L’hypertension artérielle est une maladie induite par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. De nombreuses pathologies y sont associées. A travers ce travail, j’ai abordé trois aspects de la régulation de la pression artérielle in vivo et in vitro. Dans une première partie, j’ai étudié le rôle de l’activation du récepteur AT1 de l’angiotensine II dans le développement de la fibrose, indépendamment de l’hypertension artérielle. Un modèle animal exprimant un récepteur constitutivement actif et des modèles cellulaires (MEF, HEK293, H295) exprimant le récepteur constitutivement actif de façon inductible ont été utilisés. Contrairement aux souris sur fond mixte, les souris mutées sur fond pur C57Bl6 ne développent pas de fibrose cardiaque et rénale et ont une hypertension modérée, qui est difficile à réduire par les anti-hypertenseurs. De plus, les cellules fibroblastiques MEF ne sont pas un bon modèle pour étudier la fibrose induite par l’angiotensine II. Seule l’ostéopontine est un marqueur induit par l’expression du récepteur AT1 contitutivement actif. Ces différents modèles, étudiés extensivement, ne sont donc pas adaptés pour répondre aux questions posées. Dans la seconde partie de ma thèse, un travail collaboratif a permis de mettre en évidence le rôle majeur de Wnk1 au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire induits par une infusion chronique d’angiotensine II. En effet, les souris Wnk1+/- (haplo-insuffisantes pour le gène Wnk1) présentent une résistance transitoire à l’hypertension induite par l’angiotensine II, particulièrement au cours de la première semaine d’infusion. Cette résistance est associée à une altération du remodelage hypertrophique cardiovasculaire mais la fonction rénale et la sécrétion d’aldostérone sont préservées. Au niveau mécanistique, nos résultats ont identifié Wnk1 comme un activateur important de la phosphorylation de Mypt1, un marqueur connu de l’activité de la voie Rho-kinase. Les aortes de souris Wnk1+/- présentent une diminution transitoire de la phosphorylation de Mypt1 après une semaine d’infusion d’angiotensine II. De façon importante, nous montrons aussi que l’infusion chronique d’angiotensine II induit une activation de l’expression du gène Wnk1 au niveau aortique, et la surexpression de Wnk1 in vitro active de façon importante et reproductible la phosphorylation de Mypt1, indépendamment de l’activation de Spak (substrat bien caractérisé de Wnk1). En conclusion, ce travail a permis d’identifier Wnk1 comme un nouveau gène cible de l’angiotensine II au niveau vasculaire et a révélé un nouveau mécanisme mis en jeu au cours de l’hypertension et du remodelage cardiovasculaire qui lui est associé. Cette étude fait l’objet d’un article que je signe en premier auteur et qui est actuellement soumis pour publication. Dans une dernière partie, j’ai étudié le rôle de la culline3 dans la régulationde la voie RhoKinase. Les mutations du gène Cul3 ont très récemment été identifiées comme responsables du syndrome de Gordon. Ce gène code une protéine d’échafaudage d’un complexe d’ubiquitination important et ubiquitaire (CRL3) conduisant à la dégradation protéique. La voie des Rho-kinases joue un rôle majeur dans le tonus vasculaire et sa régulation par les agents relaxants ou constricteurs. Des travauxrécents suggèrent que la dégradation de RhoA implique le complexe culline3-ring-ligase (CRL3). Nous avons voulu établir les liens structuraux et fonctionnels entre ce complexe d’ubiquitination et la voie Rho-kinase dans des modèles cellulaires, pour ainsi expliquer tout ou partie du mécanisme moléculaire conduisant des mutations constitutionnelles du gène Cul3 à produire une hypertension artérielle. Les interactions protéiques entre deux adaptateurs différents et la culline3 nous ont permis de montrer que la culline3 mutée entraine une modification d’affinité spécifique selon ses partenaires. Les interactions entre RhoA et le CRL3 n’ont pas pu être démontré. (...) / Hypertension is a disease due to multiple genetic and environmental factors. Many cardiovascular diseases are associated. During my PhD thesis, I addressed three aspects of the regulation of blood pressure in vivo and in vitro. In the first part, I studied the role of angiotensin II AT1 receptor activation in the development of fibrosis, independently of hypertension. I used animal and cellular models (MEF, HEK293, H295) expressing a constitutively active receptor. The results show that the mutant mice did not develop cardiac or renal fibrosis in a pure C57Bl6 strain. Furthermore, their moderate hypertension has not been normalized with two antihypertensives. The pure C57BL6 genetic background seems to be the cause of this moderate phenotype. Furthermore, MEF cells are not a good model to study fibrosis induced by angiotensin II. Only osteopontin is a marker induced by expression of the mutant receptor. As the mouse models and despite of their originality, these cellular models appear to be inappropriate to study AngII-dependent fibrosis. These limitations together with the weakness of the AT1 mutant phenotype lead to us to stop this project. In the second part of my thesis, a collaborative study allows us to show that Wnk1-haploinsufficiency in mice is responsible for a strong and transitory resistance to angiotensin II (AngII)-induced hypertension associated with a significant reduction of cardiovascular remodeling and a preservation of renal function and aldosterone release. Mechanistically, we unravel a critical role for Wnk1 in the activation of the phosphorylation of