Espécies de serpentes com ampla distribuição geográfica e sujeitas a diferentes condições de temperatura e precipitação ao longo de suas áreas de ocorrência podem apresentar variação geográfica em caracteres morfológicos e ecológicos (e.g. dieta e reprodução). Neste estudo, foi investigado se populações de Bothrops jararaca habitantes de áreas litorâneas e de áreas adjacentes mais elevadas da Serra do Mar e do planalto do estado de São Paulo, apresentavam variação geográfica em caracteres morfológicos e associados à biologia alimentar e reprodutiva. Foram analisados 831 espécimes de imaturos e adultos de ambos os sexos depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Butantan (IBSP) e dados adicionais de 42 indivíduos alimentados das áreas supramencionadas obtidos de trabalhos não publicados. Indivíduos jovens da população de altitude consomem presas endotérmicas (mamíferos) em freqüência significativamente maior em relação aos da população litorânea. Isso deve estar relacionado à maior disponibilidade de anuros ao longo do ano nas áreas litorâneas ou ao fato dos jovens das áreas de altitude selecionarem e serem capazes de ingerir presas endotérmicas apesar de seus pequenos tamanhos corporais. Entre os indivíduos sub-adultos e adultos das duas populações, não houve diferenças significativas nos tipos (ectotérmicas e endotérmicas) e nas classes (grupos taxonômicos) de presas consumidas, possivelmente porque esses indivíduos se alimentam de presas endotérmicas assim que possível ao longo da ontogenia, abandonando itens alimentares relativamente pequenos. Apesar das jararacas das áreas de altitude provavelmente estarem menos ativas durante os meses mais frios e secos do ano e se alimentarem com menor freqüência durante esse período, esses indivíduos aparentemente não compensam as menores oportunidades de tomada de alimento consumindo presas em freqüência superior aos coespecíficos das áreas costeiras durante os meses mais quentes e úmidos do ano. Os indivíduos da população de altitude consomem itens alimentares relativamente maiores e possuem, para quase todas as classes de tamanho estabelecidas, maior comprimento rostro-cloacal, maior tamanho relativo de cabeça e maior robustez em relação àqueles das áreas litorâneas. É possível que a sazonalidade climática mais acentuada das áreas de altitude restrinja a extensão do período de atividade e a eficiência alimentar das serpentes habitantes dessas áreas, constituindo um agente seletivo para o consumo de presas maiores. A diferença no tamanho das presas ingeridas deve ser um dos fatores relacionados às diferenças nas dimensões corporais entre as jararacas da costa e aquelas das áreas de maior altitude. Apesar das diferenças climáticas entre as duas áreas, o ciclo reprodutivo de ambos os sexos é sazonal e não difere entre as populações, provavelmente porque esse deve ser um caráter conservativo no gênero Bothrops. Jararacas de áreas de maior altitude da Serra do Mar e do planalto atingem a maturidade sexual com menor tamanho corporal, possuem maior fecundidade relativa e presumivelmente maior massa relativa de ninhada em relação àquelas das áreas litorâneas, o que deve estar associado, ao menos em parte, à dieta mais calórica dessa população. Os neonatos das áreas de altitude aparentemente possuem maiores dimensões corporais em relação aos do litoral, o que deve estar associado a maior freqüência no consumo de presas endotérmicas pelos primeiros. É sugerido que algumas diferenças entre as populações para os caracteres morfológicos e associados à biologia reprodutiva são devido à plasticidade fenotípica da espécie e outras devidas a mudanças evolutivas. / Widely distributed snakes exposed to different conditions of temperature and precipitation throughout their distributions may present geographic variation in morphological and ecological characters (e.g. diet and reproduction). In this study, I investigate whether Bothrops jararaca populations from coastal and adjacent mid-elevation sites of the Serra do Mar and plateau in São Paulo state presented geographic variations in morphological characters and in characters associated to feeding and reproduction. I analyzed 831 specimens among immature and adults of both sexes deposited in the Coleção Herpetológica do Instituto Butantan (IBSP). Data concerning 42 fed individuals from the studied areas taken from unpublished works were also included. Juveniles from the mid-elevation sites feed on endothermic preys (mammals) in higher frequency in relation to that from the coastal sites, which might be due to the higher anuran availability throughout the year at the coastal sites, and/or because the juveniles from the mid-elevation sites select and they are capable of ingest endothermic preys despite their small body size. There were no significant differences among sub-adults and adults from the two populations in the kinds (ectothermic and endothermic) and classes (taxonomic groups) of the prey consumed, which is possibly related to the fact that the individuals from both sites consumes endothermic prey as soon as possible throughout the ontogeny and abandon relatively small items. Although the jararacas from the mid-elevation sites probably are less active during the coldest and driest months of the year and feed less frequently during this period in relation to that of the coastal sites, these individuals did not seem to compensate the fewer opportunities of taking prey by feeding in higher frequency in relation to the coespecifics from the coastal sites during the hottest and warmest months of the year. The specimens from mid-elevation populations consume relatively larger prey and they have larger bodies, relative larger heads, and are stouter for most of the size classes established. It is possible that the more seasonal climate of the mid-elevation sites restricts the extension of the activity period and the feeding efficiency of snakes, which could correspond to a selective agent related to the consumption of larger prey. The difference in diet might be one of the factors that are related to differences in body dimensions between populations from the coast and from mid-elevation sites. Although there are climate differences between the two studied sites, the reproductive cycle of both sexes is seasonal and did not differ between the populations, possibly because this should be a conservative character in the genus Bothrops. The individuals from the higher Serra do Mar and plateau sites become mature with smaller body size, have higher relative fecundity and presumably higher relative clutch mass in relation to those of the coastal sites. These results should be associated, at least partially, to the more caloric preys ingested by the population from the altitude sites. The neonates from the altitude sites seem to have larger body size in relation to those from the coastal sites, what should be associated with the higher frequency of endothermic prey in their diet. It is suggested that some differences between the populations in morphological characters and for the characters associated to the reproductive biology are due to the species phenotypic plasticity and others to evolutionary changes.

Escherichia coli enteropatogênica causa uma lesão denominada attaching and effacing, codificadas por genes presentes na região LEE, que está sujeita a regulação por diferentes fatores incluindo por quorum sensing. O veneno de Bothrops jararaca é uma mistura de vários componentes com diferentes efeitos biológicos. Para analisar o efeito de suas frações na interação de EPEC com HEp-2, o veneno foi ultrafiltrado. Testes mostraram que a concentração de 100 ng de fração causou um aumento de adesão bacteriana, sugerindo componente no veneno que potencializa a adesão até certa concentração. Fenótipo das amostras com concentração mais alta foi parecido ao do controle, exceto com 1000 ng da menor fração, onde a adesão foi menor, sugerindo que há componente que afeta negativamente a adesão bacteriana em concentração maior. Estes resultados mostram como diferentes componentes de veneno de serpentes afetam a interação bactéria-célula hospedeira, e apresentam potencial biológico de componentes de baixo peso molecular no veneno. / Enteropathogenic Escherichia coli causes a lesion named attaching and effacing, encoded by genes present in LEE region, which is subject to regulation by different factors including quorum sensing. Bothrops jararaca venom is a mixture of different components with different biological effects. To analyze the effect of its fractions in interactions between EPEC and HEp-2, venom was ultrafiltered. Tests showed that a fraction concentration of 100 ng caused an increase of adherence when compared to the control, suggesting that there is a component in the venom that potentiates the adherence up to a certain concentration. Phenotype of samples with higher concentration were similar to that of the control, except the one with 1000 ng of the lowest fraction, where adherence decreased, indicating that there is a component able to negatively affect adherence when in higher concentration. These results show how different snake venom components can affect a bacteria-host cell interaction, and present biological potential of components of low molecular weight present in venom.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (Aα Bβ e ϒ), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias Aα Bβ e ϒ dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia Aα, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia Bβ e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia ϒ . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (Aα Bβ and ϒ ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine Aα Bβ and ϒ fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for Aα chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for Bβ chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for ϒ chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation

O veneno da Bothrops jararaca (VBj) causa inflamação aguda local. Os mastócitos secretam mediadores que desencadeiam a inflamação por sua ação direta ou pelo recrutamento de células. Este trabalho avalia o papel dos mastócitos na inflamação induzida por VBj em camundongos geneticamente selecionados para alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda. Os animais foram tratados com o inibidor de mastócito Cromoglicato de Sódio (CROM) e receberam o VBj, e apresentaram formação de edema similar em resposta ao veneno. Os animais AIRmax apresentaram maior dor que os AIRmin, sendo esta inibida por CROM. O VBj aumentou o número de células peritoneais em AIRmax, bem como o número de macrófagos, e diminuiu o número de mastócitos. O VBj também aumentou neutrófilos e a produção de ROS em AIRmax, efeito inibido por CROM. Os resultados mostram, portanto, que os animais AIRmax apresentam maior dor, migração de neutrófilos e macrófagos e produção de ROS que os AIRmin, e que essas reações são reduzidas quando os mastócitos são inibidos. / Bothrops jararaca venom (BjV) causes acute local inflammation. Mast cells acts secreting mediators that trigger inflammatory events through their direct action or the recruitment of other cells. This study aims to evaluate the role of mast cells in inflammation induced by BjV in mice genetically selected for maximum (AIRmax) or minimum (AIRmin) acute inflammatory response. Animals were treated with mast cell degranulation inhibitor cromolyn (CROM) and received BjV, and showed similar edema formation in response to BjV. AIRmax mice exhibited greatest pain than AIRmin, which was inhibited by CROM. BjV increased peritoneal cells number in AIRmax, as well as the number of macrophages, and diminished the number of mast cells. BjV also increased neutrophils and ROS production in AIRmax, which was inhibited by CROM. These results shows, therefore, that AIRmax mice exhibit more pain, macrophage and neutrophil migration, and ROS production than AIRmin mice, being all these reactions reduced when mast cells are inhibited.

No Brasil, ocorrem anualmente mais de 20.000 acidentes ofídicos, sendo mais de 80 por cento por espécies do gênero Bothrops. Envenenamentos por serpentes desse gênero raramente causam óbito mas, muitas vezes, levam a necrose e infecção secundária, que podem determinar a perda de um membro acometido ou de segmento desse. A dose de soro antibotrópico utilizada para o seu tratamento é baseada na gravidade do envenenamento ao exame inicial. Vários fatores têm sido associados a essa gravidade, mas poucos são os dados científicos e nenhuma avaliação foi feita para acidentes comprovadamente causados por B. jararaca. O presente estudo teve como objetivo identificar: as variáveis associadas à ocorrência de necrose; as variáveis asociadas à ocorrência de abscesso; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de necrose; os fatores prognósticos independentes para a ocorrência de abscesso. Foram analisados no presente estudo 779 casos de acidentes por B. jararaca atendidos no Hospital Vital Brazil do Instituto Butantan, no período de 1982 a 1990. Os dados foram levantados a partir de prontuários médicos arquivados nesse hospital. Os casos que apresentaram necrose e os que evoluiram para abscesso, foram comparados no que se refere a uma série de variáveis, respectivamente, com aqueles que não apresentaram necrose e não evoluiram para abscesso. Correlacionaram-se estatisticamente à análise bivariada com necrose e abscesso (p < 0,05) o acidente por serpentes de grande porte (> 60cm), a picada em perna, o uso de torniquete, a presença de dor, edema, equimose, bolha, choque, sangramento fora da região da picada. Acidentes em determinados meses do ano, picadas nos dedos da mão e alteração da coagulação sanguínea só se correlacionaram com necrose (p < 0,05). Mostraram-se fatores prognósticos independentes para necrose à análise multivariada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento, 60 - 80cm, 80 - lOOcm, 100 - 140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picadas no dedo da mão, e na perna; uso de torniquete; ocorrência de sangramento. Mostraram-se fatores prognósticos independentes para abscesso, à análise multi variada: tamanho da serpente, conforme diferentes faixas de comprimento 60-80cm, 80- lOOcm, 100-140cm; mês de ocorrência; acidentes com pessoas do sexo feminino; picada na perna; alteração da coagulação sanguínea; ocorrência de sangramento. Conclui-se que, as variáveis relacionadas com necrose e aquelas relacionadas com abscesso, os fatores prognósticos independentes para necrose e aqueles para abscesso, são os apresentados acima e que o porte de B. jararaca é o fator prognóstico independente mais importante para necrose e, principalmente, para abscesso, que são tanto mais freqüentes quanto maior o comprimento da serpente. / There is an annual incidence of over 20 000 snakebite cases in Brazil; of these over 80 per cent are caused by Bothrops species. Bothropic envenoming commonly causes necrosis and secondary infection which may lead to loss of part or of all the bitten limb. Fortunately