L’obésité, problème majeur de santé publique, est en augmentation constante. Elle est responsable d’une altération de la sécrétion des adipokines, telles que l’apeline. L’apeline est impliquée dans diverses fonctions de l’organisme et notamment dans la régulation du métabolisme énergétique. Au cours de la grossesse, ce système semble avoir un rôle crucial dans le développement foeto-placentaire. Le système apelinergique chez la femme enceinte obèse n’a encore jamais été étudié. L’objectif de cette thèse était de vérifier si le système apelinergique est modifié en cas d’obésité chez la femme enceinte, tout d’abord par une approche expérimentale sur un modèle de souris obèse et insulino-résistante, puis par une approche translationnelle vers l’humain (étude OB-APE). Matériel et méthode : Modèle murin : 40 souris femelles ont été réparties en 2 groupes : Témoin (T, n=20) et High Fat (HF, n=20). Après 3 mois de régime, les souris étaient mises en reproduction. Des prélèvements étaient réalisés à E6.5, E12.5 et E18.5. Lors du sacrifice à E18.5, la glycémie à jeun, l’insulinémie, l’apelinémie maternelle et foetale étaient dosées, les souriceaux et les placentas étaient pesés. La moitié de chaque placenta était mis dans du RNA later et l’autre moitié était mis dans de l’azote liquide. Les prélèvements étaient conservés à -80°C. Etude chez l’humain (étude OB-APE) : Etude prospective et comparative menée au sein de la maternité Jeanne de Flandre (Lille, France) entre mai 2016 et juillet 2017. Les patientes inclues étaient réparties en 3 groupes: N (normal, n= 30), O (obèses, n = 30) et ODG (obèse avec diabète gestationnel, n = 30). Trois prélèvements plasmatiques maternels d’apeline étaient réalisés : entre 35 et 40 SA), à l’accouchement et au 2ème jour du post-partum, ainsi qu’un prélèvement néonatal au cordon ombilical. Des fragments placentaires étaient prélevés à l’accouchement et du colostrum était récupéré à J2 en post-partum. Les dosages de l’apeline dans le plasma et dans le colostrum étaient réalisés par ELISA. L’expression placentaire de l’apeline et d’APJ était étudiée par RT-PCR quantitative. La sécrétion placentaire était étudiée dans un milieu nutritif standard (DMEM) ainsi qu’en présence d’insuline (50nM) ou d’angiotensine II (AT2, 1nM). Résultats:Modèle murin : Après 3 mois de régime, les souris HF étaient obèses et intolérantes aux hydrates de carbone. Il n’y avait pas de différence d’apelinémie à jeun entre les souris T et HF hors gestation. Les placentas des souriceaux HF avaient un poids supérieur à ceux des portées T (P=0.006). Il y avait au cours de la gestation une diminution de l’apelinémie dans les 2 groupes en fin de gestation, de façon plus importante dans le groupe HF que dans le groupe Témoin (P =0.01). Chez les souris obèses, il y avait une augmentation de l’insulinorésistance en fin de gestation par rapport au groupe T (P<0.05). L’expression placentaire de l’apeline et d’APJ était augmentée dans les placentas de souris obèses. Etude chez l’humain (étude OB-APE) : L’apelinémie maternelle était diminuée dans les groupes O et ODG en comparaison avec le groupe N aux 3 temps de l’étude. L’apelinémie néonatale était également diminuée dans ces mêmes groupes. Les concentrations en apeline dans le colostrum étaient à l’inverse plus élevées dans les groupes O et ODG que dans le groupe N (P = 0,007 et P = 0,05 respectivement). Ex-vivo, la sécrétion placentaire était diminuée dans les groupes O et ODG en comparaison avec le groupe N. L’ajout d’insuline dans le milieu entrainait une augmentation de la sécrétion d’apeline, alors que l’ajout d’AT2 aboutissait à une diminution de cette sécrétion. L’expression placentaire de l’ARNm d’APJ était plus importante dans les placentas de femmes obèses que chez patientes d’IMC normal (N) [...] / Obesity is a major public health problem and is constantly increasing. Obesity alters the adipokines’ secretion, such as apeline. Apeline is involved in various functions, such as energy metabolism regulating. During pregnancy, the apelinergic system seems to be crucial for fetal development. The apelinergic system in obese pregnant women has never been studied before. The aim of this thesis was to verify whether the apelinergic system is modified in case of obesity in pregnant women, first by an experimental approach on an obese and insulin-resistant mouse model and then by a translational approach to the human (OB-APE study). Material and methods : Murine model: 40 female mice were divided into 2 groups: Control (C, n = 20) and High Fat (HF, n = 20). After 10 weeks of diet, mice were mated. Samples were taken at E6.5, E12.5 and E18.5. Mice were sacrificed by decapitation at E18.5 and blood samples were collected. Fetuses and placentas were collected after cesarean section and weighed. Fasting blood glucose, insulinaemia, maternal and fetal apelinemia were measured. At E18.5, blood samples of fetuses were collected and placentas were frozen and stored at -80°C. Human model (OB-APE study) : Prospective and comparative study conducted in Jeanne de Flandre maternity (Lille, France) between May 2016 and July 2017. Patients were divided into 3 groups: group N (normal, n=30), group O (obese, n=30) and group ODG (obese with diabetes mellitus, n=30). The maternal plasma samples were obtained at 3 different times: at the end of pregnancy (35-40 weeks of gestation), at delivery and at day 2 in postpartum, as well as a neonatal umbilical cord sampling. Placental fragments were collected at delivery and colostrum was recovered on day 2 in postpartum. The measures of apelin concentrations in plasma and colostrum were performed by ELISA. The placental expression of apelin and APJ was studied by quantitative RT-PCR. Placental secretion was studied in a standard nutrient medium (DMEM) as well as in presence of insulin (50nM) or angiotensin II (AT2, 1nM). Results: Murine model: After 3 months of diet, HF mice were obese and intolerant to carbohydrates. There was no significant difference in fasted apelinemia between non-pregnant T and HF mice. The placentas of HF mice were heavier than controls (P=0.006). There was an increase in apelinemia at E12.5 in