Mypt1, a known marker of the Rho-kinase pathway activity. Wnk1-haploinsufficient mice display a significant and transitory decrease of AngII-induced phospho- Mypt1 in the aorta, concomitant to the hypertension-resistance. Importantly, we further evidence that, in the vasculature, AngII chronic infusion induces a significant upregulation in Wnk1 gene expression which causes in vitro a significant increase in Mypt1 phosphorylation independently of spak activation. Our results provide new insight into the downstream vascular signaling pathway of AngII and unravel a previously unsuspected mechanism linking Wnk1 to hypertension and vascular remodeling. In the last part, I studied the role of vascular Cullin3 (Cul3) in the development of hypertension. Mutations in this gene have been recently identified as responsible for a familial hypertension with hyperkalaemia, FHHt. The Cul3 gene encodes an important and ubiquitous ubiquitin scaffold protein participating to a protein degradation complex (CRL3). The Rho-kinase pathway plays a major role in vascular tone and its regulation by relaxing or vasoconstricting agents. Recent studies suggest that the degradation of RhoA involves the CRL3 complex. I started to analyze the structural and functional links between this ubiquitination complex and the Rho kinase pathway in cellular models to explain all or part of the molecular mechanisms leading constitutional mutations of Cul3 gene to produce hypertension. I have shown that the Cul3Δ9 mutant presents an increased neddylation compared to the wild form and mofications of its affinity for some adaptors. However, in this preliminary work, its interactions with and its role in the degradation of RhoA have not been demonstrated yet. This PhD thesis has helped to address several aspects of the pathophysiology of the vessels and the role of angiotensin II in these regulations using modern tools, original mouse and cell line models. This has particularly highlighted a new target of angiotensin II and a new WNK1 vascular role.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Angiotensinogen (ANG) is a single peptide glycoprotein that contains 452 amino acids in human (453 amino acids in rodents). ANG releases a 10-amino acids peptide known as angiotensin l (Ang I) from it's N-terminal when acted by renin, a acidic protease. Ang I can be fiirther converted into angiotensin II (Ang II) by angiotensin converting enzyme (ACE). Ang II is one of the most potent vasoconstrictors known. Ang II also acts on the brain to mcrease blood pressure. Ang II acts on the adrenal cortex to increase the secretion of aldosterone. The levels of ANG in plasma or local tissues diïectly contribute to the levels ofAng II. Therefore the studies of regulation ofANG gene expression is important to understand the molecular mechanisms of some related diseases, such as hypertension. Previous studies m which the transfection of the fusion genes that were generated with various lengths of 5'-flanking region of the rat ANG gene linked to a bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) gene as a reporter into mouse hepatoma (Hepa 1- 6) ceUs and opossum kidney (OK) cells, identified a putative cyclic AMP responsive element (CRE) in the rat ANG gene 5'-regulatory region (N-806/-779). Compared with palindromic CRE octamer (TGACGTCA), the putative CRE of the ANG gene (ANG-CRE) is almost identical except the last two bases were in reversed order (TGACGTAC). In the present study, we isolated a fuU-length cDNA of 1345 base pairs from mouse liver cDNA library, which encodes a nuclear DNA-binding protein consisting of 436 amino acids with an apparent molecular weight of 52 kilodalton (kDa). This protein binds to the ANG-CRE, and was designated as 52-kDa protein. Southwestern blot revealed that this 52 kDa protein was present in the following tissues, such as liver, kidney, testis, brain, but not in spleen. Analysis of the deduced amino acid sequence shows no apparent basic regionleucine zipper (bZIP) stmcture, indicatmg ANG-CREB is structurally distinct fi-om bZIP family members. The antiserum against 43-kDa-CREB or ATF-2 can not interact with this 52-kDa protein, further supporting that the 52-kDa protem is immunologically different fi-om the bZIP family. The 52-kDa protein may represent a new group of CRE-binding proteins. Competitive gel mobility shift assays and Southwestern blot analysis revealed that the ANG-CREB binds to ANG-CRE, and this bindmg is not displaceable by excess amounts of CREs fi-om somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxyl kmase PEPCK), and tyrosine ammo transferase (TAT) genes in vitro. These data suggest that the 52-kDa protein binds specifically to ANG-CRE and may regulate the ANG gene expression. The biological function of the 52-kDa protein is not known at present. The primary data from transient gene transfection assays showed that this protein has represser activity on the ANG gene promoter when ANG gene was stimulated by isoproterenol, but showed no effect on the ANG basal level (without any stimulation). Further experiments will be needed to study the biological function of the 52-kDa protein. / L'angiotensinogène (ANG) est une glycoprotéine fonnée de 452 acide aminés chez l'humain (453 acide aminés chez les rongeurs). Une protéase acide, la rénine, clive l'ANG de son côté N-tenninal en libérant un peptide de 10 acide aminés connu sous le nom de l'angiotensine I (Angl). Ce dernier, peut être converti en angiotensine II (AngII) sous Faction d'une enzyme de conversion dite ACE. L'Ang II est un