GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

Introdução: O emprego de técnicas de interpretação imunológica de agentes infecciosos, de uma maneira geral, confere maior sensibilidade e especificidade ao exame histopatológico; o anticorpo policlonal anti-BCG tem sido testado como uma coloração imunoistoquímica de triagem para espécimes de biópsias cutâneas, com suspeita de origem infecciosa; em casos de infecções fúngicas e bacterianas, os resultados mostraram-se claramente superiores aos conseguidos pelas técnicas histoquímicas convencionais. Objetivos: Verificar a positividade da reação imunoistoquímica com o anti-BCG em granulomas imunológicos cutâneos, que não puderam ter o seu diagnóstico etiológico definido pelos métodos histoquímicos usuais de coloração para agentes infecciosos (Grocott e Ziehl-Neelsen) e também descrever a sensibilidade e especificidade deste anticorpo, através da comparação com os exames culturais para fungos e micobactérias. Metodologia: Procedeu-se à técnica imunoistoquímica com o anti-BCG em 33 biópsias cutâneas com granulomas imunológicos, com colorações de Grocott e Ziehl-Neelsen negativas. Também foram selecionados 13 casos de hanseníase virchowiana e 11 de granulomas por degeneração do colágeno, para que servissem de controles positivos e negativos, respectivamente. A leitura das lâminas foi realizada por dermatopatologista do HCPA que não tinha conhecimento dos dados clínicos dos pacientes. Não foi realizada a quantificação do antígeno nos cortes. Resultados: Dos 33 casos estudados, 13 (39,4%) apresentaram imunoistoquímica positiva com o anti-BCG, os diagnósticos finais foram: 4 casos (12,12%) de tuberculose, 4 casos de esporotricose, 1 caso (3.03%) de cromomicose, 1 caso de hanseníase tuberculóide e 3 casos (9.09%) que não puderam ter o diagnóstico conhecido, pois perderam o acompanhamento médico. A sensibilidade do anti-BCG quando comparado com a cultura para fungos foi de 57,1% e a especificidade de 66,7%; na comparação com a cultura para micobactérias a sensibilidade foi de 100%, porém só haviam 2 exames positivos, e a especificidade foi de 67,7%. Nos casos de hanseníase virchowiana, a sensibilidade e a especificidade foi de 100%. Conclusão: A técnica imunoistoquímica com o anticorpo anti-BCG é relativamente fácil, rápida e de baixo custo e mostrou ser útil na identificação de microorganismos que não foram prontamente visualizados com as colorações de Grocott e Ziehl-Neelsen. Entretanto, o pequeno número de controles pode ter influenciado no desempenho do método.

ROQUE, C. R. Avaliação da detecção de antígenos NS1 e anticorpos IgM em amostras biológicas de vísceras in natura de pacientes que evoluíram para óbito por suspeita de dengue. 2017. 69 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by PPG Patologia (pgpatol@ufc.br) on 2017-08-07T12:11:59Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_crroque.pdf: 1123935 bytes, checksum: ea84be3a53ebfef0abfedabd1942a936 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-07T12:54:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_crroque.pdf: 1123935 bytes, checksum: ea84be3a53ebfef0abfedabd1942a936 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T12:54:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_crroque.pdf: 1123935 bytes, checksum: ea84be3a53ebfef0abfedabd1942a936 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Dengue is caused by an arbovirus of the Flaviviridae family, genus Flavivirus. Cases of infection with fatal evolution began to be reported from the introduction of DENV-2 in the state of Ceará in 1994. The study of these cases is necessary to know the causes that contribute to the death and the post-mortem diagnosis of dengue can contribute. The objective of the work was to evaluate the detection of NS1 antigen and IgM antibodies for the diagnosis of dengue in biological samples of fresh viscera collected from patients who died. A total of 109 patients were included from 2013 and 2014 whose samples were sent to LACEN/CE to perform laboratory tests to confirm death due to suspected dengue and they had at least one positive result or reagent in samples of viscera in formaldehyde, blood (serum) and/or CSF in the exams IgM ELISA, NS1 ELISA, RT-PCR, and Immunohistochemistry. The mean age of the patients was 33.46 ± 21.18 (5 days to 95 years old). The IgM ELISA in the blood showed a positivity of 21.1%; in the CSF showed a positivity of 22.0%; in the viscera showed a positivity of 16.5%. Of the positive IgM samples in viscera, 75.0% were also CSF positive IgM, and 78.3% of positive IgM samples in viscera were also positive IgM in the blood. There were more NS1 positive samples in the blood than in the CSF and in viscera. CSF and blood were the samples with the highest positivity of IgM antibodies. However, IgM antibody detection was also possible in samples of fresh viscera. The immunohistochemistry technique in preserved formalin material showed a higher positivity for the detection of dengue antigens, but it was also possible to detect NS1 antigen in fresh viscera samples. The detection of IgM antibody and NS1 antigen in the fresh viscera samples helped to improve the post-mortem diagnosis of dengue and it should be considered as another approach in the diagnosis of fatal dengue. / A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviviridae, gênero Flavivirus. A partir da introdução do DENV-2 no Ceará, em 1994, casos de infecção com evolução fatal começaram a ser reportados. O estudo desses casos é necessário para que se conheçam as causas que contribuem para o óbito e o diagnóstico da dengue pos-mortem pode contribuir. O objetivo do trabalho foi avaliar a detecção de antígeno NS1 e de anticorpos IgM para diagnóstico de dengue em amostras biológicas de vísceras in natura, coletadas de pacientes que evoluíram para óbito. Foram incluídos 109 pacientes, dos anos de 2013 e 2014, cujas amostras foram encaminhadas ao LACEN/CE para realização de exames laboratoriais para confirmação de óbito por suspeita de dengue e que apresentaram pelo menos um resultado positivo ou reagente em amostras de vísceras em formol, sangue (soro) e/ou líquor nos exames: ELISA IgM, ELISA NS1, RT-PCR, e Imunohistoquímica. A média de idade dos pacientes foi de 33,46 ± 21,18 (5 dias a 95 anos). O ELISA IgM no sangue apresentou uma positividade de 21,1%; no líquor apresentou uma positividade de 22,0%; nas vísceras apresentou uma positividade de 16,5%. Das amostras de IgM positivo em vísceras, 75,0% foram também IgM positivo no líquor e 78,3% das amostras de IgM positivo em vísceras foram também IgM positivo no sangue. Houve mais amostras de NS1 positivo no sangue do que no líquor e vísceras. As amostras onde houve maior positividade de anticorpos IgM foram líquor e sangue, entretanto a detecção de anticorpo IgM também foi possível em amostras de vísceras in natura. A técnica de imunohistoquímica, em material de vísceras conservadas em formol, apresentou uma maior positividade para a detecção de antígenos de dengue, mas também foi possível detectar antígeno NS1 em amostras de vísceras in natura. A detecção de anticorpo IgM e de antígeno NS1 nas amostras de vísceras in natura contribuiu para melhorar o diagnóstico de dengue post-mortem, devendo ser considerada como mais uma abordagem no diagnóstico de casos fatais de dengue.

Made available in DSpace on 2015-05-27T13:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 580.pdf: 1742532 bytes, checksum: 684716d3a71fb503e627b0931f084829 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) na Amazônia Ocidental, Brasil, comporta-se, dentro do padrão de transmissão modificado do ponto de vista epidemiológico, pelos diversos fatores que influenciam no ciclo da doença. A ocorrência de casos vem aumentando nos últimos anos em Manaus, com freqüência maior em áreas de assentamentos populacionais, notificados em média 600 casos/ano. Esse estudo tem como objetivo caracterizar as espécies de Leishmania spp. em amostras isoladas de pacientes com leishmaniose tegumentar americana em área endêmica da região norte, Brasil. Pacientes com leishmaniose tegumentar, procedentes de Manaus (61 por cento), região metropolitana, do interior do estado do Amazonas, Pará, Roraima e Rondônia (39 por cento) procuraram os serviços de ambulatório da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Um total de 209 pacientes submeteu-se aos exames clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Os exames parasitológicos foram realizados nos 209 pacientes através da técnica de escarificação de borda da lesão para a pesquisa direta; em 188 foi realizada punção aspirativa e em 21 biópsias para o isolamento do parasito em meios de cultura NNN/Schnneiders. Foi realizada a identificação e caracterização das espécies de Leishmania spp utilizando painel de anticorpos monoclonais e perfil de isoenzimas (MLEE). Dos 209 isolados 85 por cento (178/209) foram positivas na pesquisa direta e se conseguiu isolamento por cultura de todas as amostras. Na caracterização os serodemas apresentaram maior freqüência para L. (V.) guyanensis (73 por cento) 153/209, zimodemas 83 por cento(173/209). Em 13 por cento (26/209) dos isolados apresentaram mais de uma espécie de parasitos, denominado de infecção mista. Nessas infecções a L. (V.) guyanensis estava presente na maioria dos isolados. O expressivo índice de infecções mistas evidenciado demonstra a grande diversidade de espécies de Leishmania associadas à doença nesta área endêmica da região norte. Esses achados podem contribuir no seguimento de tratamento, com a perspectiva de intervenção terapêutica mais eficaz para o paciente

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-20T15:17:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Neste trabalho foram padronizadas as técnicas de produção de anticorpos monoclonais contra o vírus rábico e a reação em cadeia da polimerase utilizando somente um iniciador específico em condições de baixa estringência, com o objetivo de caracterizar o pseudogene de amostras de vírus rábico isoladas em Santa Catarina. Foram identificados vinte clones produtores de anticorpos antirábicos, mas apesar desta identificação, não foi possível obter um que se mantivesse estável. Problemas de contaminação da cultura também foram detectados o que impediu a manutenção dos clones e a produção de anticorpos, impossibilitando a caracterização antigênica. A caracterização do pseudogene viral foi realizada através da "low stringency single-specific primer - polimerase chain reaction" (LSSP-PCR). Para tanto, a transcrição reversa (RT) do RNA viral foi realizada utilizando-se os mesmos iniciadores específicos dirigidos para a amplificação via PCR do pseudogene viral (G+ e L-). Após a definição das condições ideais para a amplificação do pseudogene, foi padronizada a LSSP-PCR utilizando-se o iniciador G+, o qual apresentou o melhor padrão informativo para a análise de variabilidade deste gene. Um total de 12 amostras de campo isoladas de bovinos no Estado de Santa Catarina e uma amostra padrão de vírus rábico foram analisadas pela LSSP-PCR. A análise dos resultados obtidos pelo coeficiente de similaridade de Dice e unweighted pair group method analysis (UPGMA) revelou a existência de uma importante variabilidade de seqüência entre as amostras estudadas, mas não permitiu uma clara separação das amostras quanto a sua origem geográfica.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-29T20:23:10Z No. of bitstreams: 1 2017_MariaAparecidaAlvesLeitedosSantos_Parcial.pdf: 899296 bytes, checksum: a2be4aaa8ac61d44b690ab344a4f70ed (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-18T18:13:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_MariaAparecidaAlvesLeitedosSantos_Parcial.pdf: 899296 bytes, checksum: a2be4aaa8ac61d44b690ab344a4f70ed (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T18:13:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_MariaAparecidaAlvesLeitedosSantos_Parcial.pdf: 899296 bytes, checksum: a2be4aaa8ac61d44b690ab344a4f70ed (MD5) / A Doença de Kawasaki (DK) é uma vasculite sistêmica e autolimitada de etiologia ainda desconhecida que incide predominantemente em lactentes e crianças. Seu principal alvo são as artérias coronárias e outras estruturas cardiovasculares sendo que 20-25 % dos pacientes não tratados desenvolvem alterações dessas artérias que evoluem para dilatações e aneurismas. Pacientes que apresentaram anormalidades coronarianas podem apresentar anormalidades vasculares meses ou anos após o início da doença o que leva a pressupor possível continuidade do processo inflamatório. Como marcadores de inflamação são pouco estudados na DK, o objetivo da pesquisa foi determinar os níveis séricos de um biomarcador de inflamação, a calprotectina e a presença de anticorpos anti-citoplasma de neutrófilo, marcador de autoimunidade, em crianças com história de doença de Kawasaki, nas diferentes fases da doença (aguda, de convalescença e crônica). A calprotectina sérica foi analisada pelo método de ELISA, utilizando dois diferentes ensaios comerciais e a presença de anticorpos anti-citoplasma de neutrófilo foi detectada pelo método de imunofluorescência indireta. Os níveis de calprotectina sérica mostram-se aumentados nas três diferentes fases da DK, quando comparados aos controles. Anticorpos anti-citoplasma de neutrófilo estavam presentes em 25 % das crianças na fase aguda. Nas fases de convalescença e crônica sua presença variou entre 45 e 50 %. A calprotectina revelou-se um bom marcador de inflamação nas diferentes fases da DK, confirmando a persistência do processo inflamatório por longo período após o evento agudo inicial, e a presença de anticorpos anti-citoplasma de neutrófilos sugerem um possível mecanismo autoimune ambos influenciados pela participação dos neutrófilos na doença. / Kawasaki disease (DK) is a systemic, self-limiting vasculitis of unknown etiology that predominantly affects infants and children. Its main targets are the coronary arteries and other cardiovascular structures. It is said that 20-25 % of untreated patients develop coronary artery abnormalities, mainly dilations and aneurysms. These patients may still show vascular abnormalities several months or even years after the onset of the disease which leads to the assumption of a possible persistence of the inflammatory process. As markers of inflammation are poorly studied in DK, the objective of this study was to determine the serum levels of a biomarker of inflammation, calprotectin and the presence of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, a marker of autoimmunity, in children with a history of Kawasaki disease and additionally, investigate for the possible presence of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies. Results: Serum calprotectin levels were increased in the three different phases of DK in all patients when compared to controls. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies were present in 25 % of children in the acute phase. In the convalescence and chronic phases its presence varied between 45 and 50 %. Calprotectin proved to be a good marker of inflammation in the different phases of DK, confirming the persistence of the inflammatory process for a long period after the initial acute event.

Introdução: O emprego de técnicas de interpretação imunológica de agentes infecciosos, de uma maneira geral, confere maior sensibilidade e especificidade ao exame histopatológico; o anticorpo policlonal anti-BCG tem sido testado como uma coloração imunoistoquímica de triagem para espécimes de biópsias cutâneas, com suspeita de origem infecciosa; em casos de infecções fúngicas e bacterianas, os resultados mostraram-se claramente superiores aos conseguidos pelas técnicas histoquímicas convencionais. Objetivos: Verificar a positividade da reação imunoistoquímica com o anti-BCG em granulomas imunológicos cutâneos, que não puderam ter o seu diagnóstico etiológico definido pelos métodos histoquímicos usuais de coloração para agentes infecciosos (Grocott e Ziehl-Neelsen) e também descrever a sensibilidade e especificidade deste anticorpo, através da comparação com os exames culturais para fungos e micobactérias. Metodologia: Procedeu-se à técnica imunoistoquímica com o anti-BCG em 33 biópsias cutâneas com granulomas imunológicos, com colorações de Grocott e Ziehl-Neelsen negativas. Também foram selecionados 13 casos de hanseníase virchowiana e 11 de granulomas por degeneração do colágeno, para que servissem de controles positivos e negativos, respectivamente. A leitura das lâminas foi realizada por dermatopatologista do HCPA que não tinha conhecimento dos dados clínicos dos pacientes. Não foi realizada a quantificação do antígeno nos cortes. Resultados: Dos 33 casos estudados, 13 (39,4%) apresentaram imunoistoquímica positiva com o anti-BCG, os diagnósticos finais foram: 4 casos (12,12%) de tuberculose, 4 casos de esporotricose, 1 caso (3.03%) de cromomicose, 1 caso de hanseníase tuberculóide e 3 casos (9.09%) que não puderam ter o diagnóstico conhecido, pois perderam o acompanhamento médico. A sensibilidade do anti-BCG quando comparado com a cultura para fungos foi de 57,1% e a especificidade de 66,7%; na comparação com a cultura para micobactérias a sensibilidade foi de 100%, porém só haviam 2 exames positivos, e a especificidade foi de 67,7%. Nos casos de hanseníase virchowiana, a sensibilidade e a especificidade foi de 100%. Conclusão: A técnica imunoistoquímica com o anticorpo anti-BCG é relativamente fácil, rápida e de baixo custo e mostrou ser útil na identificação de microorganismos que não foram prontamente visualizados com as colorações de Grocott e Ziehl-Neelsen. Entretanto, o pequeno número de controles pode ter influenciado no desempenho do método.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-10-30T16:15:01Z No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) Previous issue date: 2017-11-12 / A criptococose é uma doença com mais de 223 mil novos casos por ano, acarretando a morte de aproximadamente 181 mil pessoas, principalmente indivíduos HIV positivos. Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies causadora da meningoencefalite criptocócica, dentre outras complicações. Os tratamentos utilizados atualmente são antifúngicos como anfotericina B, flucitosina e fluconazol. Contudo, essas drogas possuem limitações como toxicidade, custo e o surgimento de resistência em algumas linhagens. Dessa forma, terapias alternativas como uso de citocinas e anticorpos monoclonais vem sendo criados no intuito de desenvolver novas ferrramentas para o tratamento e diagnóstico desta doença. Alguns estudos mostram que mAbs (IgGs) contra glicuronoxilomanana (GXM) da cápsula de C. neoformans podem proteger contra a infecção em camundongos, mas que variantes isotípicas IgG3 podem na verdade agravar a doença, diminuindo assim a sobrevida desses animais. Além disso, já foi descrito que diferenças na região constante de IgGs com paratopos idênticos podem levar a alterações no padrão de ligação ao antígeno, o que contrasta com a definição já consolidada de que a região variável é a única responsável pela afinidade ao antígeno. O mecanismo molecular da diversidade de ligação aos antígenos da cápsula de C. neoformans por esses anticorpos de diferentes isotipos ainda é desconhecido e seu estudo possui grande importância, já que parece promover alteração na resposta imunitária, tendo assim um grande potencial para terapia da doença. No intuito de produzir variantes de anticorpos recombinantes para elucidar quais regiões são responsáveis pela mudança no padrão de ligação à cápsula de C. neoformans, foram desenvolvidos, construídos e sintetizados quatorze vetores que codificam híbridos entre isotipos IgG1 e IgG3, sendo 7 derivados do anticorpo 2H1 (um hibridoma secretor de IgG contra GXM) e sete dos anticorpos 3E5 (outro hibridoma secretor de anticorpo contra GXM). Sua produção foi realizada por meio de expressão heteróloga em células CHO DHFR-/- e HEK 293F. Por fim, foram realizados ensaios de imunofluorescência indireta para observar seu padrão de ligação à cápsula de C. neoformans. Neste foi observado que os anticorpos recombinantes 2H1 produzidos são funcionais e que as alterações realizadas em 2H1 CH1, geraram padrões de ligação de puntiforme (IgG3) e anular (IgG1), como esperado. Porém, quando a dobradiça do anticorpo 2H1 IgG3 foi substituída pela dobradiça de IgG1, o padrão de ligação à cápsula parece mudar de puntiforme para anular. Quando o inverso é feito, substituindo em um anticorpo IgG1 a dobradiça de IgG3, o padrão continua anular. Estes resultados indicam que a dobradiça é uma região necessária, mas não suficiente para determinar o padrão de ligação de um anticorpo à cápsula do fungo. / Cryptococcosis is a disease with more than 223 thousand new cases per year, resulting in the death of approximately 181 thousand people, mainly HIV positive individuals. Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main species responsible for cryptococcal meningoencephalitis, among other complications. The treatments currently used for this desease involves the antifungals amphotericin B, flucytosine and fluconazole. However, these drugs have limitations such as toxicity, cost and the emergence of resistance in some strains. Thus, alternative therapies such as the use of cytokines and monoclonal antibodies have been created in order to develop new tools for the treatment and diagnosis of this disease. Some studies show that mAbs (IgGs) against C. neoformans capsule glucuronoxylomannan (GXM) may protect against infection in mice, but that IgG3 isotypic variants may actually enhance the disease, thereby decreasing the survival of these animals. In addition, it has been described that differences in the constant region of IgGs with identical paratopes may lead to changes in the antigen binding pattern, which contrasts with the already established definition that the variable region is the only one responsible for the antigen affinity. The molecular mechanism of C. neoformans capsule antigen-binding diversity by these antibodies of different isotypes is still unknown and its study is of great importance, since it seems to affect the immune response and thus have therapeutic potential. In order to produce recombinant antibody variants to elucidate which regions are responsible for the change in C. neoformans capsule binding pattern, fourteen vectors encoding hybrids between IgG1 and IgG3 isotypes were developed, constructed and synthesized, 7 of which were derived from 2H1 antibody (IgG secreting hybridoma against GXM) and seven of the 3E5 antibodies (another GXM antibody secreting hybridoma). The antibodies were produced by heterologous expression in CHO DHFR -/- and HEK 293F cells. Finally, indirect immunofluorescence assays were performed to observe their binding patterns to the C. neoformans capsule. We observed that the 2H1 recombinant antibodies are functional and that the changes made in 2H1 CH1 have generated punctate (IgG3) and annular (IgG1) binding patterns, as expected. However, when we replaced the hinge of the 2H1 IgG3 antibody with its IgG1 counterpart, the capsule binding pattern appeared to change from punctate to annular. When the reverse is done by substituting the hinge in an IgG1 antibody for its IgG3 counterpart, the pattern remained annular. These results indicate that the hinge is necessary but not sufficient to determine the pattern by which an antibody binds to the C. neoformans capsule.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-02-18T16:55:17Z No. of bitstreams: 1 2015_CamilaAlvesSantana.pdf: 1674794 bytes, checksum: 8759cdf852cfc0b2c3ae27292328abdf (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-02-28T11:11:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CamilaAlvesSantana.pdf: 1674794 bytes, checksum: 8759cdf852cfc0b2c3ae27292328abdf (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-28T11:11:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CamilaAlvesSantana.pdf: 1674794 bytes, checksum: 8759cdf852cfc0b2c3ae27292328abdf (MD5) / A doença de Chagas é uma das principais doenças parasitárias na América Latina, atingindo cerca de oito milhões de pessoas. As manifestações da doença afetam o coração, intestinos e sistema nervoso. Seu tratamento é considerado ineficiente, não existindo medicamentos ou vacinas capazes de prevenir o desenvolvimento da patologia. Dessa forma, a maneira mais efetiva de se combater a doença de Chagas é realizando seu diagnóstico precoce e atuando sobre suas diversas vias de transmissão. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre via de transmissão do Trypanosoma cruzi, o estabelecimento da carga parasitária e produção de anticorpos específicos, parâmetros avaliados para se estabelecer o diagnóstico da infecção. Camundongos BALB/c foram infectados com 103 formas tripomastigotas de T. cruzi pelas vias intraperitoneal, oral e ocular. Infecções pelas vias sexual e congênita ocorreram de maneira natural. As avaliações foram realizadas durante a fase crônica da infecção. A qPCR revelou uma maior carga parasitária em camundongos infectados pela via intraperitoneal, o que também foi acompanhado por uma maior produção de anticorpos. As vias oral e ocular apresentaram mínima carga parasitária e não obtiveram títulos de anticorpos reagentes. O aumento da concentração de T. cruzi inoculada por essas duas vias promoveu um aumento da carga parasitária com consequente produção de anticorpos específicos. As vias sexual e congênita mostraram baixa, porém relevante, carga parasitária, o que as tornou reagentes nos testes sorológicos. Destaca-se que 54,6% dos camundongos infectados pela via congênita apresentaram diagnóstico molecular positivo com testes sorológicos negativos. O desafio desses animais com formas tripomastigotas de T. cruzi resultou em soroconversão em apenas 41,6% dos animais, sugerindo que os demais podem ter sido tolerizados aos antígenos parasitários. A demonstração de que a rota de aquisição do T. cruzi influencia na determinação da carga parasitária de camundongos na fase crônica da doença, bem como no perfil de produção de anticorpos, auxiliará na compreensão da epidemiologia da doença de Chagas em diferentes ecossistemas, onde predominam diferentes vias de transmissão. / Chagas disease is a major parasitic disease in Latin America, affecting about eight million people. The clinical manifestations affect the heart, intestines and nervous system. The treatment is considered ineffective, with no drugs or vaccines able to prevent disease development. The most effective way to fight Chagas disease is thus conducting early diagnosis and acting on its various routes of transmission. This study aimed to evaluate the relationship between T. cruzi transmission route, the establishment of parasite load and specific antibodies production, parameters evaluated to establish the diagnosis of the infection. BALB /c mice were infected with 103 T. cruzi trypomastigotes by intraperitoneal, oral and ocular routes. Sexual and congenital transmissions occurred naturally. Analyses were conducted during Chagas disease chronic phase. qPCR revealed a higher parasite load in mice infected by intraperitoneal route, which was also accompanied by an increased production of antibodies. Oral and ocular pathways had minimal parasite burden and did not obtain positive antibodies titers. A higher concentration of T. cruzi inoculums in these two pathways promoted an increase in parasite load and antibodies production. Sexual and congenital routes showed low but significant parasite load, which made them positive in serological tests. It is noteworthy that 54.6% of congenital infected mice tested positive in qPCR and negative in serological tests. The challenge of these animals with T. cruzi trypomastigotes resulted in serum conversion in only 41.6% animals, suggesting tolerization to parasite antigens. The demonstration T. cruzi acquisition route influences in parasite load of mice in the chronic phase of the disease and antibody production profile will assist in the understanding of Chagas disease epidemiology in different ecosystems.