Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica / Made available in DSpace on 2013-03-04T18:34:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 308803.pdf: 1883293 bytes, checksum: 58d4895d549f873309b93e600132bb86 (MD5) / Zinco na sua forma ionica livre e mantido em concentracoes muito baixas nas celulas de mamiferos. Em algumas vesiculas sinapticas de neuronios glutamatergicos, porem, ele pode ser encontrado em altas concentracoes, aonde atua como um modulador ionico. Em situacoes patologicas, porem, o zinco livre pode se acumular no citosol nas celulas neurais provocando diversos efeitos toxicos, tais como a inibicao de enzimas. O zinco e capaz de inibir as enzimas antioxidantes gluationa redutase (GR) e tioredoxina redutase (TrxR), duas enzimas envolvidas na defesa celular contra oxidantes. Essa inibicao, portanto, pode resultar em um decrescimo na degradacao de peroxidos, levado a uma maior vulnerabilidade a danos oxidativos. O presente trabalho tem como objetivo investigar a relacao da inibicao das enzimas antioxidantes GR e TrxR, pela exposicao de celulas neurais ao zinco, com a susceptibilidade destas celulas quando desafiadas com agentes oxidativos. Celulas derivadas de neuroblastoma (N2a), astroglioma (C6) e fatias de hipocampo de ratos adultos foram pre-incubadas com 100 uM de ZnCl2 por 30 min, e em seguida expostas por uma hora a 100 uM de H2O2 ou 100 uM de peroxido de cumeno. O tratamento com ZnCl2 provocou uma queda na atividade da GR nos 3 modelos, sendo que as celulas C6 foram mais afetadas (77% de inibicao comparado com 30-35 % nos outros modelos). A enzima TrxR tambem foi inibida em 30% nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a e fatias de hipocampo, esse efeito nao foi observado. O tratamento com ZnCl2 diminuiu a taxa de consumo de H2O2 e CHP nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a somente o consumo de H2O2 foi afetado. Em celulas N2a, tanto o tratamento com ZnCl2 como com H2O2 provocaram uma diminuicao na viabilidade celular, porem a combinacao de ambos nao aumentou esta toxicidade. As celulas C6 foram resistentes aos efeitos toxicos dos peroxidos e ZnCl2, porem, o pre-tratamento com ZnCl2 aumentou a susceptibilidade dessas celulas a toxicidade de ambos os peroxidos, diminuindo a viabilidade, aumentando a permeabilidade celular e o dano ao DNA. O ZnCl2 nao aumentou a vulnerabilidade das fatias de hipocampo a toxicidade dos peroxidos, porem, quando estas foram expostas a 1 mM de H2O2, em combinacao com ZnCl2, houve queda na viabilidade celular na mesma proporcao causada pelo pre-tratamento com BCNU, um inibidor da GR. Neste caso, supoe-se que esta queda na viabilidade e devido a inibicao da GR. Em conclusao, os dados apresentados demonstram que, apesar da alta susceptibilidade das células neuronais (N2a) ao ZnCl2 e aos peróxidos, a inibição da GR não aumentou esta sensibilidade. Por outro lado, as células derivadas de astrócitos (C6) foram mais resistentes ao ZnCl2 e aos peróxidos, porém a inibição da GR e da TrxR pelo tratamento com zinco aumentaram a citotoxicidade de ambos os peróxidos. Nas células C6, o sinergismo entre a inibição das enzimas antioxidantes e a toxicidade aos peróxidos, provavelmente se deve a menor capacidade em degradar peróxidos. Desta forma, nosso dados indicam que a inibição de enzimas antioxidantes GR e TrxR é um fator importante associado a sua toxicidade em células neurais. / Zinc in its free, ionic form is kept in very low concentrations in mammalian cells. In some synaptic vesicles in glutamatergic neurons, however, it can be found in high concentrations where it acts as an ionic modulator. In pathological situations, however, this free zinc can accumulate in the cytosol of neural cells producing a myriad of toxic effects, such as the inhibition of enzymes. Zinc can inhibit glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), both antioxidant enzymes that are crucial for cell protection against oxidants. Therefore, a disturbance in the activity of these enzymes hinder peroxide degradation and increases vulnerability to oxidative damage. The present work aims to investigate the relation between the inhibition of these enzymes by zinc and the susceptibility of neuronal and astrocytic cells, as well as hippocampal slices, to H2O2 and cumene peroxide (CHP). Cells derived from neuroblastoma (N2a), astroglyoma (C6) and hippocampal slices were pre-incubated with 100 uM of ZnCl2 for 30 min, and then exposed to 100 uM of H2O2 or CHP for 1h. Treatment with ZnCl2 decreased GR activity in the three models, but this effect was higher in C6 cells (70 % of inhibition in comparison to 