puissant vasocoiisticteur. Il agit au niveau du cerveau en augmentant la pression sanguine et au niveau du cortex rénal en augmentant la sécrétion de l'aldostérone. Les niveaux de l'ANG daiis le plasma ou dans les tissus locaux sont directement proportionnels aux niveaux de Ang II. Ainsi les études de regulation de l'expression du gène d'Ang II sont importantes pour comprendre les mécanismes moléculaires de certames maladies, comme l'hypertension. Des études antérieiu-es par transfection en utilisant des gènes de fusion générés avec différentes longueurs de région flanquées en 5' du gène ANG de rat lié au gène rapporteur de bactérie, le chloramphénicol acetyl transférase (CAT), dans les ceUules hépatome (Hepa 1-6) de souris et dans les ceUules rénales de sarigue, ont permis d'identifier un présumé élément réponse (CRE) d'AMP cyclique dans la région régulatrice en 5' du gène ANG de rat (N- 806/-779). En comparant l'octamère palindromique de CRE (TGACGTCA) avec le présumé CRE du gène ANG (ANG-CRE), il semble qu'ils sont identiques à l'exception des deux dernières bases qui sont dans un ordre inversé (TGACGTAC). Dans cette étude, nous avons isolé à partir d'une banque de cDNA du foie de souris, une cDNA de 1345 paire de bases qui code pour une protéine de liaison à l'ADN nucléaire. Cette protéine est fonnée de 436 acide aminés avec un poids moléculaire apparent de 52 kilodalton (kDa). En se liant à ANG-CER, cette protéme est désignée comme la 52-kDa protéine. Le "Southwestern blot" a révélé que la 52-kDa protéine de 52 kDa est présente dans les tissus suivants: foie, rein, testicule et cerveau; mais absente dans la rate. L'analyse de cette séquence déduite d'acide aminés ne montre pas du stmcture apparent à la région basique de la fermeture éclaire à leucine, bzip (basic region-leucme zipper), indiquant que la 52-kDa protéine est structurellement distincte des membres de la famille bzip. L'antisérum dérigé contre le 43- kDa-CREB ou contre ATF-2 n'intéragit pas avec la 52-kDa protéme confermant amsi que la 52-kDa protéine est immunologiquenient dififérente des membres de famille bzip. La 52-kDa protéine représente donc, un nouveau groupe des protéines de liaison à CRE. Les essais sur gel à mobilité compétitive et les analyses de "southwestern blot" ont révélé que la 52-kDa protéine lié ANG-CRE et que cette liaison n'était pas déplaçable par un excès du gène CRE de somatostatin (SOM), phosphoenopymvate carboxy kmase (PEPCK) et tyrosme ammo transférase (TAT) m vitro, suggérant que la 52-kDa protéine se lié spésifiquement à ANGCRE et qu'il peut réguler l'expression du gène ANG. Les fonctioiis biologiques de la 52- kDa protéine ne sont pas encore connus. Les premiers résultats obtenus à partir des essais de transfections des gènes transitoirs montrent que cette protéine a une activité represseur sur le promoteur du gène d'ANG quand ce dernier est stimulé par l'isoprotérénol, et que, sans stimulation, elle a aucun effet sur le niveau basai d'ANG. Les expériences futures seront nécessaires poiir étudier les fonctions biologiques d'AND.

Les fonctions vasculaires sont régulées par diverses stimulations biochimiques ou mécaniques qui activent les différentes cellules composant les vaisseaux sanguins.Les réponses cellulaires qui en résultent peuvent impliquer une réorganisation du cytosquelette, des changements morphologiques, l'expression de protéines membranaires ou la libération de nombreux médiateurs. Tous ces événements sont susceptibles d'influencer les propriétés mécaniques des cellules. Ainsi, le but de la présente étude est de déterminer l'impact de l'activation de certains récepteurs au niveau des propriétés mécaniques des cellules, des modifications qui pourraient avoir de fortes implications au niveau vasculaire. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches expérimentales permettant d'évaluer des changements morphologiques et mécaniques de très faible amplitude : la microscopie à force atomique (AFM) et la résonance des plasmons de surface (SPR). Nous avons ainsi étudié les effets de l'activation des récepteurs de l'angiotensine II, la thrombine et la bradykinine sur la morphologie et les propriétés mécaniques de modèles cellulaires importants dans l'étude des fonctions vasculaires. Nous avons observé que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 1] pour l'angiotensine II induit une réponse mécanique transitoire qui se traduit par une contraction du corps cellulaire, une augmentation du module d'élasticité de la cellule et une diminution de l'intégrité de l'épithélium. Quant à l'activation du récepteur PAR-1 pour la thrombine et du récepteur B[indice inférieur 2] pour la bradykinine, celle-ci provoque aussi une modification de la rigidité des cellules, mais de façon soutenue dans le temps. Ces deux agonistes augmentent aussi l'interaction entre la membrane et le cytosquelette, un phénomène observé par l'augmentation des forces requises pour l'étirement de la membrane cellulaire. Ainsi, la présente étude montre qu'une cellule peut subir des modifications importantes au niveau de ses propriétés mécaniques suivant son activation par différents agonistes, ce qui peut avoir des conséquences directes sur certaines fonctions physiologiques dépendantes des propriétés mécaniques des vaisseaux. En effet, ces changements observés au niveau de la cellule pourraient, entre autres, contribuer au contrôle du diamètre et de la compliance des capillaires, à l'adhésion des cellules inflammatoires ainsi que modifier la perception de stimuli mécaniques par les cellules endothéliales.

