Els éssers vius es divideixen filogenèticament en eucarionts, amb un nucli ben definit, i bacteris. Hi ha dos tipus de bacteris, els eubacteris i els arqueobacteris. Els arqueobacteris tenen, entre altres diferències, una estructura lipídica diferent de la resta d'organismes. Aquesta característica fa que els lípids arqueobacterians siguin utilitzats com a biomarcadors. S'ha estudiat un grup d'arqueobacteris, el bacteris metanògèns, que generen metà com a subproducte del seu metabolisme, característica que els diferencia de la resta d'organismes. Els bacteris anaerobis metanògens, es troben en els digestors anaerobis de les depuradores urbanes i també en ambients extrems com poden ser les salines. Els objectius de la tesi han estat: a) l'obtenció de cultius d'enriquiment de bacteris metanògens a partir de fang de digestor anaerobi de depuradora, amb substrats acetat i dimetilsulfur, i de tapet microbià de salines, amb substrat dimetilsulfur; b) l'estudi de la biodegradació de compostos orgànics de cadena llarga amb significació geoquímica per part de consorcis metanogènics obtinguts a partir de fang de digestor anaerobi de depuradora urbana, i c) l'estudi dels lípids dels cultius obtinguts.Els cultius d'enriquiment s'han efectuat en vials tancats, en medi líquid i sota atmosfera de nitrogen. El creixement bacterià s'ha establert mesurant la variació de la proporció de metà a la part superior del vial. El metà ha estat identificat i quantificat amb cromatografia de gasos, a partir del temps de retenció i l'àrea del pic respectivament. En els cultius amb substrat dimetilsulfur inoculats a partir de fang, el creixement s'ha establert amb cromatografia de gasos acoblada a espectrometria de masses (CG-EM), el que ha permès observar l'augment, sicrònicament al desenvolupament del cultiu, dels fragments característics del metà respecte els de l'atmosfera inicial de nitrogen. La tècnica de CG-EM també ha permès establir la via de degradació del dimetilsulfur.S'ha estudiat la biodegradació anaeròbia de 1-hexadecè i n-hexadecantiol per part de consorcis metanogènics obtinguts a partir de fang de digestor anaerobi de depuradora. És conegut que en la biodegradació anaeròbia de compostos orgànics de cadena llarga intervenen diversos grups de bacteris, que successivament oxiden el compost de cadena llarga a àcid, el qual és degradat perdent successives molècules d'acetat, que és finalmet consumit pels bacteris metanògens, produïnt-se metà i diòxid de carboni. S'ha establert la biodegradació dels dos compostos esmentats, mesurant lal propoció de metà, que ha augmentat en tots els cultius després d'una readdició de substrat. Cal mencionar que la biodegradació de n-hexadecantiol no s'ha trobat descrita amb anterioritat a aquesta tesi.L'anàlisi lipídica dels cultius obtinguts en aquest treball s'ha dut a terme mitjançant extracció orgànica i anàlisi amb CG-EM prèvia sililació de les mostres. El bis-difitanilglicerolèter (C20, C20), lípid exclusiu dels arqueobacteris, ha estat identificat a totes les mostres. Pel que fa a la resta de lípids en els cultius a partir de tapet microbià de salines s'han pogut identificar una quantitat de compostos distintius arqueobacterians superior a la dels cultius obtinguts a partir de fang.

Una de las características de la célula bacteriana es la capacidad de adaptarse a los cambios ambientales del entorno en el que se desarrolla modificando el patrón de expresión génica. Uno de los ejemplos mejor caracterizados es la respuesta frente al cambio de osmolaridad del medio, pero la mayoría de trabajos se han centrado en el estudio de genes cuya expresión se induce a elevada osmolaridad. Mediante mutagénesis al azar con el transposón MudJ se diseñó una estrategia para identificar genes en Salmonella enterica serovar Typhimurium cuya expresión se viera reducida a elevada osmolaridad. Siguiendo esta estrategia se identificó el gen yfeR, que codifica para una proteína, YfeR, descrita en los bancos de datos como un hipotético regulador de la familia LysR de reguladores transcripcionales. Los miembros de esta familia son generalmente proteínas activadoras de la transcripción y se encuentran en muchos géneros procariotas, regulando genes u operones que codifican funciones extremadamente diversas. En base a la regulación por osmolaridad del gen yfeR, y a la posibilidad de pertenecer a la familia LysR, se planteó como objetivo de esta Tesis Doctoral estudiar el modelo de regulación de YfeR.El análisis de secuencia de la proteína YfeR reveló características distintivas de los reguladores transcripcionales LysR: un extremo N-terminal altamente conservado con un dominio "helix-turn-helix" de unión al ADN; una cadena aminoacídica de 308 residuos (proteínas LysR tienen 300 +/- 20 AAs); una relación Lys/Arg anómala; además de la homología tanto con reguladores de la familia descritos como tal como con hipotéticos reguladores LysR. Al proporcionar el producto del gen yfeR en trans su expresión se autorregula negativamente, capacidad que presentan la mayoría de reguladores LysR. En la región promotora del gen yfeR se localizó una secuencia de unión de las proteínas LysR, T-N11-A, con la T y la A formando parte de una región invertida. Mediante ensayos de retardo en gel se demostró la capacidad de unión de la proteína YfeR a esta región, y por lo tanto al ADN. Todos estos resultados definen a YfeR como un miembro de la familia LysR.Los resultados de la regulación de la expresión del gen yfeR muestran tanto de forma indirecta, mediante una fusión génica yfeR::lacZ (MudJ), como de forma directa mediante el ensayo de protección frente a la RNasa-ONE, que el genyfeRestá osmoregulado reprimiéndose a elevada osmolaridad. A 89 pb del inicio de traducción del gen yfeR se localizó una pauta abierta de lectura, denominada yfeH, que se transcribía de forma divergente, característica compartida entre muchos reguladores de la familia LysR y sus genes regulados. Así, se planteó como hipótesis de trabajo que éste era el gen regulado por YfeR. Sin embargo, el estudio de la regulación de la expresión del gen yfeH demuestra que ésta se induce en fase estacionaria, pero de forma independiente a la presencia o ausencia de su posible regulador YfeR y de su regulación por osmolaridad. En base a este resultado se planteó la posibilidad de que la proteína YfeR regulase la expresión de otros genes alternativos al adyacente. El análisis de extractos celulares de un mutante yfeR respecto a la cepa salvaje mediante geles 2D demostró la presencia de diferentes proteínas con expresión diferencial. Dos de ellas pudieron ser identificadas por MALDI-TOF: IbpA, implicada en la protección frente a un estrés por superóxidos, y Lrp, un regulador global implicado en la modulación de una gran variedad de funciones metabólicas, así como de genes que se inducen en fase estacionaria y en respuesta a cambios ambientales. Este resultado posiciona a YfeR como una proteína LysR implicada en una red de regulación global frente a estímulos ambientales. / Bacteria adapt to changes in their environment by modifying its pattern of gene expression. Adaptation to the medium osmolarity is one of the best