fatalities are rare. During treatment, the dose of antivenom administered is based on the clinical severity of the envenoming. Several factors have been shown to be associated with the severity of the envenoming, however data are scarce and no such studies on Bothrops jararaca exist. The objective of this study was to identify the following: the variables associated with necrosis; the variables associated with abscess formation; the independent prognostic factors of necrosis; the independent prognostic factors of abscess formation. The study analysed 779 B. jararaca envenoming cases admitted from the Hospital Vital Brazil of the Instituto Butanatan in the period from 1982 to 1990. Data were taken from medical records in this hospital. Occurrence of necrosis or of abscesses was independently compared, in the light of a series of specific variables, with cases in which, necrosis or abscesses did not occur. Occurrence of necrosis and of abscess (p<0,05) was correlated by bivariable statistical analysis with the following: bites caused by large-sized snakes (>60cm in length); bites on the leg; use of tourniquet; presence of pain, oedema, equimosis, blisters, shock; and systemic bleeding. Occurrence of necrosis (p<0.05) was only correlated with bites on the fingers, impaired blood coagulability, and with accidents grouped according to the month of the year. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic factors for necrosis: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80- l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on fingers and legs; use of tourniquet; and the presence of haemmorrhage. The following were shown, on multivariate analysis, to be independent prognostic indicators for abscess formation: size of snake (grouped according to length 60-80cm/ 80-l00cm/ 100-140cm); month in which bite occured; female sex of the victim; bites on the leg; impaired blood coagulability; and the presence of haemmorrhage. It is concluded that the forementioned are: associated factors of necrosis and abscess formation; and the independent prognostic factors of necrosis; and independent prognostic factors of abscess. The size of B. jararaca responsible for the bite was shown to be the most important independent prognostic factor of necrosis and, even more so, of abscess.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores &alpha; e &beta;, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores &alpha; e &beta; (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores &alpha; e &beta;. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores &alpha; e &beta; e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both &alpha;1- and &beta;-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of &alpha;1- and &beta;-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by &alpha;1- and &beta;-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of &alpha;1- and &beta;-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre estrutura e função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase da classe P-III do veneno da Bothrops jararaca com atividades hemorrágica e pró-inflamatória. Mostramos que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas (domínios tipo-disintegrina/rico em cisteínas, DC, e domínio rico em cisteínas, C) são capazes de aumentar o rolamento de leucócitos na microcirculação e de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Por outro lado, a proteína D e a proteína DC contendo a mutação Asp/Ala no motif Glu-Cys-Asp não apresentaram estas atividades. Peptídeos derivados da região hiper variável (HVR) do domínio rico em cisteínas também promoveram o rolamento de leucócitos, sendo esta atividade foi inibida por anticorpos anti-aMb2, e ainda inibiram a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados sugerem que o domínio rico em cisteínas do HF3 e sua HVR desempenham um papel em sua atividade pró-inflamatória mediada pela integrina aMb2, e na inibição da agregação plaquetária. / This aim of this study was analyze the relationship between structure and function of the non-catalytic domains of HF3, a hemorrhagic and pro-inflammatory metalloproteinase of the P-III class, from Bothrops jararaca venom. Here we show that recombinant proteins of HF3 containing the cysteine-rich domain (disintegrin-like/cysteine rich and cysteine-rich proteins) but not the disintegrin-like protein and a disintegrin-like/cysteine rich protein carrying the mutation Asp/Ala in the Glu-Cys-Asp motif were able to significantly increase leukocyte rolling in the microcirculation and to inhibit collagen-induced platelet aggregation. Peptides from the hyper variable region (HVR) of the cysteine-rich domain also promoted leukocyte rolling and this activity was inhibited by anti-aMb2 antibodies. HVR peptides also inhibited platelet-aggregation. Taken together, these results suggest that the cysteine- rich domain of HF3 and its HVR play a role in triggering pro-inflammatory effects mediated by integrin aM/b2 and in the inhibition of platelet-aggregation.

As Fosfolipases A2 (PLA2) são enzimas que atuam desconstruindo membranas celulares, resultando em ácidos graxos e lisofosfolipidios, causando inflamação tecidual. Evidências indicam que serpentes possuem uma resistência natural devido a propriedades presentes no sangue, que inibem ações de proteínas presentes no veneno. Portanto, no presente trabalho foi isolado e caracterizado bioquimicamente e biologicamente o primeiro inibidor de PLA2 do tipo gama (&#947;PLI) do soro da serpente B. jararaca, denominado PLI_BJ. O inibidor de PLA2 foi isolado utilizando dois passos cromatográficos. O PLI_BJ mostrou, por SDS-PAGE, uma massa molecular aparente de 25 000 e 20 000 em condições redutoras e não redutoras, respectivamente. A sequência de aminoácidos parcial de PLI_BJ foi determinada por espectrometria de massa e corresponde a 72% e 68% de cobertura da sequência de aminoácidos de duas proteínas já descritas como PLI. O PLI_BJ mostrou também atividade inibitória satisfatória nos três testes realizados sugerindo um papel deste inibidor nos efeitos de envenenamento da serpente. / Phospholipases A2 (PLA2) are enzymes that act on cell membrane phospholipids resulting in fatty acids and lysophospholipids, deconstructing the cell wall causing tissue inflammation. Evidence indicates that snakes have natural resistance due to protective properties of blood that inhibits the action of proteins present in the venom. This study aimed to purify and characterize PLA2 inhibitors (PLI) from serum of the Bothrops jararaca snakes. PLA2 inhibitor was isolated using two chromatographic steps, and was named PLI_BJ. The purity of the PLI_BJ was confirmed by HPLC and SEC. The PLI_BJ showed, by SDS-PAGE, an molecular mass of 25,000 and 20,000 under reducing and non-reducing conditions, respectively. The partial amino acid sequence of PLI_BJ was determined by mass spectrometry and it corresponds to 72% and 68% of coverage of the amino acid sequence of two proteins already described as PLI. The PLI_BJ also showed satisfactory inhibitory activity in the three tests performed suggesting a role of this inhibitor in snake envenomation effects.

O envenenamento ofídico é considerado uma condição tropical negligenciada pela OMS, e no Brasil, o gênero Bothrops está envolvido na maioria dos casos. Primeiramente, estudamos a atividade hidrolítica do veneno de B. jararaca sobre peptídeos biologicamente ativos que podem estar relacionadas com o envenenamento. A hidrólise dos peptídeos que foram substratos para as serinopeptidases não foi eficientemente bloqueada pelo soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan e, portanto, as causas dessas falhas foram investigadas. Para isso, purificamos quatro serinopeptidases não bloqueadas pelo soro e, por estudos imunoquímicos, observamos que apesar deste não bloquear as atividades destas enzimas, o mesmo é capaz de reconhecê-las. Portanto, decidimos obter soros experimentais contra estas moléculas utilizando camundongos, a fim de compará-los com o soro comercial. Os soros experimentais contra as serinopeptidases mostraram capacidade de reconhecimento e alta afinidade contra elas, e mais importante, capacidade de neutralizar suas atividades in vitro. / Snakebite is considered a neglected tropical condition by WHO, and in Brazil, the Bothrops genus is involved in most of the cases. Initially, we have studied the B. jararaca venom activity over bioactive peptides which could be related with the envenomation. The hydrolysis of the peptides substrate for serinepeptidases were not efficiently blocked by the Butantan Institute bothropic antivenom, therefore, the causes of this flaw were investigated. Thereafter, we purified four serinepeptidases not blocked by the antivenom and, by immunochemistry analysis, we observed that although it could not neutralize the activity, it could well recognize these proteins. Thus, we decided to obtain experimental sera against these serinepeptidases in mice, in order to compare it with the commercial antivenom. The experimental sera against these enzymes demonstrated recognition capability and high affinity, and most important, the ability to neutralize their activity in vitro.