Résumé : La signalisation biaisée représente la capacité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) d'engager des voies de signalisation distinctes avec des efficacités variables selon le ligand utilisé ou la mutation dans le récepteur. Un meilleur contrôle des voies activées ou inhibées par des médicaments pourrait permettre de réduire leurs effets indésirables. Malheureusement, les mécanismes structuraux impliqués dans la transmission du signal à travers la membrane plasmique par l'entremise des RCPG sont peu connus, ce qui limite le développement rationnel de nouvelles molécules ciblant des voies de signalisation particulières. Le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]), un RCPG de classe A prototypique, peut activer différents effecteurs suite à sa stimulation par le ligand endogène angiotensine II (AngII), incluant la protéine G[indice inférieur q/11] et les β-arrestines. Il est suggéré que l'activation de ces deux voies de signalisation peut être associée à des conformations différentes du récepteur AT[indice inférieur 1]. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire afin d'explorer les interactions et les mouvements qui définissent le paysage conformationnel du récepteur AT[indice inférieur 1]. De plus, nous avons vérifié comment était modifié le paysage conformationnel par des mutations (N111G, N111W et D74N) et des ligands (AngII et [Sar[indice supérieur 1], Ile[indice supérieur 8]]AngII) ayant des profils signalétiques différents pour la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] et la voie des β-arrestines. Les résultats obtenus nous éclairent sur le rôle d'un réseau de ponts hydrogène entre des résidus polaires conservés au coeur du récepteur dont font partie les résidus N111[indice supérieur 3.35] et D74[indice supérieur 2.50]. Les résultats révèlent la présence d'un groupe de résidus hydrophobes juste au-dessus du réseau de ponts hydrogène et adjacent à la pochette de liaison du récepteur qui semble important pour la stabilisation de l'état inactif du récepteur ainsi que pour son activation par un ligand. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent que l'activation de la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] est associée avec une transition conformationnelle spécifique stabilisée par l'agoniste alors que l'activation de la voie des β-arrestines est associée à une stabilisation de l'état de repos du récepteur. / Abstract: Biased signaling represents the ability of G protein-coupled receptors to engage distinct pathways with various efficacies depending on the ligand used or on mutations in the receptor. Having better control over the signaling pathways activated or inhibited by drugs could lead to fewer undesirable effects. Unfortunately, the structural mechanisms involved in the transmission of signal across the cell membrane through the receptors are poorly understood, which limits the rational development of new molecules targetting specific signaling pathways. The angiotensin-II type 1 (AT[subscript 1]) receptor, a prototypical class A G protein-coupled receptor, can activate various effectors upon stimulation with the endogenous ligand angiotensin-II (AngII), including the G[subscript q/11] protein and β-arrestins. It is believed that the activation of those two pathways can be associated with distinct conformations of the AT[subscript 1] receptor. To verify this hypothesis, microseconds of molecular dynamics simulations were computed to explore interactions and movements that define the conformational landscape of the AT[subscript 1] receptor. We have also verified how this conformational landscape is modified by mutations (N111G, N111W, D74N) and ligands (AngII, [Sar[superscript 1]Ile[superscript 8]]AngII) that have different signaling properties on the G[subscript q/11] pathway and the β-arrestin pathway. The results provide a better understanding of the role of a hydrogen bond network formed of conserved polar residues in the receptor core which include residues N111[superscript 3.35] and D74[superscript 2.50]. The results also reveal the existence of a cluster of hydrophobic residues located right above the hydrogen bonds network and adjacent to the binding pocket that appears important for the stabilization of the ground state of the receptor as well as its ligand-induced activation. As a whole, the results suggest that activation of the G[supbscript q/11] pathway is associated with a specific conformational transition stabilized by the agonist, whereas the activation of the β-arrestin pathway is linked to the stabilization of the ground state of the receptor.