the 2 groups (P<0.05), higher in the group HF (4.89 ± 1.18 ng/mL, vs 2.44 ± 0.42 ng/mL, P<0.001). In obese mice, there was an increase in insulin-resistance at the end of pregnancy compared to the group T (P<0.05). The placental expression of apelin and APJ was increased in obese mice. Human model (OB-APE study) : Maternal apelinemia was decreased in the O and ODG groups in comparison with the N group at the 3 times of the study. Neonatal apelinemia was also decreased in these groups. The apelin concentrations in colostrum were higher in the groups O and ODG than in the group N (P=0.007 and P=0.05 respectively). Ex-vivo, placental secretion of apelin was decreased in the groups O and ODG compared to the group N. The addition of insulin in the medium led to an increase in apelin secretion, whereas the addition of AT2 led to a diminution of this secretion. Placental expression of APJ mRNA was greater in placentas of obese women than in normal (N) patients [...]

Au début de ce doctorat, plusieurs études avaient identifié l'intestin grêle, siège de l'absorption du glucose, en tant que premier organe impliqué dans le contrôle de l'homéostasie glucidique lors d'un repas. En particulier, il a été démontré que la détection entérique de glucose permettait d'impacter son utilisation par le muscle et le foie, via un relai central impliquant une libération hypothalamique de monoxyde d'azote (NO). De plus, notre groupe a également démontré qu'une altération de la détection entérique du glucose, associée à une réponse neuronale hypothalamique anormale, participait à la mise en place d'un Diabète de Type 2 (DT2). En plus de ces problèmes de détection de nutriments, les patients obèses et diabétiques souffrent de troubles de la motilité intestinale (en particulier d'une hypercontractilité intestinale), liés à une atteinte du Système Nerveux Entérique (SNE). En effet, ce dernier est constitué d'environ 600 millions de neurones interconnectés chez l'Homme, contrôlant les contractions des muscles lisses intestinaux. D'un point de vue régulation, le SNE communique en permanence avec le Système Nerveux Central (SNC) via des voies nerveuses afférentes et efférentes. L'équipe s'intéresse au rôle de l'apeline en tant que nouvelle cible thérapeutique potentielle pour traiter le DT2. En particulier, notre équipe a récemment montré que l'apeline était libérée par les entérocytes dans la partie proximale de l'intestin, et qu'à ce niveau elle contrôlait l'absorption intestinale du glucose. Cependant, le fait que l'apeline puisse également cibler les neurones du SNE, et donc moduler la contractilité intestinale, n'était pas encore démontré. Lors de ce travail de thèse, nous avons ainsi pu montrer qu'en fonction de sa concentration, l'apeline activait des populations neuronales entériques différentes provoquant une stimulation ou, au contraire, une inhibition des contractions duodénales. La stimulation de cette contractilité duodénale par de faibles concentrations d'apeline entraîne une augmentation de l'absorption intestinale de glucose, mais également une diminution de la libération de NO hypothalamique, aboutissant à une moindre utilisation de ce dernier par le muscle squelettique. A l'inverse, de fortes concentrations d'apeline sont associées à une diminution de cette activité duodénale, entraînant un retour de l'ensemble de ces paramètres à des niveaux contrôles. Dans un second temps, nous avons voulu tester si cette motilité duodénale pouvait être considérée comme une cible thérapeutique pour traiter le DT2. Pour cela, nous avons effectué un traitement oral quotidien, pendant une semaine, avec la concentration d'apeline capable de diminuer l'activité duodénale, chez des souris obèses-diabétiques. Cette stimulation chronique par l'apeline permet de restaurer la contractilité duodénale de ces souris diabétiques au même niveau que celle de souris saines. De plus, cet effet est associé à une amélioration de leur tolérance au glucose ainsi que leur index de résistance à l'insuline. Ainsi, ce doctorat a permis de décrire un nouveau mode de communication entre l'intestin et le cerveau dans le contrôle de l'homéostasie glucidique. En effet, moduler les contractions duodénales en modifiant l'activité du SNE permettrait non seulement d'impacter l'absorption intestinale de glucose, mais également d'activer un axe duodénum-hypothalamus aboutissant au contrôle de l'utilisation périphérique de glucose. Dès lors, ce couplage " SNE-contraction duodénale " représenterait une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de maladies métaboliques telles que le DT2. / Prior to this PhD, several studies had determined that the small intestine, the site of glucose absorption, is the first organ involved in the control of glucose homeostasis during food intake. In particular, enteric glucose detection has been demonstrated to impact its utilization by muscles and liver, via a central relay involving hypothalamic nitric oxide (NO) release. Moreover, our group has also demonstrated that an alteration of enteric glucose detection, associated with an abnormal hypothalamic neuronal response, participates in type 2 diabetes (T2D) development. In addition to these defaults of nutrients detection, obese and diabetic patients suffer from intestinal motility disorders (in particular intestinal hypercontractility), linked to an alteration of the Enteric Nervous System (ENS). The ENS is composed of 600 million interconnected neurons in humans, known to control intestinal smooth muscles. The ENS permanently communicates with the Central Nervous System (CNS) via afferent and efferent nervous messages. Our team studies the role of apelin as a new potential therapeutic target to treat T2D. In this context, our group has recently demonstrated that apelin is released by the enterocytes in the proximal part of the intestine. At this site, apelin controls intestinal absorption of glucose. However, it hadn't been addressed yet whether apelin is also able to target enteric neurons, and consequently modulate intestinal contractility. During this PhD, we have highlighted that, depending of its concentration, apelin activates different enteric