Os objetivos do presente estudo foram: a) avaliar a frequência de isolamentos de patógenos causadores de mastite em rebanhos leiteiros comerciais; b) determinar a susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. isolados de casos de mastite subclínica c) avaliar o perfil de multirresistência de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. d) Detectar o gene mecA em Staphylococcus spp. resistentes a oxacilina/meticilina; e) avaliar a associação entre as práticas de manejo e tratamento de mastite e a susceptibilidade antimicrobiana de Staphylococcus aureus isolados de rebanhos leiteiros. Foram selecionados para o presente estudo 13 rebanhos leiteiros a partir de um total de 60 rebanhos vinculados a um laticínio da região de Pirassununga/SP. Questionários previamente formulados foram respondidos pelos responsáveis do rebanho para avaliar a associação entre as práticas de manejo e tratamento de mastite e a susceptibilidade antimicrobiana de S. aureus. Após a seleção dos rebanhos e aplicação dos questionários, 1069 amostras de leite compostas foram coletadas durante 24 meses, em quatro períodos para realização de cultura e identificação dos patógenos, testes de susceptibilidade antimicrobiana e detecção do gene mecA. Os testes de susceptibilidade foram realizados em todos os isolados de Staphylococcus spp. e em 50% de Streptococcus spp. selecionados aleatoriamente. Os antimicrobianos testados foram: ampicilina 10 mg; clindamicina 2 &micro;g, penicilina 1 mg; ceftiofour 30 &micro;g; gentamicina 10 mg; sulfatrimetropin 25 &micro;g, enrofloxacina 5 &micro;g; sulfonamida 300 &micro;g, tetraciclina 30 &micro;g; oxacilina 1 mg; cefalotina 30 &micro;g e eritromicina 5 &micro;g. Todos os isolados de Staphylococcus spp. que apresentaram resistência a oxacilina/meticilina foram avaliados quanto à presença do gene mecA. Entre os isolados, Staphylococcus coagulase negativa foi o mais prevalente (28,6%), seguido por S. aureus (27,8%) e Corynebacterium spp. (10,9%). A susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de S. aureus foi de 95,23% (eritromicina), 93,33% (cefalotina) e 65,71% (ampicilina). A susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de Staphylococcus coagulase negativa (SCN) foi de 93,33% (cefalotina), 89,91% (eritromicina) e 62,03% (ceftiofur). Entre os isolados de Staphylococcus coagulase positiva (SCP), a susceptibilidade antimicrobiana foi de 93,33% (eritromicina), 91,11% (clindamicina e sulfonamida). A susceptibilidade antimicrobiana dos isolados de Streptococcus agalactiae foi de 38,46% (ampicilina) e 50% (sulfatrimetropin) e os isolados de S. dysgalactiae apresentaram susceptibilidade à tetraciclina de 19,44% e a clindamicina de 47,22%. A multirresistência foi maior entre os isolados de SCN (20,3%) e S.aureus (15,7%). Não foi detectado o gene mecA em nenhum dos isolados de Staphylococcus spp. Houve associação entre as variáveis para os seguintes antimicrobianos: a) tratamento de mastite clínica: ampicilina (P = 0,0055), ceftiofur (P = 0,0481), sulfatrimetropin (P= 0,0293), sulfonamida (P = 0,0043) e tetraciclina (P = 0,0058); e envio de amostras para cultura e antibiograma: ampicilina (P=0,0032), tetraciclina (P=<0,0001). Os principais fatores de risco para susceptibilidade antimicrobiana de S. aureus foram o não envio de amostras para cultura e antibiograma para tetraciclina (OR=6.012), penicilina (OR=4.687), eritromicina (OR=3.059) e ampicilina (OR=2.571), tratamento de mastite clínica para ampicilina (OR=2.178), ceftiofur (OR=1.956), gentamicina (OR=1.668), oxacilina (OR= 1.132) e penicilina (OR= 1.261) e tratamento de vaca seca para enrofloxacina (OR=2.111) e tetraciclina (OR=2.075). Os microrganismos mais frequentemente isolados foram Staphylococcus coagulase negativa e S. aureus. Os testes de susceptibilidade realizados para as espécies de Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. apresentaram alta susceptibilidade para a maioria dos antimicrobianos testados. Com exceção de Streptococcus agalactiae para ampicilina e sulfatrimetropin e os isolados de S. dysgalactiae para tetraciclina e clindamicina. A maioria dos Staphylococcus spp. e Streptococcus spp. não apresentaram perfil de multirresistência. Nenhum dos isolados de Staphylococcus spp. fenotipicamente resistentes a oxacilina/meticilina apresentaram o gene mecA. O maior fator de risco associado à susceptibilidade de S. aureus foi em relação à tetraciclina, penicilina, eritromicina e ampicilina para o não envio de amostras para cultura e antibiograma. Dois fatores de risco importantes identificados foram relacionados à ampicilina, ceftiofur, gentamicina, oxacilina e penicilina para o tratamento de mastite clínica e à enrofloxacina e tetraciclina para o tratamento de vaca seca. / The aims of this study were: a) to evaluate the frequency of mastitis pathogens in commercial dairy herds, b) to determine the antimicrobial susceptibility of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. isolated from subclinical mastitis c) to evaluate the profile of multidrug resistance of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. d) to detect the mecA gene in Staphylococcus spp. resistant to oxacillin / methicillin, e) to evaluate the association between management practices and treatment of mastitis, and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus isolates from dairy herds. Thirteen dairy herds were selected from a total of 60 dairy farms in the region of Pirassununga / SP. Questionnaires formulated previously were answered by dairy farmers to evaluate the association between mastitis treatment practices and antimicrobial susceptibility. A total of 1,069 composite samples of milk from all herds were collected for culture and identification of pathogens, susceptibility testing and mecA gene detection, over 24 months in four periods. The susceptibility tests were performed in all isolates of Staphylococcus spp. and in 50% of Streptococcus spp. randomly selected. The antimicrobials tested were ampicillin 10mg; 2&micro;g clindamycin, penicillin 1mg; ceftiofour 30&micro;g; gentamicin 10mg; sulfatrimetropin 25&micro;g, 5&micro;g enrofloxacin; 300&micro;g sulfonamide, tetracycline 30&micro;g; oxacillin 1mg; 30&micro;g cephalothin and erythromycin 5&micro;g. All Staphylococcus spp. that were resistant to oxacillin/methicillin in the susceptibility tests were investigated for the presence of mecA gene. Among the isolated bacteria, CNS was the most prevalent (28.6%), followed by S. aureus (27.8%) and Corynebacterium spp. (10.9%). The antimicrobial susceptibility of isolates of S. aureus was 95.23% (erythromycin), 93.33% (cephalothin) and 65.71% (ampicillin). The antimicrobial susceptibility of isolates of coagulase-negative Staphylococcus (CNS) was 93.33% (cephalothin), 89.91% (erythromycin) and 62.03% (ceftiofur). Among strains of coagulase positive Staphylococcus (CPS), the antimicrobial susceptibility was 93.33% (erythromycin), 91.11% (clindamycin and sulfonamide). The antimicrobial susceptibility of the strains of Streptococcus agalactiae was 38.46% (ampicillin) and 50% (sulfatrimetropin) and isolates of S. dysgalactiae were susceptible to tetracycline and clindamycin (19.44% to 47.22%). The multidrug resistance was higher among isolates of CNS (20.3%) and Staphylococcus aureus (15.7%). The mecA gene was not detected in any of Staphylococcus spp isolates. There was an association between variables for the following antimicrobials: a) treatment of clinical mastitis: ampicillin (P = 0.0055), ceftiofur (P = 0.0481), sulfatrimetropin (P = 0.0293), sulfonamide (P = 0.0043) and tetracycline (P = 0.0058); and sending samples for culture and antibiogram: ampicillin (P = 0.0032), tetracycline (P = <0.0001). Major risk factors for antimicrobial susceptibility of S. aureus were not submitting samples for culture and antibiogram for tetracycline (OR = 6.012), penicillin (OR = 4.687), erythromycin (OR = 3.059) and ampicillin (OR = 2.571), treatment of clinical mastitis: ampicillin (OR = 2.178), ceftiofur (OR = 1.956), gentamicin (OR = 1.668), oxacillin (OR = 1.132) and penicillin (OR = 1.261); and dry cow therapy: enrofloxacin (OR = 2.111) and tetracycline (OR = 2.075). The most frequent organisms isolated were coagulase negative Staphylococcus and S. aureus. The susceptibility tests performed for the species of Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. showed high susceptibility to most antimicrobials tested. With the exception of Streptococcus agalactiae to ampicillin and sulfatrimetropin and isolates of S. dysgalactiae to tetracycline and clindamycin. Most Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. did not show multidrug resistance profile. None of Staphylococcus spp. phenotypically resistant to oxacillin / methicillin showed the mecA gene. The major risk factor associated with susceptibility of S. aureus to tetracycline, penicillin, erythromycin and ampicillin was not sending samples for culture and sensitivity. Two important risk factors have been identified related to ampicillin, ceftiofur, gentamicin, penicillin and oxacillin for treatment of clinical mastitis and enrofloxacin and tetracycline for the treatment of dry cow dry cow therapy.

Nos últimos 30 anos, Acinetobacter tornou-se um dos patógenos de maior preocupação clínica pela falta de terapias eficazes em virtude do fenótipo de multirresistência frequentemente apresentado. Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. baumannii, A. genoespécie 3 e A. genoespécie 13TU são as mais comumente encontradas a partir de amostras biológicas. Estas espécies ao lado de A. calcoaceticus constituem o complexo A. calcoaceticus-A. baumannii (ACB). Este estudo propõe um esquema composto de duas PCRs para a identificação das espécies de interesse médico que fazem parte do complexo ACB. O método é simples, rápido e, além de identificar as espécies, permite pesquisar a presença de genes de resistência. Foram identificadas 515 amostras do complexo ACB, isoladas de pacientes no período de janeiro de 2005 a dezembro de 2010. A identificação das espécies do complexo ACB foi realizada por esquema composto de duas reações de PCR. Foram avaliados os perfis de sensibilidade por disco difusão e a pesquisa da presença dos genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaSPM e blaGIM foi realizada por PCR utilizando-se iniciadores específicos. No grupo de amostras estudas, 82,5% são A. baumannii (425), 11,5% A. genoespécie 13TU (59) e 6,0% A. genoespécie 3 (30), sendo A. baumannii mais isolado em pacientes internados em UTIs (p=0,0407) e A. genoespécie 13TU mais isolado em pacientes de outros ambientes hospitalares (p=0,0204). A. baumannii apresentou menor sensibilidade a todos os antimicrobianos quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. genoespécie. 3 (p<0,05). Foi possível observar ao longo do período estudado o aumento significativo da resistência aos carbapenêmicos e da sensibilidade a gentamicina por A. baumannii entre os isolados de pacientes de UTIs (p<0.05). Nenhum dos genes codificadores para metalo-lactamases foi detectado nas amostras estudadas Dentre os cepas resistentes aos carbapenêmicos (176) o gene blaOXA-23 foi detectado em 81,25% e uma amostra de A. baumannii apresentou o gene codificador para OXA-72. A tipagem molecular foi realizada por RAPD e para os isolados resistentes aos carbapenêmicos também por PFGE. Resultados obtidos por RAPD revelaram menor diversidade entre os isolados de pacientes internados em UTIs. O dendrograma obtido utilizando-se PFGE separou dois clones cujos componentes eram resistentes aos carbapenêmicos, no entanto não apresentavam o gene blaOXA-23-like. A produção de acil-homoserina lactona, autoindutor-2 e autoindutor-3 de três amostras de cada espécie clínica do complexo ACB foi pesquisada utilizando-se bioensaios. Apenas Autoindutor 3 foi detectado por bioensaio e em menor quantidade no meio précondicionados obtido a partir de A. genoespécie 3 quando comparado com A. genoespécie 13TU e A. baumannii (p<0.05). Três cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foi avaliada quanto a capacidade de adesão em monocamada de células Hep-2, MRC-5 e NCI-H292, sendo essa última a que revelou diferenças entre as espécies clínicas do complexo ACB. A. baumannii apresentou adesão difusa, A. genoespécie 13 TU adesão com formação de agrupamentos e A. genoespécie 3 não aderiu. Esse mesmo ensaio foi realizado na presença de propanolol e notou-se a diminuição de células aderidas por campo observado. Dez cepas de cada espécie clínica do complexo ACB foram pesquisadas quanto a produção de biofilme por ensaio colorimétrico utilizando cristal violeta e foi possível notar a produção significativa de biofilme por A. baumannii, quando comparado com A. genoespécie 3 (p<0.05). Esse mesmo ensaio na presença de de fentolamina, mostrou a diminuição significativa na produção do biofilme por A. baumannii. A interferência no ensaio de adesão bacteriana e biofilme, na presença de fentolamina ou propanolol, sugerem o envolvimento do autoindutor-3 na regulação desses mecanismos de virulência. / The genus Acinetobacter has emerged as one of the most troublesome pathogens for health care institutions globally. Its clinical significance, especially over the last 15 years, has been driven by its remarkable ability to up regulate or acquire resistance determinants, making it one of the organisms threatening the current antibiotic era. A. baumannii, A. 3 and A. 13TU are the most commonly species found from biological samples. These species beside A. calcoaceticus are very closely related and difficult to distinguish from each other by phenotypic properties. Therefore, it has been proposed to refer to these species as the A.calcoaceticus-A. baumannii complex(ACB). In the period from 2005 to 2009, the most frequent bacterial isolates among the nosocomial infection at the HU-USP was ACB (18%). Due to the frequency with which species are involved in ACB outbreaks of infection in the HU-USP and the emergency clinic because of expression of the phenotype of resistance to several classes of antibiotics, this study aimed to identify and characterize the species of complex ACB by molecular methods, to study their mechanisms of resistance and to characterize the different clones from patients admitted to different hospital areas. Furthermore, the ability to characterize biofilm formation, adhesion to different cell lines as well as the mechanisms of cell-cell communication were analyzed. From the ACB complex, 515 samples were identified, isolated from patients from January 2005 to December 2010. The identification of clinical species of the ACB was performed by molecular methods that were developed and validated for identification of Acinetobacter sp. include two reactions of PCR. The profiles of sensibility were evaluated by disc diffusion and the detection of the presence of genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like, blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM, and blaSPM were performed using specific primers. Molecular typing was performed by RAPD and isolates resistant to carbapenems also by PFGE. The production of autoinducers of three clinical species complex was sought using bioassays with sensor strains. The ability adhesion was evaluated in monolayer of Hep-2 cells, MRC-5 and NCI-H292E. Ten clinical strains of each species of ACB complex were screened for the production of biofilms by colorimetric assay using crystal violet. Among all the strains studied, 82.5% were A. baumannii (425), 11.5% A.13TU (59) and 6.0% A. 3 (30). A. baumannii strains were more isolated from intensive care unit (ICU) patients (p = 0.0407) and A. 13TU from other patients in different hospital settings (p = 0.0204). A. baumannii showed less sensitivity to all drugs when compared with A. 13TU and A.3 (p <0.05). It was possible to observe during the study period a significant increase in carbapenem resistance and sensitivity to gentamicin by A. baumannii isolates from patients in ICUs (p <0.05). No genes coding for metallo-lactamase was detected in the samples studied. blaOXA-23 gene was detected in 81.25% among the 176 strains resistant to carbapenems. Results obtained by RAPD revealed less diversity among isolates from ICU patients compared to isolates from patients from other hospitals. The dendrogram obtained by PFGE showed less diversity than RAPD It was unable to detect homoserine lactone and autoinducer-2 by bioassay. The survey was positive of autoinducer-3 observed differences in yield among clinical species, smaller amount produced by strains of A. 3 when compared with A. 13TU and A. baumannii (p <0.05). Among the cells studied in adhesion testing, line NCI-H292 showed the greatest power discrimination between adhesion pattern observed and species of the ACB. A. baumannii showed diffuse adherence, A. 13 TU strains showed adhesion clustering and A. 3 did not adhere. This experiment was repeated in the presence of 100 &#181;M of propranolol and it was noted a decrease in cell A. 13TU and A. baumannii adhered per field observed. The biofilm assay showed significantly higher production of biofilms by A.baumannii compared with A. 3 (p <0.05). When the test was conducted in the presence of phentolamine at 100&#181;M, it was observed a significant decrease in the biofilm productions by A. baumannii, which revealing the involvement of the autoinducer-3 in biofilm production. The data obtained suggest that the proposed method of identification is a method for identification of species of medical interest belonging to the ACB complex which could be used in a routine laboratory. The method is simple, fast and beside the identification species, provides data about the resistance genes. Moreover, it revealed that the isolates of A. baumannii are more resistant and OXAbla genes, that was restricted to the ACB complex studied in this work. A. baumannii has also increased capacity for adhesion and biofilm formation, which regulates the expression of the phenotype may be linked to the production of autoinducers-3.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_mariana_almeida_iglesias.pdf: 683600 bytes, checksum: 7c2d99601551e443f9b19dd649609f3f (MD5) Previous issue date: 2014-03-06 / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen that can cause listeriosis, both in humans and in animals. The contamination by this microorganism is difficult to control, given its wide dissemination and physiological adaptability, which allow its development under conditions which are usually unfavorable to other pathogenic bacteria. Therefore, this pathogen has become of concern to the food industry as well as consumers, since it is highly pathogenic, especially in relation to risk group and may be fatal in 30% of cases of listeriosis. Although any isolate of L. monocytogenes can be considered potentially pathogenic for humans, several studies suggest that this micro-organism has a heterogeneous pathogenicity of the strains, which makes it essential to know the gene expression of the pathogen can be understood that the differences in their virulence mechanisms, and how different potential pathogenicity. The present study aimed to verify the occurrence of. L. monocytogenes in slaughterhouses in southern Rio Grande do Sul, and through the isolates, assess their sensitivity to antibiotics, and perform a genotypic characterization by verifying the presence of virulence genes. L. monocytogenes occured in 6% of the samples, detected after bleeding at the point where the collect was held in the leather of the animal, and point 4 (pre-cooling after washing).Twelve isolates were obtained, which were evaluated for sensibility to 15 antimicrobials, of which 100% were susceptible to most antibiotics tested. Resistance to gentamycin (8%), ampicilin (8%), kanamycin (8%) and sulfonamide (83%) were observed in some isolated of L. monocytogenes. Intermediate susceptibility to clindamycin (60%) and erythromycin (8%) was observed, and multidrug-resistant strains were also observed. Proceeded to evaluate the presence of virulence genes (hlyA, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, plcB, iap, actA, mpl and PrfA) and, through the results of PCR, it was observed that all isolates possessed the evaluated genes, also confirmed the expression of the gene of internalin A by RT-PCR, showing the potential pathogenic strains of L. monocytogenes isolated from food in southern Brazil. / Listeria monocytogenes é um patógeno de origem alimentar capaz de causar listeriose, tanto em humanos como em animais. A contaminação por este micro-organismo é de difícil controle, tendo em vista sua ampla disseminação e capacidade fisiológica de adaptação, as quais permitem seu desenvolvimento sob condições que usualmente são desfavoráveis a outras bactérias patogênicas. Assim sendo, esse patógeno tornou-se motivo de preocupação para a indústria de alimentos bem como para os consumidores, uma vez que é altamente patogênica, principalmente em relação ao grupo de risco, podendo ser fatal em até 30% dos casos de listeriose. Embora qualquer isolado de L. monocytogenes possa ser considerado potencialmente patogênico para humanos, vários estudos sugerem que este micro-organismo apresenta patogenicidade heterogênea, o que torna essencial a caracterização molecular de cada isolado, bem como o conhecimento de sua expressão gênica, para que possam ser entendidas as diferenças nos seus mecanismos de patogenicidade.. Em vista do exposto, o presente estudo objetivou verificar a ocorrência de L. monocytogenes em carcaças bovinas abatidas em dois frigoríficos-matadouros do sul do Rio Grande do Sul e, a partir dos isolados, avaliar sua sensibilidade a antimicrobianos, e realizar a caracterização genotípica, através da verificação da presença de genes de virulência e da expressão da internalina A. A ocorrência de L. monocytogenes nas carcaças foi de 6%, a qual foi detectada no Ponto 1 (após a sangria) e no Ponto 4 (após a lavagem pré-resfriamento). Foram obtidos 12 isolados, os quais foram avaliados quanto a sensibilidade a 15 antimicrobianos, dos quais 100% mostraram-se sensíveis a maioria dos antibióticos testados. Resistência à gentamicina (8%), ampicilina (8%), canamicina (8%) e a sulfonamida (83%) foram observadas em parte dos isolados. Suscetibilidade intermediária foi observada para clindamicina (60%) e eritromicina (8%). Quanto aos isolados multirresistentes, dois deles apresentaram resistência a mais de um agente antimicrobiano. Procedeu-se à avaliação da presença de genes de virulência (prfA, plcA, plcB, hlya, iap, actA, mpl, inlA, inlC e inlJ) e, através dos resultados da PCR, foi possível observar que todos os isolados possuíam os genes avaliados, sendo também confirmada a expressão do gene da internalina A através da técnica de RT-PCR, evidenciando o potencial patogênico das cepas de L. monocytogenes isoladas de alimentos no sul do Brasil.

The thermophilic Campylobacters, Campylobacter jejuni and Campylobacter coli are found as commensals in the intestinal tract of healthy mammals and birds. Campylobacter jejuni is one of the leading causes of sporadic food-borne bacterial disease in humans which is predominantly contracted from poultry products. Although the vast majority of these infections are mild, life-threatening complications should be treated with antimicrobials. Patients are usually treated with either macrolides of fluoroquinolones. However, globally there is an increased trend in the development of resistance to these antibiotics. This trend has also been observed in infection of poultry and pigs. The aim of this investigation was to determine antimicrobial sensitivity of thermophilic Campylobacters isolated from pigs and poultry by broth microdilution minimum inhibitory concentration testing. A total of 482 samples of the small intestinal content from poultry and pigs from the Western Cape and Gauteng Provinces were collected and analysed. Thirty-eight Campylobacter isolates were obtained. Statistical analyses included percentage resistance, minimum inhibitory concentrations (MIC50 and MIC90) as well as the distribution percentages of the MICs. The non-parametric Mann-Whitney U test was used to establish any significant differences at an interspecies, interhost and interprovincial level. Analyses of the data obtained revealed indications of decreasing susceptibility to several antibiotic groups including the tetracyclines, macrolides, erythromycin and tylosin, as well as the lincoasamides, and fluoroquinolones. It was found that isolates from the Western Cape were more likely to be resistant to the fluoroquinolones (p = 0.0392), macrolides (p = 0.0262), and lincoasmides (p = 0.0001) and, as well as to a certain extent the pleuromutulins (p = 0.0985), whereas isolates from Gauteng were more resistant to the tetracycyclines (p = <.0001). Poultry Campylobacter spp. were more prone to be resistant to enrofloxacin (p = 0.0021). Campylobacter jejuni, mainly isolated from poultry, was more liable to be resistant to the tetracyclines (chlrotetracycline p= 0.0307), whereas C. coli, predominatly isolated from pigs was more likely to be resistant to the macrolides (tylosin p= 0.063). Four of the bacteria isolated from the Western Cape were resistant to three or more antibiotic classes, namely; tetracyclines, macrolides, lincosamides, pleuromutulins and fluoroquinolones. No multi-resistant Campylobacter spp. were isolated from the flocks in Gauteng. With the exception of tiamulin, the bacterial populations could clearly be divided into resistant and susceptible populations. As consequence of the increased resistance to the antimicrobial classes used for human therapy and the geographical differences in antimicrobial susceptibility, it is recommended that an antimicrobial resistance monitoring system for the thermophilic Campylobacter spp. be initiated in the South Africa National Veterinary Surveillance and Monitoring Programme for Resistance to Antimicorbial Drugs (SANVAD) Copyright / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2009. / Veterinary Tropical Diseases / unrestricted

Direct antimicrobial susceptibility testing (dAST) is not a standardized method and there is no recommendations regarding the volume of blood culture media to be used. The aim of the study was to optimize the method of dAST by determining a volume of blood culture media in µL to be used and to test the reproducibility of the volume optimized method. The dASTs (n=160) were performed on blood culture bottles (n=40) inoculated with reference bacteria (n=4), using four test volumes (50 µL, 75 µL, 100 µL and 125 µL). The optimized method was implemented on frozen and fresh bacterial isolates (n=120) derived from blood cultures. Susceptibility tests according to EUCASTs method for disk diffusion was also performed. Deviations in SIR-categorical agreement was calculated. The optimal volume of blood culture media for dAST was 75 µL. All dASTs were approved for three out of four reference bacteria whereas for the fourth reference bacteria eight out of ten dASTs was approved. Testing the reproducibility, the optimized method showed a sensitivity and specificity of 100 %. No deviation in categorical agreement of SIR-categorization was observed. The result shows a possibility of implementing a standardized method for dAST regarding the volume of blood culture media. / Vid direktresistensbestämning används blododlingsmedium för tillverkning av bakteriesuspensioner. Metoden är inte standardiserad och det finns ingen rekommenderad volym blododlingsmedium som bör användas. Syftet med studien var att optimera metoden för direktresistensbestämning genom att bestämma en volym blododlingsmedium i µL som används för tillverkning av bakteriesuspensioner. Den optimerade metodens prestanda utvärderades därefter på kliniska patientisolat. Metoden optimerades genom att direktresistensbestämningar (n=160) utfördes baserat på fyra volymer (50 µL, 75 µL, 100 µL och 125 µL) blododlingsmedium (n=40), som var inokulerade med fyra olika referensstammar. Den optimerade metodens reproducerbarhet testades på frysta och färska patientisolat (n=120) genom jämförelse av SIR-kategorisering mellan direktresistensbestämning samt resistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion. Den optimala volymen blododlingsmedium med kända referensstammar fastställdes vara 75 µL då samtliga direktresistensbestämningar godkändes för tre av fyra referensstammar, för den fjärde referensstammen godkändes åtta av tio. Då metoden implementerades på kliniska patientisolat från positiva blododlingar var känsligheten och specificiteten 100 % avseende kategorisk överensstämmelse enligt SIR-systemet. Inga avvikelser avseende SIR-kategorisering observerades. Resultaten visar att det är möjligt att optimera metoden avseende volymen blododlingsmedium som används för direktresistensbestämning på blododlingsflaskor. Då den optimerade metodens känslighet och specificitet var 100 %, är det möjligt att implementera metoden i rutinarbetet.

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Bacterial bloodstream infections represent a severe and potentially life-threatening condition. Diagnostic tools, providing rapid species identification and antimicrobial susceptibility testing have a great impact on disease progression and treatment optimization. Typically, antimicrobial susceptibility testing involves a time-consuming process, and faster methods are likely to contribute in clinical settings. This study aimed to assess the reliability of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) with a 16-20-hour incubation period for implementation in a clinical microbiology laboratory. This method was conducted alongside the standardized disk diffusion method from EUCAST, encompassing all bacterial species compatible with 16-20-hour RAST. The method was executed 80 times, and over 450 readings were performed. It confirms EUCAST's method validation, affirming 16-20-hour RAST as a swift and precise method for blood bacterial resistance determination. All inhibition zones were readable, with 89% of antibiotics tested falling within 1 mm of the set target value. Notable deficiencies were observed in antibiotic-species combinations, such as trimethoprim/sulfamethoxazole and gentamicin against E. coli, and erythromycin against S. pneumoniae. Accurate interpretation of inhibition zones demands precise reading practices as some zones were ambiguous. The study also underscores the importance of overnight cultures in antimicrobial susceptibility testing via standardized disk diffusion, accentuating 16-20-hour RAST's pivotal role in potentially accelerating resistance determination by up to a day. Given its commendable performance, 16-20-hour RAST is ready to be incorporated into the standard procedures at clinical microbiology laboratories, as demonstrated by its successful adoption at Unilabs, Skövde.

Clostridium perfringens causa enterite necrótica aviária devido à produção de toxinas que lesam o intestino. Neste estudo, de 94 amostras nove apresentaram C. perfringens, totalizando 22 isolados. Todos exceto um isolado, possuíram os genes nanI (95%) e/ou nanJ (81%), e 19/22, mostraram atividade neuraminidase em hemácias de frango. A atividade hemaglutinante foi observada em poucos isolados (26%). Todos os isolados foram plc positivos (toxina &alpha;), sendo classificados como tipo A. Sete isolados (31,8%) abrigaram o gene tpeL que codifica a toxina TpeL. Isolados tpeL+ mostraram efeito citotóxico característico da ação desta toxina. Alguns isolados mostraram capacidade de aderir e invadir células Vero. A maioria dos isolados foi resistente à sulfaquinoxalina (100%), cefalexina (95%) e eritromicina (95%) e sensíveis (100%) à cefoxitina, amoxicilina, enrofloxacina, amoxicilina-ácido clavulânico, penicilina-estreptomicina, cloranfenicol e metronidazol. Todos os isolados foram agrupados geneticamente em sete clusters, apresentando se como um grupo heterogêneo. / Clostridium perfringens cause avian necrotic enteritis due to production of toxins that damage the intestine. In this study, nine out of 94 samples had C. perfringens, totaling 22 isolates. All the isolates with exception of one, possessed the genes nanI (95 %) and/or nanJ (81 %), and 19/22 showed neuraminidase activity in chicken erythrocytes. The hemagglutinating activity was observed in a few isolates (26 %). All isolates were plc positive (toxin &alpha;) being classified as type A. Seven isolates (31.8%) harbored tpeL gene encoding the toxin TpeL. TpeL + isolates showed characteristic cytotoxic effect of the action of this toxin. Some isolates showed ability to adhere and invade Hep-2 cells. Most of the isolates were resistant sulphaquinoxaline (100%), cephalexin (95%) and erythromycin (95%) and sensitivity (100%) to cefoxitin, amoxicillin, enrofloxacin, amoxicillin - clavulanic acid, penicillin -streptomycin, chloramphenicol and metronidazole. All isolates were genetically grouped into seven clusters, presenting itself as a heterogeneous group.

The general objectives of this thesis were: (i) to determine the etiological and molecular profile of clinical mastitis (CM) in 20 dairy herds of Southeast, Brazil; and (ii) to quantify antimicrobial used for treatment of CM in the study population. To achieve this goals, four studies were performed. In the Study 1, we characterized the pathogen frequency and severity of CM in dairy herds. In addition, we determined the incidence rate of clinical mastitis (IRCM) and its association with the following herd-level descriptors: bulk milk somatic cell count (BMSCC), bulk milk total bacterial count (BMTBC), herd size (number of lactating cows), milk yield, housing system and season. The association between herd-level descriptors and IRCM were determined by two groups of mixed regression models: one based on the overall IRCM, and five based on the following specific-pathogen groups: contagious, other Gram-positive, Gram-negative, other (composed of yeast and Prototheca spp), and negative culture. A total of 5,957 quarter-cases of CM were recorded and the most frequently isolated pathogens were Escherichia coli (6.6% of total cultures), Streptococcus uberis (6.1%), and Streptococcus agalactiae (5.9%). The majority of CM cases were mild (60.3%), while 34.1% were moderate and 5.6% severe. Overall, the IRCM was 9.7 quarter-cases per 10,000 quarter-days at risk (QDAR), and the only herd-level parameter associated with overall IRCM was BMSCC, in which the highest IRCM was observed for herds with BMSCC &gt;600.000 × 103 cells/mL. In the models evaluating the specific-pathogen groups, IRCM with isolation of major contagious pathogens was associated with BMSCC, milk yield and housing system. For the evaluation of other Gram-positive pathogens, the IRCM was higher in the rainy season of 2015 in comparison with the other seasonal categories. In addition, for the model evaluating the Gram-negative group, the IRCM was highest in herds with BMTBC &gt;30 × 103 cfu/mL. The Study 2 aimed to characterize the treatment profile and quantify the antimicrobial consumption for treatment of CM in dairy herds; and to determine the association of antimicrobial use (AMU) and the same herd-level descriptors as described in the Study 1. Data on treatment practices and AMU were obtained from 19 dairy herds for a period of 12 months per herd. The AMU for treatment of CM was quantified monthly in units of defined daily dose (DDD) and expressed as antimicrobial treatment incidence (ATI; number of DDD per 1,000 lactating cows-day). The overall monthly mean ATI was 17.7 DDD per 1,000 lactating cow-days (15.4 for intramammary compounds, and 2.2 for systematically administered antimicrobials). Among intramammary drugs, aminoglycosides had the highest ATI (11.7 DDD per 1,000 lactating cow-days), while for systematically administrated antimicrobials, fluoroquinolones (4.2 DDD per 1,000 lactating cow-days) were the most frequently used antimicrobials. Herd size and BMSCC were positively associated with ATI. In addition, herd-level ATI was higher in freestall herds than in compost bedded-pack barns. In the Study 3, we determined the phylogeny of E. coli strains isolated from CM in dairy cows and the association of most frequent phylogroups with antimicrobial susceptibility. A total of 100 E. coli isolates recovered from CM cases described in the Study 1 were categorized according to their phylogenetic group using a quadruplex PCR method; antimicrobial susceptibility pattern was also evaluated. Most isolates were assigned to phylogenetic group A (52%), followed by B1 (38%), B2 (2%), C (4%), D (3%), and E (1%). Resistant isolates were observed for all evaluated antimicrobials. Overall, more than 96% of E. coli isolates were resistant to ampicillin, and more than 23% were resistant to cephalothin, sulphadimethoxine or tetracycline. High levels of resistance (&gt;70%) were also found to erythromycin, oxacillin, penicillin, penicillin associated with novobiocin, and pirlimycin. In contrary, high susceptibility was observed to ceftiofur (96.8%) among E. coli isolates. Difference in the antimicrobial susceptibility among phylogenetic groups was observed only for cephalothin, in which E. coli strains belonging to the phylogroup A were inhibited at lower antimicrobial concentrations than strains assigned to the phylogroup B1. In Study 4, we evaluated the genotypic diversity among Strep. agalactiae and Strep. uberis isolates recovered from CM in dairy cows; in addition, the study evaluated the association of genotypes clustered by genetic similarity with antimicrobial susceptibility pattern. Isolates were subtyped using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. A great genotypic diversity was found for both Strep. agalactiae (45 subtypes out of 89 isolates) and Strep. uberis (56 subtypes out of 88 isolates). For evaluation of antimicrobial susceptibility, subtypes of Strep. agalactiae were clustered into three groups (Ia, Ib and II), while Strep. uberis subtypes were clustered into two groups (I and II) according to their genetic similarity. Overall, Strep. agalactiae isolates showed high susceptibility to most antimicrobials, except to tetracycline and erythromycin. Differences in the antimicrobial susceptibility among clusters of Strep. agalactiae were observed for ampicillin, ceftiofur, erythromycin, pirlimycin, sulphadimethoxine and tetracycline. In contrary, Strep. uberis isolates were categorized as resistant to most antimicrobials, except to cephalothin and penicillin+novobiocin. No differences were observed among clusters for all antimicrobials in the analysis of Strep. uberis. In conclusion, the results of this thesis indicated a high IRCM in the evaluated herds, and although environmental pathogens were the most common cause of CM in these herds, contagious pathogens such as Strep. agalactiae and Staph. aureus, are still a concern in some dairy herds of Brazil. Furthermore, high frequencies of AMU and off-label protocols were observed among the evaluated herds. The non-judicious use of antimicrobials can become a risk factor for the development of antimicrobial resistance, which was even observed for isolates belonging to the three most prevalent bacterial species identified from CM cases in our study (E. coli, Strep. agalactiae and Strep. uberis). Finally, because there were some herd-level descriptors associated with the IRCM and AMU in our study, there may be opportunity for management strategies aiming to improve the control of CM in dairy herds of southeastern Brazil. / Os objetivos gerais desta tese foram: (i) determinar o perfil etiológico e molecular da mastite clínica (MC) em 20 rebanhos leiteiros do Sudeste do Brasil; e, (ii) quantificar os antimicrobianos usados para tratamento da MC na população estudada. Para alcançar esses objetivos, quatro estudos foram realizados. No Estudo 1, foi caracterizada