L’inflammation est un procédé complexe qui vise l’élimination de l’agent causal de dommages tissulaires en vue de faciliter la réparation du tissu affecté. La persistance de l’agent causal ou l’incapacité à résoudre l’inflammation mène à un dérèglement homéostatique chronique qui peut avoir une incidence sur la morbidité et la mortalité. L’athérosclérose est une condition inflammatoire chronique des vaisseaux sanguins dont l’origine est multifactorielle. L’hypertension et l’état infectieux représentent respectivement des facteurs de risque classiques et émergents du développement de cette maladie. Les fondements initiaux de l’inflammation font intervenir l’immunité innée, la première ligne de défense dont disposent les cellules pour répondre à un signal de danger. Le but de cette thèse est d’examiner le rôle pro-inflammatoire d’une famille de kinases essentielles à l’immunité innée, soit celle des kinases de IkappaB (IKK) et des kinases IKK-related. Les kinases IKKalpha et IKKbeta forment le complexe IKK avec la molécule adaptatrice NEMO/IKKgamma. Ce complexe est chargé d’effectuer la phosphorylation de l’inhibiteur de NF-kappaB, IkappaBalpha, ce qui mène à sa dégradation et à la libération du facteur de transcription NF-kappaB. Nous montrons que le peptide vasoactif angiotensine II (AngII) induit l’activité phosphotransférase d’IKKbeta dans les VSMC par immunoprécipitation de NEMO puis essai kinase in vitro. Grâce à une approche ARN interférence (ARNi) dirigée contre IKK, nous montrons que cette kinase est responsable de la phosphorylation de p65/RelA. Nous montrons que le mécanisme d’induction de NF-kappaB par l’AngII est atypique, puisqu’il ne module pas IkappaBalpha, et montrons à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques que l’activation de p65 est indépendante des voies MEK-ERK-RSK, PI3K et de la transactivation du récepteur de l’EGF. Les kinases IKK-related Tank-binding kinase 1 (TBK1) et IKK-i sont quant à elles principalement activées suite à une infection bactérienne ou virale. Ces kinases phosphorylent directement le facteur de transcription interferon regulatory factor (IRF)-3. Nous montrons que le cytomégalovirus humain, un pathogène associé à l’athérosclérose, a la capacité d’induire l’activation de TBK1 dans les VSMC. L’usage d’ARNi dirigé contre TBK1 et IKKi montre que les 2 kinases sont impliquées dans l’activation d’IRF-3. De plus, nous montrons à l’aide d’une lignée de VSMC exprimant une version dominante négative d’IRF-3 que ce dernier est essentiel à la synthèse des chimiokines RANTES et IP-10, tel qu’analysé par RT-PCR. Par ailleurs, il a récemment été montré que les kinases IKK-related étaient étroitement liées à la transformation oncogénique, et que TBK1 était pro-angiogénique. Or, l’angiogenèse est le plus souvent modulée par la réponse hypoxique qui est d’ailleurs commune à la majorité des processus inflammatoires. Le facteur de transcription hypoxia inducible factor (HIF)-1 module l’angiogenèse, l’inflammation et la survie cellulaire. Nous montrons à l’aide de cellules Tbk1 et Ikbke -/- et d’une approche lentivirale que TBK1 est spécifiquement impliquée dans l’induction traductionnelle de HIF-1alpha en condition de stress hypoxique. L’expression de TBK1 est induite sous ces conditions, et cette kinase module la phosphorylation de ERK, RSK, Akt et TSC1. Les résultats originaux présentés dans cette thèse montrent donc que les kinases IKK et IKK-related exercent leurs actions pro-inflammatoires par des mécanismes distincts. / Inflammation is a complex process that allows elimination of tissular damaging agents and thus facilitates wound repair. Persistance of a damaging agent or the incapacity to resolve the inflammatory state leads to chronic homeostatic deregulation with putative incidence on morbidity and mortality. Atherosclerosis is an inflammatory state of blood vessels which origins are multifactorial. Hypertension and the infectious state represent classical and emerging factors of atherosclerosis development, respectively. The innate immune response takes place in the initial steps of inflammation, and represents the first cellular line of defense against danger signals. The goal of this thesis is to examine the pro-inflammatory roles of the IkB kinases (IKK) and the IKK-related kinases, which are essential innate immune response protein kinases. IKKalpha and IKKbeta form, together with NEMO/IKKgamma, the IKK complex. This complex is responsible of the phosphorylation of the inhibitor of NF-kappaB, IkappaBalpha, a process that leads to its degradation and NF-kappaB release. By immunoprecipitation of NEMO and assessment of the IKK complex activity in vitro, we show that the vasoactive peptide angiotensin II (AngII) induces IKKbeta phosphotransferase activity in vascular smooth muscle cells (VSMC). The use of RNA interference (RNAi) against IKKbeta reveals that this kinase is responsible for p65/RelA phosphorylation. AngII modulation of NF-kappaB is atypical since it does not modulate IkappaB. Moreover, the use of pharmacological inhibitors shows that p65 induction is independent of both MEK-ERK-RSK and PI3K pathways, and that it does not involve EGF receptor transactivation. IKK-related kinases Tank-binding kinase 1 (TBK1) and IKK-i are known to be induced by bacterial and viral infections. These kinases are able to phosphorylate directly interferon regulatory factor (IRF)-3 transcription factor. Human cytomegalovirus (HCMV) seropositivity was shown to be linked to atherosclerosis development. We show that TBK1 activity is induced in HCMV-infected VSMC. RNAi directed against TBK1 and IKK-i reveals that both kinases are required for IRF-3 activation. The use of a VSMC line that express a dominant negative version if IRF-3 shows that this transcription factor is involved in the induction of RANTES and IP-10 chemokines, as assessed by RT-PCR. In addition, IKK-related kinases were recently shown to be implicated in oncogenic transformation. TBK1 was also shown to be pro-angiogenic. Angiogenesis is known to be regulated by the hypoxic response, a common condition of inflammatory processes. Hypoxia-inducible factor (HIF)-1 is a transcription factor that modulates angiogenesis, inflammation and cell survival. We show with the use of Tbk1 and Ikbke -/- cells combined with the use of a lentiviral approach that TBK1 is specifically involved in HIF-1alpha translational induction under hypoxic stress. We also show that TBK1 expression is enhanced under theses conditions, and that this kinase modulates the phosphorylation of ERK, RSK, Akt and TSC1. In conclusion, the results presented in this thesis show that the IKK and IKK-related kinases are both pro-inflammatory, and exert their actions by distinct mechanisms.