30-35 % of inhibition in the other models). TrxR was inhibited by 30 % in C6 cells, while in N2a and hippocampal slices this effect was not observed. Treatment with Zn decreased H2O2 and CHP consumption rate in C6 cells, but only H2O2 consumption rate was reduced in N2a cells. Both ZnCl2 and H2O2 treatment induced a decrease in cellular viability in N2a cells, but their combination did not enhance this toxicity. C6 cells were more resistant to toxic effects of ZnCl2 and peroxides, however, the preincubation with ZnCl2 increased cell vulnerability to both peroxides, decreasing cell viability, increasing membrane permeability and DNA damage. ZnCl2 did not increased vulnerability of hippocampal slices to toxic effects of peroxides, but when these cells were exposed to 1 mM of H2O2 after the ZnCl2 pre-treatment, a decrease in cell viability was observed in the same proportion as the effect caused by the pretreatment with BCNU, an inhibitor of GR, indicating that this effect is likely due to GR inhibition. In conclusion, this data demonstrate that despite the high susceptibility of N2a cells to ZnCl2 and H2O2, the zincinduced GR inhibition did not increased this vulnerability. In contrast, C6 cells were more resistant to ZnCl2 and peroxides, but the inhibition of GR and TrxR by zinc treatment highly increased the citotoxicity of both peroxides. Hippocampal slices were more resistant than the cell cultures to the toxic effects of the treatments, but when exposed to higher doses of H2O2, Zn was able to sensitize the cells to peroxide toxicity. In C6 cells, the synergism between the inhibition of enzymes and peroxide toxicity probably is related to the decreased capacity to metabolize peroxides. Therefore our data suggest that the inhibition of the antioxidant enzymes GR and TrxR by zinc is an important factor associated with its toxicity in neural cells.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012. / Made available in DSpace on 2013-07-16T04:37:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / As leveduras Saccharomyces são amplamente utilizadas na produção de álcool combustível graças à sua capacidade de adaptação ao ambiente industrial, e à habilidade de fermentar açúcares eficientemente. A sacarose, açúcar majoritário nos mostos utilizados no Brasil, é um dissacarídeo hidrolisado pela enzima invertase, que é codificada pelos genes SUC e secretada pelas leveduras. Dessa forma, obtêm-se, no meio, glicose e frutose, monossacarídeos que são transportados para o interior da célula e fermentados até etanol e CO2. No entanto, recentemente foi descrita uma outra via para a eficiente fermentação de sacarose envolvendo o transporte ativo do açúcar para o interior da célula, mediado pela permease AGT1, e sua hidrolise pela invertase intracelular. No presente trabalho uma linhagem industrial da levedura S. cerevisiae, que tende a dominar as dornas de fermentação, foi modificada utilizando técnicas de engenharia genômica visando a fermentação da sacarose através da sua captação direta. A estratégia envolveu sobre-expressar a invertase intracelular (iSUC2) e utilizar o gene da permease AGT1 (flanqueado por sequências que permitem sua sobre-expressão) para deletar a outra cópia do gene SUC2 presente no genoma diploide da levedura, impedindo portanto sua hidrólise extracelular. Embora as modificações genéticas tenham sido realizadas com sucesso, os resultados indicam que na linhagem industrial modificada (iSUC2 + suc2::AGT1) existem outros genes SUC que expressam a invertase extracelular.<br> / Abstract : Saccharomyces yeasts are widely used in the production of fuel ethanol due to its capacity to adapt to the industrial environment, and the ability to ferment sugars efficiently. Sucrose, the major sugar in musts used in Brazil, is a disaccharide hydrolyzed by the enzyme invertase secreted by yeasts and encoded by the SUC genes. Thus, glucose and fructose are obtained and transported into the cell in order to be fermented into ethanol and CO2. However, another pathway for efficient sucrose fermentation was recently described involving the active transport of the sugar into the cell mediated by the AGT1 permease, and its hydrolysis by the intracellular invertase. In this work an industrial S. cerevisiae yeast strain, which tends to dominate the fermentation vats, was modified using genomic engineering techniques aiming the fermentation of sucrose by its direct uptake. The strategy involved over-expression of the intracellular invertase (iSUC2) and the use of the AGT1 permease gene (flanked by sequences that allow its over-expression) to delete the other copy of the SUC2 gene present in the diploid genome of yeasts, preventing its extracellular hydrolysis. Although the genetic modifications were performed successfully, the results indicate that in the modified industrial strain (iSUC2 + suc2::AGT1) there are other SUC genes that express the extracellular invertase.