characterized examples, however many of the well-known situations correspond to genes whose expression is induced when medium osmolarity increases. Previous work identified by random mutagenesis in Salmonella enterica serovar Typhimurium gene yfeR, a hypothetical LysR-like regulator repressed at high osmolarity. This work is focused on the study of the model of regulation of YfeR.The sequence analysis of YfeR protein showed most of the common features of LysR family: an N-terminal conserved domain, 308 amino acids long, an anomalous Lys/Arg ratio, and homology with members of the LysR family. As for the majority of LysR regulators, YfeR negatively autoregulated its own transcription. In the promoter region of yfeR was located a sequence having characteristics of a LysR-type target consensus motif. Gel retardation assays demonstrated that YfeR binds specifically to this region. All these results clearly related YfeR to the LysR family of transcriptional regulators. About the osmoregulation of yfeR gene expression we confirmed, by indirect and direct methods (transcriptional fusion yfer::lacZ and RNasa protection assays, respectively), that its expression is repressed at high osmolarity.An ORF, yfeH, was found oriented in the opposite direction to yfeR, a common property of genes regulated by members of the LysR family. However, expression of yfeH gene is induced in stationary phase independently of the presence of YfeR and osmolarity conditions. Then we decided to search for other possible regulated genes by YfeR but not in adjacent position. Protein extracts of an yfeRmutant and wild type strains were analyzed by 2D electrophoresis. Some differences were found and two of them were identified as IbpA and Lrp. These results suggest that YfeR could be implied in a global regulation network related to environmental stimuli.

En la adaptación de las bacterias ante cambios ambientales juegan un importante papel las proteínas asociadas al nucleoide. Estas proteínas presentan una doble función: la estructuración del nucleoide bacteriano y otros procesos relacionados con el ADN como es la regulación de la expresión génica. Una de las proteínas asociadas al nucleoide mejor caracterizada es la proteína H-NS, que se encuentra ampliamente distribuída en bacterias G(-). Una de las características de H-NS es su capacidad de formar dímeros con miembros de la familia de proteínas Hha/YmoA, formando de esta manera complejos represores que intervienen en la regulación de determinados operones, como es el caso del operón hly de E. coli. En este trabajo, y en colaboración con el grupo de RMN de biomoléculas dirigido por el doctor Miquel Pons, se han realizado una serie de trabajos con la intención de conocer mejor las características estructurales de la proteína Hha y su interacción con H-NS, en los que se ha puesto de manifiesto que, aún sin ser unos de los residuos aminoacídicos más afectados en la interacción de Hha con H-NS, la cisteína en posición 18 juega un importante papel en el equilibrio conformacional de Hha cuando interacciona con H-NS. La sustitución de esta cisteína por una isoleucina da lugar a una proteína Hha mutante incapaz de complementar la mutación hha y que provoca una reducción en la tasa de crecimiento de E. coli en condiciones de baja osmolaridad. Este efecto podría venir explicado por la mayor resistencia a la fuerza iónica del medio de la interacción de esta proteína Hha mutante con la proteína H-NS, lo que podría provocar la desregulación de algún gen/es esenciales en condiciones de baja osmolaridad. Una segunda parte de esta Tesis Doctoral está dedicada al gen hns de Y. enterocolitica. Estudios previos realizados en nuestro grupo de investigación pusieron de manifiesto la esencialidad del gen hns en esta bacteria, ya que únicamente es posible obtener mutantes hns en Y. enterocolitica en presencia de algún miembro funcional de la familia de proteínas H-NS. En esta Tesis, nos centramos en el sistema que permite obtener un mutante hns en presencia de la proteína StpA, paráloga a H-NS en E. coli. Los resultados obtenidos permitieron comprobar que la presencia de StpA en Y. enterocolitica provoca drásticas alteraciones en su patrón de expresión proteico, efecto no observado en otras bacterias entéricas, y pusieron de manifiesto la importancia de las proteínas H-NS e YmoA en esta bacteria. La proteína YmoA, que interviene en la termorregulación de la expresión de factores de virulencia en Y. enterocolitica, es homologa a la proteína Hha de E. coli, y también es capaz de interaccionar con H-NS. El análisis de estos resultados ha puesto de manifiesto, por un lado, que la presencia de StpA en Y. enterocolitica simula un incremento no fisiológico en los niveles de proteína H-NS, y por otro lado, la importancia no solo de la presencia de las proteínas H-NS e YmoA en Y. enterocolitica, sino también la importancia de sus niveles relativos, ya que un incremento en los niveles de H-NS o una disminución en los de YmoA provocan una drástica alteración en el patrón de expresión proteico de Y. enterocolitica. / "Hha and YmoA family of proteins: structural studies and regulatory role in Y. enterocolitica"TEXT:H-NS protein is a nucleoid-associated protein, widely dstribute in Gram - bacteria. It has a dual function: nucleoid structure protein and others processes related to DNA like gene expression regulation. This protein is able to both oligomerize and heterodimerize with other proteins. One of the partners of these heterodimers are members of Hha/YmoA family of proteins.In the current work, we carry out the production of both Hha and H-NS proteins in order to perform structural studies by RMN. These studies show that cysteine at position 18 in Hha protein is not one of the most affected aminoacids for Hha/H-NS interaction. However, its location between two α-helix domains suggested that it might be an important residue for Hha conformation during its interaction with H-NS. Our results demonstrated that cys 18 substitution by ile, which hypothetically gives rise to a more open structure, genetates a non-functional protein. In addition, we could observe a toxic effect under low osmolarity condition in E. coli. Finally, a higher stability in H-NS/Hha interaction could be observed.The second part of this work deals with Y. enterocolitica hns gene. hns mutants can only be obtained in this bacteria in presence of some functional members of this protein family. This fact is an evidence of the essenciality of hns in Y. enterocolitica. For instance, an hns mutant can be isolated in presence of stpa gene, which is an hns paralogous gene in E.coli, but not present in Y. enterocolitica. Our results demonstrate that drastic effects in the protein expression pattern of Y. enterocolitica are produced in presence of StpA. The analysis of the previous results gave evidence of the importance of YmoA and H-NS proteins in Y. enterocolitica. Not only the presence of the proteins but also their relative levels turned out to be important, since both an increase in H-NS levels and a decrease in YmoA levels gave rise to a dramatic change in Y. enterocolitica protein expression pattern.

El género "Aeromonas" pertenece a la familia "Vibrionaceas". Dentro de este généro podemos diferenciar dos grupos: un primer grupo formado por microorganismos psicrófilos no mótiles en el que únicamente hallamos la especie "Aeromonas salmonicida" y un segundo grupo formado por microorganismos mesófilos mótiles en el que hallamos las especies "Aeromonas hydrophila", "Aeromonas sobria" y "Aeromonas caviae". Las cepas de "Aeromonas" mesófilas mótiles son microorganismos que se caracterizan por su elevada diversidad en cuanto al grado de virulencia. Estas diferencias se hallan estrechamente relacionadas con las estructuras moleculares presentes a nivel de la superficie bacteriana. La incidencia y variabilidad de este grupo hizo que obtuviesen a partir de muestras de agua diferentes bacteriófagos específicos para las estructuras superficiales bacterianas, los cuales pudiesen emplearse como marcadores biológicos que permitiesen diferenciar a un serotipo de los restantes dentro del grupo de "Aeromonas" mótiles. De este modo, se aislaron los bacteriófagos PM1, PM2 y PM3.El bacteriófago PM1 presenta doble cadena de DNA, capside poliédrica y una placa con fibras en la cola. Además, posee como receptor el antígeno O del lipopolisacárido (LPS) de las cepas de serotipo 0:34 y, en consecuencia, los mutantes espontáneos resistentes al citado bacteriófago carecen de antígeno 0 del LPS, aunque presentan sensibilidad a bacteriófagos de "Aeromonas" cuyo receptor es el núcleo del LPS. El bacteriófago PM2 presenta doble cadena de DNA, cápside poliédrica y una placa basal con espinas. Además, posee como receptor el núcleo del LPS de diferentes cepas de serotipo 0:34 y 0:11 (así como "A. salmonicida"); en consecuencia, los mutantes resistentes al mismo presentan alteraciones en los oligosacáridos del núcleo del LPS, careciendo en todos los casos de antígeno 0 del LPS. El bacteriófago PM3 presenta doble cadena de DNA y posee como receptor el flagelo monopolar de diferentes serotipos de "A. hydrophila" tanto con lámina S como sin lámina. Los mutantes resistentes a este bacteriófago presentan alteraciones en el flagelo o en la motilidad de dichas cepas bacterianas. Estos bacteriófagos han permitido la agrupación de diferentes cepas de "Aeromonas" mesófilas que luego han correspondido a serotipos distintos. Así, las cepas sensibles al bacteriófago PM1 pertenecen al serogrupo 0:34 y presentan las siguientes características:1.- Un perfil de proteínas de membrana externa tremendamente homogéneo.2.- Un LPS heterogéneo, químicamente formado por KDO, L-heptosas, glucosa y hesoxaminas, y carente en D-heptosas, galactosa, rhamnosa y pentosas.3.- Una DL(50) a 20ºC menos elevada que a 37°C, tanto en ratón como en pez, lo cual indica que son más virulentas a 20ºC que a 37°C. Este hecho se debe a la producción de antígeno 0 del LPS a 20ºC y a la práctica ausencia del mismo a 37°C. Todo ello implica al antigeno 0 del LPS en la virulencia de estas cepas.Uno de los serotipos más importantes dentro de las "Aeromonas" mesófilas a causa de su elevado grado de virulencia es el denominado serotipo 0:11. Este serotipo presenta:1. Un LPS homogéneo, formado químicamente por KDO y L-heptosas en el núcleo del LPS y glucosa, galactosa, mañosa y hexosaminas en el antígeno 0 del LPS. 2. Una lámina proteínica de estructura tetragonal, denominada lámina S, que recubre prácticamente la superficie celular haciendo que el LPS quede totalmente recubierto. Esta poca accesibilidad del antígeno 0 del LPS hace difícil encontrar marcadores biológicos (bacteriófagos) para este serotipo. 3. Todas las cepas de serotipo 0: 11 al igual que las de "A. salmonicida" poseen la propiedad de autoaglutinar. Dicha propiedad está ligada fundamentalmente a la presencia de lámina S y de flagelo.4. La DL(50) de este serotipo es dos logaritmos inferior a la existente en las cepas de serotipo 0:34 y además es muy similar en todos los mutantes isogénicos obtenidos para las diferentes estructuras superficiales. Una vez estudiados los serotipos 0:34 y 0:11 de las "Aeromonas" mesófilas se obtuvieron mutantes isogénicos, bien por resistencia a bacteriófagos específicos para las diferentes estructuras superficiales o bien mediante mutagénesis con un agente alquilante y contraselección con anticuerpos especificos frente a 1as estructuras superficiales a alterar.Con el uso de los citados mutantes se determinó que la vía clásica del complemento es la responsable en las "Aeromonas" pertenecientes al serotipo 0:34 y 0:11 de la activación del complemento y por consiguiente, de la actividad bactericida del suero. Además, se obeservó que la lámina S peresente en las cepas de serotipo 0:11 no activaba la acción del complemento (a diferencia de la lámina A de "A. salmonicida"), sino que el determinante a nivel de las estructuras superficiales de la resistencia a la actividad bactericida del suero en ambos serotipos son los oligosacáridos del núcleo del LPS. Finalmente se demostró que el LPS de todas las "Aeromonas" mesófilas es capaz de activar el complemento, y la razón de ser sensible o resistente a la actividad bactericida del suero se debe a la fijación o no de C3b pegado a la membrana y la consiguiente formación de los complejos C5b-9. / The motile "Aeromonas" group is characterized by their high diversity degree of virulence. These differences are related with molecular structures located on the bacterial surface.Several bacteriophages of motile "Aeromonas" were isolated and characterized from water samples. Thus, it was obtained bacteriophages whose receptors are: the 0 antigen lipopolisaccharide (LPS) of 0:34 serotype strains, the core LPS of 0:34 and 0:11 serotype strains (as soon as "Aeromonas salmonicida" and the monopolar flagellum of motile "Aeromonas".Then, motile "Aeromnas" 0:34 and 0:11 isogenic mutants were obtained by resistance to the specific bacteriophages for different structures, or by mutagenesis with an alquilant agent and contraselection with specific antibodies.Using the different isogenic mutants it was possible to determinate: a) the complement activation pathway in the 0:34 and 0:11 serotypes motile "Aeromonas" is the classical pathway, b) the S-layer present on the 0:11 serotype strains not activate the complement action; but, in contrast, the A-layer present on the "Aeromonas salmonicida" strains active this action, c) the complement activation determinant at the structural bacterial surface are the core LPS oligosaccharides, and d) the LPS present at all motile "Aeromonas" strains activate the classical complement pathway; and the sensibility or resistance from the bactericidal action was due to the presence or absence of C3b linked on the membranes and the subsequence formation of C5b-9 complexes.

Las quinolonas son un grupo de antimicrobianos sintéticos, con un amplio espectro de acción y utilizados con gran éxito para el tratamiento de muy diversas patologías. Es también un grupo en plena fase de desarrollo, donde continuamente están apareciendo nuevas moléculas más activas que las preexistentes en muchos casos.Lamentablemente, la resistencia a quinolonas presenta entre la mayoría de sus moléculas lo que se conoce como resistencia cruzada, o susceptibilidad reducida. Por ello y para poder desarrollar nuevas moléculas dentro de esta familia es importante conocer cuales son los mecanismos de resistencia que presentan los microorganismos, en concreto las bacterias Gram-positivas, frente a estos compuestos. De este modo se podrían diseñar nuevas moléculas que no se vean afectadas por los mecanismos de resistencia ya conocidos. Otro de los parámetros importantes es conocer como las propias quinolonas seleccionan la aparición de mutantes resistentes.Por todos estos motivos, para el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos:1- Investigar las bases moleculares de los mecanismos de resistencia en bacterias Gram-positivas. En concreto, a Staphylococcus aureus un importante patógeno nosocomial, a Streptococcus pneumoniae un patógeno extrahospitalario y a Corynebacterium spp. un patógeno oportunista emergente, perteneciente a la flora habitual de la piel.2- Estudiar la selección in vitro de mutantes resistentes a quinolonas en aislamientos clínicos de S. aureus y S. pneumoniae.3- Determinar el grado de mutagenicidad de las diversas fluoroquinolonas y correlacionarla con la selección de mutantes resistentes. / The quinolones constitutes a group of synthetic antimicrobial agents, with broad spectrum, and have been used with great success for the treatment of a wide variety of pathologies. This group of antimicrobials still under development, and continuously, new molecules more active than the pre-existing ones in many cases are appearing. The resistance to quinolones is present between most of their molecules, this phenomenon is called crossed resistance, or reduced susceptibility. For that reason, to develop new molecules within this family, it is important to know the mechanisms of resistance that the microorganisms presented in front of these compounds, in particular in Gram-positive bacteria. In this way, new molecules could be designed to circumvent the mechanisms of resistance already known. Another important parameter is to know how the quinolones select for resistant mutants. By all these reasons, for the present work the following objectives were considered: 1 - To investigate the molecular bases of the mechanisms of resistance in Gram-positive bacteria. In particular, to Staphylococcus aureus an important nosocomial pathogen, Streptococcus pneumoniae a pathogen causing mainly community-acquired infections and to Corynebacterium spp. an emergent opportunistic pathogen, pertaining to the habitual skin flora. 2 - To study the "in vitro" selection of resistant mutants to quinolones in clinical isolates of S. aureus and S. pneumoniae. To determine the power of mutagenicity of different fluoroquinolones and to correlate it with the selection of resistant mutants.

Helerotrophic (cetoenzymatic and respiratory activities) and autotrophic (photosynthetic activity) metabolism on epilithic strearn biofilms have been measured, analyzed and studied in this thesis.The main objective was to determine the role of the heterotrophs in organic matter use (autochthonous and allochthonous) in Mediterranean streams.In Riera Major, a siliceous forest Mediterranean stream, the capacity to cleave polysaccharides is more important in the epipsammon than in the epilithon. The heterotrophic activity in the surface sediment was higher than in the subsurface sediment. This has been related to the higher quantity and quality of the organic matter which accumulates in the surface sediment. A drastic increase in benthic algal biomass and ectoenzymatic activities was observed in a stream stretch where the riparian vegetation had been removed.The bedrock of La Solana, a calcareous Mediterranean stream, is covered by a thick cyanobacterial crust with a layered structure similar to a stromatolite where different algal patches developed. This structure has a great capacity for organic matter utilization and seems to be adapted to the drastic environmental changes characteristic of Mediterranean streams. Specially, the ectoenzymatic activities were immediately recovered after a dry period.The ectoenzyme kinetics in Riera Major and La Solana was investigated along a seasonal study. In La Solana Vmax values for the three enzymes studied were always higher and the turnover time of substrate hydrolysis was lower (faster) than in the Riera Major which might be related to the more labile substrates for the heterotrophs (organic compounds from the primary producers) while Riera Major is receiving a more recalcitrant material (Ieaf from the riparian vegetation).The ectoenzymatic activity in the epilithic biofiIm of a fourth-order river, the Ter, followed a markedly seasonal pattern, most activities and biomass showing a peak in spring and autumn. Discharge and nutrients were the most important factors for Ihe regulation of biofilm metabolism.The epilithic ectoenzymatic activities were also measured in a Central European mountain stream. Colonization studies (by using clay tiles as substrates for the epilithon) showed that algal material is used by the heterotrophs as an organic matter source. / METODOLOGIA: La tècnica principal utilitzada en aquest estudi és la mesura de les activitats ectoenzimàtiques en els diferents biofilms -epilítics. Epipsàmmícs, crosta cianobacteriana- de nus. En aquest capítol es descriu el desenvolupament d'aquesta metodologia (procés d'incubació, concentració dels substrats, temps d'incubació) i la seva alplicació en l'estudi dels biofilms. Així mateix són descrites les altres mesures metabóliques aplicades en aquest estudi (activitat respirotória, ETS, i activitat fotosintètica, incorporació de H(14)CO3) així com la densitat i biomassa algals (comptatge de cèl.lules, clorofil.la-a) i bacterianes (microscopia de fluorescència) i la mesura dels paràmetres físics i quimícs del riu.

OBJETIVO: Establecer la contribución de los integrones de clase 1 a la resistencia antibiótica en aislados clínicos de enterobacterias de dos contextos epidemiológicos: zoonosis por Salmonella enterica e infección por Klebsiella pneumoniae resistente a amoxicilina/clavulánico (ACL) adquirida en un centro sociosanitario. AISLADOS: Se estudiaron (a) 92 aislados humanos de Salmonella enterica serotipo Typhimurium (ST) recuperados entre 2004 y 2006 en el laboratorio de microbiología del Hospital Verge de la Cinta de Tortosa (35 aislados adicionales de una colección de 2000-2001 para estudios de epidemiología molecular) y 382 aislados de S. enterica de otros serotipos (SNT) recuperados en ese laboratorio en 2001 y entre 2004 y 2009 (b) 45 aislados de K. pneumoniae resistentes a ACL y sensibles a cefazolina y dos resistentes a ACL con fenotipo sugestivo de AmpC plasmídica y resistencia transferible a quinolonas recuperados entre 2006 y 2008 de muestras clínicas de pacientes de un centro sociosanitario de la región sanitaria Terres de l’Ebre. RESULTADOS: (a) Salmonella enterica: El 77,2% de los aislados de ST y el 16,5% de los de SNT fueron resistentes a más de dos familias de antibióticos (MDR). El 3,3% de los aislados de ST y el 41% de los de SNT fueron resistentes a ácido nalidíxico y sólo se constató resistencia a ciprofloxacino en tres aislados de S. Kentucky. Las β-lactamasas presentes en los aislados de ST resistentes a amoxicilina (60,9%) fueron OXA-1 (52%), TEM-1 (32%) y PSE-1 (18,7%) y en los aislados resistentes de SNT (24,3%) TEM-1 (90,3%), CTX-M-9 (1 aislado de S. Virchow y 1 aislado de S. Grumpensis qnrA1 positivo), CTX-M-15 (1 aislado de S. Kapemba) y DHA-1 (1 aislado de S. Newport qnrB4 positivo); ésta es la primera descripción de β-lactamasas de espectro extendido en S. Kapemba y S. Grumpensis. 56 aislados de ST y 35 de SNT, todos excepto uno MDR, poseían integrones de clase 1. En ST los aislados predominantes fueron los que albergaban el integrón de región variable (RV) blaOXA-1-aadA1, cuya frecuencia superaba la registrada para el conjunto de España, seguidos de los aislados con el perfil de integrones aadA2 + blaPSE-1 típico de la presencia de SGI1; la mayoría de aislados con uno u otro perfil de integrones estaban relacionados clonalmente. En SNT se identificaron 11 tipos de integrones en 15 serotipos distintos (incluidos S. Kapemba, S. Mikawasima y S. ser [9,12:Iv:i:-] en los que no se habían descrito previamente), siendo los de RV dfrA1-aadA1, dfrA17-aadA5 y dfrA12-orf-aadA2 los presentes en mayor número de serotipos; en los dos aislados blaCTX-M-9 positivos, este gen estaba ubicado en un integrón complejo cuya RV 1 fue dfrA16-aadA2 en S. Virchow y aadB-aadA2 en S. Grumpnesis. Se detectaron dos variantes de integrones atípicos asociados a sul3: dfrA12-orF-aadA2-cmlA-aad1 (5 aislados de ST y 4 de S. Enteritidis) y estX-psp (2 S. Grumpensis). Este último integrón y el de RV aadA13-sat, también identificado en S. Grumpensis, no se habían descrito anteriormente en S. enterica. (b) Klebsiella pneumoniae centro socio-sanitario: Todos los aislados resistentes a ACL y sensibles a cefazolina producían una penicilinasa resistente a inhibidores, IRT-11 (n=19) u OXA-1 (n=26). Los aislados productores de IRT-11 se agrupaban en tres clones y sólo uno portaba un integrón de clase 1 (RV dfrA12-orf-aadA2); este es el segundo caso comunicado de brote nosocomial por producción de un enzima IRT. Todos los aislados productores de OXA-1 eran MDR y 23 de ellos acarreaban un integrón de clase 1, transferible por conjugación y asociado a qnrS2, de RV [aac (6’)-1b-cr- blaOXA1-catB3-arr3], que en tres aislados era defectivo en 3’. Los aislados se agrupaban en tres clones diferentes según poseyesen integrones de clase 1 convencionales, defectivos o no presentaran integrones. Un integrón de idéntica RV y vinculado a blaDHA-1 y qnrB4 en un integrón complejo de nueva estructura (Genbank GU906294) muy semejante a In37 y del que se diferenciaba por haber sufrido la deleción, por la inserción de IS26, de la región comprendida entre la primera copia de 3’CS y qnrB4, se detectó en otros dos aislados MDR de K. pneumoniae, indistinguibles genéticamente y qnrS2 positivos. / The aim of this work was to assess the contribution of class 1 integrons to antimicrobial resistance in clinical isolates of Enterobacteriaceae of human origin from two epidemiological settings: zoonosis caused by Salmonella enterica and infection due to amoxicillin-clavulanate(ACL)-resistant Klebsiella pneumoniae acquired in a chronic care center. RESULTS: (a) S. Typhimurium: 71 of the 92 isolates recovered from 2004 to 2006 at the microbiology laboratory of Hospital Verge de la Cinta (Tortosa. Catalonia. Spain) were multidrug-resistant (MDR), of which 56 carried class 1 integrons. Isolates bearing the blaOXA-1-aadA1 variable region integron were the commonest among this serovar, showing a higher frequency than that reported in other areas of Spain, followed by isolates exhibiting the integron profile typical of SGI1 (aadA2 + blaPSE-1); most isolates displaying any of these two integron profiles shared identical genotype. Five isolates possessed a sul3-associated class 1 integron whose structure was 5’CS–dfrA12–orfF–aadA2–cmlA1–aadA1–qacH–IS440–sul3. (b) Non-Typhimurium S. enterica: 16.5% of the 382 isolates recovered in 2001 and from 2004-2009 at the same laboratory were MDR and 35 carried class 1 integrons. Overall, 11 different class 1 integrons were identified in 15 distinct serotypes (including S. Kapemba, S. Mikawasima and S. ser [9,12:Iv:i:-], where they had not been previously described), being those with dfrA1-aadA1, dfrA17-aadA5 and dfrA12-orf-aadA2 variable regions the most widely distributed. Two isolates (one qnrA1 positive S. Grumpensis and one S. Virchow) bore a complex class 1 integron linked to blaCTX-M-9 and 4 S. Enteritidis and 2 S. Rissen carried atypical sul3-type integrons (5’CS–dfrA12–orfF–aadA2–cmlA1–aadA1–qacH–IS440–sul3 and 5’CS–estX-psp-IS440–sul3, respectively). The former integron and the aadA13-sat one, detected in S. Grumpensis, had never been reported before in S. enterica. (c) Klebsiella pneumoniae: 47 ACL-resistant (45 cefazolin-susceptible and 2 broad-spectrum-cephalosporin-resistant) isolates, recovered between 2006 and 2008 from patients attending a chronic care center, were investigated. All cefazolin-susceptible isolates produced an inhibitor-resistant penicillinase, IRT 11 (n= 19) or OXA-1 (n=26); 23 OXA-1-producing isolates harboured a class 1 integron, associated with qnrS2, with the aac(6’)- Ib-cr, blaOXA-1, catB3, arr3 cassette arrangement (in 3 cases the integron was defective in 3’ end). An integron with identical structure, linked to blaDHA-1 and qnrB4 within an In37-like complex class 1 integron of novel structure (Genbank GU906294), was found in two epidemiologically closely related qnrS2 positive isolates.

La microbiologia de l’aigua és un camp científic que ha ajudat enormement a millorar la seguretat sanitària de les aigües destinades als usos humans. De fet, augmentar el coneixement sobre les poblacions microbianes presents a l’aigua tant pel que fa a les poblacions autòctones com a les al•lòctones, pot ser de gran ajuda de cara a garantir els estàndards de qualitat, que cada vegada són més exigents. Tanmateix, la gran heterogeneïtat dels sistemes aquàtics i de les problemàtiques lligades als seus usos, fan necessari un estudi individualitzat de les seves poblacions microbianes. Així doncs, el propòsit d’aquesta tesi doctoral va ser estudiar diferents poblacions microbianes associades a diferents sistemes aquàtics: aigües minerals naturals, aigües recreatives i aigües regenerades. Pel que fa a les aigües minerals naturals, es van estudiar les poblacions bacterianes aeròbies heterotròfiques autòctones de tres fonts a 22ºC i 37ºC durant l’hivern i l’estiu. Totes les soques aïllades es van fenotipar mitjançant les microplaques PhP-48 del Phene-Plate System®. Es van poder aïllar un elevat nombre de gèneres poc descrits en aquests ambients. Això afegit als canvis de composició observats entre estacions, confirma que es tracta d’ambients complexos, i que encara hi ha un gran desconeixement sobre la seva composició i dinàmica. D’altra banda, es va confirmar que cada aigua mineral natural conté una microbiota autòctona pròpia, l’estructura i composició de la qual és prou específica per poder diferenciar-la amb mètodes de caracterització fenotípica de la d’altres aigües minerals naturals. D’altra banda es va avaluar la capacitat de la ISO 16266:2006 per identificar Pseudomonas aeruginosa en aigües minerals naturals. En general, el procediment de la ISO 16266:2006 identifica adequadament la major part dels aïllats de P. aeruginosa, llevat dels casos de soques no pigmentades. Els resultats recomanen la incorporació dels assaigs de creixement en agar King A i a 4°C i 42°C en les anàlisis rutinàries d’aigües envasades, i s’aconsella l’ús de les galeries API®20NE en la confirmació d’aquells aïllats que generin dubtes en base als criteris de la ISO 16266:2006. En l’àmbit de les aigües recreatives, es van caracteritzar les poblacions microbianes associades a quatre piscines naturalitzades d’ús privat. Tres d’elles presentaven a l’estiu concentracions d’E. coli o enterococs superiors als límits establerts a les recomanacions. La contaminació fecal relacionada amb la fauna salvatge s’apunta com un contribuïdor significatiu en les piscines naturalitzades privades. A més, el sistema de depuració natural de les piscines naturalitzades sembla ser força limitat alhora de disminuir la contaminació fecal a les piscines, cosa que posa en dubte la seva aplicabilitat en piscines de major volum i obertes al públic. Pel que fa a les aigües regenerades, es van avaluar la capacitat del fenotipatge bioquímic de coliforms fecals i enterococs per determinar l’origen de la contaminació fecal en dues basses d’aigua regenerada utilitzades en la irrigació d’un camp de golf. La caracterització bioquímica i l’estudi d’inactivació van proporcionar evidències que la contaminació fecal detectada a les basses a l’estiu no tenia relació amb les poblacions que entraven a través de l’aigua regenerada, sinó que semblava estar relacionat amb una aportació de material fecal animal, probablement ocells, generat al propi sistema. El fenotipatge bioquímic d’enterococs i coliforms fecals és una eina útil per a l’estudi de l’origen de la contaminació fecal en aquells casos on la càrrega fecal és baixa, fet que és rellevant, tenint en compte que molts altres mètodes presenten problemes en ser aplicats per sota d’aquestes concentracions. En general, els estudis realitzats donen peu a continuar aprofundint en l’estudi de la diversitat microbiana en diferents ambients aquàtics, tant pel que fa a les poblacions autòctones com a les al•lòctones. / "Characterization and diversity of microbial populations associated to with natural mineral waters, recreational waters and reclaimed waters" SUMMARY: Microbial populations from natural mineral waters, recreational waters and reclaimed waters were characterized to increase the knowledge about their indigenous and introduced microorganisms. Regarding natural mineral waters, we characterized the aerobic heterotrophic bacteria from three sources at 22ºC and 37ºC during summer and winter. The study of the similarities showed that growing temperatures and seasons caused significant differences in structures and composition. In addition, several bacterial species were isolated and identified, some of them rarely isolated in natural mineral waters, revealing the complexity and lack of knowledge of these ecosystems. Furthermore, we evaluated the procedure included in ISO 16266:2006 to identify presumptive P. aeruginosa isolates in natural mineral waters. The results showed that ISO 16266:2006 correctly identified 27 out of 29 genotypically confirmed P. aeruginosa isolates, although two false negative identifications were obtained. Additional test assayed such as King A medium, growth tests at 4 °C and 42 °C and API® 20NE correctly discriminated all the studied strains. As far as recreational waters are concerned, we analyzed the microbial populations in four private natural swimming pools. Three of them exceeded the E. coli or enterococci limits stated in the recommendations for natural swimming pools. The concentrations of P. aeruginosa and aerobic heterotrophic bacteria were acceptable. The results suggest that wildlife was an important source of fecal pollution in the pools. Since there is a lack of regulations on these systems, and the health risks are higher than in conventional swimming pools, further research is needed to establish the parameters for ensuring safe bathing in private and public natural swimming pools. Finally, we aimed to identify the origin of the fecal contamination in two reclaimed-water open-air ponds used to irrigate a golf course. Although the concentration of fecal bacterial indicators was low, the biochemical fingerprinting used provided evidence that the origin of the fecal contamination in the ponds was not related to the reclaimed water. Furthermore, a mesocosm assays indicated that none of the microbial fecal indicators was able to regrow in the ponds. Finally, the study highlighted the fact that reclaimed water may be recontaminated in open-air reservoirs.

Esta memoria doctoral forma parte del proyecto financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), el cual tiene entre sus objetivos la búsqueda de nuevas cepas con capacidad para producir emulsionantes naturales poliméricos. Existe un interés real en el aislamiento y caracterización estructural y funcional de nuevos exopolímeros (EPS) obtenidos a partir de microorganismos de ambientes extremos que pudieran ser utilizados con estos fines en diversas industrias. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio de los EPS desde el punto de vista ultraestructural, de cepas antárticas adaptadas al frío, mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) después de procesar las muestras por criofijación a alta presión seguida de criosustitución (HPF-FS). Estas técnicas aportaron numerosos detalles sobre la ultraestructura de las distintas cepas y el material extracelular que producen, al lograr preservar el material biológico próximo a su estado natural. Se observó que este material polimérico extracelular es para la mayoría de las cepas complejo con la presencia de material capsular alrededor de las células y abundantes estructuras vesiculares dispersas en la matriz extracelular secretada por las bacterias. Es la primera vez que se describen y visualizan de manera tan clara y abundante las vesículas de membrana externa (VME) que producen bacterias no patógenas de ambientes naturales antárticos. De igual forma, es la primera vez que se reporta la presencia de estas estructuras en cepas de los géneros Marinobacter y Psychrobacter. Asimismo, se estudió el origen de las proteínas presentes en las VME mediante geles SDS-PAGE donde se mostraron los perfiles proteicos comparados con las proteínas de membrana externa. Esto evidenció el origen de estas VME formadas a partir de esta membrana, al presentar proteínas en la fracción de VME, que comigraron con proteínas que estaban presentes en la fracción de membrana externa, además en el perfil proteico de la membrana externa se detectaron proteínas adicionales que no estaban presentes en VME. Se estudió la influencia de la temperatura sobre la producción y morfología de VME producidas en la cepa S. livingstonensis NF22T Para esta bacteria psicrotolerante se demostró que la temperatura influye en la producción de VME. A bajas temperaturas la cantidad de VME que produce la cepa es mayor, su tamaño es menor y más regular y el perfil electroforético muestra la expresión diferencial de algunas proteínas, viéndose sobrexpresadas proteínas relacionadas con funciones de transporte a nivel de membrana. Se realizaron análisis proteómicos para identificar las proteínas presentes en las VME producidas a 4 y 16 ºC a partir de S. livingstonensis NF22T y S. vesiculosa M7T. Para ambas cepas se identificaron fundamentalmente proteínas de membrana externa y periplasmáticas con diferentes funciones fisiológicas, destacando por su abundancia las proteínas implicadas en el transporte y metabolismo de iones inorgánicos así como las relacionadas en la biogénesis de las envueltas celulares. El material extracelular (EPS) obtenido y purificado a partir de Shewanella vesiculosa M7T presentó mayor actividad emulsionante frente a aceites comestibles que los emulsionantes comercializados goma arábiga y xantano y su caracterización reveló que contiene abundantes VME y polímeros polisacarídicos, siendo sus componentes químicos mayoritarios azúcares neutros y aminados, lípidos de membrana y aminoácidos. / The present work is part of the research project (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), which has among its objectives the search for new strains capable to produce natural polymeric emulsifiers. There is a real interest in the isolation and structural and functional characterization of new exopolymers (EPS) derived from microorganisms of extreme environments that could be used for these purposes in various industries. Many Gram-negative, cold-adapted bacteria from the Antarctic environment produce large amounts of extracellular matter, which has potential biotechnology applications. We examined the ultrastructure of extracellular matter from Antarctic bacteria by transmission electronic microscopy after high pressure freezing and freeze substitution. All analyzed extracellular matter appeared as a netlike mesh composed of a capsular polymer around cells and large numbers of outer membrane vesicles (OMV), which have not been described for members of the genera Psychrobacter and Marinobacter so far. OMV showed the typical characteristics described for these structures, and seemed to be surrounded by the same capsular polymer as that found around cells. The analysis of OMV proteins from Antarctic strains by SDS-PAGE showed different banding profiles in OMV compared to the outer membrane, suggesting some kind of protein sorting during membrane vesicle formation. For the psychrotolerant bacterium, S. livingstonensis NF22T, the growth temperature seemed to influence the amount and morphology of OMV. In an initial attempt to elucidate the functions of OMV from S. livingstonensis NF22T and S. vesiculosa M7T we conducted a proteomic analysis on membrane vesicles obtained at 4 and 16°C. At both temperatures, OMV were highly enriched in outer membrane proteins and periplasmic proteins related to nutrient processing and transport in Gram-negative bacteria, suggesting that OMV could be related with nutrient sensing and bacterial survival. Differences were observed in the expression of some proteins depending on incubation temperature but further studies will be necessary to define their roles and implications in the survival of bacteria in the extreme Antarctic environment. The extracellular material (EPS) obtained and purified from Shewanella vesiculosa M7T had a higher emulsifying activity against edible oils than commercial emulsifiers like arabic and xanthan gums. Characterization of this EPS revealed that it contains abundant OMV and polysaccharides polymers, with neutral and amino sugars, membrane lipids and aminoacids as its major chemical components.

La sangre obtenida en el matadero es un producto altamente contaminado que requiere un procesamiento inmediato si se pretende utilizarla como insumo alimentario en la fabricación de productos destinados al consumo humano. Si bien es cierto que los sistemas de higienización podrían ser muy eficientes desde el punto de vista de calidad microbiológica, su instalación en la línea de sacrificio comportaría muchas dificultades desde el punto de vista técnico y en algún caso sería muy costoso. La bioconservación podría ser una alternativa para mejorar la calidad microbiológica de la sangre, alargar su vida útil y reducir las posibilidades de procesamiento inmediato. El presente estudio nos permitiría formular la posibilidad de aplicar la bioconservación en sangre de cerdo procedente de matadero industrial, utilizando bacterias ácido lácticas (BAL) como cultivo bioprotector, para lo cual se aislaron cepas de BAL autóctonas y se confeccionaron dos colecciones una de BAL mesófilas y otra de psicrótrofas.Se evaluó el potencial antagonista de la colección de BAL mesófilas y psicrótrofas a 30ºC y a 15ºC respectivamente frente a bacterias contaminantes habituales de este subproducto. Las BAL que demostraron antagonismo en placa (7,1% a 30ºC y 11% a 15ºC) fueron seleccionadas para evaluar el potencial antagonista en sangre, donde el efecto inhibitorio se vio favorecido por la adición de un 2% glucosa. S.aureus y P. fluorescens fueron los indicadores más inhibidos por las cepas mesófilas, en algunos casos con reducciones superiores a 7 unidades logarítmicas. En condiciones psicrótrofas la bacteria más sensible a la presencia de BAL fue Bacillus sp., donde 8 de las 11 BAL ensayadas permitieron reducciones superiores a 4 logs y 1cepa incluso superiores a 7 logs; se obtuvieron reducciones máximas de 3 logs de E.coli y Pseudomonas fue inhibida por todas las BAL ensayadas, en algún caso con reducciones superiores a 5 logs.Las 5 que cepas que presentaron el espectro de inhibición más amplio en condiciones mesófilas y 7 en condiciones psicrótrofas frente a los microorganismos indicadores contaminantes de sangre de matadero se identificaron mediante técnicas moleculares por comparación de la secuencias correspondientes al gen que codifica la síntesis de 16S ARNr (16S ADNr) con las secuencias publicadas en las bases de datos. De las 7 cepas antagonistas en condiciones psicrótrofas 5 se identificaron como Lactococcus garvieae y 2 como Enterococcus malodoratus/gilvius raffinosus. Todas las BAL con potencial antagonista en condiciones mesófilas pertenecían al género Lactobacillus, 3 de elllas se identificaron como Lactobacillus murinus/animalis y una se identificó como Lactobacillus reuteri. TA20 que tuvo un gran espectro de inhibición a ambas temperaturas se identificó como Lactococcus garvieae.En este estudio se evaluaron tres métodos de conservación a largo plazo de las cepas que mostraron potencial antagonista. Se comparó la liofilización, la atomización frente a la congelación a -80ºC que era método que se había utilizado hasta el momento para conservar ambas colecciones de BAL. En general, los métodos de deshidratación (atomización y liofilización) y mantenimiento en refrigeración a 5ºC de los cultivos deshidratados se han mostrado más eficaces que la congelación. / Blood from slaughtered animals is a product with a high contamination level that requires an immediately processing after collection if the object is to use it as a food ingredient destined to human consumption. Nevertheless, even if hygienic collection systems used in abattoirs were be efficient enough to control the microbiological quality, their installation in the slaughtered line would be technically complicate and in some case would be so expensive.Bioconservation is an alternative to improve microbiological quality, to extend its shelf life and reducing the possibility of immediate processing after collection.The present study would permit us to formulate the possibility to applicate bioconservation in porcine blood from industrial abattoirs, using lactic acid bacteria (LAB) strains as biopreservative cultures. So a mesophylic and a psicrotrophyc LAB strains collections were confectioned.The antagonistic capacity toward usual contaminant bacteria in blood of the mesophylic and psicrotrophyc collections at 30ºC and 15ºC respectively were investigated. The LAB that demonstrated the widest inhibitory spectrum in agar plate evaluation (7,1% at 30ºC and 11% at 15ºC) were screened in order to evaluate their inhibitory activity in blood, where was observed that the addition of glucose at 2% had a positive effect in the inhibitory levels. The most sensible indicators to the mesophylic LAB were S. aureus and P. fluorescens. In some cases it was obtained reductions of 7 logarithmic units. In psicotrophic conditions the most sensible bacteria to LAB presence was Bacillus spp. where 8 of the 11 strains assayed inhibited in more than 4 logarithmic units and 1 of them inhibited this indicator in 7 logarithmic units..It was obtained maxim reductions of 3 logs versus E. coli. P. fluorescens was inhibited by all the assayed strains and in some case it was obtained reductions superior to 5 logs.The 5 mesophylic and 7 psictrophyc strains that demonstrated the widest inhibitory spectrum toward the indicators microorganisms from abattoir blood were identified using molecular techniques though comparison of the gene sequences that codify the synthesis of 16S RNAr (16S DNAr) with the sequences in the data base.5 from the 7 strains with antagonistic capacity in psicotrophyc conditions were identified like Lactococcus garvieae and the other two strains were identified like Enterococcus malodoratus/gilvius/raffinosus. All the antagonistic LAB in mesophylic conditions belonged to genus Lactobacillus, 3 of them were identified like Lactobacillus murinus/animalis and one of them as Lactobacillus reuteri. TA20 that had a widest spectrum at both assay temperatures was identified as Lactococcus garvieae.In this study there were evaluated three methods of conservation of cultures belonged to those LAB that demonstrated antagonistic capacity. It was compared freeze-drying, spray drying against freezing at -80ºC, that is the method used to conserve both LAB collections. Generally, the dehydration methods (freeze-drying and spray drying) and maintaining in refrigeration at 5ºC of dehydrated cultures showed to be better than freezing at -80ºC.