neuronal populations, leading to stimulation or, on the contrary, inhibition of duodenal contractions. Stimulation of this duodenal contractility by low concentrations of apelin causes an increase in intestinal glucose absorption, but also a decrease in hypothalamic NO release, leading to a reduced utilization of glucose by skeletal muscle. Conversely, high concentrations of apelin are associated with a decrease in the duodenal activity, leading to the restoration of all these parameters at basal levels. Then, we wanted to test whether duodenal motility could be considered as a therapeutic target to treat T2D. We performed a daily oral treatment, during one week, with the concentration of apelin able to decrease duodenal activity in obese and diabetic mice. We have shown that this chronic apelin treatment restores duodenal contractility in diabetic mice, at a similar level to that observed in normal mice. Moreover, this effect is associated with an improved glucose tolerance and insulin resistance index. Thus, this PhD describes a new mode of communication between the intestine and the brain, in the control of glucose homeostasis. Indeed, the modulation of duodenal contraction by targeting ENS activity could not only impact intestinal glucose absorption, but also activate a duodenum-hypothalamus axis, leading to the control of peripheral glucose utilization. Consequently, the "ENS-duodenal contraction" coupling could represent a promising therapeutic target to treat metabolic diseases such as T2D.

Durant ces dernières années, de nombreuses études épidémiologiques ont mis en évidence que les pathologies métaboliques (obésité, diabète) et cardiovasculaires pourraient, en partie, se déterminer dès la grossesse, via des perturbations de l’environnement intra-utérin. La notion de « programmation fœtale » implique qu’une altération durant la vie fœtale perturberait le développement du fœtus et le vulnérabiliserait au développement ultérieur de pathologies. Ainsi, un enfant qui naît avec un très faible poids de naissance (inférieur à 2,4 kg) ou à l’inverse avec un poids de naissance très élevé (supérieur à 4,0 kg) est statistiquement plus vulnérable au développement de ces maladies. Pour étudier ce phénomène et tenter d’en comprendre les mécanismes, nous avons utilisé des modèles expérimentaux (rat, souris) et évalué l’action et l’expression de deux substances vasodilatatrices : le Fasudil (un inhibiteur des Rho kinases) et l’hormone apeline. Les rates gestantes traitées par le L-NAME, un inhibiteur de la NO synthase (50 mg/jour) présentaient une hypertension artérielle et leurs nouveau-nés un retard de croissance intra-utérin (RCIU) de l’ordre de 20%. L’administration aux mères de Fasudil (10 mg/jour) permettait de restaurer une pression artérielle normale en fin de gestation et améliorait considérablement la croissance fœtale des animaux exposés au L-NAME. Cependant, alors que les animaux nés avec un RCIU (nouveau-nés L-NAME) ne présentaient que peu de perturbations métaboliques à l’âge adulte, les animaux exposés au Fasudil seul étaient rapidement en surpoids, présentaient une hyperglycémie à jeun et développaient des troubles du comportement alimentaire de type hyperphagique. D’autre part, par une étude menée chez des souris obèses et intolérantes au glucose après exposition à un régime hyperlipidique, nous avons démontré que l’expression génique de l’apeline est altérée dans plusieurs organes (foie, rein, tissu adipeux) bien que l’apelinémie des souris obèses reste inchangée. Des études en voie de finalisation sont menées afin de déterminer si le système apelinergique est modulé chez des souris gestantes obèses à la fois chez les compartiments maternels et fœtaux mais aussi dans le placenta. En conclusion, nous avons démontré que l’inhibition de la voie des Rho kinases en fin de gestation programme chez la descendance un surpoids, une hyperglycémie et à une altération de la prise alimentaire. Ayant démontré que le système apelinergique est altéré chez des souris femelles obèses et intolérantes au glucose, il nous reste à déterminer si ce système est aussi perturbé en condition de grossesse associée à l’obésité maternelle. / During the last decade, many epidemiological studies have shown that adult chronic metabolic (obesity, diabetes) and cardiovascular diseases may be determined, at least in part, during pregnancy through alterations of intrauterine environment. The “fetal programming” hypothesis implies that disturbances of the fetal development (intra uterine growth restriction – IUGR or macrosomia) increase the vulnerability to develop these pathologies in adulthood. To gain more insight into the mechanisms implicated in fetal programming, we used two experimental models of rodents (rat, mouse) and evaluated first the effect of an inhibition of the Rho-kinase pathway in utero on fetal growth and postnatal development in rats. In another study performed in mice, we aimed to assess the expression of apelin and its receptor APJ in obese and glucose intolerant mice fed with a high fat diet. Using data of this preliminary study, we speculated that this signaling system may be targeted during the pregnancy of obese mothers and could be implicated into the physiopathological consequences that may affect the fetoplacental unit. We demonstrated that pregnant rats treated by L-NAME, a NO synthase inhibitor (50 mg/day) were hypertensive and that their newborns presented a dramatic IUGR. Maternal treatment with the vasodilator Fasudil (10 mg/day) restored a normal maternal blood pressure and remarkably alleviated the fetal growth of L-NAME newborns. In adults, L-NAME male rats developed mild metabolic pathologies whereas rats exposed in utero to Fasudil presented an overweight, with hyperphagia and glucose intolerance. In obese and glucose intolerant mice fed with a high fat diet, we showed that apelin gene expression was altered in several organs (liver, kidney and adipose tissue) without any variation of apelin plasma concentration. Further studies are currently performed in our laboratory to unravel the expression of the apelin/APJ pathway in pregnant obese mice and their offsprings.

