Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-30T15:15:38Z No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T14:36:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_LeonardoGuedes.pdf: 5624272 bytes, checksum: 75f7b4a1facc94065376aad00f058fb4 (MD5) Previous issue date: 2009 / As imunoglobulinas são moléculas com capacidade de ligação a uma grande diversidade de antígenos. Estudos de variabilidade mostram que três regiões em cada cadeia variável, leve (L) e pesada (H), apresentam um maior grau de variabilidade, sendo por isso denominadas Regiões Determinantes de Complementaridade (CDR). Dentre essas, a CDR3 de ambas cadeias (H e L) é a que apresenta maior variabilidade. O objetivo deste trabalho é estudar anticorpos com capacidade de reconhecimento de ácidos nucléicos. Análises em bancos de dados revelaram que dentre as diversas famílias de genes que codificam as cadeias variáveis pesadas de camundongos, a pequena família VH10 destaca-se por ter sido identificada principalmente em anticorpos anti-DNA. Essa observação nos levou a postular que determinantes estruturais codificados por segmentos da família VH10 poderiam estar envolvidos nesse reconhecimento. Assim, nesse trabalho, construíu-se bibliotecas de scFvs de camundongos apresentadas na superfície de fagos filamentosos, contendo CDRH3s variáveis, no contexto de segmentos gênicos germinais da família VH10 e da família VH4 (que não apresenta nenhum Ac descrito como ligante a ácidos nucléicos depositado em banco de dados). A abordagem experimental consistiu basicamente na comparação do grau de variabilidade das CDRH3s selecionadas pela capacidade de reconhecimento a DNA de fita simples utilizando-se o procedimento de seleção (biopanning) preconizado na técnica de Phage Display As bibliotecas apresentavam tamanhos na ordem de 107 diferentes scFvs. Elas eram selecionadas pela capacidade de ligação a oligodT - celulose e os títulos de entrada e de saída foram obtidos em três ciclos de seleção. Foram realizados imunoensaios com as partículas virais selecionadas dos ciclos 2 e 3, tanto para a detecção da expressão dos scFvs como também para a verificação da capacidade de reconhecimento ao antígeno (oligodT - biotinilado). Os resultados obtidos com a análise de clones aleatoriamente escolhidos do ciclo 2 e 3 revelaram 12 sequências de CDR3Hs associadas a ligação a ácidos nucléicos e dessas, 9 são provenientes da família VH10 e 3 da família VH4. As três sequências obtidas no contexto de VH4 também estão presentes no contexto VH10. Os resultados sugerem que scFvs no contexto da família VH10, podem apresentar uma maior variabilidade CDR3Hs para o reconhecimento de ácidos nucléicos do que aqueles que apresentam o segmento da famíliaVH4, corroborando a hipótese de que determinantes estruturais codificados pelo segmento gênico VH10 participam do processo de reconhecimento antigênico. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The immunoglobulins are molecules with the capacity to recognize a variety of antigens. Variability studies show that three regions in each variable chain, light (L) and heavy (H), have a greater degree of variability and is therefore called Complementarity Determinants Regions (CDR). Among these, the CDR3 of both chains (H and L) are the ones that show the greatest variabilities. The aim of this work is study the antibodies able to recognize nucleic acids. Analysis in databases revealed that among the different families that are gene that encode the murine variable heavy chains, the small VH10 family stands out in terms of such kind of antigen recognition. This observation led us to postulate that structural determinants encoded by the V segment of the VH10 family could be specially involved in this binding ability. Thus, we built two scFvs phage display libraries, containing variable CDRH3, in the context of germinal V gene from family VH10 and the family VH4 (which presents no antibody described as ligand to nucleic acid in databank). The experimental approach was basically the biopanning of phages from those two libraries, using oligo-dT celulose as ligand. After three selection rounds, phages from round 2 and 3 were analyzed in terms of CDR3H composition and the ability to bind to the antigen in immunoassays.The analysis of randomly selected clones revealed 12 sequences of CDR3Hs able to bind to nucleic acids. From these, 9 were from the VH10 family and 3 were VH4 phages. The three sequences obtained in the context of VH4 were also present in VH10 phages. The results suggested that VH10 scFvs may allow greater CDR3H variability than VH4 ones, corroborating the hypothesis that structural determinants encoded by the V gene segment from VH10 contributes significatively for the recognition of nucleic acids.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5210_1.pdf: 1367709 bytes, checksum: 1ba2b511ffb35d8848689e3369505b94 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Buscou-se neste trabalho a síntese de um polímero a base de Polisiloxano (POS)- Glutaraldeído-Álcool polivinílico (PVA), mediante o processo sol-gel, sendo obtidos discos com diâmetro médio de 4,0 mm2 que foram utilizados como suporte sólido para imobilização de anticorpos. Inicialmente, através de microscopia eletrônica, foi feita a caracterização ultra-estrutural dos discos antes e depois das etapas de imobilização, bem como foram realizados testes da análise química elementar e espectro infravermelho dos discos. O anticorpo monoclonal anti-Proteína S100 humana foi covalentemente fixada à rede semi-interpenetrada de POS-PVA e utilizado em ensaios imunoenzimáticos tipo ELISA para avaliar a capacidade de detecção da proteína S100 contida no soro de pacientes portadores de adenocarcinoma prostático e indivíduos sadios. Os discos de POS-PVA fixaram até 92,8% de anticorpo oferecido (7,72 &#956;g de anticorpo/disco). Os melhores valores de anticorpo anti-Proteína S100 imobilizado e diluição do soro foram 10 &#956;g e 1:400, respectivamente. Foi realizada a leitura da densidade ótica dos imunoensaios para proteína S100 sérica obtendo-se a partir dos soros dos pacientes com adenocarcinoma prostático (0,425 ± 0,042) valores significativamente menores (p<0,05) quando comparados àqueles encontrados nos soros dos indivíduos sadios (1,034 ± 0,124). O anticorpo anti-Galectina-3 também foi imobilizado e avaliada a capacidade de reconhecer a proteína sérica. Semelhante aos resultados da proetína S100, também ocorreu um decréscimo significativo no soro de pacientes portadores de câncer de próstata. Também foi realizado um estudo imunohistoquímico a partir de fragmentos de tecido prostático utilizando o mesmo anticorpo a fim de comparar os resultados da expressão tecidual da proteína com aqueles valores séricos obtidos pelo teste ELISA com os discos de POS-PVA. Pode-se verificar uma nítida diferença entre os níveis teciduais e sorológicos da Proteína S100, constatando-se que o método sorológico é mais sensível e menos invasivo para avaliar os níveis desta proteína entre diferentes doenças tumorais da próstata. Conclui-se então, que a rede semi-interpenetrada de POS-PVA, aliado à sua fácil síntese e baixo custo, presta-se como modelo de suporte para a imobilização covalente de anticorpos e a partir disso pode ser utilizado no desenvolvimento de imunosensores para diferentes tipos de doenças

Orientador: Ricardo Barini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T21:00:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_EgleCristinaCoutode_M.pdf: 2697913 bytes, checksum: 5758c656c02b04716afad158e87ef0c7 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: A literatura indica que algumas mulheres com antecedente de aborto espontâneo recorrente (AER) são portadoras do anticorpo anticardiolipina (ACL). Sugere-se que este anticorpo esteja envolvido na etiologia do AER. Realizou-se, no Departamento de Tocoginecologia do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, um estudo clínico-controlado, envolvendo 52 mulheres com antecedente de AER e 104 mulheres que tinham pelo menos um filho vivo, para determinar a associação entre a presença do ACL e o antecedente de AER. O método utilizado para identificar o ACL sérico foi o "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" (ELlSA), determinando-se o tipo de imunoglobina presente: IgM ou IgG. Os resultados obtidos foram analisados através dos testes Qui-Quadrado, Teste Exato de Fisher e Teste t de Student para comparação de médias. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre a freqüência de ACL nas mulheres que tinham aborto recorrente e nas mulheres férteis, tanto para IgG quanto para IgM / Abstract: Current medical literature indicates that a group of women with recurrent spontaneous abortion (RSA) are carriers of the anticardiolipin antibody (ACA). It has been sugested that this antibody is related to the etiology of RSA. A clinicalcontrolled study was performed including 52 women with RSA and 104 women with at least one live bom child, to determine the association between the positivity for ACA and RSA. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay was used to identify the presence of ACA and the immunoglobulin subtype: IgM or IgG. Statistical analysis was performed using' Chi-square, Fisher's Exact Test and "t" Student test to compare the mean differences between the two groups. No statistical differences were detected on the frequency of ACA betweem women with RSA and women with fertife past history, both for IgM and IgG / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia

Orientador : Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:13:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_AlbetizaLobode_M.pdf: 2145081 bytes, checksum: f8411276f6b9c1ce6a2dd0cc5ed1728a (MD5) Previous issue date: 1978 / Resumo: O presente trabalho foi realizado com o objetivo de se verificar a influência da IgS anti-IgG de coelho na liberação de Cl do complexo EACl. Os resultados obtidos permitiram as seguintes conclusões: 1 - A adição de IgS-anticorpo à complexos EACl, contendo diferentes quantidades de unidades de Cl, sempre provocou a liberação de Cl, ao passo que a adição de IgS normal não produziu o mesmo efeito. 2 - o emprego de tampão com baixa força iônica não reduziu a quantidade de Cl liberada pela ação do anticorpo, sugerindo que a afinidade da IgS pela IgG é maior do que a afinidade de Cl pelo imune complexo. 3 - o conjunto de dados sugere que a inibição da imuno hemólise pela IgS deve-se provavelmente ao impedimento estérico do sítio de combinação / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T01:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dawood_FawziAhmedMoustafa_LD.pdf: 3019449 bytes, checksum: d4a52f58543ba38520a688aaebf412d1 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed / Tese (livre-docencia) - Univer / Livre-Docente em Imunologia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O CD3 como alvo terapêutico de anticorpos, pode induzir a depleção parcial dos linfócitos T circulantes, provocando uma imunossupressão, que pode ser explorada clinicamente. Com isso, a busca por anticorpos anti-CD3 humanizados tem relevância biotecnológica. Entretanto, o CD3 é um antígeno de membrana de difícil preparação. Desse modo, procuramos obter um antígeno mimético ao CD3 que se ligue com alta afinidade a um anticorpo conhecidamente imunomodulador, o anticorpo monoclonal OKT3, de forma a facilitar a busca de novos anticorpos terapeuticos. Para isso utilizou-se o biopanning, por phage display, para selecionar peptídeos ligantes, a partir de uma biblioteca de peptídeos randômicos constrita de sete resíduos, PhDC7C (Biolabs). Um protocolo de seleção baseado em seleção negativa com IgG2a de camundongo, seguido de três ciclos sucessivos de seleção positiva. Para validação desses biopanning foi feita a titulação dos ciclos comparando-os a uma curva padrão, usando a biblioteca original amplificada por PCR, que foi utilizada para normalizar a quantidade de DNA. Foram obtidas sub-bibliotecas com um título em torno de 106 pfu/mL. Essas sub-bibliotecas foram analisadas por sequenciamento de DNA de alto desempenho e por bioinformática em busca de peptídeos selecionados especificamente pelo paratopo do anticorpo OKT3, um anti-CD3. Com a análise de bioinformática foi permitido à comparação das sequencias obtidas aos bancos de dados, existentes. Assim, foram excluídos, os peptídeos conhecidamente resultante de seleção inespecífica. Em conclusão, não foi possível encontrar um peptídeo ligante ao alvo de interesse. Provavelmente o viés encontrado na biblioteca, interferiu no sucesso da técnica, mas modificações no protocolo de seleção deverão ser considerados na seleção de peptídeos ligantes, que sirvam de mimotopos. / Anti-CD3 antibodies, a target for antibody therapy, may induce partial depletion of circulating T lymphocytes, causing immunosuppression, which can be explored clinically. Thus, a search for humanized anti-CD3 antibodies has a biotechnological relevance. However, CD3 is a difficult-to-prepare membrane antigen. Thus, we aim to obtain a CD3 antigen mimetic that binds with high affinity to a known immunomodulatory anti-CD3, the mouse monoclonal antibody OKT3. We use a seven-residue, phage display peptide library PhDC7C (Biolabs) to select for OKT3 mAb ligands peptides. The screening involves a negative selection with mouse IgG2a and three successive positive selection cycles. The validation of biopanning was done with PCR, which was used to quantify the amount of DNA. Sub-libraries with a titer of about 106 pfu / ml were obtained. These sub-libraries were analyzed by high-throughput DNA sequencing and by bioinformatics in search peptides selected specifically for the paratope of the OKT3 molecule. With a bioinformatics analysis it was possible to compare the sequences with the existing databases. Thus, peptides known as non-specific binding were excluded. However, a peptide binding to the target of interest could not be found. Further improvement in selection techinique may yield to specific OKT3 binding mimotopes.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000415077-Texto+Completo-0.pdf: 548894 bytes, checksum: e6f3e94ef77c01b55d71ea1aa94a93f8 (MD5) Previous issue date: 2009 / The metabolic syndrome is considered as a proaterogenic entity. Autoimmune phenomena, particularly autoantibodies to phospholipids cofactors such as beta2-glycoprotein I (beta2-gpI), can influence the atheroma appearance. Previous studies confirmed an association of IgA anti-beta2- gpI antibodies with cerebral ischaemia, myocardial infarction, peripheral artery disease, and carotid disease. This case-control study evaluated a possible association of anti-beta2-gpI and anticardiolipin (aCL) antibodies with the occurrence of non-complicated metabolic syndrome. Cases comprised patients with metabolic syndrome without history of vascular events; controls included individuals of Orthopaedic Infirmary admitted due to musculoskeletal disorders. Age, se, race, history of hypertension, smoking, hypercholesterolemia and diabetes mellitus were evaluated as risk factors in both groups. IgG, IgM and IgA anti-beta2-gpI and anticardiolipin antibodies were detected by enzymatic immunoassay. To estimate the grade of association of antibodies with metabolic syndrome, odds ratios (OR) were calculated. Logistic regression was utilized for adjustment of confusing factors. Sixty-eight patients with metabolic syndrome and 82 controls were studied. The group of patients with metabolic syndrome showed mean age superior to controls (P = 0. 001), while males (P = 0. 003; OR 0. 31; 95%CI 0. 15-0. 16) and the white race (P = 0. 004; OR 0. 25; 95%CI 0. 10-0. 60) predominated in controls. History of hypertension, hypercholesterolemia and diabetes mellitus were more prevalent in cases than in controls (P<0. 05).IgA anti-beta2-gpI antibodies were significantly more frequent in patients with metabolic syndrome than in the control group (P < 0. 001). The adjusted OR for IgA anti-beta2-gpI antibodies was 3. 60 (95%CI 1. 55-8. 37; P = 0. 003). The current study shows that elevated levels of IgA autoantibodies to beta2-gpI might constitute an independent risk factor for metabolic syndrome. / A síndrome metabólica é considerada uma afecção pró-aterogênica. Fenômenos autoimunes, particularmente autoanticorpos contra co-fatores fosfolipídicos como a beta2- glicoproteína I (beta2-gpI), podem ter influência no desenvolvimento do ateroma. Estudos prévios confirmaram uma associação entre IgA anti-beta2-gpI e acidente vascular cerebral isquêmico, infarto agudo do miocárdio, doença arterial periférica e doença carotídea. Este estudo de casocontrole avaliou uma possível associação de anticorpos anti-beta2-gpI e anticardiolipina (aCL) com ocorrência de síndrome metabólica não-complicada. Os casos compreenderam pacientes com síndrome metabólica sem histórico de eventos vasculares; os controles consistiram de pacientes internados em enfermaria ortopédica devido à distúrbios musculoesqueléticos. Idade, sexo, raça, histórico de hipertensão arterial sistêmica (HAS), tabagismo, hipercolesterolemia e diabetes mellitus (DM) foram avaliados como fatores de risco em ambos os grupos. Anticorpos IgG, IgM e IgA anti-beta2-gpI e aCL foram detectados por ensaio imunoenzimático. Para estimar o grau de associação dos anticorpos com síndrome metabólica, foram calculadas razões de chances (odds ratios, OR). Regressão logística foi utilizada para ajuste dos fatores de confusão. Sessenta e oito pacientes com síndrome metabólica e 82 indivíduos do grupo-controle foram estudados. O grupo com síndrome metabólica apresentou média de idade superior ao do grupo-controle (P = 0,001), enquanto o sexo masculino (P = 0. 003; OR 0,31; IC95% 1,15-0,16) e a cor branca (P = 0. 004; OR 0,25; IC95% 0,10-0,60) predominaram nos controles. Histórico de HAS, hipercolesterolemia e DM foram mais prevalentes nos casos do que em controles (P<0. 05).Anticorpos IgA anti-beta2-gpI foram significativamente mais frequentes em pacientes com síndrome metabólica do que no grupocontrole (P < 0,001). O OR ajustado para anticorpos IgA anti-beta2-gpI foi de 3,6 (IC95% 1,55-8,37; P = 0,003). O presente estudo demonstra que níveis elevados de autoanticorpos IgA anti-beta2-gpI podem se constituir em fator de risco independente para síndrome metabólica.

GVB é um patógeno agrícola composto por RNA de fita simples de senso positivo, com extremidades 3’ poliadeniladas e tem seu diagnóstico feito por testes biológicos, imunológicos e moleculares. Juntamente com outros vírus, causa a síndrome do “complexo rugoso”, que impede a pega da enxertia, destruindo o floema e matando a planta precocemente. A produção de anticorpos contra uma proteína do capsídeo e o desenvolvimento de teste imunológico são os objetivos deste trabalho. A clonagem da região codificante da proteína do capsídeo do Grapevine Virus B foi obtida por PCR, utilizando primers específicos para região codificante e com sítios de restrição para endonucleases BamHI e NdeI, obtendo-se um amplicon de 594 pb. Este fragmento foi clonado no vetor de expressão pET19b e transformado em Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). Para a expressão da proteína rGVB1a (24 kDa com cauda de histidina), estabeleceu-se uma indução de 1 mM de IPTG (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside), mantida sob agitação a 250C por 18 horas. A expressão foi analisada por SDS-PAGE 13% e a presença da rGVB1a foi confirmada por Western blot, usando anticorpo monoclonal anti-histidina. A rGVB1a expressada foi purificada por cromatografia de afinidade a cauda de histidina em resina sepharose-Ni2+. A proteína purificada foi utilizada para imunizar um coelho e sete lotes de três camundongos para obtenção de soro policlonal e monoclonal contra a proteína recombinante. A fusão de células de linfócitos B com mielomas SP2/0 foi realizada, obtendo-se um hibridoma produtor de anticorpo IgG2a que em testes de ELISA e Western blot reconhecem a proteína recombinante. Adicionalmente, testes de Western blot utilizando extrato total de plantas sintomáticas e assintomáticas foram realizados para verificar se estes soros reconheciam a proteína nativa. / GVB is an agricultural pathogen composed by a single-stranded positive sense RNA with poliadenilated 3’ end and its diagnosis is based on biological, immunological and molecular tests. Together with another virus, it causes the rugose wood complex disease which prevents grafting, destroying the phloem and killing the plant early. The objectives of this work are the production of antibodies against the coat protein and the development of an immunological test. Cloning of a coat protein coding gene from Grapevine Virus B was performed by PCR, using specific primers for the coding region with restriction sites for BamHl and Ndel endonucleases, obtaining an amplicon of 594 bp. This fragment was cloned into the pET19b expression vector and transformed with Escherichia coli BL21 Codon Plus (DE3) RP (Stratagene). For expression of rGVB1a protein (24 kDa with histidine tail) a protocol with 1 mM IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), and shaking for 18 hours at 25ºC was established. The expression was analyzed by SDS-PAGE 13% and the presence of rGVB1a was confirmed by Western-blot, using an anti-histidine monoclonal antibody.rGVB1a expressed was purified by histidine tail Ni2+ Sepharose affinity chromatography. Purified protein was used to immunize a rabbit and seven lots of mice to obtain policlonal serum and monoclonal antibody against the recombinant protein. Cell fusions of lymphocyte B and SP2/0 were performed and a hybridoma producer of IgG2a antibody was obtained. This hybridoma recognized the recombinant protein in ELISA and Western blot tests. Additionally, Western blot using the extract of symptomatic and assymptomatic plants were developed to investigate if these serum recognize the native protein.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 521.pdf: 1271118 bytes, checksum: 875497805ab7b1625a92ed477fad5b66 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Dengue é considerada a mais importante arbovirose, constituindo um grave problema de saúde pública no mundo. A doença é causada por um Flavivirus com quatro sorotipos (DENV-1, 2, 3 e 4) antigenicamente similares, mas imunologicamente distintos. A circulação simultânea desses sorotipos é apontada como um importante fator de risco para determinação dos casos graves da doença, pois aumenta a probabilidade de ocorrência de infecções secundárias e o surgimento de genótipos mais virulentos. Inquérito sorológico de base populacional conduzido na cidade do Recife, Pernambuco, entre 2005-2006, em 2.833 indivíduos com idades entre 05 e 64 anos, residentes em três áreas com condições sócio-econômicas distintas encontrou prevalência global superior a 80 por cento, indicando elevada transmissão da infecção no município. Esse estudo investigou a imunidade antidengue sorotipo específica em uma amostra aleatória de 324 participantes com sorologia positiva (IgG) de uma das áreas investigadas. Além disso, estimou-se a proporção de susceptíveis aos diferentes sorotipos na população, com base na extrapolação dos resultados da amostra. O teste de neutralização por redução do número de placas (PRNT) foi utilizado na sorotipagem. A freqüência de infecções monotípicas e multitípicas foram analisadas de acordo com grupo etário, sexo, dengue auto-referida e busca por atendimento. Observou-se elevada proporção de indivíduos imunes ao DENV-3 (35,6 por cento; IC: 86,7-96,6) e de infecções multitípicas (61,6 por cento), não tendo sido observado diferenças entre os grupos etários (p=0,395). Houve maior proporção de susceptíveis aos sorotipos DENV-1 (15 anos

Orientadora : Profª Drª Larissa M. Alvarenga / Coorientadoras : Profª Drª Adriana Oliveira Costa e Profª Drª Juliana F. de Moura / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 20/03/2012 / Inclui referências : f. 56-68 / Área de concentração: Patologia / Resumo: As amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba encontram-se amplamente distribuídas na natureza e são consideradas organismos potencialmente patogênicos. Ocasionalmente podem desencadear infecções humanas, como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite amebiana. A investigação de características diferenciais entre as linhagens patogênicas e aquelas não associadas à infecção pode auxiliar a determinar fatores relacionados à patogenicidade e desenvolvimento de testes de diagnóstico. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente, por meio de critérios fisiológicos, morfológicos e imunoquímicos, amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba. Trofozoítos de quatro isolados foram utilizados: uma amostra clínica, obtida de caso de ceratite amebiana, outra amostra ambiental, obtida da poeira da residência do mesmo paciente, e outras duas amostras de referência A. poliphaga #2, de ceratite amebiana (ATCC 30641) e A. poliphaga #4, de água de um lago (ATCC 30782). Os quatro isolados foram cultivados axenicamente em meio PYG (proteose-peptona, extrato de levedo e glicose) usados para análise por microscopia eletrônica de varredura e submetidos individualmente à lise em ultra-som para obtenção de extrato protéico bruto. Os extratos foram utilizados para determinação do perfil protéico por eletroforese e na imunização de camundongos para produção anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos produzidos foram caracterizados por ELISA, Western Blotting e imunofluorescência. A análise do perfil protéico apresentou distinções quanto à presença e expressão de algumas proteínas entre os isolados. Os resultados obtidos com os anticorpos policlonais sugerem a presença de proteínas específicas para cada uma das amostras estudadas, além de um perfil imunoquímico com anticorpos co-reativos para componentes conservados. Dez clones de anticorpos monoclonais foram obtidos, dos quais o mAb3 reconhece proteínas de três das quatro amostras estudadas. O conhecimento adquirido com a realização desse trabalho poderá ser empregado na padronização de novos critérios para identificação e caracterização de linhagens desse gênero. Além disso, permitirá que proteínas previamente caracterizadas imunoquimicamente possam ser utilizadas como marcadores de patogenicidade. Palavras - chaves: Acanthamoeba, ceratite amebiana, perfil protéico, anticorpos policlonais e monoclonais, patogenicidade. / Abstract: The free-living amoebae of the genus Acanthamoeba are widely distributed in nature and are considered potentially pathogenic organisms. Occasionally they can trigger human infections such as granulomatous amoebic encephalitis and amoebic keratitis. The investigation of differentiating characteristics between pathogenic strains and those not associated with infection may help to determine factors related to pathogenicity and the development of diagnostic tests. In this sense, the aim of this study was to perform a comparative evaluation; by means of physiological, morphological and immunochemical criteria; between clinical and environmental samples of Acanthamoeba. Trophozoites of four isolates were used: a clinical sample, obtained from a confirmed case of amoebic keratitis; an environmental sample, obtained from the dust of the residence of the same patient; and two reference samples A. poliphaga #2, obtained from an amoebic keratitis (ATCC 30641) and A. poliphaga #4, obtained from the water of a lake (ATCC 30782). The four isolates were axenically grown in PYG (proteose-peptone, yeast extract and glucose), used for analysis by scanning electron microscopy and individually submitted to lysis by ultrasound to obtain a crude protein extract. The extracts were used to determine the protein profile by electrophoresis and were used for the immunization of mice to produce polyclonal and monoclonal antibodies. The antibodies produced were characterized by ELISA, Western Blotting and Immunofluorescence. The analysis of the protein profile presented distinctions about the presence and expression of some proteins among the isolates. The results obtained with polyclonal antibodies suggest the presence of specific proteins for each of the studied samples, besides an immunochemical profile with co-reactive antibodies to conserved components. Ten clones of monoclonal antibodies were obtained, from which mAb3 recognizes three of the four samples studied. The knowledge acquired from the development of this work may be employed at the standardization of new criteria for identification and characterization of strains from this genus. Furthermore, it can enable that previously immunochemically characterized proteins could be used as markers for pathogenicity. Keywords: Acanthamoeba, amebic keratitis, protein profile, polyclonal and monoclonal antibodies, pathogenicity.