a frequência de patógenos causadores de MC e a gravidade das infecções nos rebanhos leiteiros. Além disso, foi determinada a taxa de incidência de mastite clínica (TIMC) e sua associação com as seguintes variáveis em nível de rebanho: contagem de células somáticas em leite de tanque (CCSLT), contagem bacteriana total em leite de tanque (CBTLT), tamanho (número de vacas em lactação), produção de leite, sistema de alojamento e estação do ano. A associação entre as variáveis em nível de rebanho e a TIMC foi determinada por dois grupos de modelos de regressão logística multivariada: um baseado na TIMC geral, e cinco baseados nos seguintes grupos específicos de patógenos: contagiosos, outros Gram-positivos, Gram-negativos, outros patógenos (composto de leveduras e Prototheca spp.), e cultura negativa. Um total de 5.957 casos de MC em nível de quarto mamário foi registrado e os patógenos mais prevalentes foram Escherichia coli (6,6% de todas as culturas), Streptococcus uberis (6,1%), e Streptococcus agalactiae (5,9%). A maioria dos casos de MC foi de gravidade leve (60,3%), enquanto 34,1% dos casos foram moderados e 5,6% foram graves. A TIMC geral foi de 9,7 casos por 10.000 quartos-dia em risco (QDR), e o único parâmetro em nível de rebanho associado com a TIMC geral foi a CCSLT, em que a TIMC mais alta foi observada em rebanhos com CCSLT &gt;600.000 × 103 células/mL. Nos modelos que avaliaram os grupos específicos de patógenos, a TIMC de patógenos contagiosos foi associada com a CCSLT, produção de leite e sistema de alojamento. Na avaliação de outros patógenos Gram-positivos, a TIMC foi maior na estação chuvosa de 2015 em comparação com as outras categorias referentes à estação do ano. Adicionalmente, para o modelo avaliando o grupo de patógenos Gram-negativos, a TIMC foi mais alta em rebanhos com CBTLT &gt;30.000 × 103 ufc/mL. O Estudo 2 teve como objetivo caracterizar o perfil de tratamento e o consumo de antimicrobianos em rebanhos leiteiros; e determinar a associação de uso de antimicrobianos (UAM) e as mesmas variáveis em nível de rebanho descritas no Estudo 1. Dados sobre as práticas terapêuticas e UAM foram obtidos de 19 rebanhos leiteiros durante um período de 12 meses por rebanho. A frequência de UAM para tratamento da MC foi quantificada mensalmente em unidades de doses definidas diárias (DDD) e expressa como incidência de tratamento antimicrobiano (ITA: número de DDD por 1.000 vacas em lactação-dia). A média de ITA mensal foi de 17,7 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia (15,4 para compostos intramamários, e 2,2 para compostos sistêmicos). Entre os produtos intramamários, os aminoglicosídeos tiveram a ITA mais alta (11,7 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia), enquanto que para os compostos administrados pela via sistêmica, as fluoroquinolonas (4,2 DDD por 1.000 vacas em lactação-dia) foram os antimicrobianos mais frequentemente usados. O tamanho do rebanho e CCSLT foram positivamente associados com a ITA. Além disso, a ITA foi mais alta em rebanhos com freestall do que em rebanhos com sistema tipo compost barn. No Estudo 3, determinou-se a filogenia de cepas de E. coli isoladas de casos de MC em vacas leiteiras, e a associação dos filogrupos mais frequentes com a susceptibilidade aos antimicrobianos. Um total de 100 isolados de E. coli identificados nos casos de MC descritos no Estudo 1 foram categorizados de acordo com os grupos filogenéticos por meio de um método de PCR quadruplex; o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos também foi avaliado. A maioria dos isolados pertenceram ao grupo A (52%), seguido dos grupos B1 (38%), B2 (2%), C (4%), D (3%), e E (1%). Foram encontrados isolados resistentes para todos os antimicrobianos avaliados. De forma geral, mais de 96% dos isolados de E. coli foram resistentes a ampicilina, e mais de 23% foram resistentes a cefalotina, sulfadimetoxina ou tetraciclina. Altos níveis de resistência (&gt;70%) foram encontrados também para eritromicina, oxacilina, penicilina e penicilina associada a novobiocina. Ao contrário, foi observado alta susceptibilidade ao ceftiofur (96.8%) entre os isolados de E. coli. Diferenças na susceptibilidade entre os grupos filogenéticos foi observada apenas para a cefalotina, em que os isolados de E. coli pertencentes ao filogrupo A foram inibidos em concentrações de antimicrobianas mais baixas que isolados pertencentes ao filogrupo B1. No Estudo 4, avaliou-se a diversidade genotípica entre isolados de Strep. agalactiae e Strep. uberis identificados em casos de MC em vacas leiteiras; adicionalmente, o estudo avaliou a associação dos genótipos agrupados de acordo com a similaridade genética com o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Os isolados foram genotipados por meio do método de amplificação randômica de DNA polimórfico (RAPD). Grande diversidade genotípica foi observada tanto para o Strep. agalactiae (45 subtipos de 89 isolados) quanto para Strep. uberis (56 subtipos de 89 isolados). Para a avaliação de susceptibilidade aos antimicrobianos, os subtipos de Strep. agalactiae foram agrupados em três clusters (Ia, Ib e II), enquanto que os subtipos de Strep. uberis foram agrupados em dois clusters (I e II) de acordo com a similaridade genética. De forma geral, os isolados de Strep. agalactiae apresentaram alta susceptibilidade à maioria dos antimicrobianos, exceto para tetraciclina e eritromicina. Diferenças na susceptibilidade aos antimicrobianos entre os clusters de Strep. agalactiae foram observadas para ampicilina, ceftiofur, eritromicina, pirlimicina, sulfadimetoxina e tetraciclina. Por outro lado, os isolados de Strep. uberis foram resistentes à maioria dos antimicrobianos, exceto para cefalotina e penicilina + novobiocina. Não foram encontradas diferenças entre os clusters para todos os antimicrobianos na análise de Strep. uberis. Em conclusão, os resultados desta tese indicaram alta TIMC nos rebanhos avaliados, e apesar de os patógenos ambientais serem a causa mais comum de MC nestes rebanhos, patógenos contagiosos como Strep. agalactiae e Staph. aureus, ainda são uma preocupação em alguns rebanhos do Brasil. Além disso, observaram-se altas frequências de UAM e de terapias não recomendadas em bula entre os rebanhos avaliados. O uso não judicioso de antimicrobianos pode se tornar um fator de risco para o desenvolvimento da resistência bacteriana aos antimicrobianos, o que foi inclusive observado para isolados pertencentes as três espécies bacterianas mais prevalentes nos casos de MC no nosso estudo (E. coli, Strep. agalactiae e Strep. uberis). Finalmente, pelo fato de algumas variáveis em nível de rebanho terem sido associadas com a TIMC e com o UAM em nosso estudo, é possível que hajam oportunidades para implementação de estratégias de manejo com o objetivo de melhorar o controle da MC em rebanhos leiteiros do sudeste do Brasil.

A carne está exposta à contaminações em todas as fases do seu processamento tecnológico, particularmente nas operações em que é mais manipulada e sempre que não são tomados cuidados especiais em relação às Boas Práticas de Higiene. O patógeno mais importante em carne bovina é Salmonella spp, o principal agente causador de doenças transmitidas por alimentos no mundo. Vários estudos têm relatado a ocorrência de Salmonella spp em carne bovina in natura disponível no mercado, mas pouco se sabe sobre este patógeno em carne bovina produzida no Brasil para exportação. O presente estudo objetivou verificar a prevalência, o perfil de susceptibilidade antimicrobiana, a presença de genes de virulência e o perfil de macrorrestrição por PFGE em cepas de Salmonella spp isoladas em diferentes pontos da cadeia de produção. A pesquisa foi realizada em um abatedouro de grande porte que produz carne bovina para exportação. Amostras de superfície foram coletadas de 200 animais, em três pontos do processo do abate: no couro (CO), na carcaça após a esfola (CA1) e na carcaça após a lavagem, antes da refrigeração (CA2), com um total de 600 amostras. A metodologia utilizada para detecção de Salmonella spp foi a preconizada pela ISO 6579:2002, confirmando-se os resultados de identificação pela técnica de PCR e sorotipagem completa. O patógeno foi encontrado no CO de 31 animais (15,5%), na CA1 de 7 animais (3,5%) e na CA2 de 6 animais (3%). Houve a prevalência do sorovar S. Infantis (54,5%), seguido de S. Enteritidis (13,6%). Pesquisou-se a presença dos genes de virulência invA, sitC, spaN, sifA e msgA por PCR nos isolados de Salmonella spp de cada ponto amostrado positivo, em um total de 44 isolados. Observou-se que 59,1% dos isolados apresentaram todos os genes pesquisados e que os demais apresentaram pelo menos dois dos cinco genes de virulência estudados. Os mesmos isolados foram analisados quanto à susceptibilidade aos antimicrobianos, empregando-se as fitas M.I.C Evaluator (Oxoid) com os antimicrobianos ampicilina, cefotaxima, ciprofloxacina, gentamicina, imipenem e tetraciclina. Dos 44 isolados estudados, todos foram sensíveis a cefotaxima, ciprofloxacina, gentamicina e imipenem, enquanto que 5 (11,4%) foram resistentes à ampicilina e à tetraciclina simultaneamente. O perfil de macrorrestrição, feito por FPGE, mostrou que os isolados expressaram 26 perfis genéticos distintos, sendo que maioria dos perfis (92,3%) foi constituída por apenas um ou dois isolados. Os resultados indicam que Salmonella spp está presente no abatedouro estudado. A ocorrência de isolados pertencentes ao mesmo sorovar e ao mesmo perfil de macrorrestrição no couro de animais e também nas carcaças CA1 e CA2 indica possível contaminação cruzada durante o processo de abate, reforçando a necessidade da adoção de Boas Práticas de Higiene para evitar a disseminação do patógeno na cadeia de produção da carne bovina. / Beef is exposed to contamination at all stages of the production chain, particularly in operations where it is more manipulated and when Good Hygiene Practices are not properly followed. The most relevant pathogen in bovine meat is Salmonella spp, the major causative agent of foodborne diseases in the world. Several studies have shown that Salmonella spp can occur in raw bovine meat at retail level, but little is known about this pathogen in meat produced for export. The present study aimed to determinate the prevalence, antimicrobial susceptibility test, the presence of virulence genes and PFGE macrorestriction profiles of Salmonella spp isolates obtained at different points of the production chain. The survey was conducted in a large slaughterhouse that produces bovine meat for export. Surface samples were collected from 200 animals, at three points of the slaughtering process: hide right (CO), carcass after removal of the hide (CA1) and carcass after cleaning but before chilling (CA2), with a total of 600 samples. The methodology used for detection of Salmonella spp was that recommended by ISO 6579:2002, and results were confirmed by PCR and complete serotyping. The pathogen was found in CO of 31 animals (15.5%), in CA1 of 7 animals (3.5%) and CA2 of 6 animals (3%). The prevalent serovar was S. Infantis (54.5%), followed by S. Enteritidis (13.6%). The presence of virulence genes invA, sitC, spaN, sifA and msgA was investigated by PCR in 44 isolates. All these genes were detected in 59.1% of the isolates, and the others had at least two of these virulence genes. The same isolates were tested for antimicrobial susceptibility using the MIC Evaluator strips (Oxoid) with the antimicrobials ampicillin, cefotaxime, ciprofloxacin, gentamicin, imipenem and tetracycline. All 44 isolates were sensitive to cefotaxime, ciprofloxacin, gentamicin and imipenem, whereas five (11.4%) were resistant to ampicillin and tetracycline simultaneously. The macrorestriction profiles, determined by PFGE, the 44 isolates expressed 26 different genetic profiles, and most profiles (92.3%) contained only one or two isolates. The results indicate that Salmonella spp is present in the studied abattoir. The occurrence of isolates belonging to the same serovar and presenting the same macrorestriction profile in the hides and in the carcasses indicates possible cross contamination during the slaughtering process, strengthening the need of adoption of Good Hygiene Practices to avoid dissemination of the pathogen in beef the production chain.