L’état fébrile et le vieillissement normal sont deux processus physiologiques conduisant à un déséquilibre hydrominéral de l'organisme. Ce déséquilibre se traduit par une déshydratation sévère qui peut être aggravée par des conditions climatiques comme nous l'avons vu durant l'été 2003. Dans les deux cas, fièvre et vieillissement, l'organisme répond par une stimulation du système hypothalamo-neurohypophysaire conduisant à l’augmentation de la libération de vasopressine ou hormone antidiurétique, qui pourrait prévenir une déshydratation possiblement critique. Cependant, les modalités d’activation des neurones vasopressinergiques (AVP) dans ces conditions restent inconnues.Le but des recherches réalisées dans cette thèse, a été de déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’activation des neurones vasopressinergiques (AVP) lors d’une réponse inflammatoire et au cours du vieillissement.Nous avons pu démontrer dans la première partie de ce travail que lors d’un épisode inflammatoire (mimé par une injection de lypopolysaccharide LPS) l’activité des neurones AVP est rapidement augmentée et cette activation est soutenue pendant plus de six heures. De plus, cette activation n’est pas due à un effet potentiel secondaire du LPS sur l'osmolarité plasmatique ou la pression artérielle. L’activation précoce des neurones AVP par le LPS semble être soutenue par l’IL-6 (qui mime les effets du LPS), puisque l’activation par le LPS est bloquée par une injection préalable d’anticorps anti-IL-6.Dans la seconde partie de ce travail, nous avons pu montrer le traitement chronique d’IGF-I chez le rat âgé permet de restaurer une fonction urinaire comparable à celle observée chez l’adulte, en agissant vraisemblablement directement sur les neurones AVP puisque le taux plasmatique d’AVP chez les rats âgés traités par l’IGF-I revient à des valeurs normales, i.e., équivalente à celle de rats adultes. Cette hypothèse est confortée par le fait que (i) les neurones AVP expriment le récepteur de l’IGF-I et qu’il n’y a pas de différence dans l’expression de ces récepteurs entre rats âgés et adultes, et (ii) les neurones AVP sont inhibés par l’IGF-I.Enfin, dans la dernière partie de ce travail, nous avons pu montrer que lors du vieillissement, les neurones AVP sont activés, ce qui se traduit par un taux plasmatique d’AVP élevé et un taux d’apeline très faible. De même, les astrocytes sont activés et ne présentent plus de plasticité morphofonctionelle. La microglie, en état d’alerte, ne semble pas jouer un rôle prépondérant dans cette suractivation neuronale et astrocytaire. De plus, cette suractivation neuronale est palliée par un traitement central par un anticorps anti-IL-6 ou un inhibiteur non sélectif des canaux TRPV. Cependant, un traitement central par un anticorps anti-IL-6 n’affecte pas l’expression des TRPV2 dans le noyau supra-optique (NSO). En conclusion générale, il apparait que :1/ L’IL-1 n’est pas le chef d’orchestre de tous les processus inflammatoires. En effet, dans le NSO, l’activation des neurones AVP est soutenue par l’IL-62/ La balance pro- / anti-inflammatoire est un élément importante du dysfonctionnement neuronal. Cependant, le facteur critique du dysfonctionnement des neurones AVP n’est pas la production excessive de facteurs inflammatoires mais l’insuffisante production compensatoire de facteurs anti-inflammatoires.3/ lors du vieillissement, la neuroinflammation responsable du dysfonctionnement des neurones AVP peut être qualifiée de type « chronique à bas bruit », processus dans lequel (i) la microglie, en alerte, voit sa réactivité décuplée lors d'une sollicitation inflammatoire supplémentaire; (ii) le cross-talk astrocytes-neurones est figé dans une configuration d'hyperactivité, semblable à celle observée à l'âge adulte en condition de stimulation physiologique soutenue (comme lors d'une déshydratation), mais qui empêche toute réponse appropriée du réseau à toute demande physiologique supplémentaire, quelle soit transitoire (comme la réponse à une injection aigüe de LPS ou de NaCl 9%) ou soutenue (déshydratation de 48h).Cependant, les données de la littérature montrent le rôle majeur de la microglie dans d'autres types de neuroinflammation dites à « haut bruit », et dont les effets délétères - qui vont du dysfonctionnement neuronal à la neuro-dégénérescence – trouvent leur origine dans la surexpression de molécules microgliales telles l'IL-1 ou le TNF. Pour tenter de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans un tel dysfonctionnement et pour caractériser la nature du dysfonctionnement neuronal, nous avons mis au point un modèle pharmacologique de neuroinflammation à haut bruit, en injectant directement dans les NSO de l'IL-1. Nos données préliminaires montrent que le dysfonctionnement neuronal ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires à l’origine de ce dysfonctionnement diffèrent de ceux observés lors du vieillissement : la microglie est activée et surexprime de nombreuses molécules inflammatoires, probablement à l’origine du dysfonctionnement neuronal (absence de pattern phasique, même lors d’une stimulation osmotique), puisque les astrocytes ne semblent pas être affectés. L’absence de pattern phasique à l’origine du faible taux d’AVP plasmatique traduit une perturbation des propriétés électrophysiologiques intrinsèques sous-tendant ce pattern phasique (récepteurs ; canaux ioniques) et/ou des afférences excitatrices (Glu ; ACh ; Na) ou inhibitrices (GABA) modulant cette activité phasique. / The fever and normal aging are two physiological processes leading to water and mineral imbalance in the body. This imbalance results in severe dehydration which can be aggravated by climatic conditions as we saw during the summer of 2003. In both cases, fever and age, the body responds by stimulating the hypothalamic-neurohypophysial system leading to increased release of vasopressin or antidiuretic hormone, which could possibly prevent dehydration criticism. However, the modalities of activation of vasopressinergic neurons (AVP) in these conditions remain unknown. The aim of the research done in this thesis was to determine the cellular and molecular mechanisms responsible for the activation of vasopressinergic neurons (AVP) during an inflammatory response and during aging. We showed ,in the first part of this work, that during an inflammatory episode (mimicked by an injection of lypopolysaccharide LPS) the activity of AVP neurons is rapidly increased and this activation is sustained for more than six hours. Moreover, this activation is not due to a potential secondary effect of LPS on plasma osmolarity and blood pressure. The early activation of AVP neurons by LPS seems to be supported by IL-6 (which mimics the effects of LPS), since activation by LPS is blocked by prior injection of anti-IL-6. In the second part of this work, we showed chronic treatment of IGF-I in old rats can restore bladder function similar to that observed in adults, presumably by acting directly on neurons AVP as the rate plasma AVP in aged rats treated with IGF-I returned to normal values, ie, equivalent to that of adult rats. This hypothesis is supported by the fact that (i) AVP neurons express the receptor for IGF-I and there is no difference in the expression of these receptors between adult and aged rats, and (ii) AVP neurons are inhibited by IGF-I. Finally, in the latter part of this work, we showed that during aging, the AVP neurons are activated, which results in increased serum AVP level and a very low rate of apelin. Similarly, astrocytes are activated and show more morphofunctional plasticity. Microglia does not seem to play a role in neuronal and astrocytic overactivation. Moreover, this neuronal overactivation is overcome by a central processing by an anti-IL-6 or a nonselective TRPV channels. However, an icv treatment by an anti-IL-6 does not affect the expression of TRPV2 in the supraoptic nucleus (SON). In general conclusion, it appears that: 1 / IL-1  is not the conductor of all inflammatory processes. Indeed, in the NSO, the activation of AVP neurons is sustained by IL-6 2 / the balance of pro-/ anti-inflammatory is significant in neuronal dysfunction. However, the critical factor in the dysfunction of AVP neurons is not the excessive production of inflammatory factors, but the insufficient production of compensatory anti-inflammatory factors. 3 / during aging, neuroinflammation responsible for the dysfunction of AVP neurons can be classified as type "chronic and low-grade" process in which (i) microglia, in alert, saw its reactivity increased tenfold during inflammatory additional solicitation; (ii) cross-talk astrocyte-neuron is stuck in a pattern of hyperactivity, similar to that observed in adulthood under conditions of sustained physiological arousal (such as in dehydration), but that would prevent the proper response network to any additional physiological demand, which is transient (as the response to acute injection of LPS or NaCl 9%) or sustained (48 h dehydration). However, literature data show the important role of microglia in other types of neuroinflammation called "high grade", and whose deleterious effects - ranging from neuronal dysfunction to neurodegeneration - are rooted in Microglial overexpression of molecules such as IL-1 or TNF  . In an attempt to understand the cellular and molecular mechanisms involved in such dysfunction and to characterize the nature of neuronal dysfunction, we have developed a pharmacological model of neuroinflammation high grade by injecting IL-1  directly into the SON. Our preliminary data show that neuronal dysfunction and the cellular and molecular mechanisms behind this dysfunction differ from those observed during aging: activated microglia overexpressing many inflammatory molecules, probably at the origin of neuronal dysfunction ( absence of phasic pattern, even during osmotic stimulation), since astrocytes do not appear to be affected. The absence of phasic pattern causing the low plasma AVP reflects a disturbance of intrinsic electrophysiological properties underlying the phasic pattern (receptors, ion channels) and / or afferent excitatory (Glu, ACh, Na) or inhibitory (GABA) modulating the phasic activity.

