acids incorporated into proteins in the seeds of the maize mutants Oh43o1, Oh43o2, Oh43fl1 and Oh43fl2 and the wild type OH43+; iii) to study the enzymes AK, HSDH, DHDPS in quinoa seeds and some aspects involved in nitrogen assimilation and amino acids profile. When the mutants B77xB79o5; B37o7: W22o10, W22o11 and W22o13 were studied, the analysis revealed important variations on AK and HSDH activities among the genotypes when compared to their respective wild type. The results indicated that DHDPS was strongly inhibited by lysine, and that there was not significant variation among the mutants Oh43o1, Oh43o2, Oh43fl1 and Oh43fl2 when compared to the wild type. The amino acids composition revealed high concentrations of lysine in the soluble form and incorporated into protein in the Oh43o2 mutant. The study of quinoa seeds allowed the identification of at least two AK isoenzymes, one sensitive to lysine inhibition and another sensitive to threonine, two HSDH isoenzymes, one resistant and another sensitive to threonine inhibition and one DHDPS isoenzyme sensitive to lysine inhibition. Quinoa also exhibited high concentration of soluble lysine and lysine incorporated into protein.

Introdução - A metabolômica permite determinar padrões de variação dos metabólitos entre indivíduos doentes e não doentes, com ou sem ingestão de um determinado alimento ou dieta. Compreender a relação entre metabólitos e doenças metabólicas pode ajudar a combater obesidade e doenças crônicas. Objetivo - Investigar a associação entre o perfil metabolômico de aminoácidos, a ingestão dietética e o estado nutricional em adultos participantes do Inquérito de Saúde no município de São Paulo, Brasil. Métodos - Foram avaliados dados de 168 indivíduos. A análise metabolômica para identificação de 21 aminoácidos foi realizada nas amostras de plasma, utilizando kit AbsoluteIDQTMp180 da Biocrates Life Science AG (Innsbruck, Austria). O consumo alimentar foi estimado por meio da aplicação do questionário de frequência alimentar. Os grupos de aminoácidos e de alimentos foram submetidos à análise fatorial por componente principal. A variável Metabolicamente Saudável foi construída considerando-se as Diretrizes da Sociedade Brasileira de Cardiologia para o diagnóstico e tratamento da síndrome metabólica. A regressão linear múltipla foi aplicada para avaliar as associações, tendo como variáveis de ajustes: etnia, idade, renda familiar, sexo, dieta, atividade física. A comparação entre grupos foi feita por MANOVA e a confirmação da diferença significativa pelo teste de Bonferroni. Resultados - A porcentagem de indivíduos com obesidade foi de 24%, sendo que a média de IMC correspondeu a 26 kg/m2. A população estudada apresentou média de idade de 50 anos, sendo a maioria de etnia branca (56%) e do sexo masculino (52%), com pouca adesão à atividade física (21%). Os parâmetros bioquímicos estavam, em média, abaixo das concentrações estabelecidas como normais, exceto a insulina, cuja média foi de 20,8 ?UI/mL. Todavia, ao estratificar pelo estado nutricional e metabolicamente saudável, os parâmetros bioquímicos se mostraram diferentes, tais como a glicemia, triglicerídeos e colesterol total. A ingestão dietética foi igual entre os grupos estudados. O perfil de aminoácido revelou potencial de diferenciar os estados nutricional e metabólico, destacando os aminoácidos de cadeia ramificada (Leu, Ile, Val). Foram identificados dois padrões de aminoácidos relacionados a beta oxidação e aos aminoácidos glicogênicos. O primeiro teve relação positiva para os indivíduos com obesidade e metabolicamente não saudável. O segundo, apresentou relação inversa para ambos os estados. O consumo de manganês pela população foi de 2,5 mg/dia, sendo infusão de mate a principal fonte (28mg Mn/porção). Os indivíduos obesos ingeriram menor quantidade de manganês, que apresentou relação inversa ao estado nutricional e ao padrão de aminoácidos relacionado ao metabolismo não saudável. Identificaram-se três padrões alimentares: perfil saudável, tradicional e moderno. A associação com o estado nutricional e metabolicamente saudável foi positiva para o padrão saudável. Conclusão - Os aminoácidos de cadeia ramificada se revelaram biomarcadores para identificar o estado nutricional e metabólico de indivíduos adultos. Os indivíduos que tiveram baixo consumo de manganês apresentaram maior adesão ao perfil metabolômico de aminoácidos relacionados com beta oxidação. / Introduction - The metabolomics allows to determine patterns of variation of the metabolites between people with or without illness, considering or not the food consumption. Understanding the relationship between metabolites and metabolic disorders, it is possible to deal with obesity and chronic diseases. Objective - To investigate the association between the metabolic profile of amino acids and dietary intake and nutritional status in adults from the household survey conducted in the city of São Paulo, Brazil. Method - The 21 amino acids were identified by metabolomic analysis, using Absolute IDQTMp 180 kit from Biocrates Life Science AG (Innsbruck, Austria). Food intake was estimated using the food frequency questionnaire. The amino acid and food groups were submitted to factorial analysis by main component. The Metabolically Healthy variable was constructed considering the Guidelines of the Brazilian Society of Cardiology for the diagnosis and treatment of the metabolic syndrome. Multiple linear regression was applied to evaluate the associations, adjusted by the variables: ethnicity, age, family income, sex, diet, physical activity. The comparison between groups was made by MANOVA, and the confirmation of the significant difference, by the Bonferroni test. Results - The percentage of people with obesity was 24%, although the mean BMI corresponded to 26 kg/m2. The population studied presented a mean age of 50 years, most of them white (56%) and male (52%), with little adherence to physical activity (21%). The biochemical parameters were, on average, below the established normal concentrations, except for insulin (20,8 ?UI/mL). However, when stratified by nutritional status and metabolically healthy, the biochemical parameters were statistically different. The dietary intake was the same among the groups studied. The amino acid profile revealed potential to differentiate the nutritional and metabolic states, highlighting the branched chain amino acids. Two amino acid patterns related to beta-oxidation and glycogenic amino acids had been identified. The former had a positive relationship for obese and metabolically unhealthy people. The second presented an inverse relation for both states. The manganese consumption by the population was 2.5 mg / day, and the mate infusion was the main source (28mg Mn/serving). Obese subjects consumed less manganese, which had an inverse relationship to nutritional status and to the amino acid pattern related to unhealthy metabolism. Three dietary patterns were identified: healthy, traditional and modern profiles. The association with nutritional and metabolically healthy status was positive for the healthy pattern. Conclusion - The branched-chain amino acids had been revealed to be biomarkers to identify the nutritional and metabolic status of adult individuals. The individuals that had low manganese consumption showed greater adhesion to the metabolic profile of amino acids related to beta-oxidation, and could be used as biomarker for the ingestion of this micronutrient.

A bovinocultura de corte destaca-se na economia nacional, crescendo cada vez mais no mercado cárneo mundial. O confinamento reduz a necessidade de área de produção, auxiliando na redução do impacto ambiental da atividade além do aumento da competitividade no setor. No sistema de produção com milho grão inteiro, os animais são alimentados com dieta à base de milho grão inteiro e núcleo protéico-mineral-vitamínico peletizado, dispensando o uso de volumoso. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do uso de milho grão inteiro e suplementação com minerais orgânicos na nutrição dos animais confinados sobre o consumo, desempenho, parâmetros de fermentação ruminal (pH, concentração de nitrogênio amoniacal e de ácidos graxos de cadeia curta). Foram utilizados trinta e seis novilhas de raça Nelore, com idade de vinte e quatro meses, e média de peso de 244,67kg. Os animais foram alojados em baias com dois animais por baia e distribuídos em dois tratamentos: pellet controle e pellet com inclusão de minerais orgânicos selênio e zinco e os aminoácidos colina, metionina e valina. Nos dois tratamentos o pellet tinha em sua composição 30% de PB, sendo a inclusão do pellet de 15% e 85% de milho grão inteiro. O experimento teve duração de 86 dias e o momento do abate foi determinado em função da deposição de gordura, acima de quatro milímetros, no músculo Longissimus dorsi utilizando ultrassonografia. Apesar da ingestão de matéria seca em média de 6 kg por dia, sem a inclusão de volumoso, os animais não apresentaram sinais de acidose, com valor médio de pH sanguíneo de 7.37, provavelmente em função da utilização do grão integral. Os animais apresentaram eficiência alimentar de 0,166 e não houve diferença significativa entre os tratamentos (P>0,05), rendimento de carcaça quente em média de 52%. Não houve diferenças significativas (P>0,05) em relação ao consumo de matéria seca, ganho de peso, parâmetros ruminais, número e severidade de abscessos hepáticos, entre o controle e o tratamento com minerais orgânicos. Não foram encontradas diferenças significativas entre os tratamentos propostos, a dieta com milho grão inteiro. / The beef cattle industry stands out in the national economy, growing increasingly in the global meat market. The intensive animal farming (feedlot) reduces the need of production area, helping to reduce the environmental impact of the activity in addition to increased competition in the sector. On the production system with whole grain corn, the animals are fed a diet based on corn grain and pelleted protein-vitamin-mineral core, without the need for forage. The objective of this study was to evaluate the effect of using whole grain corn and organic minerals supplementation in feedlot animals nutrition on intake, digestibility, ruminal fermentation parameters (pH, ammonia nitrogen concentration and short-chain fatty acids). Were used thirty-six Nelore heifers, aged twenty-four months and average weight of 244.67 kg. The animals were housed in stalls with two animals per stall and divided into two treatments: pellet control and pellet with inclusion of organic minerals of selenium and zinc and amino acids choline, methionine and valine. In both treatments the pellet had in its composition 30% in gross weight, with the inclusion of the pellet of 15% and 85% whole grain corn. The experiment lasted 86 days and the slaughter time was determined according to the deposition of fat above four millimeters, in the Longissimus dorsi muscle using ultrasonography. Despite the dry matter intake averaged 6 kg per day, the animals showed no signs of acidosis, with an average pH value of 7.37, probably due to the use of whole grain. The animals showed feed efficiency of 0.166 kg per day per kg of dry matter intake, hot carcass yield of 52.45% on average. There were no significant differences in the number and severity of liver abscesses between the control and treatment with organic minerals. Despite not find significant differences between the treatments.