FERRAZ, Clarissa Perdigão Mello. Estudo in vitro da nefrotoxicidade do veneno total e fração fosfolipase A2 da serpente Bothropoides insularis (AMARAL, 1921). 2012. 101 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2016-03-03T13:04:39Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_cpmferraz.pdf: 2722365 bytes, checksum: f1db0c53e9a0ccd82e07f690fb60bc5d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2016-03-03T14:10:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_cpmferraz.pdf: 2722365 bytes, checksum: f1db0c53e9a0ccd82e07f690fb60bc5d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-03T14:10:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_cpmferraz.pdf: 2722365 bytes, checksum: f1db0c53e9a0ccd82e07f690fb60bc5d (MD5) Previous issue date: 2012 / Natural products and their derivatives are currently the most important source of novel therapeutic agents and provide useful tools for studies in physiopathology and pharmacology. Snake venoms display a wide array of pharmacological properties due to their complex combinations of active substances, especially peptides and proteins, capable of interfering with physiological processes. Snakes of the genera Bothrops and Bothropoides accounted for 70% of snake bites reported in Brazil. The Bothropoides insularis (golden lancehead) is endemic to Queimada Grande, an island off the state of São Paulo. Like the venom of other Bothrops species, the venom of B. insularis has coagulant, hemorrhagic and fibrinolytic properties and is known to cause kidney failure in vivo. The objective of the study was to evaluate of whole venom of B. insularis and its phospholipase A2 fraction in Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell culture tubes. The cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum in plastic vials with an atmosphere containing 5% CO2 at 37°C. Treatment with whole venom reduced cell viability at all the concentrations tested (200, 100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg/mL) and yielded an IC50 of 9 μg/mL. Cell membrane integrity during the process of cell death from whole venom was evaluated by LDH enzyme assay, indicating enzyme release at all concentrations. Flow cytometry with Annexin V-FITC and propidium iodide revealed that cell death at the lowest concentrations (18 and 36 μg/mL) of whole venom occurred predominantly by apoptosis. However, at the highest concentration (72 μg/mL), in addition to death by apoptosis, an increased number of cells in late apoptosis was observed.In the Rhodamine 123 assay the treatment with whole venom (36 μg/mL) induced significant depolarization of the mitochondrial membrane potential. The expression of genes involved in cell death by apoptosis did not show any significant results, when tested with whole venom in 24h. The phospholipase A2 fraction was also submitted to cell viability and membrane integrity assays at several concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg/mL), with no significant results in any of the experiments. Taken together, our results indicate that the venom of B. insularis is cytotoxic in MDCK cell culture and that cell death occurs predominantly by apoptosis. / Os produtos naturais e seus derivados têm sido as fontes mais comuns na obtenção de agentes terapêuticas inovadores, além de fornecerem ferramentas para estudos fisiopatológicos e farmacológicos. Os venenos de serpentes exibem uma infinidade de atividades farmacológicas, por serem formados por uma mistura complexa de substâncias ativas, principalmente peptídeos e proteínas, capazes de interferir com muitos processos fisiológicos. As serpentes Bothrops e Bothropoides são responsáveis por 70% dos acidentes ofídicos ocorridos no Brasil. A serpente Bothropoides insularis (jarara ilhoa), é uma espécie endêmica nativa da ilha de Queimada Grande na costa Sul do Estado de São Paulo, seu veneno apresenta características semelhantes aos das outras serpentes do gênero Bothrops, como atividade coagulante, hemorrágica, fibrinolítica e insuficiência renal in vivo. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do veneno total da Bothropoides insularis e sua fração fosfolipase A2 em culturas de células tubulares renais do tipo MDCK (Madin-Darby canine kidney). Células MDCK foram cultivadas em garrafas plásticas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2, com meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%. O tratamento com veneno total da B.insularis causou diminuição da viabilidade celular em todas as concentrações (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 mg/mL) estudadas com um IC50 de 9 μg /mL. A integridade da membrana celular foi avaliada pelo método de determinação da enzima lactato desidrogenase, e após a exposição das células ao veneno houve um aumento significativo da enzima. Nos ensaios de citometria de fluxo com anexina V-FITC e iodeto de propídio foi observada a morte celular nas menores concentrações (18 e 36 μg/mL) estudadas com o veneno total e ocorreu predominantemente por apoptose. No entanto na maior concentração (72μg/mL) estudada, foi observado além da morte por apoptose, um aumento de células em apoptose tardia. Nos ensaios com rodamina 123, o tratamento com o veneno total da B.insularis (36 μg/ mL) levou a despolarização significativa do potencial de membrana mitocondrial. Não houve expressão significativa de genes envolvidos na morte celular por apoptose. Ensaios de viabilidade celular e integridade de membrana foram realizados com a fração fosfolipase A2 do veneno da B.insularis, em várias concentrações (200; 100; 50; 25; 12,5 e 6,25 mg/mL), não apresentado resultados significativos em nenhum dos experimentos. Esses resultados demonstram a citotoxicidade do veneno de B. insularis em culturas de células tubulares renais (MDCK), e sugerem morte celular predominantemente por apoptose.