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-19T03:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T00:07:17Z : No. of bitstreams: 1 182934.pdf: 7268543 bytes, checksum: 82c54dff6fb099c9858b242474fee418 (MD5) / O ácido ascórbico (AA), quando presente em amostras biológicas, pode interferir nos ensaios laboratoriais modificando o diagnóstico clínico-laboratorial. Os objetivos desse estudo foram: i) avaliar o grau de interferência de várias doses de AA nos ensaios bioquímicos séricos e urinários que utilizam reações de óxido-redução, em amostras coletadas em diferentes períodos de tempo após a ingestão de vitamina C; ii) comparar o nível de interferência do AA em diferentes "kits" e tiras reativas para urinálise após a adição do AA; iii) verificar o tempo de oxidação do AA em amostras de soro necessário para diminuir o efeito interferente e; iv) estudar os possíveis mecanismos da interferência do AA em ensaios baseados no sistema de reação oxidase/peroxidase com 4-aminofenazona e compostos fenólicos (Trinder). Após a ingestão de 0,15 a 4 g/d de vitamina C por uma semana, os níveis séricos de AA elevaram-se significativamente provocando inibição até 12 e 24 h após a ingestão nas determinações séricas de bilirrubina total e ácido úrico, respectivamente (p<0,05). Colesterol total, glicose e creatinina não sofreram interferências, enquanto que os triglicerídeos apresentaram uma inibição 12 h após a ingestão de 4 g/d de vitamina C. Os níveis urinários de AA foram suficientemente elevados para provocar uma inibição significativa nas reações para a detecção de glicose e hemoglobina urinárias, inclusive em amostras coletadas após 48 h a ingestão. A adição ao soro de AA, em concentrações semelhantes àquelas encontradas após a suplementação vitamínica, causou interferências significativas nas reações para a determinação de ácido úrico, enquanto doses maiores de AA, encontradas após a administração endovenosa, também interferiram nas reações para triglicerídeos, colesterol, glicose e bilirrubina. A comparação dos níveis de interferência ex vivo e in vitro demonstraram que o AA parece interferir no metabolismo da bilirrubina, enquanto que para os demais analitos a interferência foi somente analítica. O AA adicionado em diferentes concentrações às amostras de urina também provocou inibição nas reações para a detecção de glicose, hemoglobina, nitrito, bilirrubina e, em menor extensão, para leucócitos. Em geral, o grau de interferência foi diretamente proporcional à concentração de AA e inversamente proporcional à quantidade de analito na amostra. As diferentes marcas de "kits" e tiras reativas estudadas não apresentaram diferenças importantes em relação ao efeito interferente do AA. Dependendo da concentração de AA, o mesmo continuou a interferir nas reações de Trinder, principalmente para ácido úrico, até 72 h após a adição do AA. Os resultados dos estudos in vitro demonstraram que o ácido de hidroascórbico não interferiu nas reações. A quantificação do AA nas amostras de soro demonstrou uma estabilidade elevada se comparada com a sua meia-vida em solução aquosa, sendo este o responsável pela prolongada interferência. O estudo do mecanismo de interferência demonstrou que o AA interfere nas reações de Trinder com 4-aminofenazona e compostos fenólicos através do consumo do peróxido de hidrogênio, responsável pela formação do cromógeno oxidado. O AA não interferiu, portanto, com os constituintes da reação nem tampouco na redução do cromógeno oxidado. Baseados nesses resultados, podemos concluir que mesmo pequenas doses de AA provocaram importantes interferências nos ensaios laboratoriais, dependendo do tempo em que as amostras foram coletadas após a ingestão. Assim, para evitar resultados falso-negativos sugerimos a suspensão da ingestão de altas doses de vitamina C (2-4g), 48 e 72 h antes das coletas de sangue e de urina, respectivamente. Devido à alta estabilidade do AA no soro, para evitar o efeito interferente é necessário esperar um tempo superior ao recomendado para a realização dos ensaios. Finalmente, baseado no mecanismo de interferência, podemos sugerir que substâncias redutoras do AA deveriam ser acrescentadas aos reagentes para aumentar a resistência contra o efeito interferente do AA, tendo em vista que a 4-aminofenazona e os compostos fenólicos não reagiram com o AA.

