La xénophagie est une forme d'autophagie sélective permettant de capture des pathogènes dans les autophagosomes et de les dégrader dans les autolysosomes. Cette sélectivité est assurée par une famille de protéines ; les récepteurs autophagiques qui reconnaissent des substrats cytosoliques d'un côté et les membres de la famille LC3 ancrés dans la membrane de l'autophagosome de l'autre. Parmi ces récepteurs, NDP52 cible la bactérie Salmonella Typhimurium vers l'autophagie.Nous décrivons un rôle nouveau et inattendu pour NDP52 ; assurer la maturation d'autophagosomes durant l'infection par Salmonella mais aussi durant l'autophagie basale. De manière intéressante, ce rôle de NDP52 dans la maturation est indépendant de son rôle dans le ciblage de la bactérie puisque ces fonctions nécessitent des domaines et des partenaires moléculaires de NDP52 distincts. Nous montrons aussi que d'autres récepteurs peuvent participer à la maturation comme Optineurine. Ce travail montre donc que NDP52 assure deux rôles durant la xénophagie en ciblant les bactéries vers les autophagosomes en formation puis en promouvant la maturation de l'autophagosome. De plus, nous proposons aussi un possible mécanisme de régulation de ces deux fonctions par des modifications post-traductionnelles des récepteurs autophagiques.Ce travail démontre que les récepteurs autophagiques jouent des rôles au-delà du ciblage des pathogènes qui sont aussi cruciaux pour une xénophagie efficace. De plus, les récepteurs autophagiques sont aussi nécessaires pour le déroulement de l'autophagie basale. Ces travaux offrent une nouvelle compréhension de la régulation moléculaire de l'autophagie et de la xénophagie / Xenophagy relies on the ability of the autophagy process to selectively entrap intracellular pathogens within autophagosomes to degrade them into autolysosomes. The selectivity of the process relies on proteins named autophagy receptors that share the ability to recognise cytosolic cargos on one hand and autophagosome-bound members of the ATG8 family on the other. Among autophagy receptors NDP52 has been described to target Salmonella Typhimurium to the growing autophagosome. We describe a new unexpected role for NDP52, as this receptor also regulates the maturation of Salmonella-containing autophagosomes and during ongoing autophagy. Interestingly, the role of NDP52 in maturation is independent from its role in targeting as they rely on different binding domains and protein partners. We also show that other autophagy receptors also mediate autophagosome maturation such as Optineurin. Therefore, our work shows that NDP52 plays a dual function during xenophagy first by targeting bacteria to growing autophagosomes and then by assuring autophagosome maturation. Moreover, we also provide insights as to how these dual roles are regulated by post-translational modifications of autophagy receptors.This work demonstrates that autophagy receptors have other roles beyond pathogen targeting that are also crucial for an efficient xenophagy. Moreover, autophagy receptors are also necessary for autophagy completion in uninfected cells. These results strengthen our understanding of both ongoing autophagy and xenophagy molecular mechanisms

La viande rouge est un facteur de risque du cancer colorectal, considérée comme probablement cancérigène chez l'Homme. Le lien entre la viande rouge et le cancer colorectal impliquerait la lipoperoxydation induite par le fer héminique, aboutissant à la formation d'aldéhydes cytotoxiques présents dans les eaux fécales des rats ayant consommé de l'hème, dont le 4-hydroxynonénal (HNE). Ces eaux fécales ont préférentiellement induit la mort cellulaire dans des cellules coliques murines normales plutôt que dans des cellules coliques murines mutées pour le gène APC (adenomatous polyposis coli), considérées comme prénéoplasiques. Cette résistance des cellules prénéoplasiques est associée à une activité plus élevée du Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived)-like 2) par rapport aux cellules normales, mise en evidence par l'invalidation du Nrf2. Afin de valider l'importance des aldéhydes néoformés derives de la lipoperoxydation, nous avons optimisé la depletion des composes carbonyls dans les eaux fécales qui a aboli le différentiel de mortalité entre les cellules normales et prénéoplasiques. En utilisant des cellules épithéliales coliques humaines (CECH) afin de se rapprocher de la physiologie humaine, nous avons confirmé que le HNE et les eaux fécales des rats ayant consommé de l'hème ont aussi induit une mortalité plus élevée dans les CECHs normales que dans celles invalidées pour APC ; et qu'une activité de Nrf2 plus élevée est aussi observée dans ces dernières. L'autophagie, dont le niveau est plus élevé dans les CECHs invalidées pour APC, exercerait des effets protecteurs contre la toxicité du HNE et des eaux fécales en activant Nrf2. Globalement, nos résultats suggèrent que le Nrf2 et l'autophagie seraient impliqués dans la résistance des cellules prénéoplasiques suite à une exposition aux eaux fécales des rats ayant consommé de l'hème. Ce différentiel de résistance pourrait expliquer l'effet promoteur de la viande rouge sur la cancérogenèse colorectale, en établissant une sélection positive des cellules prénéoplasiques au détriment des cellules normales. / Red meat is a factor risk for colorectal cancer, considered as probably carcinogenic to humans. Red meat is associated to colorectal cancer through the oxidative properties of heme iron released in the colon. This latter is a potent catalyst for lipid peroxidation, resulting in the neoformation of deleterious aldehydes present in the fecal water of heme-fed rats, including 4-hydroxynonenal (HNE). Fecal water of heme-fed rats preferentially induced mortality in mouse normal colon epithelial cells than in those harboring mutation on APC (adenomatous polyposis coli) gene, considered as preneoplastic. This relative resistance of preneoplastic cells to fecal water of heme-fed rats was associated with their higher activity of Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) compared to normal cells, as evidenced by Nrf2 invalidation. To investigate the importance of secondary aldehydes derived from lipid peroxidation, depletion of carbonyl compounds in the fecal water was optimized and this turned out to abolish the difference of mortality between normal and preneoplastic cells. By using human colon epithelial cell (HCEC) lines to approach human physiology, we confirmed that HNE and fecal water of heme-fed rats also induced higher mortality in normal HCECs compared to APC-invalidated HCECs, and that higher Nrf2 activity in APC-invalidated HCECs was also associated with such a difference. Furthermore, autophagy, found to be up-regulated in APC-invalidated HCECs, was suggested to exert protective effects against HNE and fecal water toxicity by activating Nrf2. Taken together, these findings suggest that Nrf2 and autophagy were potentially involved in the resistance of preneoplastic cells upon exposure to HNE or fecal water of heme-fed rats. This different resistance could explain the promoting effect of red meat and heme-enriched diet on colorectal cancer, by initiating positive selection of preneoplastic cells over normal cells.

L’exposition à l’uranium, qu’elle soit naturelle ou accidentelle, est un sujet de préoccupation de santé publique. Cet actinide est utilisé dans de nombreuses applications civiles ou de défenses. Il est également présent de façon naturelle dans l’eau de boisson et dans l’alimentation. Sa toxicité chimique cible en majorité le rein, organe de stockage à court terme, et les tissus squelettiques, où l’uranium est retenu pendant des années. L’uranium induisant une perte osseuse à long terme, il est susceptible d’affecter les cellules impliquées dans le processus de remodelage osseux : les ostéoclastes (OCs) qui résorbent la matrice osseuse, les ostéoblastes (OBs), qui la reconstitue via la minéralisation, et les ostéocytes (OSTs), les capteurs mécano-sensibles, orchestrant le cycle de remodelage. Par ailleurs, aucune thérapie de chélation (comme il en existe pour d’autres métaux lourds) n’est véritablement efficace pour diminuer l’exposition interne et éliminer cet actinide en cas de contamination à l’uranium. Dans l’optique de comprendre les mécanismes de toxicité mis en jeu sur les cellules osseuses, la première partie de cette thèse est ainsi consacrée à l’étude des effets moléculaires et fonctionnels d’une exposition aiguë et chronique à l’uranium sur une lignée ostéocytaire, les cellules MLO-A5. Nous avons d’abord montré que ces cellules présentent une IC50 plus élevée que les OCs et les OBs et qu'une exposition aiguë stimule le processus autophagique. Dans un second temps, nous avons analysé la réponse de ces cellules lors d’une exposition chronique à des concentrations sub-toxiques d’uranium, et observé une inhibition drastique de leur capacité de minéralisation, sans toutefois affecter leur viabilité.Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés aux effets d’un décorporant potentiel de l’uranium, le 3,4,3-LI(1,2-HOPO), sur les OBs et les OCs, dans le but de mettre au point une méthode de criblage de nouveaux décorporants. Les résultats ont montré que le 3,4,3-LI(1,2-HOPO) permet une restauration partielle des capacités de différenciation et de résorption des OCs exposés à l'uranium. Ces résultats permettront d’adapter cette méthode pour le criblage de futurs décorporants dans une démarche de valorisation. Ainsi, ces travaux ont permis d’accroître les connaissances de la toxicité chimique de l’uranium sur les cellules osseuses, et ont apporté de nouvelles données toxicologiques in vitro concernant les effets d’un agent décorporant, le 3,4,3-LI(1,2-HOPO), dans ces modèles cellulaires. / Natural or accidental uranium exposure is a health care concern. Uranium is a natural metal found in the environment and is both used for civil or military applications. It is also naturally present in food and water. It exhibits both a radiological and a chemical toxicity, the latter being considered largely predominant for natural uranium. Kidneys and bones are the main targeted organs of its toxicity. The skeleton is the storage organ of uranium and can be retained there for years, causing a long-term bone loss. Bone cells, osteoclasts cells in charge of bone resorption, osteoblasts involved in matrix production and mineralization, and osteocytes, considered the major orchestrators of bone remodeling, are therefore likely to exhibit impaired functions. Furthermore, current chelation therapy treatments failed to demonstrate a true decorporating efficiency after internal uranium contaminations.The first part of this study describes molecular and cellular effects of acute and chronic uranium exposure on a murine osteocytic cell line MLO-A5. Acute exposure enhanced their autophagic process and CI50 determination shows less toxicity on osteocytes than on osteoclasts and osteoblasts. Moreover, mineralization capacity of these cells was strongly inhibited after a chronic exposure without affecting cell viability. In a second part, we determined the in vitro effects of 3,4,3-LI(1,2-HOPO), a potential decorporating agent, on osteoclasts and osteoblasts with the intend to develop methods for decorporating agent screening. This molecule shows an ability to partly restore differentiation and resorption function of exposed osteoclasts to uranium. These results constitute a step forward in the development of screening methods to evaluate the potential of new decorporating agent.Taken together, these results enhanced our knowledge of uranium toxicity mechanisms on bone cells and brought new toxicological data regarding the use of 3,4,3-LI(1,2-HOPO) in our cellular models.