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:06:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1952_1.pdf: 436008 bytes, checksum: 2bc5d55cfecbd7102987de5ec1c6f17c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / A variabilidade intraespecífica presente nas peçonhas de serpentes pode causar implicações na sintomatologia dos envenenamentos e nas pesquisas com toxinas desses animais. O presente estudo identificou a variabilidade em 52 amostras de peçonha de B. erythromelas, relacionando-a ao sexo, origem geográfica, desenvolvimento ontogenético e variação individual das serpentes. Para tanto, foram determinadas a dosagem proteica, a distribuição de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições redutoras, as atividades coagulante sobre o plasma, proteolítica sobre azocaseína e fosfolipásica utilizando clara de ovo como substrato. Os resultados obtidos não mostraram diferenças significativas nas amostras de peçonha de B. erythromelas provenientes de machos e fêmeas (Achova). A variabilidade das atividades proteolítica (p=0,004) e coagulante (p=0,02) foi dependente do desenvolvimento ontogenético, observando em ambos os casos relação inversa ao tamanho dos animais. O conteúdo proteico (p=0,01) e a atividade fosfolipásica (p=0,04) foram significativamente maiores nas amostras de peçonha de serpentes originárias do estado da Bahia quando comparadas às de Pernambuco. A variação individual foi observada no padrão eletroforético das proteínas, conteúdo proteico e atividades fosfolipásica e coagulante. Diante do exposto, concluímos que, dentre os parâmetros testados, o principal fator de variabilidade da peçonha de B. erythromelas é de origem genética, porém o desenvolvimento ontogenético e a origem geográfica também são fatores de variabilidade que devem ser levados em consideração no momento do tratamento ofídico e pesquisas com toxinas dessa espécie

A espécie Bothrops atrox é responsável por grande parte dos acidentes no estado do Amazonas. No entanto, ainda são poucos os estudos sobre as toxinas que compõem o veneno dessa serpente, os mecanismos envolvidos na sintomatologia dos acidentes, bem como de formas de inibição. Os soros antiveneno utilizados atualmente com o objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos mostraram reatividade cruzada entre componentes dos venenos de serpentes do gênero Bofhrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). No entanto alguns componentes do veneno não apresentaram essa reatividade (SILES-VILARROEL et al.., 1974), mostrando a existência de toxinas espécie específicas.Os venenos de serpentes estão sujeitos a grandes variações induzidas por diversos aspectos ontogenéticos e influencia do habitat. Assim, essas variações podem gerar toxinas espécie específicas cujos mecanismos de ação ainda são desconhecidos e que os anticorpos presentes nos antivenenos disponíveis não sejam capazes de reconhecer e neutralizar eficientemente. O gênero Bothrops possui espécies extremamente variáveis, algumas de difícil classificação taxonõmica, e novas espécies têm sido descobertas recentemente. Como contribuição para o acúmulo de informações a respeito das diferentes composições do veneno do gênero Bothrops, e para o conhecimento de toxinas já isoladas e as ainda não isoladas na espécie tipo Bothrops atrox, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno.Os dados obtidos são importantes para a elaboração de um painel da expressão gênica dessa espécie e permitirá a identificação de toxinas que podem ser comuns ou não ao veneno de outras espécies do gênero. Aliado a isso, esses dados permitirão a correlação com o estudo proteõmico, e possivelmente fornecerão subsídios para a melhoria da terapêutica empregada no tratamento dos casos envenamento na região. / The species Bothrops atrox is responsible for most accidents in state of Amazonas. However, there are few studies on toxins that make up the venom of this snake, mechanisms involved in symptomatology of accidents, as well as inhibition forms. Sera antivenom currently used in order to neutralize the systemic and local activities of the venoms showed cross-reactivity between components of the venom of Bothrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). However some components of the venom showed no reactivity (SILES-VILARROEL et al., 1974), indicating the existence of species-specific toxins. Snake venoms are subject to large variations induced by several aspects and influences of ontogenetic habitat. Thus, these variations can produce toxins whose mechanisms of species-specific action are still unknown and antibodies present in available antivenoms maybe not are capable to recognize and neutralize some toxins efficiently. Bothrops species have highly variable, some of difficult taxonomic classification and new species have been discovered recently. As a contribution to gain of information about of different compositions of Bothrops venom and to knowledge of toxins not yet isolated and the isolated in Bothrops atrox type species we constructed a venom gland cDNA library . The data obtained are important for the development of gene expression panel of this species and enable the identification of toxins common or not in the venom of other species. These data will allow correlation with the proteomic study, and possibly provide input for improving the therapeutic used in the treatment of accidents cases in the region.

A Bothrops jararaca é a serpente de maior importância médica no Brasil. Vários estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar os componentes do veneno de serpentes, entretanto, a base molecular dos genomas das serpentes é pouco conhecida. Assim, foi realizado o sequenciamento e montagem do genoma da serpente Bothrops jararaca. Foram construídas bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realização de corridas de sequenciamento usando a tecnologia Illumina e sequências complementares foram obtidas em equipamento PACBIO RS II. Uma biblioteca de BACs também foi construída e 768 pools de 12 BACs foram sequenciados. Um grande conjunto de segmentos genômicos foi obtido e foi possível identificar genes de várias toxinas, entre elas SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs e VEGF. Ainda foi possível depreender o contexto genômico de muitos destes genes e identificamos os principais elementos repetitivos genômicos. Estes achados são relevantes para o entendimento da função e evolução do sistema venenífero e podem servir de base para outros estudos futuramente. / The pit viper Bothrops jararaca is the most medically important snake in Brazil. Several studies were conducted in order to characterize the components of snake venom. However, the molecular basis of snake genomes is poorly known. Hence, it was carried out the sequencing and assembly of the Bothrops jararaca snake genome. Shotgun and mate-pair libraries were constructed to perform sequencing runs using Illumina technology and complementary sequences were obtained in PACBIO RS II equipment. A BAC library was also constructed and 768 pools of 12 BACs were sequenced. A large number of genomic segments was obtained. It was possible to identify genes of several toxins, including SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs and VEGF. In addition, it was possible to infer the genomic context related to most of these genes and identify the main genomic repetitive elements. These findings are relevant for understanding the function and evolution of the venom system and it provides the basis for further studies.

Variações ontogenéticas nas enzimas pró-coagulantes do veneno de B. jararaca filhotes (vBjF) tornam este veneno mais coagulante que o de serpentes adultas (vBjA). Além disso, o vBjF não é tão eficientemente neutralizado pelo soro antibotrópico in vitro, como o vBjA. Neste trabalho comparamos as alterações hemostáticas induzidas pelos venenos vBjA e vBjF em ratos e avaliamos sua recuperação após o tratamento com soro antibotrópico (SAB), por meio de análises de tromboelastometria, dosagens de fatores de coagulação, e análise de plaquetas. Ratos Wistar machos foram inoculados com vBjA e vBjF (1,6 mg/kg , s.c.) ou solução salina (controle), e tratados com SAB ou solução salina (100 mL i.v.) 1 hora (h), após a inoculação dos venenos. Amostras de sangue de ratos tratados foram coletadas em 1, 3, 6 e 24 h após a injeção para avaliar os níveis de fibrinogênio plasmático, haptoglobina plasmática, hemoglobina plasmática, produtos de degradação de fibrinogênio e fibrina (PDF/f), complexo trombina- antitrombina III (TAT), fator de von Willebrand ( vWF), fatores de coagulação II e X , e também para contagem e análise funcional das plaquetas. Para as análises de tromboelastometria, foram coletadas amostras de sangue citratado (recalcificado) e de sangue nativo (sem anticoagulante) em 6 e 24 h após a inoculação e tratamento com solução salina ou SAB. Às amostras de sangue citratado foram adicionados reagentes específicos para analise das vias intrínseca e extrínseca da coagulação. Parâmetros como o tempo de coagulação (CT), o tempo de formação do coágulo (CFT) e ângulo alfa foram adquiridos durante 1 h. Em 3 h a contagem de plaquetas de ratos inoculados com vBjA e vBjF, e também o níveis de fibrinogênio, haptoglobina, FII, FX e vWF caíram abruptamente em relação aos controles, enquanto os de TAT e PDF/f aumentaram. Em 6 h os níveis de fibrinogênio ainda encontravam-se bastante baixos para ambos os venenos. Pela análise de tromboelastometria, notou-se que em 6 h os parâmetros CT, CFT, ângulo alfa permanecem muito alterados em ratos não tratados. Com o tratamento com SAB, todos os parâmetros foram significativamente restaurados, para ambos os grupos envenenados, principalmente em 3 e 6 horas após a inoculação venenos . Assim, apesar das diferenças entre vBjA e vBjF com relação a composição e potencial de neutralização in vitro, o tratamento com SAB foi igualmente eficiente na reversão dos distúrbios hemostáticos decorrentes do envenenamento por ambos os venenos / Ontogenetic variations in the pro-coagulant enzymes of the young B. jararaca venom (YBjv) makes it more coagulant than that from adult snakes (ABjv). Moreover, YBjv is not so efficiently neutralized by specific antivenin in vitro as ABjv. Herein we compared hemostatic disturbances induced by ABjv and YBjv in rats and assessed their recovery after treatment with botropic antivenin by thromboelastometry, dosages of coagulation factors, and platelet analysis. Male Wistar rats were inoculated with ABjv and YBjv (1.6 mg/kg, s.c), or saline (control), and treated with botropic antivenin (SAB) or saline (100 μL i.v.) 1 hour (h) after venom inoculation. Blood samples of treated rats were collected 1, 3, 6 and 24 h after injection to evaluate plasmatic fibrinogen, plasmatic haptoglobina, plasmatic hemoglobin, fibrin and fibrinogen degradation products (FfDP), thrombin-antithrombin III complex (TAT), von Willebrand factor (vWF), coagulation factors II and X, and also to count and functional analysis on platelets. Thromboelastometry was carried out on citrated (recalcified) and native (without anticoagulant) blood samples, collected 6 and 24 h after injection and treatment with SAB or saline. Citrated samples were mixed with specific reagents to analyze the intrinsic and extrinsic pathways. Parameters as clotting time (CT), clot formation time (CFT) and alpha angle were acquired for 1 h. At 3 h, platelet count of ABjv and YBjv rats and also fibrinogen, haptoglobin, FII, FX and vWF levels fell abruptly in regard to controls, while TAT and FfDP increased. At 6 h the fibrinogen levels still pretty low for both venoms. By thromboelastometry analysis, at 6 h, it was noticed that the CT, CFT, alpha angle remain greatly altered on non-treated rats. With the SAB treatment, all the parameters were significantly restored, for both envenomed groups, especially at 3 and 6 h after the venoms inoculation. Thus, despite differences in composition and in vitro neutralization potential among ABjv and YBjv, the treatment with SAB was equally efficient in reversing the hemostatic disturbances caused by both venoms

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento da semente de Araucaria angustifolia através da proteômica comparativa, buscando compreender as alterações fisiológicas e metabólicas que ocorrem durante esse processo. Inicialmente, foram avaliados três diferentes metodologias de extração de proteínas. A metodologia composta por solução de extração contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 1% de ditiotreitol, 2% de Triton-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 5 µM de pepstatina, seguido de precipitação em 20% de ácido tricloroacético apresentou géis de maior resolução e reprodutibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para o estudo das alterações no proteoma da semente de A. angustifolia. Uma dificuldade associada ao estudo do proteoma de espécies não sequenciadas é a baixa representatividade nos bancos de dados protéicos, resultando em identificações baseadas em homologia. Estratégias proteômicas baseadas em fracionamento em gel resultam em grandes contaminações por fragmentos de queratina. Sendo assim, foi desenvolvido um programa de remoção de espectros de baixa qualidade para utilização em proteômica baseada em homologia. As análises mostraram que o programa reduz o tempo de busca, melhora a qualidade dos alinhamentos e não resulta em perda de identificações positivas. Finalmente, utilizando as metodologias descritas, foram estudadas as alterações no proteoma durante o desenvolvimento da semente de A. angustifolia. Noventa e seis proteínas foram identificadas e agrupadas de acordo com sua função biológica e padrão de detecção. Os resultados obtidos permitiram o estabelecimento de marcadores protéicos no início e final do desenvolvimento embrionário. A análise das proteínas abundantes no início da embriogênese indica um maior controle no metabolismo oxidativo em relação aos estádios finais. Contrariamente, o final da embriogênese é caracterizado por um alto metabolismo de assimilação de carbono e acúmulo de proteínas de reserva. As implicações dos resultados obtidos no controle e melhoramento de sistemas de embriogênese somática na espécie também foram discutidas / The aim of the present work was to characterize the seed development of Araucaria angustifolia through proteomics in order to understand the physiological and biochemical changes during this process. For that, initially, three different protein extraction methods were evaluated. The extraction based on protein solubilization in 7 M urea, 2 M thiourea, 1% dithiothreitol, 2% Triton-100, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 5 µM pepstatin, followed by 20% trichloroacetic acid precipitation showed the highest gel resolution and reprodutivity and, thus, was chosen to be used in the analysis of the proteome of A. angustifolia seeds. One aspect that hampers the proteome study of unsequenced species is the low protein representativity in databases. So, protein identification is usually carried out through homology. Strategies based on 2-DE result in high keratin contamination. In the present work a spectra filtering software was developed and evaluated for use in homology driven proteomics. The software reduced the time of search, improved alignment quality and did not result in lost of positive identifications. Finally, using the described strategies, the changes in the proteome of A. angustifolia seeds were studied. Ninety six proteins were identified and classified according to their biological functions and expression profiles during seed development. The identified proteins may be used as protein markers of early and late embryogenesis. Proteins involved in the control of oxidative metabolism were highly expressed during the early stages of seed development; while, carbon metabolism and storage proteins were highly expressed in late stages. Considerations on the improvement and control of somatic embryogenesis through medium manipulation and protein markers screening using data generated are also discussed.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:16Z : No. of bitstreams: 1 salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf: 205572 bytes, checksum: ea2da7983b8e624b8fb6f242a2874147 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-16T11:30:15Z: salvador_ghm_me_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-03-16T11:31:00Z : No. of bitstreams: 1 000709624.pdf: 1507151 bytes, checksum: e7624c11b3bf8ce0e311b5d40988f595 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... / Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: Antonio Sérgio Kimus Braz / Resumo: Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis pela maioria dos acidentes ofídicos que ocorrem no Brasil. Uma das principais complicações deste tipo de acidente é o dano muscular, que muitas vezes pode evoluir para necrose. Estes danos podem estar relacionados à ação de fosfolipases A2 (Asp49- PLA2) e fosfolipases A2 homólogas (dentre as quais se encontram as Lys49-PLA2s) presentes nos venenos botrópicos. Esta complicação relacionada ao envenenamento ofídico não é atualmente contornada pela administração de soro antiofídico e, por isso, diversos trabalhos vêm sendo realizados na tentativa de se conhecer os sítios farmacológicos destas toxinas com o intuito de, no futuro, desenvolver tratamentos complementares à soroterapia. Neste trabalho, por meio de estudos utilizando a técnica de cristalografia de raios X, realizamos estudos comparativos entre a BmooPLA2-I e outras Asp49-PLA2s que inibem a agregação plaquetária e sugerimos que outras regiões além do sítio proposto anteriormente são responsáveis por esta atividade biológica. Estudos com a MjTX-II e outras Lys49-PLA2s também foram realizados e propuseram que moléculas de cadeia longa, como ácidos graxos e os polietilenoglicóis (PEGs), possuem contribuição direta para a cristalização destas toxinas. Além disso, estes compostos interagem com o sítio ativo, causando, em alguns casos, a hiperpolarização dos resíduos Cys29/Gly30 pelo Lys122, reforçando assim a teoria que propõe que a atividade catalítica das Lys49-PLA2s não é somente inibida pela presença da cadeia lateral da Lys49 junto ao loop de ligação de cálcio, mas também por outros fatores estruturais. Por fim, estudos com a MjTX-I revelaram que esta toxina é diferenciada das outras Lys49-PLA2s, visto que sua estrutura cristalográfica apresenta quatro moléculas na unidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bothrops snakes are responsible for the most part of the snakebites that occur in Brazil. A major complication of this type of accident is muscle damage, which can often progress to necrosis. This damage may be related to the action of phospholipases A2 (Asp49-PLA2s) and homologue phospholipases A2 (including Lys49-PLA2s) present in Bothrops venoms. This complication related to snakebite is not currently solved by the administration of ophidic serum and, therefore, several studies have been conducted in attempt to understand the pharmacological sites of these toxins and to develop complementary treatments to serum therapy. In this work, we performed a comparative crystallographic study between BmooPLA2-I and other Asp49-PLA2s which present inhibitingplatelet aggregation activity using protein crystallography. The results suggest that some regions distinct from the site proposed by prior works could be responsible by this biological activity. Studies with MjTX-II and other Lys49-PLA2s were also performed and it was proposed that long-chain molecules, such as fatty acids and polyethylene glicols (PEGs), contribute to the crystallization of these toxins. Besides, these compounds interact with the active site, thus causing the hyperpolarization of the Cys29/Gly30 residues via Lys122. These findings reinforce the theory which establishes the catalytic activity of Lys49-PLA2s is not abolish only by the presence of the Lys49 sidechain close to the calcium binding loop, but also due to other structural features. Finally, studies with the MjTX-I revealed that this toxin is different from other Lys49-PLA2s since its crystal structure presents four molecules in the asymmetric unit and a distinct configuration of the myotoxic site as previously proposed for other Lys49-PLA2s. Other studies with MjTX-I using spectroscopy... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T13:35:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_LucimaraJulio_M.pdf: 11295607 bytes, checksum: 8492693ea03dda6f72a75c0c23ee0d9c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O veneno de Bothrops lanceolalus exerce várias atividades biológicas, dentre elas a atividade hemolítica indireta. Neste trabalho verificamos algumas das características desta atividade in vitro. O veneno induziu hemólise indireta em eritrócitos de cavalo, boi, rato e carneiro, sendo que, dentre essas espécies, a primeira foi mais sensível; não houve atividade hemolítica direta. A hemólise foi concentração-dependente e atenuada em temperaturas >40°C. O tratamento do veneno com brometo de p-bromofenacil aboliu a atividade da fosfolipase A2 (PLA2) do veneno e impediu a hemólise. Corroborando estes achados, uma PLA2 ácida purificada deste veneno também induziu hemólise. Esta PLA2 reagiu contra o anti-soro do veneno de B. lanceolatus. Estes resultados indicam que atividade hemolítica do veneno de B. lanceolatus é mediada pela PLA2. A reação cruzada da PLA2 com o anti-soro sugere que a atividade desta enzima pode eficazmente ser neutralizada durante a terapia sorológica / Abstract: Bothrops lanceolatus venom exerts a variety of biological activities, including indirect hemolysis. In this work, we examined some of the characteristics of this activity in vitro. The venom caused indirect hemolysis in horse, ox, rat and sheep erythrocytes, with the first of these species being the most sensitive; there was no direct hemolysis. The hemolysis was concentration-dependent and was markedly attenuated at >40°C. Treatment of the venom with />-bromophenacyl bromide abolished the phospholipase A2 (PLA2) activity of the venom and prevented the hemolysis. In agreement with this finding, an acidic PLA2 purified from this venom also caused hemolysis. This PLA2 reacted with antivenom against B. lanceolatus venom. These results indicate that the hemolytic activity of B. lanceolatus venom is mediated by PLA2. The cross-reactivity of the PLA2 with antivenom suggests that the activity of this enzyme may be effectively neutralized during antivenom therapy / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T23:41:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monzon_GeorginaSucasaca_M.pdf: 3056250 bytes, checksum: d246d55d0b29698ce7253fb6a9fc3f6a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O veneno botrópico possui uma mistura de substâncias protéicas necessárias para a sobrevivência da serpente, dentre elas, as mais amplamente estudadas são as fosfolipases A2, que hidrolisam glicerofosfolipídios de membrana na posição sn-2, liberando isofosfolipídios e ácidos graxos, que além de desempenhar uma ação biológica no processo de digestão de lipídios, exibem também uma ampla variedade de efeitos farmacológicos. O presente trabalho teve como objetivo, caracterizar farmacologicamente uma nova fosfolipase A2 denominada Bp-13 do veneno de Bothrops pauloensis, serpente endêmica do cerrado brasileiro, avaliando sua ação sobre a junção neuromuscular, efeito miotóxico e atividade edematogênica. A Bp-13 foi purificada utilizando-se o sistema cromatográfico HPLC de fase reversa em coluna µ-Bondapack C18; possuindo uma massa molecular de 14 035 Da e atividade catalítica de 2,43 nmol/min/mg (30-35 ºC), dependente de Ca2+ porém inibida por Mg2+, Mn2+, Cd2+ e Sr2+. A atividade neuromuscular foi avaliada em preparações biventer cervicis (BC) de pintainho, extensor digitorum longus (EDL) e nervo frênico-diafragma (NFD) de camundongo, sob estimulação elétrica indireta durante 120 min a 37 ºC. A Bp-13 (3,56 µM) induziu bloqueio neuromuscular completo e irreversível, nas preparações de mamífero, que se mostraram mais sensíveis à ação da toxina do que as preparações de ave. Em preparação BC de pintainho o bloqueio neuromuscular foi de 28 ± 2 % após 120 min de incubação com a Bp-13 (7,12 µM) e a contratura evocada após a adição exógena de ACh foi parcialmente inibida. Concentrações menores (0,71 e 1,42 µM) foram testadas na preparação NFD de camundongo, induzindo o bloqueio da resposta contrátil em 29 ± 5 % e 55 ± 6 %, respectivamente. Em alguns experimentos, onde o Ca2+ foi substituído pelo Sr2+ na solução de Tyrode houve ausência do bloqueio neuromuscular característico da Bp-13 (3,56 µM); evento semelhante foi observado quando a temperatura do banho foi alterada de 37 ºC para 24 ºC, com bloqueio de 37,4 ± 6 % da resposta contrátil. A Bp-13 (3,56 µM) foi capaz de inibir a resposta contrátil a estímulo elétrico direto em preparações NFD de camundongo previamente curarizadas. Com o estudo eletrofisiológico realizado em preparação músculo hemidiafragma de camundongo, avaliaram-se os potenciais de membrana em repouso (PM). A Bp-13 (3,56 µM) causou uma despolarização progressiva do sarcolema, alcançando valores de -80 ± 1 mV (controle) até -37 ± 3 mV após 120 min de incubação com a toxina. Em preparações músculo diafragma pré-tratadas com d-Tubocurarina (10 µM), observou-se uma redução da despolarização induzida pela da Bp-13 (-37 ± 3 mV para -58 ± 2 mV). A miotoxicidade foi avaliada in vitro através de análise morfológica do músculo diafragma de camundongo e in vivo através da determinação da atividade de creatinoquinase (CK). Na análise morfológica considerou-se fibras normais as que mantiveram íntegro o sarcolema com o formato poligonal e fibras alteradas as que apresentavam hipercontração das miofibrilas, células com lesão tipo delta, edemaciadas e vacuolizadas. A porcentagem de fibras lesadas de preparações incubadas com o veneno de Bothrops pauloensis (100 e 50 µg/mL) foi de 14,4 ± 3 % e 8,7 ± 3 % respectivamente; e com a fração Bp-13 (20 e 50 µg/mL) foi de 8,3 ± 4 % e 30,6 ± 5 %, respectivamente. Quando as preparações foram mantidas em solução de Tyrode, onde o Ca2+ foi substituído pelo Sr2+, as alterações morfológicas foram de 36,7 ± 11 %, ou seja, semelhante aos valores observados com a Bp-13 na solução de Tyrode normal. O aumento nos valores de liberação de creatinoquinase, após 30 min da injeção da Bp-13, revelou o efeito miotóxico in vivo, valores que retornaram ao normal após 6 horas. A dose de 10 µg/pata de Bp-13 injetada em ratos via intraplantar induziram a formação de edema de pata após 15 min de injeção da toxina. Conclui-se, então, que a Bp-13 é uma miotoxina, que inibe a resposta neuromuscular dependente de temperatura e de Ca2+, em preparações isoladas EDL e NFD de camundongo, sugerindo que a atividade catalítica possivelmente contribua com o evento farmacológico, embora o efeito mionecrótico in vitro não seja afetado, indicando uma dissociação entre estes efeitos. / Abstract: Bothropic venom has several substances necessary to serpent survival, among them, one of the most widely studied are phospholipase A2 enzymes, that hydrolise sn-2 from membrane phospholipids, releasing lysophospholipids and fatty acids, which beyond playing a biological action in the lipid digestion process, also exhibit a wide variety of pharmacological effects. The present work had as objective to characterize pharmacologically a new phospholipase A2 denominated Bp-13 from the Bothrops pauloensis (endemic serpent to the Brazilian cerrado) venom, evaluating its action at neuromuscular junction, myotoxic effect and edematogenic activity. Bp-13 was purified through chromatographic system, a reverse phase HPLC on a µ-Bondapack C18 column; it has a molecular mass of 14 035 Da, 2,43 nmol/min/mg (30- 35 ºC) catalytic activity Ca2+ dependent, however it was inhibited by Mg2+, Mn2+, Cd2+ and Sr2+. Neuromuscular activity was evaluated in chick biventer cervicis (BC) preparations, extensor digitorum longus (EDL) and mouse phrenic nerve-diaphragm (PND), under indirect electrical stimulation during 120 minutes, at 37oC. Bp-13 (3,56 µM) induced complete and irreversible neuromuscular block in mammalian preparations, which showed to be more sensitive to toxin action than bird preparations. In chick BC preparation, neuromuscular block was 28 ± 2 % after 120 minutes incubation with Bp-13 (7,12 µM) and evoked contracture after exogenous ACh addiction was partially inhibited. Smaller concentrations (0,71 e 1,42 µM) were tested in mouse PND preparation, inducing block of the contractile response in 29 ± 5 % and 55 ± 6 %, respectively. In some experiments, where Ca2+ was substituted for Sr2+ in Tyrode's solution, there was absence of the Bp-13 characteristic neuromuscular block (3,56 µM); similar event was observed when the bath temperature was altered from 37 ºC to 24 ºC, with a block of 37,4 ± 6 % of the contractile response. Bp-13 (3,56 µM) was able to inhibit contractile response to direct electrical stimulus in previously curarized mouse PND preparations. Through electrophysiological study performed in mouse hemidiaphragm muscle preparation, membrane potentials at rest were evaluated (MP). Bp-13 (3,56 µM) caused a progressive sarcolemma depolarization, reaching values from -80 ± 1 mV (control) until - 37 ± 3 mV after 120 minutes in toxin incubation. In d-tubocurarine (10 µM) pre-treated hemidiaphragm muscle preparations, a depolarization reduction was observed, induced by Bp-13 (-37 ± 3 mV to -58 ± 2 mV). Myotoxicity was evaluated in vitro through morphological analysis of the mouse hemidiaphragm muscle and in vivo through determination of creatinkinase (CK) activity. Regarding morphological analysis, fibers which maintained intact sarcolemma with polygonal shape were considered normal, and fibers which presented hypercontraction of myofibrils, delta type lesion cells, edemaciated and vacuolized, were considered altered fibers. Lesioned fibers from Bothrops pauloensis (100 and 50 µg/mL) venom incubated preparations were 14,4 ± 3 % and 8,7 ± 3 % , respectively; and for Bp-13 fraction (20 e 50 µg/mL) they were 8,3 ± 4 % and 30,6 ± 5 %, respectively. When preparations were Ca2+ was substituted for Sr2+, morphological maintained in Tyrode's solution, where alterations were 36,7 ± 11 %, that is similar to the observed values with Bp-13 in normal Tyrode's solution. The increase in creatinkinase release values after 30 minutes of Bp-13 injection revealed in vivo myotoxic effect, values that returned to normal after 6 hours. Bp-13 concentration of 10 µg injected in rats via intraplantar induced paw edema formation after 15 minutes of toxin injection. In conclusion, Bp-13 is a myotoxin that inhibits temperature and Ca2+ dependent neuromuscular response in mouse EDL and PND isolated preparations, suggesting that its catalytic activity possibly contributes to the pharmacological event, although in vitro myotoxic activity was unaffected by these treatments, indicating a dissociation between these effects. / Mestrado / Mestre em Farmacologia