Le système rénine-angiotensine est impliqué dans le remodelage structurel et électrique caractérisant la fibrillation auriculaire (FA). L’angiotensine II (ANG II) induit le développement de fibrose et d’hypertrophie au niveau des oreillettes, prédisposant à la FA. Or, les mécanismes électrophysiologiques par lesquels l’ANG II pourrait promouvoir la FA sont peu connus. L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer l’effet de l’ANG II sur les courants potassiques et calciques au niveau auriculaire indépendamment du remodelage structurel. Pour ce faire, nous avons utilisé la technique de patch-clamp avec un modèle de souris surexprimant le récepteur de type 1 à l’angiotensine II (AT1R) spécifiquement au niveau cardiaque. Pour distinguer les effets directs de la surexpression d’AT1R des effets induits par le remodelage cardiaque, nous avons étudié des souris âgées de 180 jours, qui présentent du remodelage structurel, et des souris âgées de 50 jours, qui n’en présentent pas. Des études précédentes sur ce modèle ont montré qu’au niveau des myocytes ventriculaires, l’ANG II réduit le courant potassique global (Ipeak) et rectifiant entrant (IK1) ainsi que le courant calcique de type L (ICaL). Ainsi, notre hypothèse est que l’ANG II modulera aussi ces courants au niveau auriculaire, pouvant ainsi augmenter l’hétérogénéité de repolarisation auriculaire et de ce fait le risque de développer et maintenir la FA. Nous avons observé une diminution significative de la densité d’IK1 dans l’oreillette gauche des souris transgéniques sans changement d’Ipeak. De plus, la densité d’ ICaL n’est pas réduite chez les souris transgéniques âgées de 50 jours. En conclusion, l’effet de l’ANG II sur les courants potassiques et calciques semble dépendre de la chambre cardiaque. En effet, nous savions que l’ANGII réduisait Ipeak, IK1 et ICaL au niveau ventriculaire, mais nos résultats ont montré qu’il ne les affectait pas directement au niveau des oreillettes. Ceci suggère des mécanismes de régulation impliquant des voies de signalisation distinctes selon les chambres cardiaques. Enfin, nos résultats montrant l’absence de l’influence directe de la surexpression d’AT1R sur les canaux K+ et Ca2+ au niveau des myocytes auriculaires renforcent l’importance d’approfondir nos connaissances sur les effets de l’angiotensine II sur le développement de la fibrose, sur le remodelage structurel et sur la conduction électrique cardiaque. / The renin-angiotensin-aldosterone system contributes to the structural and electrical remodelling that characterise atrial fibrillation (AF). Angiotensin II (ANG II) induces fibrosis and hypertrophy in the atrium, creating a substrate for AF development. Whether or not ANG II promotes electrophysiological remodelling in the atrium and by which mechanisms is not known. The objective of this research project is to evaluate the effect of ANG II on potassium and calcium currents in atrial myocytes independently of structural remodelling. We used the patch-clamp technique to measure ionic currents in a mouse model overexpressing the angiotensin II type 1 receptor (AT1R) locally in the heart. To differentiate the direct effects of AT1R overexpression with those related to structural remodelling, we studied mice aged of 180 days that are characterised by structural remodelling and mice aged of 50 days that aren’t. Previous studies have shown that this mouse presented with reduced total potassium current (Ipeak) and inward rectifier potassium current (IK1) as well as with a decrease in L-type calcium currents (ICaL) in ventricular myocytes. Therefore, our hypothesis was that ANG II would also regulate those currents at the atrial level, possibly leading to an increase in heterogeneity in atrial repolarisation and to an increase in AF initiation and maintenance. We show in this project a significant reduction of the IK1 in the left atrium of transgenic mice without any changes of the Ipeak. Furthermore, we show no modulation of ICaL density in 50 days old transgenic mice. We conclude that ANG II effect on potassium and calcium currents depends on the cardiac chamber. Indeed, although we already knew ANG II reduced Ipeak, IK1 and ICaL in ventricular myocytes of transgenic mice, in this project we found ANG II did not affect Ipeak and ICaL at the atrial level. These findings suggest distinctive regulation pathways by which ANG II affects the different cardiac chambers. Furthermore, the absence of direct influence of ANG II on potassium and calcium currents in atrial myocytes reinforces the importance to better understand ANG II’s effect on cardiac fibrosis development, structural remodelling and electric conduction.