Notre équipe étudie les mécanismes de résistance à l’apoptose induite par divers agents dans les cellules de lymphomes B infectées ou non par le virus d’Epstein-Barr (EBV). EBV est un virus oncogénique de la famille des gamma-herpès virus qui est associé notamment au lymphome de Burkitt (LB) et aux syndromes lymphoprolifératifs post-transplantation (PTLD). Des résultats précédents ont montré que l’utilisation de la nutline-3, une molécule capable de se fixer sur MDM2, active p53 dans ces cellules tumorales. Cependant cette activation de p53 provoque l’apoptose des cellules B EBV(-) alors que les cellules B EBV(+) en latence III (exprimant toutes les protéines virales dites « de latence ») sont beaucoup plus résistantes. Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes impliqués dans cette résistance afin de mettre en place des stratégies thérapeutiques pour la contourner. La première partie de ma thèse a été consacrée à l’étude du rôle de l’autophagie dans la résistance des cellules EBV(+) en latence III à l’apoptose. L’autophagie est un processus de dégradation des protéines qui joue un rôle physiologique complexe impliqué à la fois dans la survie et dans la mort cellulaire. Les travaux effectués ont montré que: 1) l’autophagie est induite en réponse au traitement par la nutline dans les cellules EBV(+) en latence III ; 2) ces cellules expriment fortement la Bécline-1 et présentent une activation constitutive de l’autophagie ; 3) l’autophagie participe à la résistance de ces cellules à l’apoptose. La seconde partie de ma thèse a été consacrée au développement de nouvelles molécules ciblant les protéines anti-apoptotiques de la famille de Bcl-2. En effet, outre Bcl-2 qui est surexprimé dans les cellules EBV(+), les cellules de LB et les PTLD surexpriment aussi Mcl-1, une autre protéine anti-apoptotique. Or il a été montré que cette protéine était fréquemment à l’origine de résistance à des inhibiteurs déjà développés (et en essais cliniques) contre Bcl-2. Le développement de molécules ciblant Mcl-1 s’avère donc utile pour les contrer. Pour cela une collaboration avec une équipe de chimiste (dirigée par Fanny Roussi à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles à Gif-sur-Yvette) a été mise en place. Nous avons identifié et étudié les mécanismes d’action de plusieurs molécules inhibitrices potentielles de Mcl-1 et/ou Bcl-xL capables d’induire l’apoptose dans nos deux modèles de lymphomes. / Our team investigates the mechanisms of resistance to apoptosis induced in various B-cell lymphomas including some infected by the Epstein-Barr virus (EBV). EBV is an oncogenic member in the gamma-herpesvirus family. Among other pathologies, it is associated with Burkitt’s lymphoma (BL) and post-transplant lymphoproliferative disorders (PTLD). Previously, our laboratory has found that in these tumor cells, the binding of nutlin-3 to MDM2 results in the activation of p53. However, although p53 activation leads to apoptosis in EBV(-) cells, EBV(+) latency III cells which express all viral « latency » proteins are much more resistant. During this PhD project, I studied the mechanisms involved in this resistance and made attempts to define new therapeutic strategies that would bypass them. First, the role played by autophagy was investigated. This catabolic process which degrades proteins and organelles is physiologically complex as it is involved in both cell survival and cell death. Our work has demonstrated that: 1) autophagy was induced in nutlin-3 treated EBV(+) latency III cells; 2) Beclin-1 was strongly expressed in these cells whose autophagy was constitutively activated; 3) autophagy was involved in the resistance to apoptosis observed in these cells. Second, I turned my efforts to the identification of new molecules targeting anti-apoptotic members of the Bcl-2 family. Like Bcl-2, the antiapoptotic protein Mcl-1 is heavily expressed in LB and PTLD cell lines but in this case, independently of their EBV status and this is a frequent cause for the observed resistance to Bcl-2 inhibitors that are currently tested in clinical trials. Molecules targeting Mcl-1 could thus prove promising to circumvent this resistance. In a collaboration with a Chemistry team supervised by Fanny Roussi at the Institut de Chimie des Substances Naturelles in Gif-sur-Yvette, we have identified the mechanisms of action of potential inhibitors of Mcl-1 and/or Bcl-xL, another anti-apoptotic molecules which induce apoptosis in our two lymphoma models.

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité. / Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy.

Les cellules endothéliales (CE) qui tapissent la surface luminale des vaisseaux sanguins sont sensibles aux variations des contraintes hémodynamiques engendrées par le flux sanguin comme les forces de cisaillements (FC). Altérer les mécanismes qui détectent les FC pourrait compromettre l’intégrité des CE entrainant une dysfonction endothéliale et le développement de l'athérosclérose, qui reste la cause majeure des pathologies cardiovasculaires. L'athérosclérose se développe initialement au niveau des embranchements et des courbures des vaisseaux, au niveau de territoires vasculaires où les FC sont faibles et où les CE présentent un phénotype «pro-athérogène». Dans ce contexte physiopathologique, mon projet de thèse cherche à identifier un nouveau mécanisme qui pourrait retarder le développement des plaques d’athéromes au niveau des régions vasculaires qualifiées de «pro-athérogènes» où les FC sont faibles. De façon intéressante le cil primaire (CP), protrusion membranaire présente à la surface de la CE, serait capable d’intégrer ces faibles FC. En réponse à ces forces, cet organelle cellulaire pourrait activer des voies de signalisation protectrices nécessaires pour contrebalancer les mécanismes de dysfonction endothéliale. Ainsi, bloquer l'assemblage et/ou la fonction du CP à la surface des CE pourrait participer à l'accélération du processus athéromateux. Récemment, des études ont établi une communication à double sens entre le CP et l'autophagie en réponse aux faibles FC. Parmi les acteurs de signalisation impliqués dans l'autophagie, les phosphoinositide 3-kinases (PI3K), enzymes clés impliquées dans la production de 3-phosphoinositides (3-PI), pourraient être d'un intérêt majeur. En effet, le PI(3)P, 3-PI produit par les PI3K de classe II et de classe III, est impliqué dans la nucléation de la vésicule d’autophagie. Bien que VPS34 (unique PI3K de classe III) soit décrite comme la principale isoforme de PI3K capable de réguler l'autophagie, l'implication de l’isoforme alpha des PI3K de classe II vient juste d’être caractérisée. De façon originale, la PI3KCIIalpha a également été identifiée comme un régulateur majeur de la biogenèse du CP via la synthèse de PI(3)P dans les fibroblastes embryonnaires et dans les cellules épithéliales rénales. Ainsi, l’ensemble de ces données nous ont amené à étudier la PI3KCIIα au niveau de l'interaction entre le CP et l’autophagie dans les CE. Mon travail a particulièrement mis à jour le rôle central de cette enzyme dans le maintien d’une signalisation protectrice essentielle pour garantir la fonction endothéliale. Mon projet de thèse propose d’identifier les mécanismes moléculaires contrôlant l'interaction entre le CP et l’autophagie in vitro dans les HUVEC et le rôle de la PI3KCIIα dans un contexte de FC in vivo dans des souris ApoE-/- capables de développer spontanément des plaques d’athérome. Mes résultats indiquent que la délétion de la PI3KCIIα abolit la biogénèse du CP et réduit le flux autophagique dans les HUVEC. En utilisant un modèle de souris athéromateuses invalidé pour la PI3KCIIα (ApoE-/- PI3KCIIα+/-), mon travail montre que l'absence de l’interaction entre le CP et l’autophagie in vivo pourrait participer à la progression des plaques d'athérome dans les régions vasculaires où les FC sont faibles. Enfin, nos résultats démontrent qu’en absence de la PI3KCIIα et de l'interaction entre le CP et l’autophagie, les CE de ces zones pro-athérogènes ne sont plus capables de réguler leur morphologie, suggérant que ces cellules perdent leur capacité d’adaptation aux faibles FC. En étudiant l’interaction entre l’autophagie et le CP dans les CE, mon projet de thèse permettra une meilleure compréhension des fonctions biologiques contrôlées par les FC dans ces cellules et offrira de nouvelles perspectives dans l’identification de mécanismes moléculaires originaux impliqués dans les premières étapes du développement de la plaque d'athérome. / Endothelial cells (EC) are highly responsive to changes in hemodynamic shear stress (SS) that drags the vessel luminal surface. Altering the mechanisms that detect SS on EC could compromise its integrity leading to the initiation of endothelial dysfunction and the development of atherosclerosis, the underlying cause of coronary artery disease (CAD). In arterial tree, atherosclerosis develops in a pattern that correlates with low shear stress (SS) localized with branches and curvatures where EC present an “atheroprone” phenotype. In this context, my PhD project proposes to identify novel mechanism in atheroprone territories that could delay atherogenic response induced by low SS. Very interestingly, primary cilium (PC) that protrudes from EC surface was shown to integrate these low SS forces and relay protective signaling pathways in order to counteract EC dysfunction. Thus, we hypothesized that blocking PC assembly and/or functions could participate to the acceleration of atheroma plaque progression. Recent findings links PC with autophagy as an important crosstalk in response to low SS. Among the signaling module involved in autophagy, phosphoinositide 3-kinases (PI3K) which are key enzymes involved in 3-phosphoinositides (3-PI) production, could be of major interest. Indeed, a critical 3-PI signaling involved in the nucleation of autophagic vesicle is PI(3)P, a product of class II and class III PI3K. Although the class III PI3K VPS34 is largely described as a master regulator of autophagy, the implication of class II PI3K is less characterized. Meanwhile, PI3KCII was also clearly identified in embryonic fibroblast and renal epithelial cell as a regulator of PC biogenesis via PI(3)P synthesis. Altogether, these data led us to investigate the role of PI3KCIIα as an essential protective signaling hub of EC through PC/autophagy interplay. My PhD project defines more specifically the molecular mechanisms controlling PC/autophagy interplay in vitro in HUVEC and the role of PI3KCIIα in fluid flow context in vivo in ApoE-/- atherosclerotic animal model. My results indicate that deletion of PI3KCIIα abrogated PC biogenesis and decreased autophagic flux in HUVEC. Using a mice model deleted for PI3KCIIα prone to atherosclerosis (ApoE-/-PI3KCII+/-), my work reveals that absence of PC/autophagy interplay in vivo could participate to atheroma plaques progression in low SS parts of the arterial tree. Finally, our data support the idea that EC of atheroprone areas were not able to regulate their morphology in absence of PI3KCIIα contributing to a defect in adaptation to low SS in absence of PC/autophagy interplay. By connecting autophagy and PC, my PhD project improve our understanding of the biological functions of EC controlled by SS and open new advances in the comprehension of molecular mechanisms involved in the first steps of atheroma plaque development.

La survie des êtres vivants repose sur leur capacité d'adaptation à leur environnement et au maintien de l'homéostasie cellulaire. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressée à deux de ces aspects : d'abord à la réponse immunitaire innée et inflammatoire par l'étude des voies associées aux facteurs de transcription NF-kB et ensuite à l'autophagie, qui consiste en la capacité d'une cellule à dégrader certains composants cellulaires ou des pathogènes intracellulaires. La rapidité d'activation/inactivation de ces processus cellulaires est permise par des modifications post-traductionnelles de certains acteurs parmi lesquelles l'ubiquitination des protéines, qui consiste en la liaison covalente de mono- ou polymères d'ubiquitines sur des protéines, et qui apparaît désormais comme un mécanisme majeur. Dans ce contexte, mes travaux ont consisté d'une part, en la mise en évidence de la fonction de la déubiquitinase USP36 dans la régulation de la voie immunitaire NF-B associée au récepteur 1 au TNFa (TNF-R1) en cellules humaines en culture. J'ai montré par des approches de biologie cellulaire et de biochimie qu'USP36 est un régulateur négatif spécifique de cette voie et est constitutivement associée au récepteur, contribuant ainsi à la régulation de l'ubiquitination de RIP1, un composant essentiel de la voie du TNF-R1. De cette étude, nous avons conclu qu'USP36 est un acteur clé de la voie du TNF-R1 permettant la répression de la voie en absence d'activation et favorisant un retour à l'état stationnaire en réponse à une stimulation au TNFa. D'autre part, mes travaux ont consisté en la réalisation d'un crible génétique in vivo chez la Drosophile pour l'identification de déubiquitinases impliquées dans la régulation de l'autophagie. J'ai identifié UBPY et USP12 dont la perte de fonction affecte à la fois la progression de l'autophagie et de l'endocytose. A partir de l'étude de ces enzymes, nous avons pu établir qu'une voie endocytaire intacte est requise pour le bon fonctionnement de l'autophagie. / The survival of living organisms is based on their ability to adapt to their environment and to maintain their cellular integrity. During my PhD, I was interested in two of these aspects: first, the innate immunity and inflammatory response through the study of the NF-kB-associated pathways, and then in autophagy, consisting in the ability of a cell to degrade some cellular components or intracellular pathogens. The rapid activation/inactivation of these cellular processes is permitted by the post-translational modifications of some components. Among these changes, protein ubiquitination, consisting in the covalent binding of ubiquitin mono- or polymers on target proteins, appears to be an essential mechanism. In this context, my work consisted on one hand, in showing the function of the deubiquitinating enzyme USP36 in the regulation of the immune pathway depending on the TNFa-associated receptor 1 (TNF -R1) pathway in cultured human cells. Using cellular and biochemical approaches, I showed that USP36 is a specific negative regulator of this pathway, constitutively associated with the receptor and which contributes to the regulation of the ubiquitination status of RIP1, which plays a major role in signal transduction. From this study, we conclude that USP36 is a key component of the TNF-R1 pathway, allowing for the repression of this pathway without stimulation and promoting the return to the steady-state after TNFa; treatment. On the other hand, I performed a genetic screen in vivo in Drosophila for the identification of deubiquitinating enzymes involved in regulating autophagy. I identified UBPY and USP12, whose loss-of-function affects both progression of autophagy and endocytosis. Further investigations allowed us to establish that an intact endocytic pathway is required for productive autophagy.

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative, avec une pathogenèse inconnue. Des études récentes suggèrent que l'activation du facteur de transcription du récepteur activateur de la prolifération des peroxysomes (PPAR) gamma est une cible thérapeutique pour ce maladie. Les agonistes du PPARγ inhibent l'inflammation et réduisent la synthèse des produits de dégradation du cartilage in vitro et in vivo. Cependant, des études utilisant des agonistes du PPARγ n’élucident pas les effets exacts médiés par ce gène complexe. En effet, certains de ces agonistes ont la capacité de régulariser d'autres voies de signalisation indépendantes de PPARγ, ainsi entraînant des effets secondaires graves. Afin d'obtenir une efficacité thérapeutique avec potentiellement moins de problèmes de sécurité, il est donc essentiel d'élucider, in vivo, le rôle exact de PPARγ dans la physiopathologie OA. Mon projet de thèse permettra de déterminer, pour la première fois, le rôle spécifique de PPARγ in vivo dans la physiopathologie OA. Les souris utilisées pour l’étude avaient une délétion conditionnelle du gène PPARγ dans le cartilage. Ces dernières ont été générées en employant le système LoxP/Cre. Pour tester cette hypothèse, j'ai généré deux types de souris avec une délétion au PPARγ, (a) une suppression du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage germinale pour l'étude de l'arthrose liée au développement et à l'âge et (b) la suppression inductible du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage chez la souris adulte pour les études OA. L’étude précédente dans notre laboratoire, utilisant ces souris ayant une délétion au gène PPARγ germinales, montre que ces souris présentent des anomalies du développement du cartilage. J'ai également exploré si ces souris qui présentent des défauts précoces du développement ont toutes les modifications phénotypiques dans le cartilage au cours du vieillissement. Mes résultats ont montré que les souris adultes, ayant une délétion au gène PPARγ, ont présenter un phénotype de l'arthrose spontanée associée à une dégradation du cartilage, l’hypocellularité, la fibrose synoviale. Cette étude a montré que PPARγ est un régulateur essentiel pour le cartilage, et c’est le manque (l’absence) de ce dernier qui conduit à un phénotype de l'arthrose spontanée accélérée (American Journal of Pathologie). A partir de ce but de l'étude, on n’a pas pu vérifier si ces souris présentaient l’OA spontanée en raison des défauts de développement ou à la suite de la délétion du gène PPARγ. Pour contourner les défauts de développement, j'ai généré des souris ayant une délétion du gène PPARγ spécifiquement dans le cartilage inductible avec le système Col2rTACre. Ces souris ont été soumises à modèle de la chirurgie OA (DMM: déstabilisation du ménisque médial) et les résultats révèlent que les souris PPARγ KO ont une dégradation accélérée du cartilage, une hypocellularité, une fibrose synoviale et une augmentation de l'expression des marqueurs cataboliques et des marqueurs inflammatoire. La perte de PPAR dans le cartilage articulaire est un évènement critique qui initie la dégradation de cartilage dans OA. Les études récentes suggèrent que le procès d’autophagie, une forme de survie cellulaire programmée, est altéré pendant l’OA et peut contribuer vers une protection diminuée des cellules, résultant la dégradation du cartilage. J’ai donc exploré le rôle de PPARγ dans la protection des cellules en déterminant l’effet de manque de PPARγ dans le cartilage par l’expression de mTOR (régulateur négatif principal d’autophagie) et les gènes d’autophagie durant OA. Mes résultats ont montré que les souris KO PPARγ présentent également une augmentation sur l'expression de mTOR et une diminution sur l’expression des marqueurs autophagiques en comparaison avec les chondrocytes articulaires isolés des souris contrôles OA. J'ai suggéré l'hypothèse que PPARγ contrôle la régulation de la signalisation de mTOR/autophagie, et finalement la mort des chondrocytes et l’expression des facteurs cataboliques et les facteurs inflammatoire. Pour tester cette hypothèse, j’ai fait la transfection des chondrocytes arthrosiques PPARγ-KO avec le vecteur d’expression de PPARγ pour déterminer si la restauration de l'expression de PPARγ peut sauver le phénotype des cellules PPARγ-KO OA. J'ai observé que la restauration de l'expression de PPARγ dans les cellules PPARγ-KO en présence du vecteur d'expression PPARγ, a pu considérablement régulariser négativement l'expression de mTOR et mettre en règle positivement l'expression des gènes autophagiques ainsi que le sauvetage significative de l'expression du collagène de type II et l’aggrecan et de baisser de manière significative l'expression de marqueurs cataboliques critiques et des marqueurs inflammatoires. Pour prouver que l’augmentation de la signalisation de mTOR et la diminution de l'autophagie est responsable du phénotype OA accélérée observée dans les souris PPARγ KO in vivo, j'ai généré les souris doubles KO PPARγ- mTOR inductible spécifique du cartilage en utilisant le système Col2 - rtTA -Cre et soumis ces souris à DMM modèle de l'arthrose. Mes résultants démontrent que les souris avec PPARγ- mTOR doubles KO ont été significativement protégés contre les OA DMM induites associées à une protection significative contre la destruction du cartilage, la perte de protéoglycanes et la perte de chondro-cellularité par rapport aux souris témoins. Considérant que mTOR est un répresseur majeur de l'autophagie, j'ai trouvé que l'expression de deux marqueurs de l'autophagie critiques (ULK1 et LC3B) a été significativement plus élevée dans les chondrocytes extraits les souris doubles KO PPARγ-mTOR par rapport aux souris témoins. En plus, les études de sauvetage in vitro en utilisant le vecteur d'expression PPAR et les études in vivo utilisant les souris doubles KO PPARγ- mTOR montrent que PPARγ est impliqué dans la régulation de la protéine signalant de mTOR/autophagie dans le cartilage articulaire. Ces résultats contournent PPARγ et sa signalisation en aval de mTOR/autophagie en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement de l'arthrose. / Osteoarthritis (OA) is an age related degenerative joint disease with unknown pathogenesis. Recent studies suggest that the activation of the transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) is a therapeutic target for OA. Agonists of PPARγ inhibit inflammation and reduce the synthesis of cartilage degradation products both in vitro and in vivo. However, studies using agonists of PPARγ do not elucidate the exact effects mediated by this complex gene. Indeed, some of these agonists have the ability to regulate, in vivo, various other signaling pathways independent of PPARγ, resulting in serious side effects. It is therefore vital, in order to achieve therapeutic efficacy with potentially less safety concerns, to elucidate the exact in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology. Thus, the aim of my PhD project was to determine the specific in vivo role of PPARγ in OA pathophysiology using cartilage-specific PPARγ knockout (KO) mice and subjecting these mice to surgical model of OA. I generated two separate PPARγ KO mice harboring a (a) constitutive cartilage-specific germ-line deletion of PPARγ gene for developmental and age-related OA study and (b) inducible cartilage-specific deletion of PPARγ in adult mouse specifically for OA studies using LoxP Cre system. Previous study in my laboratory using germ-line PPARγ KO mice shows that these mice exhibit cartilage developmental defects. I further explored if these mice which exhibit early developmental defects have any phenotypic changes in the articular cartilage during ageing. My results showed that adult PPARγ KO mice exhibited a spontaneous OA phenotype associated with enhanced cartilage degradation, hypocellularity, synovial fibrosis, and increased expression of catabolic and inflammatory factors. This study showed that PPARγ is a critical regulator of cartilage health, the lack of which leads to an accelerated spontaneous OA phenotype (Vasheghani et al, 2013; American Journal of Pathology). From this aim of the study, I could not ascertain if cartilage-specific germline PPARγ KO mice exhibited spontaneous OA because of developmental defects or as a result of PPARγ deficiency. To bypass the developmental defects, I then generated inducible cartilage-specific PPARγ KO mice using Col2rTACre system and subjected these mice to destabilization of medial meniscus (DMM) model of OA surgery. My results revealed that PPARγ KO mice showed accelerated cartilage degradation, hypo-cellularity, synovial fibrosis and increased expression of catabolic and inflammatory factors during OA. Loss of chondrocyte cellularity within the articular cartilage is one of the critical events that initiate the degradation of the cartilage during OA. Recent studies suggest that the process of autophagy, a form of programmed cell survival, is impaired during OA and may contribute towards decreased chondro-protection resulting in cartilage degradation. Thus, I further explored the role of PPARγ in chondro-protection by determining the effect of PPARγ deficiency in the cartilage on the expression of mTOR (master negative regulator of autophagy) and autophagy genes during OA. My results revealed that PPARγ-deficient chondrocytes exhibit significantly enhanced expression of mTOR and decreased expression of genes that initiate autophagy process compared to chondrocytes extracted from control OA mice. I then hypothesized that PPARγ controls mTOR/autophagy signaling and ultimately the fate of chondrocytes and the expression of catabolic and inflammatory factors in the articular cartilage. To test this, I transfected PPARγ KO OA chondrocytes with PPARγ expression vector to determine if restoration of PPARγ expression can rescue the phenotype of PPARγ KO OA cells. I observed that restoration of PPARγ expression in PPARγ KO cells significantly down-regulated the expression of mTOR and up-regulate the expression of autophagy genes along with significant rescue in the expression of collagen type II and aggrecan and significant down-regulation in the expression of critical catabolic and inflammatory markers. To validate our in vitro finding that enhanced mTOR signalling and resultant decrease in autophagy is responsible for accelerated OA phenotype observed in PPARγ KO mice, I generated inducible cartilage-specific PPARγ-mTOR double KO mice and subjected these mice to DMM model of OA. My results clearly demonstrate that PPARγ-mTOR double KO mice exhibit significant protection against DMM-induced OA associated with significant protection from cartilage destruction, proteoglycan loss and loss of chondro-cellularity compared with control mice. Since mTOR is a major repressor of autophagy, I found that the expression of two critical autophagy markers (ULK1 and LC3B) was significantly elevated in PPARγ-mTOR double KO mice compared to control mice. My in vitro rescue studies using PPARγ expression vector and in vivo studies using PPARγ- mTOR double KO mice clearly show that PPARγ is involved in the regulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. Therefore, deficiency of PPARγ upregulates mTOR signalling resulting in the suppression of autophagy and decreased chondroprotection and increased catabolic activity leading to accelerated severe OA. This study for the first time provides direct evidence on the role of PPARγ in chondroprotection by modulation of mTOR/autophagy signalling in the articular cartilage. These findings outline PPARγ and its downstream signalling by mTOR/autophagy as potential therapeutic targets for the treatment of OA.

Dues à leur importance croissante dans la dégénérescence musculaire, les mitochondries sont de plus en plus étudiées en relation à diverses myopathies. Leurs mécanismes de contrôle de qualité sont reconnus pour leur rôle important dans la santé mitochondrial. Dans cette étude, nous tentons de déterminer si le déficit de mitophagie chez les souris déficiente du gène Parkin causera une exacerbation des dysfonctions mitochondriales normalement induite par la doxorubicine. Nous avons analysé l’impact de l’ablation de Parkin en réponse à un traitement à la doxorubicine au niveau du fonctionnement cardiaque, des fonctions mitochondriales et de l’enzymologie mitochondriale. Nos résultats démontrent qu’à l’état basal, l’absence de Parkin n’induit pas de pathologie cardiaque mais est associé à des dysfonctions mitochondriales multiples. La doxorubicine induit des dysfonctions respiratoires, du stress oxydant mitochondrial et une susceptibilité à l’ouverture du pore de transition de perméabilité (PTP). Finalement, contrairement à notre hypothèse, l’absence de Parkin n’accentue pas les dysfonctions mitochondriales induites par la doxorubicine et semble même exercer un effet protecteur. / Mitochondria are becoming the focus of many studies because of their increasingly important role in cellular damage and related myopathies. Their endogenous quality control mechanisms are recognized for their crucial role in mitochondrial health. In our study, we attempted to determine if the deficit of mitophagy in Parkin deficient mice would cause an exacerbation of mitochondrial dysfunctions usually induced by doxorubicin. We have analyzed the impact of the ablation of Parkin in response to treatment with doxorubicin at the level of cardiac functions, mitochondrial functions as well as mitochondrial enzymology. Our results demonstrated that at baseline, the absence of Parkin didn’t induce cardiac pathologies but was associated with many mitochondrial dysfunctions. Doxorubicin induced respiratory dysfunctions, mitochondrial oxidative stress as well as greater susceptibility to permeability transition pore (PTP) opening. Finally, contrary to our hypothesis, the absence of Parkin, didn’t exacerbate mitochondrial dysfunctions induced by doxorubicin and seemed to have a protective effect.

L'arthrose est la maladie musculo-squelettique la plus commune dans le monde. Elle est l'une des principales causes de douleur et d’incapacité chez les adultes, et elle représente un fardeau considérable sur le système de soins de santé. L'arthrose est une maladie de l’articulation entière, impliquant non seulement le cartilage articulaire, mais aussi la synoviale, les ligaments et l’os sous-chondral. L’arthrose est caractérisée par la dégénérescence progressive du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, le remodelage de l'os sous-chondral, la détérioration des tendons et des ligaments et l'inflammation de la membrane synoviale. Les traitements actuels aident seulement à soulager les symptômes précoces de la maladie, c’est pour cette raison que l'arthrose est caractérisée par une progression presque inévitable vers la phase terminale de la maladie. La pathogénie exacte de l'arthrose est encore inconnue, mais on sait que l'événement clé est la dégradation du cartilage articulaire. Le cartilage articulaire est composé uniquement des chondrocytes; les cellules responsables de la synthèse de la matrice extracellulaire et du maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Les chondrocytes maintiennent la matrice du cartilage en remplaçant les macromolécules dégradées et en répondant aux lésions du cartilage et aux dégénérescences focales en augmentant l'activité de synthèse locale. Les chondrocytes ont un taux faible de renouvellement, c’est pour cette raison qu’ils utilisent des mécanismes endogènes tels que l'autophagie (un processus de survie cellulaire et d’adaptation) pour enlever les organelles et les macromolécules endommagés et pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. i L'autophagie est une voie de dégradation lysosomale qui est essentielle pour la survie, la différenciation, le développement et l’homéostasie. Elle régule la maturation et favorise la survie des chondrocytes matures sous le stress et des conditions hypoxiques. Des études effectuées par nous et d'autres ont montré qu’un dérèglement de l’autophagie est associé à une diminution de la chondroprotection, à l'augmentation de la mort cellulaire et à la dégénérescence du cartilage articulaire. Carames et al ont montré que l'autophagie est constitutivement exprimée dans le cartilage articulaire humain normal. Toutefois, l'expression des inducteurs principaux de l'autophagie est réduite dans le vieux cartilage. Nos études précédentes ont également identifié des principaux gènes de l’autophagie qui sont exprimés à des niveaux plus faibles dans le cartilage humain atteint de l'arthrose. Les mêmes résultats ont été montrés dans le cartilage articulaire provenant des modèles de l’arthrose expérimentaux chez la souris et le chien. Plus précisément, nous avons remarqué que l'expression d’Unc-51 like kinase-1 (ULK1) est faible dans cartilage humain atteint de l'arthrose et des modèles expérimentaux de l’arthrose. ULK1 est la sérine / thréonine protéine kinase et elle est l’inducteur principal de l’autophagie. La perte de l’expression de ULK1 se traduit par un niveau d’autophagie faible. Etant donné qu’une signalisation adéquate de l'autophagie est nécessaire pour maintenir la chondroprotection ainsi que l'homéostasie du cartilage articulaire, nous avons proposé l’hypothèse suivante : une expression adéquate de ULK1 est requise pour l’induction de l’autophagie dans le cartilage articulaire et une perte de cette expression se traduira par une diminution de la chondroprotection, et une augmentation de la mort des chondrocytes ce qui conduit à la dégénérescence du cartilage articulaire. Le rôle exact de ULK1 dans la pathogénie de l'arthrose est inconnue, j’ai alors créé pour la première fois, des souris KO ULK1spécifiquement dans le cartilage en utilisant la technologie Cre-Lox et j’ai ensuite soumis ces souris à la déstabilisation du ménisque médial (DMM), un modèle de l'arthrose de la souris pour élucider le rôle spécifique in vivo de ULK1 dans pathogenèse de l'arthrose. Mes résultats montrent que ULK1 est essentielle pour le maintien de l'homéostasie du cartilage articulaire. Plus précisément, je montre que la perte de ULK1 dans le cartilage articulaire a causé un phénotype de l’arthrose accéléré, associé à la dégénérescence accélérée du cartilage, l’augmentation de la mort cellulaire des chondrocytes, et l’augmentation de l'expression des facteurs cataboliques. En utilisant des chondrocytes provenant des patients atteints de l’arthrose et qui ont été transfectées avec le plasmide d'expression ULK1, je montre qu’ULK1 est capable de réduire l’expression de la protéine mTOR (principal régulateur négatif de l’autophagie) et de diminuer l’expression des facteurs cataboliques comme MMP-13 et ADAMTS-5 et COX-2. Mes résultats jusqu'à présent indiquent que ULK1 est une cible thérapeutique potentielle pour maintenir l'homéostasie du cartilage articulaire. / Osteoarthritis (OA) is the most common musculoskeletal disease worldwide. It is one of the leading causes of pain and disability among adults, and represents a considerable burden on the healthcare system. OA is a disease of the entire joint, involving not only the articular cartilage but also the synovium, ligaments and subchondral bone. It is characterized by the progressive degeneration of the articular cartilage, osteophyte formation, remodelling of the subchondral bone, deterioration of tendons and ligaments and various degrees of inflammation of the synovium. While current therapies and management strategies can help alleviate symptoms early in the disease process, OA is characterized by almost inevitable progression towards end-stage disease. The exact pathogenesis of OA is largely unknown but the key event in OA is the degradation of the articular cartilage. The articular cartilage is only composed of chondrocytes; cells responsible for the synthesis of the extracellular matrix (ECM) and maintenance of articular cartilage homeostasis. Chondrocytes maintain the articular cartilage matrix by replacing degraded macromolecules and respond to focal cartilage injury or degeneration by increasing local synthesis activity. Since chondrocytes exhibit low levels of turnover, they rely on endogenous mechanisms such as autophagy (a cell survival and adaptation process) to remove damaged organelles and macromolecules in order to maintain articular cartilage homeostasis. Autophagy is a lysosomal degradation pathway that is essential for survival, differentiation, development and homeostasis. It regulates maturation and promotes survival of terminally differentiated chondrocytes under stress and hypoxic conditions. Studies by us and others have shown that compromised autophagy is associated with decreased chondroprotection, increased cell death and articular cartilage degeneration. Carames et al showed that autophagy is constitutively expressed in normal human articular cartilage. However, expression of key autophagy inducers is reduced in ageing cartilage. Our previous studies have also identified a panel of key autophagy genes that are expressed in low levels in human OA cartilage as well as in the articular cartilage from mouse and dog models of experimental OA. Specifically, we identified that expression of unc-51 like kinase-1 (ULK1) is suppressed in human OA cartilage and experimental OA models. ULK1 is a serine/threonine protein kinase and is the most upstream autophagy inducer. Loss of ULK1 results in disruption of autophagy induction. Since adequate autophagy signaling is required for maintaining chondroprotection as well as articular cartilage homeostasis, we hypothesized that ULK1 is required for autophagy induction in the articular cartilage and loss of it will result in decreased chondroprotection and enhanced chondrocyte death leading to the degeneration of articular cartilage. Since the exact role of ULK1 in pathogenesis of OA is unknown, I created for the first time, an inducible cartilage- specific ULK1 knockout (KO) mice using Cre-Lox technology and subjected these mice to the destabilization of the medial meniscus (DMM) mouse OA model to specifically elucidate the specific in vivo role of ULK1 in OA pathogenesis. My results show that ULK1 is essential for maintaining articular cartilage homeostasis. Specifically I show that loss of ULK1 in the articular cartilage results in an accelerated OA phenotype; which is associated with accelerated cartilage degeneration, enhanced chondrocyte cell death, increased expression of catabolic MMP-13. Using human OA chondrocytes transfected with ULK1 expression plasmid I show that ULK1 is able to reduce the expression of mTOR (major negative regulator of autophagy) and decrease the expression of OA catabolic factors including MMP-13, ADAMTS-5 and COX-2. My results so far suggest that ULK-1 is a potential therapeutic target to maintain articular cartilage homeostasis.