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-05. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:24:50Z : No. of bitstreams: 1 000859360.pdf: 1034814 bytes, checksum: c0a4def8be0c2f45d09cbd7c089d88da (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-28T13:37:51Z: 000859360.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-28T13:38:52Z : No. of bitstreams: 1 000859360.pdf: 1034815 bytes, checksum: 0e2a44e2cca5e564a6825b47d8322e41 (MD5) / O fipronil é um inseticida amplamente utilizado para controlar pragas nas plantações e em animais. Existem relatos de intoxicação devido à exposição de fipronil em mamíferos e o fígado é um alvo potencial. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos metabólitos do fipronil, fipronil dessulfinil e fipronil sulfona sobre a bioenergética, produção de espécies reativas de oxigênio e efluxo de cálcio em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. O fipronil dessulfinil (5 a 25 μM) inibiu o estado 3 da respiração em mitocôndrias energizadas com glutamato mais malato, substratos do complexo I da cadeia respiratória, e diminuiu o potencial de membrana mitocondrial, resultando em inibição da síntese de adenosina trifosfato. O metabólito dessulfinil também causou desacoplamento nas mitocôndrias energizadas com succinato e estimulou o efluxo de cálcio. O metabólito sulfona também atuou como inibidor e desacoplador mitocondrial e estimulou o efluxo de cálcio, porém em menores concentrações (0,5 a 5 μM). Os efeitos dos metabólitos do fipronil na bioenergética mitocondrial e homeostase do cálcio podem estar relacionados com os efeitos tóxicos do inseticida no fígado / Fipronil is an insecticide extensively used to control pests in crops and animals. There are relates of poisoning due to exposure of fipronil in mammals and the liver is a potential target. In this study, we evaluated the effects of metabolites of fipronil, fipronildesulfinyl and fipronilsulfone on the bioenergetics, reactive oxygen species production and calcium efflux from mitochondria isolated from rat liver. Desulfinyl (5 to 25 μM) inhibited state-3 respiration in mitochondria energized with glutamate plus malate, substrates of complex I of the respiratory chain, and decreased the mitochondrial membrane potential resulting in inhibition of. Synthesis. Desulfinyl also caused uncoupling in succinate-energized mitochondria and calcium efflux. The metabolitesulfone also acted as mitochondrial inhibitors and uncouplers and caused calcium efflux, but inlower concentrations (0.5 to 5 μM). These effects of metabolites of fipronil on mitochondrial bioenergetics and calcium homeostasis may be related to toxic effects of the insecticide in the liver

As acidúrias L-2-hidroxiglutárica (LHGA) e D-2-hidroxiglutárica (DHGA) são distúrbios neurometabólicos hereditários caracterizados por extenso e severo dano cerebral, ocasionando predominantemente convulsões, coma e atrofia cerebral. Na LHGA, as lesões cerebrais ocorrem principalmente no cerebelo enquanto a maior parte do cérebro é afetada na DHGA. Além disso, hipotonia, fraqueza e hipotrofia muscular, bem como cardiomiopatia têm sido observadas nos pacientes afetados por essas acidemias orgânicas, com maior freqüência na DHGA. Bioquimicamente, ocorre acúmulo tecidual dos ácidos L- 2-hidroxiglutárico (LGA) e D-2-hidróxiglutárico (DGA), respectivamente, na LHGA e na DHGA. Além disso, elevadas concentrações urinárias de lactato, 2-cetoglutarato e outros metabólitos do ciclo de Krebs têm sido descritas em pacientes acometidos por essas patologias, sugerindo uma disfunção mitocondrial. mitocondrial. Tendo em vista que a etiopatogenia da disfunção tecidual nesses pacientes é desconhecida, o presente trabalho investigou o efeito in vitro dos ácidos LGA e DGA sobre diversos parâmetros do metabolismo energético celular. Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos DGA e LGA sobre a utilização de glicose e produção de CO2 em homogeneizados e fatias de córtex cerebral. Verificamos que o DGA reduziu significativamente tanto o consumo de glicose quanto a produção de CO2 pelo córtex cerebral, enquanto o LGA não demonstrou efeito sobre esses parâmetros. Além disso, o DGA inibiu significativamente a atividade da citocromo c oxidase em homogeneizado de córtex cerebral de ratos (35-95%), de forma dose-dependente, sem alterar a atividade dos demais complexos da cadeia respiratória. A inibição verificada foi do tipo acompetitiva. Por outro lado, o LGA não alterou a atividade de nenhum dos complexos enzimático estudados. Posteriormente, avaliamos o efeito in vitro dos ácidos DGA e LGA sobre a atividade da creatina quinase (CK) em homogeneizado total e nas frações citosólica e mitocondrial de tecido cerebral, muscular esquelético e cardíaco de ratos. Os resultados mostraram que o DGA inibiu significativamente a atividade das isoformas mitocondrial e citosólica da CK em preparações de córtex cerebral, músculo esquelético de cardíaco. Por outro lado, tanto DGA quanto LGA inibiram seletivamente a isoforma mitocondrial em preparações de cerebelo. Estudos cinéticos mostraram um perfil não competitivo de inibição com relação à fosfocreatina para ambos os ácidos nos tecidos estudados. Além IV disso, observamos também que o efeito inibitório de ambos os ácidos foi totalmente revertido por glutationa reduzida, sugerindo uma modificação causada pelos metabólitos sobre os grupos sulfidrila, essenciais para a atividade da enzima. Nossos resultados sugerem que a inibição significativa causada pelo DGA sobre as atividades da citocromo c oxidase e da creatina quinase no córtex cerebral, assim como nos músculos cardíaco e esquelético poderiam explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da disfunção neurológica e anormalidades estruturais no sistema nervoso central, bem como a mitocondriopatia esquelética e a cardiomiopatia presente nos pacientes afetados por DHGA. Por outro lado, é possível que a inibição seletiva da creatina quinase mitocondrial provocada pelo LGA em cerebelo possa estar associada à degeneração cerebelar característica dos pacientes com LHGA.

Nucleotídeos extracelulares são envolvidos em diversos processos patofisiológicos no sistema nervoso central. Astrócitos são a maior fonte de nucleotídeos extracelulares da adenina no cérebro e também importantes alvos para as ações desses nucleotídeos via receptores purinérgicos P2. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ecto-nucleotidases, que incluem membros da família das ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase), ecto-5’-nucleotidase (ecto- 5’N) e ecto-adenosina deaminase (ADA). Culturas de astrócitos preparadas de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos foram capazes de rapidamente converter ATP extracelular a ADP, que foi então hidrolizado a AMP. Os nucleosídeos tri-fosfatados foram hidrolisados preferencialmente aos difosfatados em todas as estruturas cerebrais. A análise cinética sugere que varias ecto-nucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Análises preliminares de mRNA por PCR indicaram que astrócitos expressam múltiplos membros da família das NTPDases (NTPDase1 a NTPDase3 e NTPDase5/6). Por RT-PCR quantitativo (Real-time PCR), nós identificamos a NTPDase2 (CD39L1) como a NTPDase predominante expressa por astrócitos de hipocampo, córtex e cerebelo de ratos. Astrócitos do cerebelo apresentaram um padrão diferente para a hidrólise do AMP, com uma atividade específica 7 vezes maior, quando comparada com astrócitos de hipocampo e córtex. Uma maior expressão da ecto-5’N por RT-PCR foi identificada nessa estrutura. Não houve acúmulo de adenosina extracelular em todas as estruturas estudadas, indicando a presença de uma alta atividade ecto-adenosina deaminase em astrócitos. Dipiridamol aumentou significativamente os níveis de inosina no meio extracelular de astrócitos de hipocampo e córtex, mas não em astrócitos de cerebelo. Essas diferenças observadas podem indicar heterogeneidade funcional dos nucleotídeos no cérebro. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos como indicadoras da invasividade e agressividade dos gliomas malignos, nós avaliamos a degradação dos nucleotídeos extracelulares em cinco linhagens de gliomas diferentes e comparamos com astrócitos. Todas as linhagens de gliomas examinadas apresentaram baixas razões de hidrólise quando comparadas com astrócitos. Resultados preliminares sugerem que a falta de expressão da NTPDase1 e 2 possam ser responsáveis pela baixa hidrólise de ATP nas linhagens de gliomas. Considerando que o ATP é reconhecido como um fator mitogênico que induz a proliferação em células de gliomas, a substancial diminuição na hidrólise de ATP e ADP observadas em gliomas, sugere que alterações na via das ecto-nucleotidases pode representar um importante mecanismo associado com a transformação maligna desse tipo de tumor.

