Graphitische Karbonitride sind organische, kovalent gebundene, geschichtete und kristalline Halbleiter mit einer hohen thermischen und chemischen Stabilität. Diese Eigenschaften machen 2D Schichten der graphitischen Kristalle potentiell nützlich für das Ziel, Limitationen von organischen 0D Molekularen und 1D polymerischen Halbleitern zu überwinden. Trotz dieser interessanten Eigenschaften haben nur wenige Publikationen erfolgreich graphitische Karbonitride in optoelektronischen Bauteilen eingesetzt. Um die Vorteile dieser Materialien nutzbar zu machen, wurden bessere Synthesebedingungen gesucht. Die Verwendung von einem Iod-Eutektikum zeigt, dass Anionen mit einem größeren Radius als Bromid nicht für die Stabilisation von graphitischen Karbonitriden geeignet sind. Das Optimieren der Synthesebedingungen von Poly(triazin-imid)-LiBr resultiert in der Reduzierung von einem kohlenstoffreichen Zersetzungsprodukt bei vollständiger Kondensation. Das Untersuchen der elektronischen Struktur mit ab initio Berechnungen ergibt, dass der elektronische VB-CB-Übergang verboten ist. Dies resultiert daraus, dass die Zustände des obersten Valenzbandes nichtbindender Natur sind. Ein Band aus nichtbindenden Elektronen als oberstes Valenzband ist vor allem aus „lone-pair semiconductors“ aus der sechsten Hauptgruppe bekannt. In der Welt organischer Halbleiter wurde dieses Phänomen bisher nicht beobachtet. Die geringe makroskopische elektrische Leitfähigkeit der PTI-Filme wurde mit der Leitfähigkeit auf Nanoebene verglichen, woraus gefolgert werden kann, dass der Ladungsträgertransport durch den nanokristallinen Charakter an den Kristall-Kristall Übergängen gestört wird. Die elektronische Leitfähigkeit, Mobilität der Ladungsträger sowie die Ladungsträgerdichte wurden untersucht. Die Energie Niveaus legen nahe das Elektronentransport in der Präsenz von Sauerstoff möglich ist. Die erste Applikation eines kovalenten organischen Netzwerks in einer organischen lichtemittierenden Diode ist gezeigt worden. / Graphitic carbon nitrides are organic covalently-bonded, layered, and crystalline semiconductors with high thermal and oxidative stability. These properties make 2D layers of graphitic carbon nitrides potentially useful in overcoming the limitations of 0D molecular and 1D polymer semiconductors. Only few reports have shown them being employed in optoelectronic applications. With the goal to find better reaction conditions that enable higher product quality from the ionothermal synthesis the size effect of anions is studied by using an iodide eutectic instead of bromide or chloride eutectic. The highest crystalline condensation product obtained is melem, revealing that the large iodide anion is not capable of stabilizing a graphitic structure. Studying the synthesis conditions of poly(triazine imide) (PTI), the best characterized graphitic carbon nitride in literature, it is revealed that the brown discoloration of the product is due to a carbon rich side product. Reduction of reaction temperature and increase of reaction time allows omittance of carbonisation. Analyzing the electronic structure with ab initio calculations one finds that the lowest energy electronic transition in PTI is forbidden due to a non-bonding uppermost valence band. A uppermost non-bonding valence band is most reminiscent of lone-pair semiconductors and unknown in the world of organic semiconductors making PTI the first organic lone-pair semiconductor. The low electrical conductivity of PTI derivatives is compared to nanoscale conductivity values. The results indicate that macroscopic conductivity is hampered by the nano-crystalline character due to charge carrier trapping at crystal interfaces. The effective mobility is in the range of amorphous organic semiconductors with an unexpectedly high carrier density. The energy levels in PTI-LiBr potentially enable environmentally stable n-transport. The first successful Application of a covalent organic framework in a organic light emitting diode is presented.

CRISPR-Cas ist ein adaptives Immunsystem, dass Bakterien und Archaeen vor eindringenden Nukleinsäuren schützt. Es besteht aus einem sogenannten CRISPR-Array, der als genetisches Gedächtnis vorangegangene Infektionen speichert und einem cas Lokus, welcher für die Abwehr essentielle Proteine codiert. Das CRISPR-assoziierte Protein 9 (Cas9) des Typ II CRISPR-Cas Systems aus Streptococcus pyogenes ist heutzutage das Mittel der Wahl für Gentherapie und Genom-Modifikationen. Allerdings gibt es nach wie vor Probleme mit der Ungenauigkeit dieses Systems, welche für eben genannte Ansätze behoben werden müssen. Aus diesem Grund ist es besonders wichtig zu verstehen, in welcher Weise die Spezifität von Cas9 beeinflusst wird. In dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen für eine spezifische Erkennung der Zielsequenz durch drei verschiedene Cas9 Proteine des Typs II-A und ein Cas12a Protein des Typs V-A CRISPR-Cas Systems untersucht. Wir zeigen, dass Arginin Seitenketten der sogenannten „bridge“ Helix in Cas9 von S. pyogenes eine wichtige Rolle in der Bindung und Spaltung der DNS spielen. Diese Seitenketten können in zwei Gruppen unterteilt werden, welche die Spezifität von Cas9 entweder vergrößern oder verkleinern. Die Aminosäuren R63 und R66 reduzieren die Spezifität von Cas9 indem sie den sogenannten R-loop in Anwesenheit einer Fehlpaarung stabilisieren. Wir zeigen außerdem, dass Q768 eine erhöhte Toleranz von Cas9 zu Fehlpaarungen an Position 15 der Zielsequenz vermittelt und dass das Entfernen dieser Aminosäure die Spezifität von Cas9 im Bereich der Zielsequenz, die am weitesten von der PAM entfernt ist, erhöht. Eine Kombination der Mutationen der oben genannten Arginin und Glutamin Seitenketten führt zur Erhöhung der Gesamtspezifität von Cas9. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zum Verständnis bei, wie Cas9 Fehlpaarungen innerhalb der Zielsequenz detektiert und können dabei helfen weitere Strategien für eine verbesserte Spezifität von Cas9 zu entwickeln. / CRISPR-Cas (CRISPR-associated) systems are adaptive immune systems that have evolved in bacteria and archaea for protection against invading nucleic acids. They consist of a CRISPR array, where the genetic memory of the infection is stored and ultimately transcribed and processed into CRISPR RNAs (crRNAs), and of an operon of cas genes that encodes the Cas proteins. This thesis is focused on class 2 CRISPR-Cas systems that employ single RNA-guided nucleases in the interference phase. Dual-RNA guided CRISPR-associated protein 9 (Cas9) of the type II CRISPR-Cas system has become the tool of choice for genome editing applications in life sciences. However, off-target cleavage by Cas9 is one major issue that needs to be addressed for applications of the CRISPR-Cas9 technology for therapeutic purposes. Therefore, understanding the features that govern Cas9 specificity is of great importance. In this thesis, seed sequence requirements of three Cas9 proteins from the class 2 type II-A and one Cas12a protein from the class 2 type V-A CRISPR-Cas system have been investigated. We analyze the influence of mismatches and show that they affect target binding and/or cleavage by S. pyogenes Cas9. Additionally, we demonstrate that the arginine residues from the bridge helix of S. pyogenes Cas9 are important for target DNA binding and cleavage. Furthermore, these residues comprise two groups that either increase or decrease Cas9 sensitivity to mismatches i.e. specificity. R63 and R66 reduce Cas9 specificity by stabilizing the R-loop in the presence of mismatches. We also show that Q768 mediates Cas9 tolerance to a mismatch at target position 15 and removal of Q768 increases Cas9 specificity in the PAM-distal part of the target. Combination of arginine mutations and Q768A increased overall the sensitivity to mismatches. The results of this thesis elucidate how Cas9 senses PAM-adjacent mismatches and provide a basis to develop strategies for Cas9 variants with enhanced specificity.

Als Reaktion auf DNA-Schäden aktivieren Zellen den NF-κB-Signalweg, der die apoptotischen Reaktionen reguliert. Die Signalwege, die die zytoplasmatischen NF-κB-Dimere als Reaktion auf eine breite Palette von Immun- und Entzündungssignalen aktivieren, sind umfassend untersucht worden; die molekularen Mechanismen, die die Kern-DNA mit der zytoplasmatischen Aktivierung von NF-κB verbinden, sind jedoch relativ wenig bekannt. Hier haben wir mithilfe genomweiter siRNA-Screens systematisch Regulatoren und wesentliche Komponenten identifiziert, die für die durch DNA-Schäden ausgelöste Aktivierung des NF-κB-Signalwegs erforderlich sind. Von den identifizierten Komponenten konnten wir nachweisen, dass TSG101 die NF-κB-Aktivierung durch DNA-Schäden reguliert. Wir konnten zeigen, dass TSG101 mit PARP1 interagiert und dessen katalytische Aktivität kontrolliert. Die Ausrichtung auf TSG101 führt dazu, dass PARP1 in DNA-Läsionen gefangen wird und die durch DNA-Schäden ausgelöste NF-κB-Aktivierung vermindert wird. In Abwesenheit von TSG101 fehlen den Zellen PAR-abhängige zelluläre Reaktionen und sie sind für die durch DNA-Schäden ausgelöste Apoptose sensibilisiert. Die signalinduzierte Verarbeitung von p100 ist ein wesentlicher Schritt für die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-κB-Wegs. Trotz seiner Bedeutung für die Immunantwort, die Entwicklung und verschiedene bösartige Erkrankungen wurden die Komponenten des Ubiquitin-Proteasom-Systems, die die Verarbeitung von p100 regulieren, nie mit endogenen Systemen analysiert. In dieser Studie haben wir mit Hilfe eines CRISPR-Cas9-basierten Knock-out-Screening-Systems nicht-redundante E3-Ligasen identifiziert, die für die signalinduzierte p100-Verarbeitung erforderlich sind. Außerdem haben wir das TWEAK-induzierte Ubiquitinom mittels Massenspektrometrie charakterisiert. / In response to DNA damage, cells activate the NF-κB pathway that regulates the apoptotic responses. The signaling pathways that activate the cytoplasmic NF-κB dimers in response to a wide range of immune and inflammatory signals have been investigated extensively; however, the molecular mechanisms that link the nuclear DNA with cytoplasmic activation of NF-κB is relatively less known. Here we systematically identified regulators and essential components required for the DNA damage-induced activation of the NF-κB pathway using genome-wide siRNA screens. Amongst the identified components, we validated that TSG101 regulates the NF-κB activation by DNA damage. We showed that TSG101 interacts with PARP1 and controls its catalytic activity. Targeting TSG101 consequently achieves trapping of PARP1 in DNA lesions and diminishes the DNA damage-induced NF-κB activation. In the absence of TSG101, cells lack PAR-dependent cellular responses and are sensitized to DNA damage-induced apoptosis. The signal-induced processing of p100 is an essential step for the activation of the non-canonical NF-κB pathway. Despite of its importance in immune responses, development, and several malignancies, the ubiquitin-proteasome system components regulating p100 processing were never analyzed using endogenous systems. In this study, utilizing a CRISPR Cas9 based knock out screening system we identified non-redundant E3 ligases required for the signal-induced p100 processing. We also characterized the TWEAK-induced ubiquitinome via mass spectrometry.

Im ersten Teil der Arbeit wurde die Verwendung von Präkursor microRNA-21(pre-miR21)-spezifischen Peptidnukleinsäure(PNA)-Sonden zur Inhibierung der Dicer-vermittelnden miRNA-Reifung untersucht. Im Gegensatz zur Arbeitshypothese wurde bei der Behandlung von Zellen mit den pre-miR21-spezifischen PNA-Sonden jedoch keine Änderung des miR-21 Niveau beobachtet. Um die Hybridisierung der Sonde an die Zielsequenz nachzuweisen, wurden fluorogene Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (FIT-Sonden), unter Verwendung des Interkalationsfarbstoffes Thiazolorange (TO), entwickelt. Wie vorläufige Ergebnisse zeigen, könnte die TO-PNA Sonde für die Unterscheidung von Zellen mit hohem miR-21-Gehalt nützlich sein, aber eine weitere Verbesserung der Sonde ist noch erforderlich. Im nächsten Teil der Arbeit wurden neuartige FIT-Sonden für die Analyse der Dicer-vermittelnden miR-21-Reifung entwickelt. Um die gleichzeitige Detektion der entstehenden pre-miR21 und der antisense miR-21 (as-miR21) in Echtzeit zu ermöglichen, wurden die Verwendung von spektral unterscheidbaren FIT-Sonden auf Quinolinblau(QB)-und TO-Basis getestet. Das entwickelte Sonden-Paar ermöglichte die Analyse der rhDicer-Reaktion. Dabei wurde entdeckt, dass die rhDicer-Reaktion an der in vitro transkribierten pre-miR21 unspezifisch spaltet. Zusätzlich wies die kürze as-miR21 spezifische TO-Sonde (7nt) eine Sensitivität gegenüber der Anwesenheit des Ago-2 Proteins auf. In der Zukunft könnten die entwickelten Sonden für schnelle in vitro Screenings neuer Dicer-und Ago-2-Inhibitoren angewendet werden. Im zweiten Teil der Dissertation wurde die Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren (small molecular inhibitors, SMIs) getestet. Zusammenfassend könnten die zwei identifizierten SMIs für die Inhibierung der miR-122-Reifung genutzt werden, allerdings bleibt die Spezifität der SMIs fraglich und mögliche off-target-Effekte können nicht ausgeschlossen werden. / MicroRNAs (miRNAs) represent small non-coding RNA molecules that mostly negatively regulate gene expression. To yield mature miRNAs, primary miRNA precursors go through two consequent cleavages by Drosha and Dicer RNAse. This work describes the development of tools for inhibition und monitoring the dicer-mediated miRNA processing. Here, peptide nucleic acid (PNA) based probes, targeting the precursor miR-21 (pre-miR21), were designed for inhibition the dicer-mediated miR-21 maturation. In contrast, no change in miR-21 level was observed after cell treatment with the pre-miR21 specific PNA probes. To detect the probe/target hybridization state, the fluorogenic forced intercalation (FIT) PNA probes, bearing thiazole orange dye (TO), were developed. As preliminary results show, the FIT PNA probe might be useful for discrimination of high miR-21 abundant cells, but further probe improvement is still required. To monitor the pre-miR21 cleavage, the combination of the two spectrally distinguishable FIT PNA probes, bearing quinoline blue (QB) and TO fluorophore, was developed to allow the rapid and simultaneous detection of pre-miR21 and antisense mature miR-21 (as-miR21). The probe set was successfully used for detection of the modelled dicer reaction. However, the monitoring of rhDicer reaction have revealed that rhDicer cleaves the in vitro transcribed pre-miR21 nonspecifically. Additionally, the short as-miR21 specific TO PNA probe (7nt) was responsive to the presence of Ago-2 protein. In future, the developed probes can be applied for the fast in vitro screening of new Dicer and Ago-2 inhibitors. In the second part of this work, an alternative approach, small molecular inhibitors (SMIs), was tested. Two identified pre-miR122-targeting SMIs might be used for inhibition of the miR-122 maturation, although, a specificity of these SMIs remains questionable and possible off target effects cannot be excluded.

In dieser Arbeit wurde eine neue Templat-gesteuerte fluorogene Peptidverknüpfung vorgestellt. Speziell modifizierte Peptidfragmente wurden durch die Bindung an ein Templatmolekül zu einer chemischen Reaktion befähigt, wodurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt werden konnte. Das erlaubte eine Reaktionskontrolle in Echtzeit. Die fluorogene Peptidverknüpfung konnte erfolgreich mit einem Coiled-coil Peptid-Model etabliert werden. Dabei wurden Peptidthioester derart modifiziert, dass in räumlicher Nähe zur Thioestergruppe ein Fluorophor platziert wurde und die acetylierte Mercaptogruppe als Fluoreszenzlöscher agierte. Die modifizierten Thioester können nach dem Reaktionsmechanismus der nativen chemischen Peptidverknüpfung (NCL) unter der Bildung einer Amidbindung mit N-terminalen Cysteinylpeptiden reagieren. Die fluoreszenzlöschende Mercaptogruppe verlässt dabei den Peptidthioester als Nukleofug, wodurch ein fluoreszierendes Reaktionsprodukt entsteht. Die Templat-gesteuerte Durchführung dieser fluorogenen nativen chemischen Peptidverknüpfung (fNCL) erlaubte die Reaktionsdurchführung bei sehr geringen Peptidkonzentrationen. Die Synthese der benötigten fluorogenen Thioester gelang zum einem durch die Anwendung der selbstreinigenden Thioestersynthese mit einer Tandem-Entschützungs-Kupplungs-Strategie und zum Anderen mit Hilfe eines synthetisierten fluorogenen Azid-Thioesterbausteins, welches mit einem Alkin-modifizierten Peptid zur Reaktion gebracht wurde. Neben Coiled-coil Peptiden, wurden auch doppelsträngige DNA und Antikörper als Template für die fNCL eingesetzt. Die fNCL konnte zur Durchführung eines Abstandsscreenings angewendet werden. Es wurde eine Abhängigkeit zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Abstand der Bindungsstellen im Templat für zwei reaktive Peptidbindungspartner gezeigt. Durch diese Untersuchung konnte die räumliche Abstandsgrenze zwischen zwei Bindungsstellen in einem Templatmolekül bestimmt werden, die keinen Templat-Effekt mehr beobachten lässt. / In this thesis a new template-controlled fluorogenic peptide linkage was presented. Specially modified peptide fragments were enabled to undergo a chemical reaction by binding to a template molecule, which resulted in a fluorescent signal. This allowed a reaction control in real time. The fluorogenic peptide linkage was successfully established using a coiled coil peptide model. Peptide thioesters were modified in such a way that a fluorophore was placed in close proximity to the thioester group and the acetylated mercapto group acted as fluorescence quencher. These modified thioesters can react with N-terminal cysteinyl peptides according to the reaction mechanism of the native chemical ligation (NCL) under the formation of an petide bond. The fluorescence-quenching mercapto group leaves the peptide thioester as a leaving group, resulting in a fluorescent reaction product. Template-controlled execution of this fluorogenic native chemical ligation (fNCL) allowed the reaction to be performed at very low peptide concentrations. The synthesis of the required fluorogenic thioesters was achieved on the one hand by applying a self-purifying thioester synthesis with a tandem-protective coupling strategy and on the other hand by using a synthesized fluorogenic azide thioester building block which was reacted with an alkine-modified peptide. In addition to the coiled coil peptides, double-stranded DNA and antibodies were used as templates for fNCL. Finally, the fNCL could be used to perform a distance screening. A dependence between the reaction rate and the distance between the binding sites in the template for two reactive peptide binding partners was shown. By this investigation a distance between two binding sites in a template molecule could be determined, which does not show a template effect anymore.

Transglutaminases (TGs) catalyze the covalent crosslinking of proteins via isopeptide bonds. The most prominent isoform, TG2, is associated with physiological processes such as extracellular matrix (ECM) stabilization and plays a crucial role in the pathogenesis of e.g. fibrotic diseases, cancer and celiac disease. Therefore, TG2 represents a pharmacological target of increasing relevance. The glycosaminoglycans (GAG) heparin (HE) and heparan sulfate (HS) constitute high-affinity interaction partners of TG2 in the ECM. Chemically modified GAG are promising molecules for pharmacological applications as their composition and chemical functionalization may be used to tackle the function of ECM molecular systems, which has been recently described for hyaluronan (HA) and chondroitin sulfate (CS). Herein, we investigate the recognition of GAG derivatives by TG2 using an enzyme-crosslinking activity assay in combination with in silico molecular modeling and docking techniques. The study reveals that GAG represent potent inhibitors of TG2 crosslinking activity and offers atom-detailed mechanistic insights.

Die Verwendung von nukleinsäuretemplatgesteuerten Reaktionen stellt einen innovativen Ansatz zur Therapie von Krankheiten dar, deren Ursprung in einer genetischen Veränderung von Zellen liegt. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgte eine Weiterentwicklung der RNA-templatgesteuerten Acyltransferreaktion nach Seitz et al. hinsichtlich des Aufbaus von aromatischen Amidbindungen, wie sie in vielen niedermolekularen Wirkstoffen vorkommen. Als Modellverbindungen dienten die Bcr-Abl-Tyrosinkinaseinhibitoren Nilotinib, Ponatinib und GZD824, die durch zentrale Benzanilidmotive charakterisiert sind und zur Therapie der chronischen myeloischen Leukämie eingesetzt werden. Das konzipierte Reaktionssystem beruht auf dem Mechanismus der nativen chemischen Ligation, weswegen die Bcr-Abl-Inhibitoren durch die Einführung einer Thiolgruppe modifiziert werden mussten. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikation in den meisten Fällen nur zu einer geringen Beeinträchtigung der biologischen Aktivität führt. Der RNA-templatgesteuerte Aufbau der Benzanilidstrukturen konnte sowohl mit PNA- als auch mit DNA-verknüpften Inhibitorfragmenten basierend auf Ponatinib und GZD824 erzielt werden. In Gegenwart eines komplementären RNA-Templats erfolgte die benachbarte Hybridisierung der reaktiven Konjugate, infolgedessen ein Benzoyltransfer von einem thioestermodifizierten Donor auf ein ortho-Mercaptoanilinderivat als Akzeptor stattfand. Mit PNA/PNA-Reaktionssystemen wurde auch in Abwesenheit des RNA-Templats eine signifikante Produktbildung beobachtet, was auf hydrophobe Wechselwirkungen der Konjugate zurückgeführt wurde. Unter Verwendung von DNA/DNA- bzw. PNA/DNA-Konjugatpaaren blieb die templatunabhängige Produktbildung hingegen ausreichend gering. Die entsprechenden Reaktionssysteme wurden hinsichtlich der erzielten Produktausbeuten optimiert, wobei sowohl die Linkerlänge bzw. -struktur der reaktiven Konjugate als auch die Templatarchitektur variiert wurde. / The use of nucleic acid-templated reactions represents an innovative approach to the therapy of diseases that originate in genetic alterations of cells. In this work, the RNA-templated acyl transfer reaction invented by Seitz et al. was extended towards the formation of aromatic amide bonds which occur in a variety of small molecule drugs. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors nilotinib, ponatinib, and GZD824 were used as model compounds, as they are characterized by central benzanilide motifs and find application in the treatment of chronic myeloid leukemia. The designed reaction system is based on the mechanism of native chemical ligation which required the modification of the Bcr-Abl inhibitors by introducing a thiol group. It was shown that thiolation affected the biological activity only moderately. The RNA-templated formation of the benzanilide structures was achieved with both PNA- and DNA-linked inhibitor fragments of ponatinib and GZD824. The presence of a complementary RNA template enabled adjacent binding of the reactive conjugates, triggering a rapid benzoyl transfer from a thioester-linked donor to an ortho-mercaptoaniline derivative as an acceptor. With PNA/PNA reaction systems, significant product formation was observed in absence of the RNA template, which was attributed to hydrophobic interactions between the conjugates. However, the template-independent product formation remained low when DNA/DNA or PNA/DNA conjugate pairs were used. The product yields of the corresponding reaction systems were optimized by varying the linker length and structure of the conjugates as well as the template architecture.

Die Fähigkeit Nukleinsäuren in lebenden Organismen nachzuweisen und zu visualisieren, ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse. Die Forschungsgruppe von Prof. Dr. Oliver Seitz hat zu diesem Zweck fluorogene FIT-Hybridisierungssonden entwickelt, die die besondere Eigenschaft der Cyaninfarbstoffe Thiazolorange und Chinolinblau nutzen, stärker zu fluoreszieren, wenn sie in die beengte Umgebung eines Nukleinsäureduplex aus Sonde und spezifischer Zielsequenz eingebracht werden. Obwohl FIT-Sonden eine gute Fluoreszenzverstärkung und Spezifität aufweisen, wäre eine weitere Verbesserung ihrer Helligkeit und des Signal-Hintergrund-Verhältnisses wünschenswert. Um dies zu erreichen, wurde in dieser Arbeit ein Ansatz untersucht, bei dem FIT-Sonden mit zwei Fluorophoren desselben Typs ausgestattet werden (FIT2-Strategie). Dies sollte sowohl die Helligkeit der Sonde erhöhen, als auch die Fluoreszenz im Einzelstrang und bei Hybridisierung mit fehlgepaarter RNA durch eine Mischung aus kontaktvermittelter Fluo-reszenzlöschung und strahlungsfreiem Energietransfer verringern. Verschiedene Sonden-längen, Farbstoffabstände und -positionen wurden untersucht und es konnte bestätigt werden, dass FIT2-Sonden eine höhere Extinktionskoeffizienten, größere Fluoreszenzver-stärkung und eine bessere Selektivität aufweisen als einfach markierte Sonden. Außerdem behalten sie ihre Fähigkeit zur Unterscheidung von Match- und Mismatch-Zielen in visko-sem Zelllysat besser bei. Zudem konnte gezeigt werden, dass das FIT2-Konzept durch Hinzufügen eines hybridisie-rungsunempfindlichen Cyanin 7 Farbstoffs zu den Sonden dahingehend erweitert werden kann, dass eine ratiometrische Detektion der hybridisierten Sonde möglich ist und Hellig-keitsunterschiede aufgrund von lokalen Schwankungen der Sondenkonzentration bei der Bildgebung lebender Zellen korrigiert werden können. Mit diesen qFIT2-Sonden konnten Jurkat und CCRF-CEM T-Zellen in einem Mikroskopie-basierten Experiment unterschieden werden. / The ability to detect and visualize nucleic acids in living organisms is crucial for under-standing cellular processes. For this purpose, the research group of Prof. Dr. Oliver Seitz has introduced fluorogenic forced intercalation (FIT) hybridization probes, which exploit the unique property of the cyanine dyes thiazole orange and quinoline blue to exhibit increased fluorescence when placed in the constrained environment of a nucleic acid du-plex formed between probe and specific target sequence. Although FIT probes demon-strate solid fluorescence enhancement and specificity, further improvement of their abso-lute brightness and signal-to-background ratio would be desirable. To achieve this, the present thesis investigated an approach that equips FIT probes with two identical fluorophores (FIT2 strategy). This should on the one hand increase probe brightness, while simultaneously reducing fluorescence in the single strand and when hy-bridized to mismatched RNA, through a combination of contact-mediated quenching and non-radiant energy transfer. Various probe lengths, dye-dye distances and positions were screened, and it could be confirmed that FIT2 probes have higher extinction coefficients, greater fluorescence enhancement and better selectivity than their mono-dye counter-parts. Moreover, they better retain their ability to discriminate match and mismatch tar-gets in viscous cell lysate. Finally, it was demonstrated that the FIT2 concept can be extended by adding a hybridiza-tion-insensitive Cyanine 7 dye to the probes, allowing ratiometric detection of hybridized probe and correction of brightness differences due to local fluctuations in probe concen-tration during live-cell imaging. Using these qFIT2 probes, Jurkat and CCRF-CEM T-cells could be distinguished in a microscopy-based experiment.

Die Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie sind zentrale Techniken zur Analyse von Zellen, Geweben und Organen. Besonders in der Immunologie werden sie zur Identifizierung und Charakterisierung von Biomolekülen mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper verwendet. Fluoreszenzmarker müssen je nach Anwendung hohe Helligkeit, geringe Größe und minimierte Löschung des Signals aufweisen. Stark markierte Konstrukte leiden jedoch oft unter Fluoreszenzlöschung oder großen Molekularmassen. Diese Arbeit untersucht verzweigtes Polyethylenglykol (PEG) als Träger für Fluorophore. PEG-Ketten wurden als räumliche Trennmittel identifiziert und an Aminodextran gekoppelt, wodurch hochgradig multimerisierte Fluorophor-PEG-Dextran-Zwischenprodukte entstanden. Diese Konjugate, gekoppelt mit Antikörpern, zeigen hohe Fluoreszenzintensität und wurden bei der Detektion von CAR SUP-T1-Zellen erfolgreich eingesetzt. PEG-basierte Reagenzien durchdringen jedoch oft die Zellmembran nicht, was für intrazelluläre Ziele und größere Gewebe wichtig ist. Sequentielle Multiplex-Analysen sind durch unvollständige Spaltung und Restsignale problematisch. Deshalb wurden synthetische Peptide als Rückgrat für die Fluorophor-Multimerisierung untersucht. Diese Konstrukte, verbunden mit Nanokörpern, zeigten erhöhte Helligkeit und Gewebepenetration in der Lichtblattmikroskopie von Mausorganen. Zudem wurde ein dualer Entfernungsmechanismus in die REAdyelease-Technologie integriert. Basierend auf Oligonukleotiden, Disulfiden oder Peptiden in Kombination mit Aminodextran konnte eine schnellere Signalreduktion ermöglicht werden. Dies wurde in der Konfokalmikroskopie an einer Pankreastumorzelllinie demonstriert. / Flow cytometry and fluorescence microscopy are crucial for analyzing cells and tissues, especially in immunology, where immunofluorescence is used for identifying, visualizing, and characterizing biomolecules with fluorescently labeled antibodies. These labels must meet various requirements: high brightness, small size, and the ability to be rendered non-fluorescent. However, highly labeled constructs often suffer from fluorescence self-quenching or high molecular masses, limiting their effectiveness. This work demonstrates that branched polyethylene glycol (PEG) serves as an efficient fluorophore multimerization platform for protein labeling. I explored factors critical for preventing fluorophore self-quenching in multi-fluorophore systems. Fluorescent PEGs were multimerized on an amino-dextran scaffold, generating highly multimerized fluorophore-PEG-dextran intermediates. When conjugated to antibodies, these intermediates allowed bright labeling of biomarkers on cells and tissues and were successfully used in detecting CAR SUP-T1 cells. Despite their strengths, PEG-based reagents often lack deep tissue penetration, essential for intracellular targets and 3D organ imaging. To enhance tissue penetration, I designed small peptide-based backbones for fluorophore multimerization. These constructs, coupled with nanobodies, produced homogeneous fluorescent conjugates that quickly penetrated mouse organs and enabled bright staining in light-sheet microscopy. The final part of the thesis focuses on synthesizing labels for cyclic immunofluorescence. I addressed the issue of incomplete label removal by creating erasable conjugates with two release sites. Fluorescent conjugates based on oligonucleotides, disulfides, or peptides combined with amino-dextran can be rapidly erased from labeled epitopes using a dual-release approach. This method was demonstrated in confocal microscopy and used for iterative imaging of biomarkers on a sample of a pancreatic tumor cell line.

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