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Le Système Rénine Angiotensine tient une place prépondérante au sein de la circulation cérébrale. Les Antagonistes des Récepteurs AT1 à l'Angiotensine II (ARAII) ont prouvé leur efficacité dans la prévention de l'Accident Vasculaire Cérébral (AVC), indépendamment de leur effet anti-hypertenseur. Plusieurs mécanismes pourraient être impliqués dans cette cérébroprotection. D'une part, en bloquant les récepteurs AT1, les ARAII favorisent la stimulation des récepteurs AT2 à l'angiotensine II. Le caractère bénéfique lié à la stimulation des récepteurs AT2 s'oppose au caractère délétère lié à la stimulation des récepteurs AT1. Nous avons montré que cet équilibre AT1 - AT2 est modifié au niveau cérébrovasculaire suite à un régime hypersodé. En effet, la vasodilatation des artérioles cérébrales médiée par les récepteurs AT2 est abolie, ce qui pourrait constituer un élément délétère lors de la survenue d'un évènement ischémique. D'autre part, certains ARAII présentent une affinité pour les récepteurs PPAR-gamma. Cette activité, démontrée comme protectrice à différents niveaux vasculaires, pourrait également être bénéfique pour la circulation cérébrale. Nous avons en particulier montré que l'activation PPAR-gamma améliore les effets des ARAII au niveau de la circulation cérébrale (diamètre artériolaire, réactivité à l'angiotensine II). Les mécanismes en jeu semblent impliquer des modifications de la fonction des récepteurs AT1-AT2, indépendamment de leur expression. La stimulation des récepteurs AT2 et l'activation PPAR-gamma constituent donc deux propriétés particulières des ARAII. Ces propriétés pourraient participer au caractère cérébroprotecteur des ARAII, au-delà du seul blocage des récepteurs AT1. Le développement de molécules duales regroupant les activités antagoniste AT1 - agoniste PPAR-gamma pourrait constituer un avenir thérapeutique intéressant dans le traitement de l'hypertension en apportant une protection cérébrovasculaire supérieure aux traitements actuels / The Renin Angiotensin System plays a major role in cerebral circulation. AT1 receptor blockers (ARBs) afford protection against cerebrovascular complications that go beyond that to be expected from their blood pressure lowering action. Several mechanisms could explain such beneficial effects. Firstly, by blocking AT1 receptors, ARBs promote AT2 receptor stimulation by angiotensin II. The beneficial effect related to stimulation of AT2 receptors (vasodilation) counterbalances the deleterious actions of AT1 receptors stimulation. Changes in this ratio may then alter cerebral circulation. We demonstrated that the AT1- AT2 ratio is modified at the cerebrovascular level during high salt intake, which is a risk factor for stroke. The AT2-mediated vasodilation of pial arterioles is abolished. Secondly, some ARBs act as partial agonists of PPAR-gamma. Such an activity, which has been demonstrated to protect extracerebral vessels, could also be beneficial for cerebral circulation. Our results showed that PPAR-gamma activation improves ARB effects on cerebral circulation (arteriolar diameter, angiotensin II reactivity). The underlying mechanisms could imply functional regulation of AT1-AT2 receptors without any change in expression status. AT2 receptor stimulation and PPAR-gamma activity are two special properties of ARBs. These properties could contribute to the cerebroprotection induced by ARBs, beyond the AT1-receptor blockade. Development of new molecules with AT1-receptor blockade and PPAR-gamma activity could take part into the future therapeutic management of hypertension, providing a better cerebrovascular protection

Chez les patients présentant un syndrome métabolique, le développement des comorbidités cardiaques et rénales associées au diabète de type 2 sont liées à des altérations au niveau vasculaire. Afin d’évaluer l’effet protecteur rénal et cardiaque de nouvelles molécules, le modèle de rat Zucker fatty/Spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid (ZSF1) semblait approprié. Cependant, son développement lent et les impacts rénaux et cardiaques modestes en limitaient son utilisation. Notre but fut d’exacerber ces altérations par deux méthodes. Nous avons d’abord effectué une néphrectomie unilatérale chez le rat ZSF1 et évalué l’évolution des fonctions cardiaque et rénale en fonction de l’âge. Seule une exacerbation de la dysfonction rénale a été mise en évidence. Néanmoins nous avons pu démontrer l’effet protecteur rénal de l’inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine lisinopril ainsi que d’un composé antioxydant, le bardoxolone. Notre seconde stratégie a consisté à infuser de l’angiotensine II (AngII) à des rats ZSF1. L’hypertension déjà existante dans ce modèle a été fortement accrue, et le niveau d’aldostérone circulante a été significativement augmenté. Dans ce contexte, les fonctions cardiaque et rénale ont été dégradées de manière importante. Enfin nous avons montré que dans ce modèle, un inhibiteur de l’aldostérone synthase induisait une meilleure protection rénale que l’antagoniste des récepteurs à l’aldostérone éplérénone. Nous avons donc mis en évidence que le rat ZSF1-AngII est un modèle de dysfonction cardio-rénale permettant d’évaluer l’effet protecteur de composés sur les fonctions rénale et cardiaque, dans un contexte de syndrome métabolique / In the context of metabolic syndrome, development of Type 2 Diabetes is associated with (and influenced by) cardiac and renal comorbidities linked to micro- and macro-vasculature alterations. To assess the efficacy of new compounds on targeted organs in the context of metabolic syndrome, the Zucker fatty/Spontaneously hypertensive heart failure F1 hybrid (ZSF1) rat model could be suitable assuming cardiorenal alterations would develop in a short timeframe. Actually, the ZSF1 rat model recapitulates features of human metabolic syndrome, but develops relatively late (1year-time) and moderate cardiac and renal dysfunctions. The aim of our work was to exacerbate cardiorenal impairments in terms of onset and extent. Two options were explored. On one hand, unilateral nephrectomy was performed in ZSF1 rats, and cardiac and renal functions were longitudinally assessed. This surgical insult only significantly deteriorated renal function, which was prevented by standard of care, lisinopril and new renal protective agent, bardoxolone. On the other hand, subcutaneous infusion of angiotensin II (AngII) was used in the aim to induce hemodynamic and hormonal stress and thus to enhance cardiorenal impairments. AngII-infused ZSF1 rats displayed significant hypertension and increased levels of circulating aldosterone. Moreover, renal and cardiac functions dropped, concomitantly. We showed in this model that an aldosterone synthase inhibitor induced overall better renal protection than the mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone. Our data showed that ZSF1-AngII rat is a suitable model to evaluate the cardio and renoprotective effects of drugs in the context of metabolic syndrome

La rigidité artérielle et la fibrose ont une valeur prédictive dans le développement des maladies cardiovasculaires (CV). Ces 2 phénotypes impliquent les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) notamment des récepteurs membranaires et les protéines du cytosquelette. Les objectifs ont été d’étudier : (i) l’influence du récepteur minéralocorticoïde (MR) sur la réactivité vasculaire, (ii) le rôle de l’intégrine αvβ3 dans le développement de la rigidité artérielle et la fibrose vasculaire, et (iii) l’impact de la vimentine et la synémine sur la structure et la fonction artérielle. Ces trois études ont utilisées des souris avec invalidation génétiques des protéines d’intérêt. Résultats : l’absence du MR diminue la réactivité vasculaire en altérant le couplage contraction/relaxation des CMLVs via des mécanismes Ca2+- et NO-dépendants (une diminution de la vasoconstriction en réponse au Ca2+ extracellulaire et une altération de la vasorelaxation endothélium-dépendante en réponse à l’acétylcholine). L’invalidation de la sous-unité αv prévient la fibrose en réponse à l’administration d’angiotensine II. L’absence de la vimentine et non celle de la synémine augmente la rigidité artérielle via des changements des adhésions focales des CMLVs mais aussi des cellules endothéliales. En conclusion, les récepteurs membranaires et protéines intracellulaires étudiées influencent la fonction et la structure des artères grâce à des actions spécifiques sur le tonus musculaire, la mécanotransduction et l’organisation ultra-structurale des CMLVs. Ces études montrent au niveau cellulaire et moléculaire le déterminisme plurifactoriel des phénotypes de rigidité-fibrose de la paroi artérielle. Ces résultats nécessitent des travaux plus mécanistiques pour affirmer l’implication de ces protéines dans les maladies CV liées au vieillissement / Arterial stiffness and fibrosis have a predictive value in the development of cardiovascular diseases (CV). These two phenotypes involve vascular smooth muscle cells (VSMCs) including membrane receptors and cytoskeletal proteins. The objectives were to examine: (i) the influence of the mineralocorticoid receptor (MR) on vascular reactivity, (ii) the role of avb3 integrin in the development of arterial stiffness and vascular fibrosis, and (iii) the impact of vimentin and synemin on arterial structure and function. The mice with genetic invalidation of the proteins of interest were used in these three studies. Results: the absence of MR decreased vascular reactivity by altering the contraction/relaxation coupling of VSMC through Ca2+- and NO-dependent mechanisms (a decrease of vasoconstriction in response to extracellular Ca2+ and impaired endothelium-dependent vasorelaxation in response to acetylcholine). The invalidation of the αv subunit prevented fibrosis in response to the administration of angiotensin II. The absence of vimentin, and not that of the synemin, increased arterial stiffness via changes in focal adhesions of VSMCs as well as endothelial cells. In conclusion, the studied membrane receptors and intracellular proteins that influenced the structure and function of arteries through specific actions on muscle tone, the mechanotransduction and the ultra-structural organization of VSMCs. These studies show the multifactorial dependency of the stiffness-fibrosis phenotypes of the arterial wall at the cellular and molecular levels. These results require more mechanistic work to determine the role of these proteins in CV diseases related to aging