Orientador: Fábio Erminio Mingatto / Banca: Daniel Nicodemo / Banca: Sérgio Diniz Garcia / Resumo: O fipronil é um inseticida amplamente utilizado para controlar pragas nas plantações e em animais. Existem relatos de intoxicação devido à exposição de fipronil em mamíferos e o fígado é um alvo potencial. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos metabólitos do fipronil, fipronil dessulfinil e fipronil sulfona sobre a bioenergética, produção de espécies reativas de oxigênio e efluxo de cálcio em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. O fipronil dessulfinil (5 a 25 μM) inibiu o estado 3 da respiração em mitocôndrias energizadas com glutamato mais malato, substratos do complexo I da cadeia respiratória, e diminuiu o potencial de membrana mitocondrial, resultando em inibição da síntese de adenosina trifosfato. O metabólito dessulfinil também causou desacoplamento nas mitocôndrias energizadas com succinato e estimulou o efluxo de cálcio. O metabólito sulfona também atuou como inibidor e desacoplador mitocondrial e estimulou o efluxo de cálcio, porém em menores concentrações (0,5 a 5 μM). Os efeitos dos metabólitos do fipronil na bioenergética mitocondrial e homeostase do cálcio podem estar relacionados com os efeitos tóxicos do inseticida no fígado / Abstract: Fipronil is an insecticide extensively used to control pests in crops and animals. There are relates of poisoning due to exposure of fipronil in mammals and the liver is a potential target. In this study, we evaluated the effects of metabolites of fipronil, fipronildesulfinyl and fipronilsulfone on the bioenergetics, reactive oxygen species production and calcium efflux from mitochondria isolated from rat liver. Desulfinyl (5 to 25 μM) inhibited state-3 respiration in mitochondria energized with glutamate plus malate, substrates of complex I of the respiratory chain, and decreased the mitochondrial membrane potential resulting in inhibition of. Synthesis. Desulfinyl also caused uncoupling in succinate-energized mitochondria and calcium efflux. The metabolitesulfone also acted as mitochondrial inhibitors and uncouplers and caused calcium efflux, but inlower concentrations (0.5 to 5 μM). These effects of metabolites of fipronil on mitochondrial bioenergetics and calcium homeostasis may be related to toxic effects of the insecticide in the liver / Mestre

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Marsdenia megalantha (Apocynaceae) à uma espÃcie encontrada sobre rochas granÃticas no interior do Nordeste brasileiro. Ao sofrer injÃrias, diferentes partes da planta exudam lÃtex que, rapidamente, coagula, prevenindo perda de Ãgua e penetraÃÃo de patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades antifÃngicas do lÃtex M. megalantha e identificar proteÃnas relacionadas com o mecanismo de defesa das plantas contra fitopatÃgenos. Para isso, indivÃduos dessa espÃcie foram coletados no municÃpio de QuixadÃ-CE e o lÃtex coletado em alÃquotas de tampÃo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M (10:1, v/v), a fim de evitar sua coagulaÃÃo. Esse material foi centrifugado a 10.000 x g, 10 min, 25 ÂC, dialisado exaustivamente contra Ãgua destilada e, novamente, centrifugado sob as mesmas condiÃÃes. O sobrenadante, denominado de proteÃnas totais do lÃtex, apÃs diÃlise contra tampÃo acetato de sÃdio 0,05 M, pH 5,2, foi submetido à cromatografia em coluna de Resource-Q, equilibrada com esse mesmo tampÃo. Duas fraÃÃes protÃicas foram obtidas, uma nÃo retida (FnRq), obtida com o tampÃo de equilÃbrio, e uma retida (FRq), resultante do acrÃscimo de NaCl 0,2 M ao tampÃo. Na avaliaÃÃo do potencial antifÃngico, FnRq (22 &#956;gP/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo dos esporos de Fusarium solani. Quando avaliadas atividades enzimÃticas relacionadas ao mecanismo de defesa das plantas, quitinases, peroxidases e proteases foram detectadas em ambas as fraÃÃes oriundas da Resource Q. FnRq, apÃs cromatografia em coluna de Superose 12 HR 10/30, resultou em dois picos (S1 e S2), com atividades enzimÃticas distintas, porÃm ambas com potencial para inibir a germinaÃÃo dos esporos de F. solani. Em S1 ficou concentrada toda atividade peroxidÃsica, diferentemente de S2 que reteve a atividade quitinÃsica. Por PADE-SDS, S1 se mostrou puro, como uma Ãnica banda de Mr de 67 kDa, diferindo de S2, cujo perfil apresentou vÃrias bandas protÃicas. Sequenciamento por degradaÃÃo de Edman revelou que a extremidade NH2-terminal de S1 estava bloqueada. AvaliaÃÃo dos mecanismos de aÃÃo antifÃngica usando esporos de F. solani mostrou que proteÃnas presentes no lÃtex de M. megalantha sÃo capazes de interferir com o funcionamento de bombas de prÃtons, de induzir a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes na permeabilidade de membranas. Esses resultados apresentam o lÃtex de M. megalantha como uma rica fonte de proteÃnas antifÃngicas, com potencial para serem usadas na defesa contra o fitopatÃgeno F. solani. / Masdenia megalantha (Apocynaceae ) is a species which grows on the hinterland in Northeast, Brazil. Upon injuries, each organ of the plant exudates a latex which quickly coagulates on exposure to air, preventing losses of water and the penetrat ion of plant pathogens. This present work had the aim to describe the antifungal properties of M. megalantha latex and to identify the related proteins in plant defense against phytopathogenous. So, latex was harvested from trees in Quix adÃ, CearÃ, Brazil, and diluted with 0.05 M Tris - HCl, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl (10:1, v/v) , to prevent its coagulation. The diluted latex was centrifuged (10,000 g , 10 min, 25 ÂC), dialyzed extensively against water, and further centrifuged under the same above conditi ons. The supernatant, denominated Latex Proteins (LP), after exhaustive dialysis against 0.05 M sodium acetate, pH 5.2, was applied to a Resource - Q column equilibrated with this same buffer. Two different fractionswas obtained, one the non - retained protein s (FnRq), eluted with the equilibrating buffer, and the other, the retained proteins (FRq), eluted with 0.2 M NaCl in the above buffer. The FnRq (22 &#956;fP/mL) was the only fraction able to inhibited the spore germination of the phytophatogenic fungi Fusarium solani . In addition, the evaluation of some enzymatic activities involved in plant defense mechanisms against phytopathogenous fungi such as chitinases, peroxidases and proteases were observed in both fractions from Resource - Q. FnRq, after performed in a Superose - 12 HR 10/30 column chromatography, originated another two different protein peaks (S1 and S2), showing different enzymatic activities, but both capable to inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungi F. solani . S1 concentrated all th e peroxidase activity, whereas S2, which concentrate the chitinolityc activity. Under SDS - PAGE, S1 was presented as a purified protein band, instead of S2. Indeed, the NH2 - Terminal sequence under Edman degradation showed that S1 protein was blocked. The an tifungal action mechanisms evaluated in this work has showed that these protein presents in M. megalantha latex were able to interfere with the proton pump present in plasmatic membrane, and also to induce the ROS production, and promote alteration in the membrane permeability within the F. solani spores. These results show the latex from M. megalantha as a rich source of antifungal proteins, with potential to been used in the defense against the phytopathogenous F. solani.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A medicina natural e complementar, especialmente a fitoterapia, se torna cada vez mais utilizada no combate as necessidades de grande parte da populaÃÃo em saÃde bucal, particularmente nos paÃses em desenvolvimento. Dentre os fitoterÃpicos, as lectinas podem ter um valor como agentes antiplaca e antimicrobianos, uma vez que podem estar intimamente relacionadas com a interferÃncia da formaÃÃo do biofilme dos microrganismos, jà que se tratam de proteÃnas que reconhece carboidratos de forma especÃfica e reversÃvel. O objetivo deste estudo foi testar in vitro a capacidade de inibiÃÃo das lectinas isoladas das espÃcies de Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana e Hypnea cervicornis, na formaÃÃo de biofilmes bacterianos e atividade antimicrobiana contra microrganismos orais (Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). A atividade antimicrobiana das cinco lectinas testadas foi determinada pelo teste convencional da microdiluiÃÃo em placas de poliestireno, sendo testada as concentraÃÃes de 2mg/mL à 31,5&#956;g/mL contra os microrganismos em estudo. Para avaliaÃÃo de aderÃncia foi feito um ensaio semiquantitativo de aderÃncia em placas de microtitulaÃÃo de poliestireno (96 poÃos), onde foi adicionado 100 &#956;L de cada uma das lectinas, em seguida adicionada 100 &#956;L de suspensÃo bacteriana (108 UFC/mL) e incubado a 37ÂC em uma atmosfera de 10% de CO2. A aderÃncia foi revelada e quantificada por tintura com cristal violeta. A absorÃÃo do cristal violeta foi determinada atravÃs da leitura no espectrofotÃmetro (595nm). Somente a lectina de ConA apresentou a atividade bactericida ou bacteriostÃtica contra os microorganismos estudados. No teste de inibiÃÃo da formaÃÃo do biofilme, todas as lectinas testadas foram favorÃveis na inibiÃÃo, reduzindo significativamente a aderÃncia (p< 0,05). A lectina de ConA nÃo teve aÃÃo sobre a formaÃÃo do biofilme de nenhumas das bactÃrias testadas. / Natural and complementary medicine, especially phytotherapy, is becoming more and more useful to fulfill the needs of great part of the population when it comes to oral health, particularly in the developing countries. Among the phytotherapics, lectins may be valuable as anti-plaque and antimicrobial agents, since they can be intimately related with inference in biofilm formation, given that these proteins recognize carbohydrates in a specific and reversible way. Within that context, this study aimed to test the ability of five lectins (extracted from Canavalia ensiformis, Canavalia maritima, Cymbosema roseum, Acacia farnesiana and Hypnea cervicornis) in inhibiting the formation of biofilm and killing oral microorganisms(Streptococcus sanguis ATCC10556 e S. mutans UA159). The antimicrobial activity of the five lectins tested was determined by the convetional test of microdilution in polystyrene plaques. The lectin concentrations assayed against the microorganisms varied from 2mg/mL to 31. 5&#956; g/mL. To evaluate the adherence, a semi -quantitative assay was perfomed within microtitulation plaques (96 wells), to where were added 100&#956;L of each lectin, and then 100&#956;L of bacterial suspension (108 CFU/mL). This material was incubated in 10% CO 2 atmosphere at 37ÂC. Adherence was revealed and quantified by violet crystal staining. Absorption of violet crystal was determined by spectophotometry (595nm). Only ConA presented bactericide or bacteriostatic activity against the strains tested. The assay of inhibition of biofilm formation revealed that almost all lectins had this kind of activity, reducing the adherence in a significant way (p<0.05). ConA had no effect on the formation of biofilm for any bacteria tested.

Resumo: O objetivo neste estudo foi analisar a utilização das proteínas de fase aguda (PFA) e perfil bioquímico-sérico como um método para realizar diagnóstico diferencial precoce de mucometra e piometra. Coletaram-se amostras do endométrio de fêmeas caninas hígidas na fase de diestro, sem qualquer alteração ou afecção no trato reprodutor ou em outros sistemas (Grupo diestro: Grupo 1, n=39) e amostras do endométrio de fêmeas caninas acometidas por mucometra (Grupo mucometra: Grupo 2, n=43), e fêmeas caninas acometidas por piometra (Grupo piometra, Grupo 3 ao 6, n=118), durante ovariohisterectomias (OH) eletivas ou terapêuticas. Os dados também foram comparados entre os grupos categorizados segundo a classificação ASA (American Society of Anesthesiologists). Realizou-se anamnese do histórico reprodutivo detalhado, exame físico, exame de macroscopia vulvar, citologia vaginal, exames hematológicos e bioquímicos, e dosagem sérica de progesterona e estradiol, exames de imagem (radiografia e ultrassonografia abdominal). A concentração de proteína total do soro sanguíneo foi determinada pelo método do biureto. As leituras das amostras foram realizadas em espectrofotômetro semi-automático (Labquest, Labtest, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil), com comprimentos de onda específicos para o teste. Para o fracionamento proteico utilizou-se a técnica SDS-PAGE. Verificou-se que conforme a evolução do quadro inflamatório, os níveis séricos das proteínas de fase aguda, ceruloplasmina, transferrina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to analyze the use of acute phase proteins (PFA) and biochemical-serum profile as a method to perform early differential diagnosis of mucometra and pyometra. Samples of the endometrium of healthy canine females were obtained in the right-handed stage, without any alteration or affection in the reproductive tract or in other systems (Group 1, n = 39) and endometrial samples of canine females affected by mucometra (Group 2, n = 43), and canine females affected by pyometra (Pyometra Group, Group 3 to 6, n = 118) during elective or therapeutic ovariohysterectomies (OH). The data were also compared among the groups classified according to the ASA (American Society of Anesthesiologists) classification. Anamnesis of the detailed reproductive history, physical examination, vulvar macroscopy examination, vaginal cytology, hematological and biochemical exams, and serum progesterone and estradiol dosage, imaging (radiography and abdominal ultrasonography) were performed. The total protein concentration of the blood serum was determined by the biuret method. The sample readings were performed in semi-automatic spectrophotometer (Labquest, Labtest, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil), with specific wavelengths for the test. SDS-PAGE was used for protein fractionation. Serum levels of the acute phase proteins, ceruloplasmin, transferrin, albumin (p <0.0001), IgGCP (p <0.0001), haptoglobin (p <0.0001), alpha glycoprotein acid (p <0.0001), IgGCL (p <0.0001) ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor