Among fungal infections, those caused by Candida spp are the most recurrent. Candidaemias are the most emergent and amphotericin B has been the mainstay of therapy in spite of its therapeutic failures. Because of these limitations, susceptibility testing of fungi against antifungal agents has been evidencing a great importance in order to confirm susceptibility to the used antifungal agents. In this study, 144 Candida spp isolates from immunocompromised patients, that either evolved into death (Group 1) or survived to candidaemia episodes (Group 2), were assessed. Tests were made according to proceedings and culture media described on M27-A2 document currently provided by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Media such as Yeast Nitrogen Base- dextrose (YNBd) and Antibiotic Medium were also tested, being used a higher number of Amphotericin B concentrations. Susceptibility values of strains from Group 1 were significantly higher than Group 2 when Antibiotic Medium 3 (AM3) and YNBd were used. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Fungicidal Concentration (MFC) media values for strains from patients that survived to candidaemia were, respectively, 0.5 μg/dL and 0.7 μg/dL; whereas MIC and MFC media values for strains from patients that evolved into death were, respectively, 0.6 μg/dL and 0.9 μg/dL. Significant differences were not observed between the two groups of strains when using RPMI 1640 medium. / Dentre as infecções fúngicas, aquelas provocadas por Candida spp são as mais recorrentes, sendo as candidemias a forma mais emergente, cujo tratamento mais utilizado tem sido à base de anfotericina B, apesar das falhas terapêuticas a esse poliênico. Devido a tais falhas, os testes de avaliação da suscetibilidade de fungos a agentes antifúngicos passam a ter grande importância para confirmar a suscetibilidade aos agentes antifúngicos usados. Neste estudo foram avaliadas 144 isolados de Candida spp, oriundas de pacientes imunodeprimidos que evoluíram ao óbito ou que sobreviveram aos episódios de candidemia. Os testes foram realizados de acordo com os procedimentos e meios de cultura descritos no documento M27-A2 do atual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Testou-se também os meios Yeast Nitrogen Base dextrosado (YNBd) e Antibiotic Médium 3 (AM3) sendo utilizado um número maior de concentrações de anfotericina B. Os valores de suscetibilidade das cepas provenientes dos pacientes que evoluíram ao óbito foram significativamente maiores que os valores obtidos dos pacientes que sobreviveram a candidemia quando os meios utilizados foram o Antibiotic Médium 3 (AM3) e o YNBd, nos quais encontrou-se valores médios de Concentração Inibitória Mínima (CIM) igual a 0,5 μg/dL e valores de Concentração Fungicida Mínima (CFM) igual a 0,7 μg/dL para pacientes que sobreviveram a candidemia; valores médios de CIM igual a 0,6 μg/dL e de CFM igual a 0,9 μg/dL foram encontrados nas cepas dos pacientes que evoluiram ao óbito. Com o meio de cultura RPMI 1640 não foram observadas diferenças significativas nos valores de suscetibilidade entre os dois grupos de pacientes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-31Bitstream added on 2014-06-13T20:41:27Z : No. of bitstreams: 1 doria_rgs_dr_jabo.pdf: 805921 bytes, checksum: 7baf913cbb38741225210e93ed796dd6 (MD5) / Avaliaram-se os efeitos da perfusão regional intravenosa com anfotericina B, um antimicótico, em membros de equinos acometidos por pitiose, combinada com a excisão cirúrgica. Foram utilizados 16 equinos, jovens e adultos, da raça pantaneira, com pitiose em membro torácico ou pélvico, distalmente às articulações do cotovelo ou joelho, distribuídos em dois grupos experimentais. Um constituído de 12 equinos tratados, após excisão cirúrgica e termocauterização, por perfusão regional intravenosa do membro com anfotericina B (Ganf) e outro constituído de quatro equinos não tratados (controle, Gc). As feridas foram fotografadas e avaliadas antes do início do tratamento (D0) e após sete (D7), catorze (D14), vinte e um (D21), vinte e oito (D28), trinta e cinco (D35) e sessenta (D60) dias e foi realizado exame do aparelho locomotor. No Ganf, 92% dos animais apresentaram cicatrização das feridas de pitiose e no Gc 100% apresentaram recrudescência da afecção. No Ganf, 58% exigiram administração única de anfotericina B pela técnica de perfusão regional do membro e 42% exigiram uma readministração, após 14 dias. No Ganf, 33% apresentaram ulceração no local da administração da anfotericina B e 42% apresentaram aumento de volume do membro e dor à palpação na região perfundida pela anfotericina B. No Ganf, 100% dos animais apresentavam claudicação severa no D0 e 92% não apresentavam claudicação no D21. Conclui-se que a administração de anfotericina B, por perfusão regional intravenosa, promove a cura da pitiose, com mínimas reações adversas, sendo uma alternativa terapêutica para o tratamento de pitiose em membros de equinos. / The effects of intravenous regional perfusion with amphotericin B, an antifungal drug, in equine limbs with pythiosis associated with surgical excision were evaluated. 16 horses, young and adults, pantaneira breed, with pythiosis in thoracic or pelvic limbs, distally to the elbow or knee joints, were allocated into two experimental groups. One constituted by 12 horses treated, after surgical excision and thermocauterization, by intravenous regional limb perfusion with amphotericin B (Ganf) and other constituted by four not treated horses (control, Gc). The wounds were photographed and evaluated before the beginning of the treatment (D0) and after seven (D7), fourteen (D14), twenty-one (D21), twenty-eight (D28), thirty-five (D35) and sixty (D60) days and examination of the locomotor system was performed. 92% of the animals with pythiosis presented wound healing in Ganf and, in Gc, 100% presented recrudescence of the disease. In the Ganf, 58% of the animals needed single administration of amphotericin B by regional limb perfusion and 42% of the animals needed one more administration after 14 days. In the Ganf, 33% of the animals presented ulceration in the amphotericin B injection site and 42% of the animals presented limb edema and pain during palpation of the amphotericin B perfused region. In Ganf, 100% of the animals presented severe lameness at D0 and 92% of the animals presented no lameness at D21. It can be concluded that the administration of amphotericin B by intravenous regional perfusion promotes pythiosis remission with minimal side effects, being a therapeutic alternative to the pythiosis treatment in equine limbs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-20Bitstream added on 2014-06-13T18:46:55Z : No. of bitstreams: 1 pestana_kc_dr_arafcf.pdf: 1397611 bytes, checksum: 139f2c10e325976c56a9928f8e54e882 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Anfotericina B (AmB) é o fármaco de escolha para o tratamento das infecções fúngicas invasivas, importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunodeprimidos. A toxicidade da AmB na forma convencional tem estimulado o desenvolvimento de novas formulações para a administração do fármaco. Neste trabalho foram estudadas microemulsões óleo/água, contendo fosfatidilcolina de soja/tween 20 como agentes tensoativos, CaptexTM 200 como fase oleosa e tampão fosfato 50mM pH 7,2 como fase aquosa, com o objetivo de reduzir a toxicidade e aumentar a absorção oral da AmB. Os sistemas obtidos com diferentes proporções dos componentes foram descritos através de um diagrama de fase pseudo-ternário. As microestruturas foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS), reologia, microscopia de luz polarizada e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). Foi desenvolvido e validado um método por CLAE para a determinação de AmB em plasma para aplicação em estudo do perfil farmacocinético do fármaco veiculado na ME em ratos. A nefrotoxicidade da AmB foi avaliada pela determinação da creatinina plasmática dos ratos após administração oral da nova formulação desenvolvida (50 mg/kg), e comparada à administração da formulação convencional na mesma dose. Foi observado que o tamanho das gotículas das microemulsões aumenta quando a AmB é incorporada ao sistema. As amostras apresentaram comportamento Newtoniano e, dependendo da composição do sistema, antitixotropia foi observada. Também foi observado que a viscosidade aumenta com o aumento da fase oleosa assim como a formação de estruturas lamelares ordenadas que são desfavorecidas com a adição do fármaco. A incorporação do fármaco depende das proporções de fase oleosa e tensoativo. As interações da AmB... / Amphotericin B (AmB) is the drug of choice for therapy of invasive fungal infections, an important cause of morbidity and mortality among immunodeficient patients. The high toxicity of AmB in its conventional formulation have induced the development of innovative formulations for the drug administration. In this work, oil-in-water microemulsions containing soya phosphatidylcholine/Tween® 20 (1:1) as surfactant, captexTM 200 as oil phase, and phosphate buffer 50mM, pH 7.2 as aqueous phase were studied in order to reduce AmB toxicity and increase its oral absorption. Systems obtained with different proportions of the components were described by pseudoternary phase diagram. The microstructures of the system were characterized by dynamic light scattering (DLS), rheological behavior, polarized light microscopy and small angle X-ray scattering (SAXS). Was developed and validated a fast and selective HPLC method to determine AmB for application to study of pharmacokinetic profile of drug in rats. The nephrotoxicity of AmB was assessed by determining of rat plasma creatinine after oral administration of the novel formulation (50 mg/kg) and comparing with it a conventional formulation in the same dose. It was observed that the oil droplets size increase when AmB is incorporated into the system. The samples presented Newtonian behavior depending on the system composition. An anti-thixotropic behavior was found, as well, the viscosity increases withthe oil phase. The data showed the formation of ordered structures with lamellar arrangements in the drug unloaded systems and that order decrease with the drug incorporation. The AmB incorporation into the system was dependent on both the oil phase and surfactant. The interactions of AmB with the systems can control both the drug solubility and release... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-06-15T21:37:26Z No. of bitstreams: 1 EvertonDoNascimentoAlencar_TESE.pdf: 6171877 bytes, checksum: 2831c92f54cc1bc8644ca0318786032e (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-06-21T22:22:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 EvertonDoNascimentoAlencar_TESE.pdf: 6171877 bytes, checksum: 2831c92f54cc1bc8644ca0318786032e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-21T22:22:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EvertonDoNascimentoAlencar_TESE.pdf: 6171877 bytes, checksum: 2831c92f54cc1bc8644ca0318786032e (MD5) Previous issue date: 2017-12-14 / Esta tese foi gerada como parte dos esforços em gerar conhecimentos de estudos de estabilidade química e cinética de degradação que possam ser aplicados a microemulsões contendo Anfotericina B (AmB). O objetivo desta tese foi determinar as vias de degradação da AmB em óleo, visto que microemulsões são multifásicas e de composição complexa. Esta tese mostra esforços experimentais em determinar as vias de degradação da AmB em óleo, assim como determinar o esquema de degradação e o modelo matemático que reflita o comportamento de degradação desta molécula em solução lipídica. Diferentes soluções contendo AmB em óleo foram preparadas e armazenadas em diferentes condições de temperatura e luz, assim como presença e ausência de co-solutos. Estudos analíticos foram feitos por Espectrofotometria UVVis e por método validado em Cromatografia Líquida de Alta Pressão. Foi possível observar que o uso de antioxidantes doadores de hidrogênio no meio reacional aumentou a estabilidade de AmB sob estresse térmico ao longo do tempo. Entretanto, a cinética de degradação da AmB em triglicerídeo de cadeia média não foi linearmente dependente da temperatura. A adição de um iniciador radicalar aumentou a degradação da AmB em metanol. Adicionalmente, baseado em estudos de adsorção e agregação, foi possível observar que estes fenômenos não estão diretamente relacionados a degradação da AmB em óleo. Em armazenamento protegido da luz, a via de degradação mais provável por ser responsável pela perda de AmB do meio reacional é a auto-oxidação. Enquanto sob luz visível e UV, a oxidação catalisada pela luz é predominante. Modelos cinéticos foram construídos baseados nestas evidências experimentais. O modelo complexo para condições protegidas de luz mostrou que a AmB sofre não somente auto-oxidação, mas perda reversível, que pode estar relacionada à hidrólise por água residual. O modelo para degradação sob exposição à luz foi de pseudo-primeira ordem. Os modelos teóricos representaram os dados experimentais adequadamente e as constantes cinéticas foram estimadas. Entretanto, devido a degradação ocorrer por vias de degradação múltiplas e concomitantes, os parâmetros cinéticos de cada processo envolvido não foram estimados. As informações geradas por esta tese ajudarão a estimar adequadamente a cinética de degradação em sistemas de liberação complexos quando associados aos dados cinéticos nas demais fases em que o fármaco esteja presente. Além disto, este estudo sugeriu possíveis produtos oriundos da oxidação da AmB. Portanto, estudos de identificação e síntese devem ser realizados a fim de investigar a relação da toxicidade da AmB e seus produtos de degradação. / This thesis is part of research efforts with the intent of applying chemical stability and drug degradation kinetics knowledge to lipid-based systems, as amphotericin B (AmB) usually requires a lipid-based nanotechnological delivery system to overcome its biopharmaceutical issues. The aim of this thesis was to determine the instability pathway and degradation kinetics of AmB in oil solutions, since stability of drug in delivery systems are chemically complex to be investigated due to their multi-phased aspect. This thesis was driven on the hypothesis that AmB´s toxicity might be associated to the drug degradation instead of what is reported by the literature, which is mainly related to the drug´s aggregation state. The experimental research herein was conducted in order to investigate the chemical instability pathways and kinetics of AmB in oils, aiming to generate knowledge that can be useful on a larger context involving microemulsions currently studied by our research group. For this purpose, reaction mixtures containing AmB were prepared using different solvents and cosolutes. Samples were stored under different conditions of temperature and light exposure. AmB aggregation state in the reaction mixtures was investigated by UV-Vis spectroscopy. The degradation pathway of AmB in oil was investigated. The results revealed that the use of hydrogen donator antioxidants decreased the degradation of AmB under thermal stress. Also, the AmB degradation under dark conditions was not linearly temperature dependent. Additionally, the use of radical initiator greatly increased the degradation of AmB in methanol. Based on the obtained results, adsorption and aggregation did not appear to play an important role in the AmB degradation in oil. Under dark conditions, the most likely pathway for AmB degradation in oil was autoxidation, whereas under light exposure, the most likely degradation pathway was light catalyzed oxidation. Empirical degradation schemes were drawn and differential equations were developed to explain the AmB loss process. A kinetic model was successfully used to describe the AmB loss in different solvents under dark environment. The model proved that AmB undergoes a complex degradation pathway, once a simple autocatalytic model could not describe its loss. In fact, a reversible loss probably related to hydrolysis might be involved, as demonstrated by the scheme and the kinetic model. A second model successfully described the AmB loss under light exposure. AmB loss in this condition showed to be of pseudo-first order. Due to the complex degradation pathway, the kinetics of the different processes leading to the AmB degradation could not be distinguished. The information generated by this research will help to predict AmB instability in microemulsion systems, once the data of AmB degradation in aqueous phase and surfactants will be associated. Additionally, further efforts on trying to generate and isolate the degradants here suggested can help on the investigation of the toxicity related to degradation products.