Abstract Calcified aortic valve disease represents a spectrum of disease spanning from mild aortic valve sclerosis to severe aortic valve stenosis (AS), being an actively regulated disease process and showing some hallmarks of atherosclerosis. The calcified aortic valve lesion develops endothelial injury and is characterized by inflammation, lipid accumulation, renin-angiotensin system activation and fibrosis. There is no approved pharmacological treatment available in AS. This study was aimed to characterize gene expression of endothelial factors in aortic valves in patients representing different stages of calcified aortic valve disease to reveal new targets for pharmacological interventions in AS. Aortic valves obtained from 75 patients undergoing valve replacement surgery were studied. Expression of natriuretic peptides (ANP, BNP and CNP), their processing enzymes (corin and furin), natriuretic receptors (NPR-A, NPR-B and NPR-C), endothelin-1 (ET-1), endothelin converting enzyme-1 (ECE-1), endothelin receptors A and B (ETA and ETB), and apelin pathway (apelin and its receptor APJ) was characterized by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry. AS was characterized by distinct downregulation of gene expression of CNP, its processing enzyme furin and the target receptor NPR-B. Furthermore, increased amount of ET-1 and its target receptor ETA as well as imbalance between ETA and ETB receptors and downregulated endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene expression were observed. Finally, gene expression of apelin and APJ receptor were significantly upregulated in stenotic valves when compared to controls in combination with disequilibrium between expression of angiotensin II receptors AT1 and AT2. The study provides a better understanding of molecular mechanisms associated with calcific aortic valve disease and suggest potential targets for novel therapeutic interventions.

Les proprotéines convertases (PCs) sont des enzymes impliquées de nombreux processus pathologiques. Nous avons étudié deux substrats des PCs: l'apeline et la glycoprotéine B (gB) du virus d'Epstein Barr (EBV), et le rôle de cette maturation protéolytique dans la médiation de leurs fonctions. L'apeline est surexprimée dans plusieurs cancers dont le cancer colorectal (CCR), et nous avons montré que la furine, un membre des PCs, clive l’apeline. Pour déterminer le rôle de ce clivage dans le CCR métastatique, nous avons généré un mutant non clivable (apeline-DM). In vitro, ce mutant inhibe la croissance de cellules cancéreuses du côlonet ne les protège pas de l'apoptose, contrairement à l'apeline sauvage. In vivo, l'apeline-DM diminue drastiquement la croissance tumorale et la formation de métastases hépatiques chez la souris. Les mêmes résultats sont obtenus dans des modèles de souris déficientes pour l’apeline, démontrant l'intérêt d'utiliser l'apeline-DM ou des dérivés comme potentiels agents anticancéreux dans le traitement des CCR métastatiques. La gB du virus EBV, virus impliqué dans certains cancers lymphoïdes et épithéliaux chez l'homme, permet l'entrée du virus dans la cellule lors de l'infection. Nous avons montré que les PCs, et notamment la furine, clivent la gB. In vitro, l'induction de la protéine virale LMP1 augmente l'expression de la furine, qui se traduit par une augmentation de l'infection par EBV. Ces résultats suggèrent l'existence d'une boucle de régulation entre la furine et LMP1 permettant d'améliorer la propagation cellulaire du virus. L'utilisation d'inhibiteurs de l'activité des PCs permettrait donc de bloquer l'infection par EBV. / Proprotein convertases (PCs) are enzymes involved in many pathological processes. We have identified two novel substrates of the PCs: apelin and glycoprotein B (gB) of Epstein Barr Virus (EBV), and studied the role of PC-mediated proteolytic maturation in their functions. Apelin is overexpressed in some cancers including colorectal cancer (CRC), and we demonstrated that furin, one of the PCs member, cleaves apelin in two peptides. To determine the role of apelin cleavage by furin in the metastatic CRC, we generated a non-cleavable mutant (apelin-DM). This mutant inhibited the growth of colon cancer cells in vitro and could not protect against apoptosis, unlike the wild-type apelin. In vivo, apelin-DM drastically reduces tumor growth and the formation of hepatic metastases in mice. These results were confirmed in apelin deficient mouse models thus demonstrating the potential interest of using apelin-DM, or its derivatives, as anticancer agents in the treatment of metastatic CRC. The gB of EBV, a virus involved in some lymphoid and epithelial cancers in humans, is involved in the entry of the virus into the cell during infection. We have shown that PCs, especially furin, cleave gB. In vitro,induction of the LMP1 viral protein increases furin expression, which results in an increase in EBV infection. These results suggest the existence of a regulatory loop between furin and LMP1 to improve the cellular propagation of the virus. The use of inhibitors of PCs activity would thus block EBV infection, a virus against which there is no treatment nowadays.

Abstract Calcific aortic valve disease (CAVD) represents a disease spectrum, ranging from mild aortic valve sclerosis to severe obstructive aortic stenosis (AS), associated with a high risk of myocardial infarction and cardiovascular death. It is a common disease in the Western countries, and with their aging populations, its prevalence is likely to increase. Today, CAVD is recognized as an actively regulated disease. Mechanical stress and endothelial injury are the initiating factors, followed by lipid accumulation and oxidation, leading to inflammation, fibrosis and calcification. Ultimately, the progressive calcification hinders the normal valvular function and obstructs the flow of blood through the valve. The only effective treatment for symptomatic AS is aortic valve replacement. The trials with pharmacological treatments, mainly with anti-atherosclerotic drugs, have not been successful in slowing the progression of the disease. This study was aimed to identify differentially expressed transcripts, and molecular markers taking part in the pathophysiology behind CAVD. In particular, factors related to the renin-angiotensin system, and the apelin – APJ pathway, were investigated during the development of CAVD. In addition, the expressions of granzymes and perforin, as well as podoplanin, were studied in different stages of CAVD. It was demonstrated that these molecules are expressed in aortic valves and dysregulated in AS. These results can help to clarify the mechanisms driving CAVD, thus being potential targets for pharmacological therapy. Furthermore, the studied molecules may reflect the stage and possible subgroups of CAVD. / Tiivistelmä Aorttaläpän ahtauma edustaa tautijatkumoa, joka alkaa lievästä aorttaläpän paksuuntumisesta eli aorttaskleroosista ja jatkuu vaikeaan aorttaläpän kalkkeutuneeseen ahtaumaan eli aorttastenoosiin, johon liittyy korkea sydäninfarktin ja sydän- ja verisuonitatutiperäisen kuoleman riski. Aorttaläpän ahtauma on yleinen tauti länsimaissa, ja väestön ikääntyessä sen esiintyvyys on luultavimmin lisääntymässä. Nykyään aorttaläpän ahtauman tiedetään olevan aktiivisesti säädelty tauti. Mekaaninen rasitus ja endoteelivaurio käynnistävät tautiprosessin, läppäkudokseen kertyy lipidejä ja ne hapettuvat, mikä johtaa tulehdukseen, sidekudoksen lisääntymiseen ja kalkkeutumiseen. Lopulta etenevä kalkkeutuminen heikentää läpän normaalia toimintaa ja estää veren normaalia virtausta sydämestä aorttaan. Ainoa tehokas hoito oireiseen aorttastenoosiin on aorttaläpän korvausleikkaus. Lääkehoitoina on kokeiltu erityisesti ateroskleroosin hoitoon käytettäviä lääkkeitä, mutta niillä ei ole onnistuttu estämään taudin etenemistä. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin molekyylejä ja biokemiallisia reittejä, jotka liittyvät reniini-angiotensiinijärjestelmään ja apeliini-APJ-reittiin. Lisäksi tutkittiin grantsyymien ja perforiinin sekä podoplaniinin ilmentymistä aorttaläpän ahtauman eri kehitysvaiheissa. Tulosten perusteella näitä tekijöitä ilmennetään aorttaläpässä ja niiden määrä on muuttunut kalkkeutuneessa läpässä. Tulokset auttavat osaltaan ymmärtämään aorttaläpän ahtaumaan ja kalkkeutumiseen johtavia mekanismeja, joita voidaan hyödyntää uusia lääkehoidon kohteita suunniteltaessa. Tutkitut molekulaariset tekijät voivat kuvastaa aortan ahtaumataudin vaiheita ja mahdollisia alaryhmiä.

Ο λιπώδης ιστός θεωρείται πλέον ενδοκρινές όργανο που παράγει πληθώρα βιολογικά δραστικών πεπτιδίων, που καλούνται λιποκίνες. Ανάλογα με την ανατομική τους εντόπιση, οι διαφορετικές αποθήκες λίπους έχουν και διαφορετική ικανότητα παραγωγής λιποκινών και επίδρασης σε φυσιολογικές λειτουργίες. Οι λιποκίνες που παράγονται από τον περιαγγειακό λιπώδη ιστό εμπλέκονται στην παθογένεια αγγειακών νόσων, συμπεριλαμβανόμενης της αθηροσκλήρωσης. Είναι γνωστό πως η αντιπονεκτίνη ασκεί αντιαθηρογόνες δράσεις, ενώ ο ρόλος της Τ-καντχερίνης ως υποδοχέα της αντιπονεκτίνης δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Το απελινεργικό σύστημα, αποτελούμενο από την απελίνη και τον υποδοχέα της APJ, αποτελεί μεσολαβητή ποικίλων καρδιαγγειακών λειτουργιών και ενδέχεται να συμμετέχει και στην αθηροσκληρωτική διαδικασία. Η χεμερίνη είναι λιποκίνη με γνωστό ρόλο στην ανοσία, στη λειτουργία του λιπώδους ιστού και στο μεταβολισμό, δρώντας κυρίως μέσω του υποδοχέα της CMKLR1. Μελετήσαμε την πρωτεϊνική έκφραση της αντιπονεκτίνης και της Τ-καντχερίνης, της απελίνης και του APJ, της χεμερίνης και του CMKLR1 σε ανθρώπινες αορτές, στεφανιαίες αρτηρίες και στον αντίστοιχο περιαγγειακό λιπώδη ιστό και συσχετίσαμε την έκφρασή τους με την παρουσία αθηροσκλήρωσης και με κλινικές παραμέτρους. Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για την αντιπονεκτίνη, την Τ-καντχερίνη, την απελίνη, τον APJ, τη χεμερίνη και τον CMKLR1 σε δείγματα ανθρώπινων αορτών και στεφανιαίων αρτηριών, περιλαμβανόμενου και του περιαγγειακού λίπους. Οι αορτικές και στεφανιαίες αθηρωματικές βλάβες αξιολογήθηκαν με βάση την κατάταξη του AHA. Ανοσοϊστοχημική χρώση, ποικίλης έντασης, για την αντιπονεκτίνη ανιχνεύθηκε μόνο στα λιποκύτταρα, ενώ η Τ-καντχερίνη εντοπίστηκε στα αγγειακά λεία μυικά κύτταρα (ΑΛΜΚ) και στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ανοσοϊστοχημική χρώση για την απελίνη ανιχνεύθηκε σε λιποκύτταρα, ΑΛΜΚ, ενδοθηλιακά κύτταρα και μακροφάγα-αφρώδη κύτταρα των αθηρωματικών βλαβών, ενώ ο APJ εντοπίστηκε στα ΑΛΜΚ και στο ενδοθήλιο των αγγείων. Ανοσοθετικότητα για τη χεμερίνη παρατηρήθηκε και στις δύο αποθήκες λίπους ,στα ΑΛΜΚ και σε αφρώδη κύτταρα των αθηρωματικών βλαβών. Ο CMKLR1 εκφράστηκε σε ΑΛΜΚ και σε αφρώδη κύτταρα αορτών και στεφανιαίων αγγείων με αθηρωματικές βλάβες. Η έκφραση αντιπονεκτίνης στον περιαγγειακό λιπώδη ιστό και η έκφραση Τ-καντχερίνης στα ΑΛΜΚ συσχετίστηκαν αρνητικά με την αθηροσκλήρωση και στις δύο εντοπίσεις, όπως και η έκφραση απελίνης στα ΑΛΜΚ. Η έκφραση χεμερίνης στις περιαγγειακές αποθήκες λίπους και στα αφρώδη κύτταρα συσχετίστηκε στατιστικά σημαντικά με τη βαρύτητα της αθηροσκλήρωσης και στις δύο εντοπίσεις. Πολλές ακόμα – ειδικές για την εντόπιση – συσχετίσεις παρατηρήθηκαν. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν πιθανό ρόλο της Τ-καντχερίνης ως μεσολαβητή των αντιαθηρογόνων δράσεων της αντιπονεκτίνης, ενώ υποστηρίζουν το ενδεχόμενο αντιαθηρογόνο προφίλ της απελίνης και του υποδοχέα της APJ στις ανθρώπινες αρτηρίες. Ενισχύουν, ακόμα, τον υποτιθέμενο ρόλο της χεμερίνης στην εξέλιξη των αθηρωματικών βλαβών, πιθανότατα δρώντας μέσω του CMKLR1 υποδοχέα της. Περαιτέρω έρευνα είναι αναγκαία για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της τοπικά παραγόμενης αντιπονεκτίνης, απελίνης και χεμερίνης και της σηματοδότησης μέσω των αντίστοιχων υποδοχέων τους – T-cadherin, APJ και CMKLR1 – στην παθογένεια της αθηροσκλήρωσης στον άνθρωπο. / Adipose tissue is considered an endocrine organ, producing numerous bioactive peptides, called adipokines. Depending on their anatomical location, different fat depots have a different capacity to produce adipokines and influence physiological functions. Adipokines produced by periadventitial fat have been implicated in the pathogenesis of vascular disease, including atherosclerosis. Adiponectin has established anti-atherogenic actions, while the role of T-cadherin as an adiponectin receptor is not fully elucidated. The apelinergic system, consisting of apelin and its APJ receptor, is a mediator of various cardiovascular functions and may also be involved in the atherosclerotic process. Chemerin is an adipokine with an established role in immunity, adipose tissue function and metabolism, acting, mainly through its CMKLR1 receptor. We investigated the protein expression of adiponectin and T-cadherin, apelin and APJ, chemerin and CMKLR1 in human aortas, coronary vessels and the respective periadventitial adipose tissue and correlated their expression with the presence of atherosclerosis and clinical parameters. Immunohistochemistry for adiponectin, T-cadherin, apelin, APJ, chemerin and CMKLR1 was performed on human aortic and coronary artery samples including the periadventitial adipose tissue. Aortic and coronary atherosclerotic lesions were assessed using the AHA classification. Adiponectin immunostaining, of varied intensity, was detected only in adipocytes, while T-cadherin was localized to vascular smooth muscle cells (VSMCs) and endothelial cells. Apelin immunostaining was detected in adipocytes, VSMCs, endothelial cells and foam cells in atherosclerotic lesions, while APJ was found in VSMCs and endothelia. Chemerin immunopositivity was noticed in both periadventitial fat depots, in VSMCs and foam cells in atherosclerotic lesions. CMKLR1 was expressed in VSMCs and foam cells in aortic and coronary vessels with atherosclerotic lesions. Periadventitial adiponectin and VSMC T-cadherin expression were negatively correlated with atherosclerosis in both sites, as was VSMC apelin expression. Chemerin expression in periadventitial fat depots and foam cells was statistically significantly correlated with the severity of atherosclerosis in both locations. Several other – depot specific – associations were observed. Our results suggest a possible role for T-cadherin as a mediator of anti-atherogenic adiponectin actions, while they support the putative anti-atherogenic profile for apelin and its APJ receptor in human arteries. They also lend some support to a presumable role of chemerin in the progression of atherosclerotic lesions, possibly acting through its CMKLR1 receptor. Further research is necessary to elucidate the role of locally produced adiponectin, apelin and chemerin and signaling through their respective receptors – T-cadherin, APJ and CMKLR1 – in the pathogenesis of human atherosclerosis.

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Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/ L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/ L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque. / The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/ Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/ Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure.