Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WaltecaLLS.pdf: 496999 bytes, checksum: 0f86df4fe320a7189a5b69ba52a5056e (MD5) Previous issue date: 2009-12-17 / Universidade Federal do Rio Grande do Norte / As infec??es f?ngicas oculares est?o sendo reconhecidas em todo o mundo como uma importante causa de morbidade e cegueira. A baixa biodisponibilidade dos f?rmacos como a anfotericina B, antif?ngico bastante utilizado no tratamento destas infec??es, nos tecidos posteriores dos olhos aliada ?s barreiras anat?micas oculares, que s?o capazes de limitar a sua absor??o e associado ao grave risco de desenvolvimento de rea??es adversas levam, geralmente, a um insucesso no tratamento desejado e a s?rias conseq??ncias para os pacientes acometidos. Pesquisadores em todo o mundo est?o buscando novas alternativas para contornar esta problem?tica e uma das principais linhas de pesquisa estabelecidas consiste no desenvolvimento de novas formula??es que visam melhorar a biodisponibilidade e reduzir a toxicidade associada ? aplica??o da anfotericina B. As microemuls?es surgem como novos sistemas capazes de carrear este f?rmaco para uso oftalmol?gico. O presente estudo objetivou a obten??o de uma microemuls?o biocompat?vel com a via de administra??o ocular contendo anfotericina B a fim de se estabelecer uma nova forma farmac?utica vi?vel para a administra??o t?pica nos olhos. O sistema obtido demonstrou, por meio dos estudos de caracteriza??o realizados, biocompatibilidade com a via de administra??o pretendida e surge, portanto, como uma nova e interessante apresenta??o farmac?utica contendo anfotericina B para ser utilizada, no futuro, no tratamento de infec??es f?ngicas oculares

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MiguelASF_DISSERT.pdf: 792186 bytes, checksum: d323fa6e666b8282771fcc51f7c2abcc (MD5) Previous issue date: 2011-07-11 / The aim of this work was to evaluate how an aqueous micellar system containing Amphotericin B (AmB) and sodium deoxycholate (DOC) can be rebuilt after heating treatment. Also a review of the literature about the new physicochemical and biological properties of this new system was carried out. Afterwards, heated (AmB-DOC-H) and unheated (AmB-DOC) micelles were subsequently diluted at four different concentrations (50mg.L-1, 5mg.L-1, 0.5mg.L-1 and 0.05mg.L-1) to perform the physicochemical study and, then, the pharmacotoxicity assay, in which two cell models were used for the in vitro experiments, Red Blood Cells (RBC) from human donors and Candida parapisilosis (Cp). While potassium (K+) and hemoglobin leakage from RBC were the used parameters to evaluate the acute and chronic toxicity, respectively, the efficacy of AmB-DOC and AmB-DOC-H were assessed by K+ leakage and cell survival rate from Cp. The spectral study revealed a slight change on the aggregate peak from 327nm to 323nm for AmB-DOC-H compared to AmB-DOC. Concerning the toxicity, although AmB-DOC and AmB-DOC-H presented different behavior for hemoglobin leakage, AmB-DOC produced higher leakage than AmB-DOC-H at high concentrations (from 5mg.L-1) with values tending to zero. However, concerning K+ leakage, both AmB-DOC and AmB-DOC-H, showed similar profile for both cell models, RBC and Cp (p<0,05). AmB-DOC-H and AmB-DOC also revealed similar profile of activity against Cp with equivalent survival rate. In short, the AmB-DOC-H showed much less toxicity than AmB-DOC, but remained as active as the late one against fungal cell. Therefore, the results highlight the importance of this new procedure as a simple, inexpensive and safe alternative to produce a new kind of micelle system for treatment of systemic fungal infections / A anfotericina B micelar (AmB) ? um importante agente antimicrobiano utilizado contra infec??es f?ngicas sist?micas. No entanto, seu uso ? limitado devido a sua alta toxicidade. Formula??es de anfotericina B em estruturas lip?dicas s?o menos t?xicas, por?m apresentam elevado custo. A AmB em solu??o aquosa possui formas monom?ricas e agregadas, estes ?ltimos s?o os respons?veis pelas rea??es adversas. Este trabalho avaliou a AmB desoxicolato de s?dio (AmB-DOC) e AmB aquecida (AmBDOC- H) em rela??o a sua toxicidade e atividade, bem como perfil de seu espectro em quatro concentra??es diferentes (50mg.L-1, 5mg.L-1, 0,5mg.L-1 e 0.05mg.L-1). O aquecimento controlado das solu??es AmB levou a altera??es no espectro de 327nm AmB (agregados) para 323nm (superagregados). Al?m disso, quando as amostras foram submetidas ao processo de dilui??o, apresentam o mesmo comportamento espectrofotom?trico: ambas as amostras diminuem o pico das formas auto-associadas at? apresentarem apenas mon?meros com pico em 409nm, o que sugere um processo de libera??o de mon?meros por concentra??o-dependente. No que diz respeito ? toxicidade, AmB-DOC e AmB-DOC-H apresentaram comportamentos distintos: a taxa de libera??o de hemoglobina de hem?cias para AmB-DOC, em altas concentra??es, foi muito superior a AmB-DOC-H, cujos valores tendem a zero (p <0,05). J? em rela??o ? libera??o de K+ ambas as amostras apresentaram perfil semelhante. Sobre a atividade, AmB-H mant?m o mesmo perfil da AmB-DOC. Em suma, a AmB-DOC-H ? muito menos t?xica do que AmB-DOC e mantendo a atividade. Sendo este procedimento uma alternativa simples, de baixo custo e segura para, em um o futuro pr?ximo, ser utilizada no tratamento de infec??es f?ngicas sist?micas

Orientador: Rosângela Gonçalves Peccinini / Banca: Arnóbio Antonio da Silva Junior / Banca: Kelly Chrystina Pestana Biava / Banca: Clarice Madalena Bueno Rolim / Banca: Anselmo Gomes de Oliveira / Resumo: Depois de quase 50 anos de uso na terapia, a alta potência e amplo espectro de ação asseguram que a anfotericina B (AmB) continue a ser o fármaco de escolha na terapia moderna contra infecções fúngicas invasivas. A AmB está associada a alta incidência de nefrotoxicidade e reações relacionadas à infusão, o que limita a sua utilização e muitas vezes requerem a redução da dose. Novas formulações estão sendo pesquisadas para melhorar as características farmacocinéticas da AmB, levando a novas alternativas de administração, hoje limitada à via intravenosa. No presente estudo, foi avaliado o perfil farmacocinético de um novo sistema microemulsionado de anfotericina B (MEAmB) desenhada por Franzini (2011) por via intravenosa e oral em ratos wistar (n=10), dose de 1mg / kg e 10mg / kg pelas vias intravenosa e oral respectivamente, além da avaliação preliminar de segurança. A formulação apresentou um perfil farmacocinético semelhante à AmB desoxicolato em sua administração intravenosa, sem diferenças significativas tanto nos parâmetros farmacocinéticos quanto na comparação "ponto a ponto". A MEAmB trouxe ainda diminuição no potencial de nefrotoxicidade, mantendo os níveis de ureia e creatinina inalterados comparando-se pré e pós-exposição enquanto a AmB desoxicolato promoveu aumento significativo dos biomarcadores renais. A MEAmB apresentou uma baixa biodisponibilidade oral (apenas 5,8%) não permitindo os estudos de eficácia planejados para essa formulação. Ainda, através da aplicaçã... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: After nearly 50 years of use in therapy, high power and broad spectrum of action ensure that amphotericin B (AmB) remains the drug of choice in modern therapy against invasive fungal infections. The AmB is associated with high incidence of nephrotoxicity and infusion-related reactions, which limit their use and often require dose reduction. New formulations are being researched to improve the pharmacokinetic characteristics of AmB, that may lead to new alternative administration routes, limited today only to intravenous administration. In the present study, the pharmacokinetic profile of a new microemulsion system of amphotericin B (MEAmB) formulated by Franzini (2011) for intravenous and oral administration was investigated in wistar rats (n = 10), dose of 1mg / kg and 10mg / kg for intravenous and oral routes respectively, and also a preliminary assessment of safety oral administration. The formulation showed a pharmacokinetic profile similar to AmB deoxycholate in its intravenous administration, no significant differences were found in the pharmacokinetic parameters between the AmB deoxycholate and MEAmB. The MEAmB granted a statistical decrease in the nephrotoxicity potential, keeping urea and creatinine levels unchanged comparing pre- and post-exposure while AmB deoxycholate caused a significant increase in renal biomarkers. The MEAmB showed low oral bioavailability (only 5.8%) not allowing the efficacy studies planned for this formulation. A study of population pharmacokinetic was (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-20T23:04:19Z No. of bitstreams: 1 FranciscoAlexandrinoJunior_DISSERT.pdf: 22625815 bytes, checksum: d018908142617b3f4933652c5ec6c7ed (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-02-24T22:34:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FranciscoAlexandrinoJunior_DISSERT.pdf: 22625815 bytes, checksum: d018908142617b3f4933652c5ec6c7ed (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-24T22:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FranciscoAlexandrinoJunior_DISSERT.pdf: 22625815 bytes, checksum: d018908142617b3f4933652c5ec6c7ed (MD5) Previous issue date: 2015-03-31 / A leishmaniose ? uma infec??o parasit?ria, emergente e n?o controlada, que por usa elevada incidencia est? presente no programa de doen?as tropicais negligenciadas da Organiza??o Mundial da Sa?de (OMS). Adicionalmente, esta ? considerada, neste programa, a segunda maior causa de perda de anos de vida ?til devido a ?bito ou debilidade, chegando em 2004 a quase 2 bilh?es de anos de vida ?til perdidos em todo o mundo. Anualmente, registra-se 1,3 milh?o de casos, dos quais aproximadamente 1 milh?o corresponde a sua forma tegumentar (LTA). Apesar desta contundente realidade, atualmente n?o h? uma proposta de tratamento ou medicamento que adeque simultaneamente eficacia terap?utica, boa rela??o custo-benef?cio, f?cil produ??o e eventos adversos negligenciaveis. Com o int?ito de elaborar uma abordagem alternativa e inovadora para o tratamento da LTA, esse trabalho prop?s o desenvolvimento e a avalia??o de uma formula??o t?pica do tipo curativo polim?rico, baseado em um hidrog?l de ?lcool polivin?lico contendo anfotericina B (AmB). Ap?s a produ??o dos hidrog?is foi observado que a AmB incorporada pode estar entre as cadeias polim?ricas sob a forma de dispers?o molecular. Essa localiza??o alterou o mecanismo de intumescimento, de um transporte limitado pela difus?o (caso I) para an?malo, permitindo que o sistema intumes?a mais e mais r?pido, quando comparado com o mesmo sem o ativo. No entanto, n?o foi observada a libera??o imediata da AmB, sendo esta liberada de forma cont?nua e seguindo o modelo o cin?tico de Higuchi. O hidrog?l contendo AmBdemonstrou ter eficiente atividade leishmanicida nas primeiras 24 horas. Al?m disso, apresentou impermeabilidade a microrganismos, e permeabilidade ao vapor d??gua compat?vel com as necessidades da pele em seu estado lesionado, o que indica uma poss?vel habilidade de prevenir infec??es secund?rias e manter um ambiente favor?vel ao processo cicatricial. Estes resultados demonstram que os hidrog?is s?o sistemas promissores para a libera??o controlada de AmB e um potencial tratamento t?pico para a LTA.

A lesão renal aguda LRA induzida pela anfotericina B (Anf-B), um antibiótico poliênico isolado do actiniomiceto Streptomyces nodus, ocorre após alguns dias do início da terapia medicamentosa. Os sinais clínicos característicos são acidose, hipocalemia, depleção de magnésio, sódio e poliúria, resultantes da vasoconstrição renal com redução do fluxo sanguíneo renal (FSR), da taxa de filtração glomerular (TFG) e toxicidade direta nas células epiteliais tubulares com geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). A diosmina e hesperidina (DH) são flavonoides com propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Esse estudo investigou a ação renoprotetora do pré-condicionamento com diosmina e hesperidina em ratos submetidos à toxicidade renal pela Anf-B. Foram utilizados ratos Wistar, adultos e machos distribuídos nos grupos: Salina (controle, 3ml/kg de solução fisiológica 0,9%, salina, intraperitoneal-i.p., uma vez ao dia, cinco dias); DH (50mg/kg de DH na água de bebedouro, dez dias); Anf-B (15mg/kg, i.p. uma vez ao dia, cinco dias); Anf-B+DH (pré-medicação com a solução de DH em água de bebedouro dez dias e a partir do sexto dia do protocolo, Anf-B, 1 vez dia, i.p., 5 dias,). Foram avaliadas a função renal função renal (clearance de creatinina-Clcr, método de Jaffé), as frações de excreção de sódio, potássio e magnésio-FENa, K por meio do método de eletrodo íon seletivos e Mg por Mg por método colorimétrico a lesão oxidativa (peróxidos-PU, FOX-2 e substâncias reativas com o ácido tiobarbitúrico-TBARS urinários). O tratamento com Anf-B resultou em quadro de lesão renal aguda com redução do Clcr, elevação do fluxo urinário, da FENa, da FEK e da FEMg, com elevação de PU e TBARs urinários. O pré-condicionamento com DH demostrou efeito renoprotetor por meio da elevação do Clcr e redução das FENa, FEMg e FEK, além de demonstrar proteção antioxidante confirmada pela redução de metabólitos oxidativos. / The acute kidney inury (AKI) induced by amphotericin B (Amp-B), an antibiotic polyenic group isolated of the actinomycete Streptomyces nodus, occurs after some days of the beginning of drug therapy. Clinical manifestations include acidosis, hypokalemia, magnesium and sodium wasting and polyuria, resulting from renal vasoconstriction with decrease in blood flow, glomerular filtration rate (GFR) and direct toxicity in tubular cells with liberating reactive oxygen species (ROS). Diosmin and hesperidin (DH) are flavonoids with antioxidant and antiinflamatory properties. This study investigated the renoprotective effect of DH in rats submitted to the toxicity by Amp-B. Adult male wistar rats were used and divided in the following groups: Saline (control, 3ml/kg of NaCl 0,9% intraperitoneal (i.p.), once a day, for 5 days); DH (50mg/kg in drinking water, 10 days); Amp-B (15mg/kg, i.p., once a day, 5 days); Amp-B+DH (DH in drinking water, 10 days, from the sixth day, 15mg/kg of Amp-B, i.p., 5 days). Renal function (creatinine clearance-crCl, Jaffé method), sodium, potassium and magnesium excretion fraction, (FENa, FEK,) through selective ion method and FEMg by colorimetric method, oxidative injury (urinary peroxides-FOX-2, thiobarbituric acid reactive substances-TBARS) were evaluated. Amp-B induced AKI with reduction in crCl and increment in FENA, FEK, FEMg, UP and TBARS. The pre-treatment with DH confirmed a renoprotective effect through by increasing GFR and decreasing FENa, FEK, FEMg. In addition, the antioxidant protection was confirmed by reduction of oxidative metabolites by DH.

O objetivo deste trabalho foi sintetizar emulsÃes de Pickering a partir da goma do cajueiro (GC) enxertada com poli lactÃdeo (PLA) para incorporaÃÃo de anfotericina B (AB), utilizando como fase oleosa o miglyol. A GC foi isolada do exsudato por precipitaÃÃo em etanol e modificada por reaÃÃo de enxertia na cadeia lateral com o PLA. O copolÃmero foi purificado por lavagem com hexano e denominado GCPLAP. Foram realizadas trÃs condiÃÃes reacionais, 1:1; 1:5 e 1:10, variando a razÃo molar GC/PLA. A confirmaÃÃo da reaÃÃo foi possÃvel atravÃs dos espectros de FTIR, pelo aparecimento de uma banda em 1700 cm-1, caracterÃstica de estiramento C=O da carbonila. O grau de substituiÃÃo foi determinado por RMN H1, que aumentou com o aumento da proporÃÃo molar de PLA. O TGA mostrou que a enxertia do PLA confere uma maior estabilidade tÃrmica à GCPLAP quando comparado a GC. Na anÃlise tÃrmica de DSC observa-se um estreitamento do pico endotÃrmico a medida em que se aumenta a proporÃÃo de PLA. NÃo foi possÃvel detectar os cristais de PLA enxertados na GC por difraÃÃo de raios-X. Pelos dois mÃtodos de citotoxicidade in vitro, MTT e LDH, foi comprovada a nÃo citotoxicidade do copolÃmero. As emulsÃes foram sintetizadas vertendo a fase orgÃnica sob a fase aquosa e houve a formaÃÃo instantÃnea das emulsÃes. O teste do fenol sulfÃrico demonstrou que para todas as condiÃÃes de emulsÃes o processo de isolamento por centrifugaÃÃo nÃo desestabiliza nem separa as nanopartÃculas das gotas de Ãleo. O tamanho das emulsÃes, determinados por espalhamento dinÃmico de luz, apresentaram distribuiÃÃo unimodal e diminuÃram apÃs o isolamento em centrÃfuga. As emulsÃes com copolÃmero GCPLAP 1:1 obtiveram os menores valores de tamanho e IPD, alÃm de melhor estabilidade com a variaÃÃo do tempo. A AB foi incorporada Ãs emulsÃes e atravÃs do espectro de UV-Vis foi possÃvel verificar que a eficiÃncia de encapsulamento em torno de 25% para todas as formulaÃÃes testadas. / The aim of this work was to synthesize Pickering emulsions from the cashew tree gum (GC) grafted with polylactide (PLA) using miglyol as oily phase as potential matrix for Amphotericin B (AB) incorporation. GC was isolated from exsudate by precipitation with ethanol and it was modified through the PLA graft reaction. The copolymer was purified and named GCPLAP. The graft reaction was performed in three GC/PLA molar ratio conditions (1:1, 1:5 and 1:10). The presence of PLA gratf to GC was confirmed by FTIR and NMR spectra. The degree of substitution was measured by RMN 1H, and it increases with increase of PLA amount in the CG/PLA molar ratio conditions. TGA analysis showed the graft of PLA provides a better thermal stability in comparison with GC. DSC thermal analysis showed a more well define peak as the PLA ratio increases. It was not possible to detect crystallization due the insertion of PLA into GC through X-ray microscopy. In vitro citotoxicity methods (MTT and HDL) confirmed the non-toxicity of the grafted polymer. Emulsions were prepared by adding the organic phase in the aqueous phase, resulting the immediate emulsion formation. The sulfuric phenol test showed the presence of CG in all emulsion prepared with differents GC/PLA molar ratio samples. The isolation by centrifugation does not destabilize or separate nanoparticles from oil droplets. The emulsion size, measured by dynamic light scattering, presented unimodal distribution and they decreased after the isolation by centrifugation. Emulsions with GCPLAP 1:1 presented the less values in size and IPD, in addiction to the best stability over time. The AB was incorporated in the emulsions and it was possible to verify the encapsulation efficiency by UV-VIS, was about 25% in all of the tested formulations.

O fenômeno de amplificação gênica é um mecanismo de auto-preservação celular observado com freqüência no protozoário parasita Leishmania quando submetido a estímulos negativos como, por exemplo, a presença de drogas. A região H do genoma de Leishmania (Leishmania) major é um dos loci mais estudados que leva à amplificação em resposta a drogas não relacionadas, como a terbinafina. Foram isoladas linhagens de L. (L.) major e Leishmania (Viannia) braziliensis resistentes à terbinafina. Análises por corridas curtas de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e Southern blotting revelaram que a resistência observada nestas linhagens não foi gerada pela amplificação do locus H. Sendo assim, a resistência ao inibidor da esqualeno epoxidase está sendo gerada por um outro mecanismo uma vez que outros loci podem estar envolvidos na resistência à terbinafina e através da análise diferencial do perfil de proteínas, os mutantes resistentes apresentaram diferenças na expressão de proteínas. O alvo inicial para a elucidação da resistência à terbinafina nas linhagens selecionadas foi a via de biossíntese de ergosterol. Foram escolhidos os genes da 3-cetoacil-CoA tiolase (ERG10), esqualeno sintase (ERG9 ou SQS1), esqualeno epoxidase (ERG1), oxidoesqualeno-lanosterol ciclase (ERG7) e lanosterol 14-demetilase (ERG11), de L. major e L. braziliensis, além do gene YIP1 de L. braziliensis. Para isso foram sintetizados oligonucleotídeos a partir das seqüências geradas pelo projeto genoma destas espécies depositadas em bancos de dados. Os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 de L. major e de L. braziliensis além do YIP1 de L. braziliensis amplificados por PCR foram clonados no vetor pGEM-T Easy, que possibilitou a construção de reagentes para ruptura de todos genes pela inserção da marca HYG e, com exceção do gene ERG7 de L. braziliensis, os genes foram subclonados no vetor pXG1. Fragmentos de restrição dos genes clonados no vetor pGEM-T Easy foram utilizados para analisar o nível de seus transcritos por northern blot. Também verificamos através de corridas curtas de PFGE e análises de Southern, que as linhagens em estudo não apresentam amplificação dos loci em estudo. A participação de genes da via de biossíntese de ergosterol de L. major e L. braziliensis e do gene YIP1 de L. braziliensis na resistência ou susceptibilidade à terbinafina e/ou anfotericina B foi verificada através de experimentos funcionais. Com esse objetivo, os genes YIP1, ERG10 e ERG1 de L. braziliensis foram transfectados na linhagem LB2904 de L. braziliensis, e os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 e a ruptura do gene ERG1 pelo cassete HYG de L. major foram transfectados na linhagem LT252 de L. major. Foram realizados experimentos para analisar a susceptibilidade à anfotericina B associada ou não à terbinafina, das linhagens selvagens de L. major e L. braziliensis, e a partir destes experimentos iniciais, foram selecionadas linhagens destas duas espécies resistentes à anfotericina B. Para analisar a possível função regulatória dos elementos RIME 5/2/6 de L. braziliensis, foi feita a amplificação por PCR da repetição invertida LbRIME 5/2/6b que permitiu a clonagem deste fragmento no vetor pGEM-T Easy e a sua ruptura pela marca SAT. A clonagem no vetor pGEM possibilitou a análise da interação de proteínas nucleares à repetição LbRIME 5/2/6b através do gel shift. / Gene amplification is a common phenomenon observed in Leishmania cell lines subjected to drug pressure. The H locus of Leishmania (Leishmania) major is normally found amplified in cell lines selected in unrelated drugs, as terbinafine. We selected cell lines of L. (L.) major and Leishmania (Viannia) braziliensis resistant to terbinafine. Short-run Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Southern blotting analysis showed that this resistance was not generated by H locus amplification. Resistance to squalene epoxidase inhibiter is being generated by other mechanism once others loci can be involved in the terbinafine resistance and through protein partner differential analysis, mutants resistant showed differences in protein expression. The initial target to terbinafine resistance elucidation in the cell lines selected was ergosterol biosynthesis pathway. We choose genes: 3-ketoacyl-CoA thiolase (ERG10), squalene synthase (ERG9 or SQS1), squalene epoxidase (ERG1), oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7), and lanosterol 14-demethylase (ERG11), of L. major and L. braziliensis, besides YIP1 gene of L. braziliensis. For this, primers were synthesized using the sequences generated by genome project of these species inserted in gene bank. The genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 of L. major and of L. braziliensis besides YIP1 of L. braziliensis were amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector that enabled all genes disruption by insertion of HYG cassette and, with exception of the ERG7 gene of L. braziliensis, genes were subcloned into shuttle-vector pXG1. Restrictions fragments of these genes were used in Northern analysis to verify the transcripts level. We verified through short-run PFGE and Southern analysis that the resistant cell lines do not show amplification of studied loci. The participation of ergosterol biosynthesis pathway genes of L. major and L. braziliensis and YIP1 gene of L. braziliensis in the resistance to terbinafine was verified in functional experiments. With this objective, the genes YIP1, ERG10 and ERG1 of L. braziliensis were transfected into LB2904 cell line of L. braziliensis, and the genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 and the ERG1 gene disruption by HYG mark of L. major were transfected into LT252 cell line of L. major. Experiments that analyze the susceptibility to amphotericin B associated or not to terbinafine were performed using the wild type cell lines of L. major and L. braziliensis, and with this initials experiments, we selected cell lines of these two species resistant to amphotericin B. In order to analyze the possible regulatory function of the RIME 5/2/6 elements of L. braziliensis, the repeat LbRIME 5/2/6b was amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector and with this clone, the element was disrupted with a SAT cassette. The cloning into vector pGEM enabled to analyze the interaction of the nuclear protein with the repeat LbRIME 5/2/6b through gel shift assay.

Introdução: As leishmanioses são antropozoonoses que constituem um grave problema de saúde pública por apresentarem um complexo espectro clínico de manifestações e relevante diversidade epidemiológica. Aproximadamente 5% dos pacientes com leishmaniose cutânea não tratada adequadamente irão desenvolver a leishmaniose mucosa (LM). As principais opções terapêuticas disponíveis para esta apresentação da doença são os antimoniais pentavalentes, a pentamidina e as anfotericinas B. As formulações lipídicas da anfotericina B tem sido desenvolvidas na tentativa de melhorar a eficácia e a tolerabilidade das anfotericinas, entretanto, ainda há escassez de estudos que avaliem eficácia, dose e segurança da anfotericina B lipossomal (AFBL) no tratamento da LM. Objetivo: Relatar a experiência do ambulatório e da enfermaria de um hospital escola com medicamentos usados no tratamento da leishmaniose mucosa, comparando a eficácia e a segurança da anfotericina B lipossomal com as outras drogas. Métodos: Foram avaliados os prontuários de todos os pacientes do Ambulatório de Leishmanioses do Departamento de Moléstias Infecciosas e Parasitárias do HC-FMUSP com diagnóstico confirmado de LM e tratados no período de janeiro de 2000 a julho de 2015. Dados clínicos e epidemiológicos foram descritos, e também avaliados os efeitos adversos e os desfechos com o uso das principais drogas para LM. Resultados: Foram avaliados 71 pacientes com leishmaniose mucosa e um total de 106 tratamentos. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (60,6%) e da Região Nordeste do Brasil (50%). Observou-se associação de flebite (46,2%) e de tremor (30,8%) com o grupo que recebeu anfotericina B complexo lipídico e maior desenvolvimento de artralgia (16%) no grupo que recebeu o antimonial. Os pacientes tratados com anfotericina B desoxicolato apresentaram a maior taxa de insuficiência renal aguda (57,10%) em relação aos demais grupos de drogas. O grupo que usou antimonial pentavalente foi o único que desenvolveu alterações nas enzimas pancreáticas (28%) e alterações eletrocardiográficas (20%). Dos pacientes que usaram anfotericina B desoxicolato, 85,7% precisaram interromper definitivamente o tratamento, o que contribuiu para a pior taxa de cicatrização final (14,3%), enquanto a AFBL apresentou a melhor taxa (81,3%) quando comparada aos demais tratamentos, OR= 4,971 [1,829-13,508] (p= 0,001). O uso de itraconazol mostrou alta taxa de recidiva (63,6%). A dose média de AFBL usada no tratamento de LM foi 1907mg e 28,91mg/kg. Quando comparadas as drogas com a AFBL, a pentamidina foi a única que não apresentou diferença estatisticamente significante em relação aos desfechos de tratamento. Conclusão: A pentamidina e a AFBL mostraram-se, neste estudo, as melhores opções terapêuticas no tratamento da LM, sendo que a AFBL foi a droga com a maior taxa de cicatrização. Com base neste estudo e em outras experiências da literatura até o momento, o intervalo de dose compreendido entre 30 e 35 mg/kg é o que parece alcançar eficácia próxima a 100%. Sugerimos, portanto, uma dose cumulativa de 30 mg/kg para o tratamento da LM. Este estudo amplia a experiência com o uso do itraconazol e da pentamidina, e é o primeiro a descrever o uso da ABCL na LM. Apresenta, ainda, a maior casuística que conhecemos na literatura com o uso da AFBL, além de ser o primeiro estudo a compará-la com as demais drogas no tratamento da LMCRO / Introduction: Leishmaniases are anthropozoonoses that constitute a severe problem of public health as they present with a complex spectrum of manifestations and relevant epidemiologic diversity. Approximately 5% of patients with untreated cutaneous leishmaniosis will develop mucosal leishmaniasis (ML). The main treatment options for this presentation are: pentavalent antimonials, pentamidine, and amphotericins B. The lipid formulations of amphotericin B have been developed to improve efficacy and tolerability, however, there are few studies that evaluate efficacy, dosage, and safety of liposomal amphotericin B (LAB) for treatment of ML. Objective: To report outpatient and inpatient experience of a hospital school with medications used for treatment of mucosal leishmaniasis by comparing the efficacy and safety of liposomal amphotericin B with other drugs. Methodology: The medical records of all patients of the Leishmaniasis Outpatient Clinic of the Department of Infectious and Parasitic Diseases of the Hospital das Clínicas of University of São Paulo were assessed. The patients had diagnosis of ML and were treated between January 2000 and July 2015. Epidemiologic and clinical data were described, as well as adverse effects and outcomes of the main drugs for treatment of ML. Results: Seventy-one patients with ML and a total of 106 treatments were assessed. The majority of the patients were male (60.6%) and from the Northeast of Brazil (50%). There was an association of phlebitis (46.2%) and tremor (30.8%) to the group that received amphotericin B lipid complex (ABLC). There was a higher development of arthralgia (16%) in the group that received the antimonial. Patients treated with deoxycholate amphotericin B presented with the highest level of acute kidney injury (57.1%) when compared to other drugs. The group who received pentavalent antimonial was the only one to develop pancreatic enzymes abnormalities (28%) and electrocardiographic abnormalities (20%). Within the patients who used deoxycholate amphotericin B, 85.7% had to discontinue the treatment, contributing to the worst healing rate (14.3%). LAB presented with the best healing rate (81.3%) when compared to the other treatments, OR = 4.971 [1,829-13,508] (p=0,001). The use of itraconazole showed high recurrence rate (63.6%). The mean dosage of LAB for the treatment of ML was 1,907 mg and 28.91 mg/kg. When LAB was compared to other drugs, pentamidine was the only one with no statistical significance related to the outcomes of the treatment. Conclusion: In this study, pentamidine and LAB were the best therapeutic options for the treatment of ML; LAB was the drug with better healing rate. Based on this study and other references in the literature, the dosage interval between 30 and 35 mg/kg appears to reach efficacy close to 100%. Therefore, our recommendation is the use of a cumulative dosage of 30 mg/kg for the treatment of ML. This study enhances the experience of itraconazole and pentamidine, and it is the first one to describe the use of ABLC for the treatment of ML. In addition, it presents the largest casuistic known in the literature with the use of LAB, and it is a pioneer in comparing this drug with other drugs in the treatment of ML

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Joel Rocha da Silva.pdf: 557734 bytes, checksum: 97955f40a90305a3592aea224371f9ea (MD5) Previous issue date: 2008-05-27 / Magnetite nanoparticles were prepared by the coprecipitation of ions Fe2+ and Fe3+ using ammonia solution as precipitating agent. Maghemite nanoparticles were prepared by forced oxidation of magnetite nanoparticles in acidic medium using nitrate ions as oxidizing agent. The magnetic nanoparticles were used to the preparation of aqueous magnetic fluids samples by the functionalization of the nanoparticles with bilayers of laurate/laurate and laurate/Pluronic. Aliquots of the magnetic fluids were dried and the resultant powders were characterized by chemical analysis (the contents of ions Fe2+ and Fe3+), X-ray powder diffraction (XRD) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The contents of ions Fe2+ and Fe3+ in all the samples showed that the nanoparticles are not pure magnetite or maghemite phases. X-ray powder diffraction (XRD) indicated the existence of inverse cubic spinel phase, but didn't permit the distinction between magnetite and maghemite phases. Based on the results of chemical and XRD analyses, the nanoparticles could be better characterized as reduced maghemite, which mean maghemite phase containing ions Fe2+. The average sizes of the oxide nanoparticles estimated by XRD were around of 10 nm. FTIR analyses showed that the nanoparticles were functionalized with bilayers of laurate/laurate and laurate/Pluronic. FTIR analyses also were indicative of the maghemite phase. The hydrodynamic size of the functionalized nanoparticles measured by PCS were in the range of 70-90 nm for the samples based on laurate and in the range of 100-200 nm for the samples containing Pluronic. The measurements of zeta potential showed that the magnetic fluids based on laurate bilayers presented better colloidal stability than that one based on bilayers of laurate/Pluronic. On the other hand, the studies of colloidal stability in cell culture medium by hydrodynamic size measurements showed the lost of colloidal stability of all the samples, in all the concentrations of medium investigated. The fluids with laurate/laurate bilayers showed higher ratio of aggregation in the culture medium than the fluids with laurate/Pluronic. The association of amphotericin B with nanoparticles was carried out only using the samples with laurate bilayers. The results showed that the ratio of association depends on the concentration of amphotericin added to the magnetic fluid. It was observed 100% of amphotericin association in the range of nanoparticles/amphotericin concentrations used, which in turn are adequated for posterior in vivo studies / Nanopartículas de magnetita foram preparadas pela coprecipitação dos íons Fe2+ e Fe3+ usando uma solução de amônia como o agente de precipitação. As nanopartículas de maguemita foram preparadas por oxidação forçada de nanopartículas de magnetita usando íons nitrato como o agente de oxidação, em meio ácido. As nanopartículas magnéticas foram usadas para a preparação de fluidos magnéticos aquosos pela funcionalização das nanopartículas com bicamadas de laurato/laurato e laurato/Pluronic. As alíquotas dos fluidos magnéticos foram secas e o pó resultante foi caracterizado por análise química (teores dos íons Fe2+ e Fe3+), difração de raios X pelo método do pó (DRX) e espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR). Os teores dos íons Fe2+ e Fe3+ em todas as amostras mostram que as nanopartículas não são fases puras da magnetita ou de maguemita. A difração de raios X (DRX) pelo método do pó indicou a existência da fase cúbica de espinélio inverso, mas não permite a distinção entre a magnetita e as fases de maguemita. Baseado nos resultados de análises químicas e de DRX, as nanopartículas poderiam ser melhor caracterizadas como maguemita reduzida, a qual resulta em uma fase de maguemita contento íons Fe2+. Os tamanhos médios das nanopartículas dos óxidos estimados por DRX foram em torno de 10 nm. As analises de FT-IR mostram que as nanopartículas foram funcionalizadas com bicamadas de laurato/laurato e laurato/Pluronic. As análises de FT-IR também foram indicativos da fase maguemita. O tamanho hidrodinâmico das nanopartículas funcionalizadas medidas por PCS foi em torno de 70-90 nm para amostras a base de laurato e em torno de 100-200 nm para amostras contendo Pluronic. As medidas de potencial zeta mostraram que os fluidos magnéticos a base de bicamada de laurato apresentam melhor estabilidade coloidal do que os a base de bicamada de laurato/Pluronic. Por outro lado, o estudo da estabilidade coloidal em meio de cultura por medidas de tamanho hidrodinâmico mostra a perda da estabilidade coloidal de todas as amostras, em todas as concentrações do meio investigado. Os fluidos com bicamadas de laurato/laurato mostraram taxas mais altas de agregação no meio de cultura do que os fluidos com laurato/Pluronic. Os estudos de associação de anfotericina B com nanopartículas foram realizados somente usando as amostras com bicamadas laurato/laurato. Os resultados mostraram que a taxa de associação depende da concentração de anfotericina adicionada ao fluido magnético. Foi observado 100% de associação da anfotericina na faixa da concentração nanopartículas/anfotericina usadas, que por sua vez são adequadas para posteriores estudos in vivo

Desenvolveram-se métodos bioanalíticos para determinação de anfotericina B e fluconazol em apenas 200 L de plasma e líquor (LCR) através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE UV-VIS). A anfotericina B foi determinada através de CLAE-VIS utilizando p-nitrofenol como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas com acetonitrila, seguida da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por tampão acetato 0,1M pH 5,0 e acetonitrila (50:50,v/v) 0,5mL/min em 385nm; o tempo de corrida foi 15 min. Através da validação o método mostrou-se robusto com 0,2-25,0 &#181;g/mL(linearidade, r2 0,9999), LD 0,1 &#181;g/mL, precisão (5,4% e 6,9%), exatidão expressa através do erro sistemático (3,3% e 2,2%): intra e interdias). Os estudos de estabilidade evidenciaram 1,0% para o erro sistemático e 3% de precisão na bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), e os ciclos de congelamento evidenciaram boa estabilidade uma vez que todos os ensaios foram realizados em Laboratório de luz amarela. O fluconazol foi determinado através de CLAE-UV utilizando carbamazepina como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas pela extração líquido-líquido com diclorometano em meio alcalino, seguido da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por água UP e acetonitrila (70:30,v/v) 0,5mL/min em 210nm; o tempo de corrida foi 15 min. O método mostrou-se robusto com 0,2-250 &#181;g/mL(linearidade, r2 0,9998), LD 0,1&#181;g/mL, com boa recuperação absoluta (98%) e relativa (100%), precisão 0,5%/1,3%, exatidão expressa através do erro sistemático (1,2%). Evidenciou-se ótima estabilidade para os extratos em bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), na longa duração (20&#176; C, 9 meses) e através dos ciclos de congelamento. Investigaram-se 21 pacientes adultos de ambos os sexos portadores de meningite criptocócica com AIDS após internação emergencial em terapia de alta dose com anfotericina B (1mg/Kg) e fluonazol (400 mg, 12/12 horas) durante 12 semanas. O monitoramento das concentrações de anfotericina B e fluconazol no plasma e no LCR forneceram as razões que permitiram estimar a penetração dos antifúngicos no SNC. Obtiveram-se concentrações de anfotericina B, médias (IC95%): 2,30 (0,02-5,08) &#181;g/mL no plasma e 0,30 (0,19-0,36) &#181;g/mL no LCR. As concentrações do fluconazol, médias (IC95%) foram: 31,7 (20,1-43,3) &#181;g/mL no plasma e 19,4 (11,1-27,7) &#181;g/mL no LCR. Com base nos resultados obtidos conclui-se que a penetração da anfotericina B foi insuficiente (10-27%), enquanto que a do fluconazol mostrou-se adequada com valores médios (IC95%) de 67 (47-87) %. / Analytical methods were developed to determine amphotericin B and fluconazole in only 200 L of plasma and in cerebrospinal fluid (CSF) by liquid chromatography (HPLC UVVIS). Amphotericin B was determined by HPLC - VIS using p-nitrophenol as internal standard, after the purification of biological matrices using acetonitrile, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of acetate buffer 0.1M pH 5.0 plus acetonitrile (50:50,v/v) 0.5mL/min at 385nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-25,0&#181;g/mL (linearity, r2 0.9999), DL 0.1&#181;g/mL, precision (5.4%/6.0%), accuracy expressed as systematic error (3.3%/2.2%). The stability was investigated, error systematic was 1% for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h). Thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. All procedures were performed under yellow light at room temperature. Fluconazole was determined by HPLC - UV using carbamazepine as internal standard, after the purification of biological matrices using liquid-liquid extraction in alkaline medium, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of purified water plus acetonitrile (70:30,v/v) 0.5mL/min at 210nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-250 &#181;g/mL(linearity, r2 0.9998), DL 0.1&#181;g/mL. Absolute recovery was 98% and relative recovery was 100%, intra/interday precision were 0,5/-1,3%; accuracy expressed as systematic error were 1.2%/1.2%.and relative recovery was 100%. Good stability for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h) and long term stability (at 20o C for 9 months) were demonstrated. Also thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. Twenty one adult patients of both sex were investigated. Inpatients with meningitis by Cryptococcus neoformans with AIDS were under high dose therapy with amphotericin B 1mg/Kg plus fluonazole 400 mg, every 12h during 12 weeks. Therapeutic monitoring of amphotericin B and fluconazole in plasma and in CSF showed ratios that indicate the penetration of antifungal drugs into CNS. Mean (CI95%) data were for amphotericin B 2.30 (0.02-5.08 ) &#181;g/mL in plasma and 0.30 (0.19-0.36) &#181;g/mL in CSF. Fluconazole showed 31.7 (20.1-43.3) &#181;g/mL in plasma and 19.4 (11.1-27.7) &#181;g/mL in CSF. Based on data obtained we conclude that the penetration of amphotericin B was poor (10-27%) while fluconazole was adequate 67% (47-87%), mean (CI95%).