Orientador: Carlos Augusto Araújo Valadão / Banca: Rita de Cássia Campbell / Banca: José Wanderley Cattelan / Banca: Antônio Carlos Alessi / Banca: Juliana Regina Peiró / Resumo: Avaliaram-se os efeitos da perfusão regional intravenosa com anfotericina B, um antimicótico, em membros de equinos acometidos por pitiose, combinada com a excisão cirúrgica. Foram utilizados 16 equinos, jovens e adultos, da raça pantaneira, com pitiose em membro torácico ou pélvico, distalmente às articulações do cotovelo ou joelho, distribuídos em dois grupos experimentais. Um constituído de 12 equinos tratados, após excisão cirúrgica e termocauterização, por perfusão regional intravenosa do membro com anfotericina B (Ganf) e outro constituído de quatro equinos não tratados (controle, Gc). As feridas foram fotografadas e avaliadas antes do início do tratamento (D0) e após sete (D7), catorze (D14), vinte e um (D21), vinte e oito (D28), trinta e cinco (D35) e sessenta (D60) dias e foi realizado exame do aparelho locomotor. No Ganf, 92% dos animais apresentaram cicatrização das feridas de pitiose e no Gc 100% apresentaram recrudescência da afecção. No Ganf, 58% exigiram administração única de anfotericina B pela técnica de perfusão regional do membro e 42% exigiram uma readministração, após 14 dias. No Ganf, 33% apresentaram ulceração no local da administração da anfotericina B e 42% apresentaram aumento de volume do membro e dor à palpação na região perfundida pela anfotericina B. No Ganf, 100% dos animais apresentavam claudicação severa no D0 e 92% não apresentavam claudicação no D21. Conclui-se que a administração de anfotericina B, por perfusão regional intravenosa, promove a cura da pitiose, com mínimas reações adversas, sendo uma alternativa terapêutica para o tratamento de pitiose em membros de equinos. / Abstract: The effects of intravenous regional perfusion with amphotericin B, an antifungal drug, in equine limbs with pythiosis associated with surgical excision were evaluated. 16 horses, young and adults, pantaneira breed, with pythiosis in thoracic or pelvic limbs, distally to the elbow or knee joints, were allocated into two experimental groups. One constituted by 12 horses treated, after surgical excision and thermocauterization, by intravenous regional limb perfusion with amphotericin B (Ganf) and other constituted by four not treated horses (control, Gc). The wounds were photographed and evaluated before the beginning of the treatment (D0) and after seven (D7), fourteen (D14), twenty-one (D21), twenty-eight (D28), thirty-five (D35) and sixty (D60) days and examination of the locomotor system was performed. 92% of the animals with pythiosis presented wound healing in Ganf and, in Gc, 100% presented recrudescence of the disease. In the Ganf, 58% of the animals needed single administration of amphotericin B by regional limb perfusion and 42% of the animals needed one more administration after 14 days. In the Ganf, 33% of the animals presented ulceration in the amphotericin B injection site and 42% of the animals presented limb edema and pain during palpation of the amphotericin B perfused region. In Ganf, 100% of the animals presented severe lameness at D0 and 92% of the animals presented no lameness at D21. It can be concluded that the administration of amphotericin B by intravenous regional perfusion promotes pythiosis remission with minimal side effects, being a therapeutic alternative to the pythiosis treatment in equine limbs. / Doutor

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-12-29T16:13:13Z No. of bitstreams: 1 HenriqueRodriguesMarcelino_TESE.pdf: 41935029 bytes, checksum: f0753c6daecb5d46efe91996e88f61a5 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-01-02T16:17:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 HenriqueRodriguesMarcelino_TESE.pdf: 41935029 bytes, checksum: f0753c6daecb5d46efe91996e88f61a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-02T16:17:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HenriqueRodriguesMarcelino_TESE.pdf: 41935029 bytes, checksum: f0753c6daecb5d46efe91996e88f61a5 (MD5) Previous issue date: 2016-04-08 / Esta tese foi realizada com o objetivo geral de desenvolver e a caracterizar nanocarreadores com potencial para sobrepujar as propriedades biofarmac?uticas n?o-favor?veis da anfotericina B (AmB), uma mol?cula extremamente eficaz no tratamento de infec??es sistemicas fungicas e leishmaniose, mas dif?cil de formular independentemente da via de administra??o desejada. Acredita-se que essa mol?cula hidrof?bica possui limita??es devido a pronunciada tend?ncia de agregar sob condi??es fisiol?gicas humanas. A primeira parte desta tese foi conduzida pela hip?tese de que o estado de agrega??o da AmB teria um forte impacto sobre as propriedades farmacocin?ticas da mesma. Por tal raz?o, complexos de albumina e amB foram produzidos de forma a controlar o estado de agrega??o da AmB. A estrutura dos coloides obtidos foi caracterizada atrav?s de ensaios de espectroscopia UV-Vis e dicroismo circular. Adicionalmente, o impacto do estado de agrega??o na permeabilidade intestinal e no poss?vel reconhecimento dos agregados pelo sistema imunol?gico foram investigados. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de micro- e nanocarreadores para sobrepor as barreiras para absor??o da AmB ap?s a sua administra??o pela via oral. Para este fim, AmB foi incorporada em micro- e nanoemuls?es para observa??o da habilidade destes sistemas de incrementar a permeabilidade intestinal de mol?culas. Tal habilidade foi avaliada atrav?s do m?todo ex vivo de C?maras de Ussing, onde o tecido intestinal ? utilizado como barreira entre duas semi-c?maras. Nenhuma permea??o foi detectada nas condi??es experimentais utilizadas. No entanto, os dados obtidos atrav?s da medidas eletrofisiol?gicas demonstraram que a velocidade da perda da viabilidade do tecido ? dependente do estado de agrega??o da AmB em contato com o tecido. Tamb?m foi observado, atrav?s dos ensaios de permeabilidade que as rotas de absor??o paracelular e transcelular devem ser rotas marginais quando a absor??o da AmB ? observada in vivo, como descrito na literatura. Como alternativas, as rotas de absor??o pela captura de agregados e part?culas pelas placas de Peyer e a rota de absor??o linf?tica t?m sido discutidas. Finalmente, um otro sistema particulado que objetiva a libera??o em n?vel de col?n e baseada na utiliza??o da xilana, um biopol?mero natural e enzimaticamente degradado. A xilana ? polissacar?deo presente em gr?os, cereais e plantas angiospermas que ? especificamente degradado na regi?o col?nica, especificamente pela microbiota l? presente. A t?cnica aplicada de forma original consiste na forma??o de uma emuls?o ?gua-?gua de xilana em presen?a de PEG, seguida por uma etapa de reticula??o com o tris?dio trimetafosfato. Atrav?s da aplica??o desta t?cnica foi poss?vel produzir part?culas ? base de xilana que podem ter seu tamanho m?dio, de forma controlada, variado entre 380 nm e 4.5 ?m, de acordo com os par?metros utilizados. Esta t?cnica tamb?m ? livre do uso de solventes org?nicos e possui potencial aplica??o para a libera??o controlada de AmB em n?vel de col?n. / This thesis is part of the development and evaluation of nanomedicines potentially able to overcome unfavorable biopharmaceutical properties of amphotericin B (AmB), a highly effective molecule used for the treatment of systemic fungal infections and leishmaniasis, but difficult to formulate efficiently, whatever the route of delivery. It is believed that this hydrophobic molecule suffers from severe limitations due to its pronounced tendency to aggregate under physiological conditions. The first part of the thesis was driven on the hypothesis that the degree of aggregation of AmB could have a strong impact on some of its pharmacokinetics properties. For this purpose albumin has been used to produce controlled complexes between albumin and AmB in order to control AmB aggregation states. The morphological characteristics of the resulting colloidal objects have been carefully characterized by UV-Vis spectroscopy and circular dichroism. Furthermore, the impact of aggregation state on both the intestinal permeability and a possibly expected recognition of the aggregates by the immunological system were investigated. The second part of this work was focused on the development of micro- and nanocarriers intended to overcome the absorption barrier raised against AmB after oral delivery. For this purpose, AmB was loaded into micro- and nanoemulsions to evaluate a possible permeability enhancement effect through the intestinal membrane, which was evaluated in ratas using the Ussing chamber model. No detectable permeation was seen in any of the experimental conditions. However, the electrophysiological data showed tissue viability losses due to the strong toxicity of AmB, that were dependent on the aggregation state of AmB when in contact with the tissue. It was also concluded from detailed permeation experiments in healthy tissues that paracellular and transcellular routes were likely to be only marginal pathways when oral absorption are observed in vivo, as reported in the literature. The likeness of other possible absorption pathways, including Peyer's patches capture and lymphatic pathway implication for aggregated particles has been discussed. Finally, another particulate system intended for colonic delivery and based on xylan, a natural and enzymatically degradable biopolymer, has been investigated. Xylan is a polysaccharide present in grains, cereals and angiosperm plants that is specifically degraded on colon region, by the microbiota. An original process consisting in a water-in-water emulsion of xylan in presence of PEG followed by a crosslinking phase using trisodium trimetaphosphate has been developed, making possible the production of xylan-based biocompatible micro- and nanospheres ranging from 380 nm to 4.5 ?m, depending on the parameters in the process. This eco-friendly process is free of harmful solvents and has potential application for the delivery of AmB at the colonic level.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-09-19T19:36:44Z No. of bitstreams: 1 MiguelAdelinoDaSilvaFilho_TESE.pdf: 3307229 bytes, checksum: 121783886d066fa57c0f37b4ba45bf1e (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-09-19T22:27:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 MiguelAdelinoDaSilvaFilho_TESE.pdf: 3307229 bytes, checksum: 121783886d066fa57c0f37b4ba45bf1e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-19T22:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MiguelAdelinoDaSilvaFilho_TESE.pdf: 3307229 bytes, checksum: 121783886d066fa57c0f37b4ba45bf1e (MD5) Previous issue date: 2017-05-19 / O aumento da incid?ncia das infec??es f?ngicas sist?micas juntamente com o crescimento de isolados cl?nicos resistente ao tratamento usual ? um cen?rio epidemiol?gico ? desafiador para a pr?tica cl?nica. O desenvolvimento de novas estrat?gias terap?uticas ? de suma import?ncia para o controle desse quadro epidemiol?gico. A anfotericina B micelar (AmB-D) apresenta um satisfat?rio perfil de atividade, por?m sua toxicidade ? pronunciada. Uma alternativa para redu??o da sua toxicidade ? o aquecimento moderado da AmB-D que resulta nos superagregados (AmB-H). Objetivando desenvolver uma nova alternativa terap?utica, foi avaliado as modifica??es estruturais da AmB-H acessando suas caracter?sticas f?sico-qu?micas, perfil de toxicidade ?in vitro? em hem?cias, atividade ?in vitro? em cepas de Candida sp e o delineamento de um modelo semi mecan?stico PKPD. A espectroscopia demonstrou que h? um deslocamento da banda dos agregados de 327nm para 323nm, AmB-D e AmB-H respectivamente. O estudo de dilui??o comprovou que AmB-H atua como reservat?rio das formas monom?ricas de anfotercinida B. Os estudos de toxicidade em hem?cias demonstraram que as formas agregadas de AmB-H em altas concentra??es (5mg.L-1 e 50mg.L-1) apresenta em torno de 2% de libera??o de hemoglobina enquanto que a AmB-D apresenta libera??o de 100%, comprovando o perfil de baixa toxicidade por um modelo mais robusto. A avalia??o de atividade da AmB-H apresentou resultados similares aos da AmB-D em ensaios com C. albicans e C. parapsiloses. A avalia??o das etapas cr?ticas do processo de liofiliza??o de AmB-H demonstrou ser um procedimento seguro, o que torna uma excelente estrat?gia de produ??o dos superagregados. Com rela??o ? farmacometria, o modelo semi mecan?stico PKPD demonstrou que AmB-H ? cerca de 25% mais potente que a AmB-D e tamb?m forneceu outros importantes dados quantitativos que corroboram com a literatura cient?fica e que servir?o de suporte tanto para o desenvolvimento de estudos cl?nicos. Todos esses dados demonstram que a AmB-H ? um sistema promissor e juntamente com outros dados da literatura, fornece subs?dios cient?ficos s?lidos para dar in?cio aos estudos cl?nicos e finalmente o desenvolvimento de uma nova estrat?gia terap?utica. / The increasing incidence of systemic fungal infections along with the growth of clinical isolates resistant to first line clinical treatment is a challenging epidemiological scenario in clinical practice. The development of new strategies is of paramount importance for the control of this rampant problem. Micellar amphotericin B (AmB-D) has a satisfactory activity profile, but its toxicity is pronounced. An alternative to reduce its toxicity is the controled heating of AmB-D resulting in superaggregates (AmB-H). Aiming a new therapeutic alternative, it was evaluated as structural modifications of AmB-H by accessing its physico-chemical characteristics, ?in vitro? toxicity profile in red blood cells, ?in vitro? activity in Candida sp strains and designed a semi-mechanistic PKPD model. A spectroscopy screening showed that there is a blue shift at the aggregate band from 327nm to 323nm, AmB-D and AmB-H respectively. The dilution study showed that AmB-H acts as the reservoir for the amphotericin B monomeric forms. Red blood cell toxicity studies have demonstrated that at high concentrations of AmB-H (5mg.L-1 and 50mg.L-1) presents around 2% of hemoglobin leakage whereas AmB-D presents the 100%, proving the profile of low toxicity by this experiment model. The activity evaluation, the AmB-H presented similar results to AmB-D against C. albicans and C. parapsiloses. The evaluation of the critical steps of the freeze-drying process, AmB-H has proven no changing during the process making it a good manufacturing strategy. Regarding the pharmacometrics, the semi-mechanistic PKPD model demonstrated that AmB-H is about 25% more potent than AmB-D and the model also provides quantitative parameters estimates that corroborate with a scientific literature and it provides a support to the development of clinical trials. All these data demonstrate that AmB-H is a promising system and together with scientific literature, it produces solid scientific subsidies to initiate clinical trials and finally the development of a new therapeutic strategy.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: Amphotericin B (AmB) is an antifungal extracted from Streptomyces nodosus. Its fungicidal activity depends primarily on its binding to the sterol group, present in the membrane of fungi. Due to the toxicity of this drug this study aimed to evaluate their mutagenic, carcinogenic and recombinogenic activity. To do so, we used Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) and the test for the detection of Epithelial Tumors (wts), both in Drosophila melanogaster. In the assessment using SMART, larvae from 72 h, descendants from the standard (ST) cross and the high bioactivation (HB) cross were treated with different concentrations of Amphotericin B (0.01; 0.02 e 0.04 mg/mL). The results revealed that the AmB is a promutagen exhibiting increase in the number of spots on individuals from high bioactivation (HB) cross with a high level of the cytochrome P450. The results also indicate that recombinogenicity is the main genotoxic event induced by AmB. Homologous recombination can function as a determinant at different stages of carcinogenesis. For verification, larvae from the wts test, descendants from the wts/TM3 virgin female and mwh/mwh male cross, were treated with the same three AmB concentrations separately and in association with mitomicin C (0.1 mM). The results did not, however, provide evidence that AmB has carcinogenic potential. / CAPÍTULO II: A Anfotericina B (Anf B) é um antifúngico extraído de Streptomyces nodosus, que possui atividade antibiótica efetiva contra diversas espécies de fungos patogênicos. Devido à toxicidade desta droga, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar sua atividade mutagênica, recombinogênica e carcinogênica. Para tanto, foram utilizados os testes para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (SMART) e o Teste para Detecção de Tumores Epiteliais (wts), ambos realizados em Drosophila melanogaster. No SMART foram utilizadas larvas de 4 horas provenientes do cruzamento padrão (ST) e de alta capacidade de bioativação metabólica (HB). As larvas provenientes de ambos os cruzamentos foram tratadas com diferentes concentrações de Anfotericina B (0,01; 0,02 e 0,04 mg/mL). Os resultados revelaram que a Anf B causou aumento significativo no número de manchas nos indivíduos provenientes do cruzamento HB, o que sugere que esse fármaco atua como um prómutageno, manifestando tal efeito após a biotransformação pelo sistema citocromo P450. Os resultados indicam, também, que a recombinogenicidade é o principal evento induzido pela Anf B. A recombinação homóloga pode ter função determinante nos diferentes estágios da carcinogênese. Para esta verificação, larvas provenientes do teste wts, descendentes do cruzamento de fêmeas virgens wts/TM3 com machos mwh/mwh, foram tratadas com as mesmas concentrações de Anf B isoladas e em associação com a mitomicina C (0,1 mM). Os resultados não revelaram atividade carcinogênica para a Anf B. / Mestre em Genética e Bioquímica

As infecções fúngicas invasivas (IFIs) são um problema de saúde pública e representam uma importante causa de morbidade e mortalidade. A Anfotericina B (AnfB) é a droga de escolha no tratamento das IFIs. Apesar da sua eficácia, a AnfB está associada com efeitos adversos como a nefrotoxicidade. Com o número elevado de pacientes suscetíveis às IFIs, estudos foram desenvolvidos e demonstraram que a nefrotoxicidade pode ser prevenida através do uso de AnfBs modificadas. Dessas modificações, a AnfB incorporada à uma emulsão lipídica (AnfB/EL) apresenta baixo custo e similar eficácia. Existe uma alta prevalência de deficiência de vitamina D (dVD) na população mundial. Sendo assim, a hipovitaminose D pode acelerar a progressão da doença renal e refletir em mau prognóstico em casos de nefrotoxicidade. Esse trabalho visa analisar se a deficiência da vitamina D pode induzir a nefrotoxicidade da AnfB/EL. Ratos Wistar foram divididos em quatro grupos: controle, animais que receberam dieta padrão por 34 dias; AnfB/EL, animais que receberam dieta padrão por 34 dias e injeção intraperitoneal de AnfB/EL (5mg/kg/dia) nos últimos 4 dias; dVD, animais que receberam dieta depletada em vitamina D por 34 dias; e dVD+AnfB/EL, animais que receberam dieta depletada em vitamina D por 34 dias e a injeção intraperitoneal de AnfB/EL (5mg/kg/dia) nos últimos 4 dias. Amostras de sangue, urina e tecido renal foram coletadas para a análise dos efeitos da droga sobre a função, hemodinâmica e morfologia renal. A associação de AnfB/EL com a hipovitaminose D levou a injúria renal, lesão tubular discreta, hiperfosfatúria, hipermagnesiúria, hipertensão e comprometimento do mecanismo de concentração urinária. Dessa forma, é essencial monitorar os níveis de vitamina D em pacientes tratados com AnfB/EL, uma vez que a deficiência dessa vitamina é um fator indutor de nefrotoxicidade associada ao uso da AnfB/EL / Invasive fungal infections (IFI) have become a worldwide serious health problem and represent a significant cause of morbidity and mortality. Amphotericin B (AmB) is the drug of choice for the treatment of IFI. Despite its efficacy, use of AmB has been associated with adverse reactions such as nephrotoxicity The increasing number of high-risk patients, who are more susceptible to IFI and are more likely to use AmB, has enabled the development of modified AmBs in order to reduce nephrotoxicity. Among these formulations, an extemporaneous lipid emulsion preparation of AmB (AmB/LE) is a lower cost alternative with similar benefits. Moreover, studies have shown a high prevalence of vitamin D deficiency (VDD) in immunocompromised individuals and patients hospitalized in intensive care units. Thus, vitamin D deficiency or insufficiency may hasten the progression of kidney disease and reflect on a worse prognosis in cases of acute kidney injury and drug-induced nephrotoxicity. In view of the high worldwide incidence of hypovitaminosis D, the aim of this study was to investigate whether vitamin D deficiency may induce AmB/LE-related nephrotoxicity. Wistar rats were divided into four groups: control, received a standard diet for 34 days; AmB/LE, received a standard diet for 34 days and AmB/LE (5mg/kg/day) intraperitoneally in the last 4 days; VDD, received a vitamin D-free diet for 34 days; and VDD+AmB/LE, received a vitamin D-free diet for 34 days and AmB/LE (5mg/kg/day) intraperitoneally in the last 4 days. Blood, urine and renal tissue samples were collected in order to evaluate the effects of the drug on renal function, hemodynamic and morphology. Association of AmB/LE and vitamin D deficiency led to impaired renal function, mild tubular injury, hypertension and urinary concentration defect. Hence, it is important to monitor vitamin D levels in AmB/LE treated patients, since vitamin D deficiency induces AmB/LE nephrotoxicity

Desenvolveram-se métodos bioanalíticos para determinação de anfotericina B e fluconazol em apenas 200 L de plasma e líquor (LCR) através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE UV-VIS). A anfotericina B foi determinada através de CLAE-VIS utilizando p-nitrofenol como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas com acetonitrila, seguida da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por tampão acetato 0,1M pH 5,0 e acetonitrila (50:50,v/v) 0,5mL/min em 385nm; o tempo de corrida foi 15 min. Através da validação o método mostrou-se robusto com 0,2-25,0 µg/mL(linearidade, r2 0,9999), LD 0,1 µg/mL, precisão (5,4% e 6,9%), exatidão expressa através do erro sistemático (3,3% e 2,2%): intra e interdias). Os estudos de estabilidade evidenciaram 1,0% para o erro sistemático e 3% de precisão na bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), e os ciclos de congelamento evidenciaram boa estabilidade uma vez que todos os ensaios foram realizados em Laboratório de luz amarela. O fluconazol foi determinado através de CLAE-UV utilizando carbamazepina como padrão interno, após purificação das matrizes biológicas pela extração líquido-líquido com diclorometano em meio alcalino, seguido da análise em coluna Nova Pak C18 (150 x 3,9mm, 4 micron) e fase móvel constituída por água UP e acetonitrila (70:30,v/v) 0,5mL/min em 210nm; o tempo de corrida foi 15 min. O método mostrou-se robusto com 0,2-250 µg/mL(linearidade, r2 0,9998), LD 0,1µg/mL, com boa recuperação absoluta (98%) e relativa (100%), precisão 0,5%/1,3%, exatidão expressa através do erro sistemático (1,2%). Evidenciou-se ótima estabilidade para os extratos em bandeja (tempo e condição de análise por 24 h), na longa duração (20° C, 9 meses) e através dos ciclos de congelamento. Investigaram-se 21 pacientes adultos de ambos os sexos portadores de meningite criptocócica com AIDS após internação emergencial em terapia de alta dose com anfotericina B (1mg/Kg) e fluonazol (400 mg, 12/12 horas) durante 12 semanas. O monitoramento das concentrações de anfotericina B e fluconazol no plasma e no LCR forneceram as razões que permitiram estimar a penetração dos antifúngicos no SNC. Obtiveram-se concentrações de anfotericina B, médias (IC95%): 2,30 (0,02-5,08) µg/mL no plasma e 0,30 (0,19-0,36) µg/mL no LCR. As concentrações do fluconazol, médias (IC95%) foram: 31,7 (20,1-43,3) µg/mL no plasma e 19,4 (11,1-27,7) µg/mL no LCR. Com base nos resultados obtidos conclui-se que a penetração da anfotericina B foi insuficiente (10-27%), enquanto que a do fluconazol mostrou-se adequada com valores médios (IC95%) de 67 (47-87) %. / Analytical methods were developed to determine amphotericin B and fluconazole in only 200 L of plasma and in cerebrospinal fluid (CSF) by liquid chromatography (HPLC UVVIS). Amphotericin B was determined by HPLC - VIS using p-nitrophenol as internal standard, after the purification of biological matrices using acetonitrile, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of acetate buffer 0.1M pH 5.0 plus acetonitrile (50:50,v/v) 0.5mL/min at 385nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-25,0µg/mL (linearity, r2 0.9999), DL 0.1µg/mL, precision (5.4%/6.0%), accuracy expressed as systematic error (3.3%/2.2%). The stability was investigated, error systematic was 1% for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h). Thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. All procedures were performed under yellow light at room temperature. Fluconazole was determined by HPLC - UV using carbamazepine as internal standard, after the purification of biological matrices using liquid-liquid extraction in alkaline medium, followed by chromatographic analysis in a Nova Pak C18 column (150 x 3.9mm, 4 micron) and mobile phase consisting of purified water plus acetonitrile (70:30,v/v) 0.5mL/min at 210nm; the run time required was 15 min. Bioanalytical method validated showed robustness, 0.2-250 µg/mL(linearity, r2 0.9998), DL 0.1µg/mL. Absolute recovery was 98% and relative recovery was 100%, intra/interday precision were 0,5/-1,3%; accuracy expressed as systematic error were 1.2%/1.2%.and relative recovery was 100%. Good stability for the vials on the rack (time and conditions of drug analysis, 24h) and long term stability (at 20o C for 9 months) were demonstrated. Also thawing cycles showed good stability after three freezing-thawing cycles. Twenty one adult patients of both sex were investigated. Inpatients with meningitis by Cryptococcus neoformans with AIDS were under high dose therapy with amphotericin B 1mg/Kg plus fluonazole 400 mg, every 12h during 12 weeks. Therapeutic monitoring of amphotericin B and fluconazole in plasma and in CSF showed ratios that indicate the penetration of antifungal drugs into CNS. Mean (CI95%) data were for amphotericin B 2.30 (0.02-5.08 ) µg/mL in plasma and 0.30 (0.19-0.36) µg/mL in CSF. Fluconazole showed 31.7 (20.1-43.3) µg/mL in plasma and 19.4 (11.1-27.7) µg/mL in CSF. Based on data obtained we conclude that the penetration of amphotericin B was poor (10-27%) while fluconazole was adequate 67% (47-87%), mean (CI95%).