Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T04:49:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Smaal_Adriana_M.pdf: 6478282 bytes, checksum: 2107d35eeaa596500136ca0dd4e07119 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O envenenamento por serpentes do gênero Bothrops resulta em alterações sistêmicas que incluem coagulopatia, hemorragia sistêmica, choque hipovolêmico e insuficiência renal aguda. Neste estudo investigamos a ação de da peçonha de B. jararacussu e suas frações cromatográficas sobre alguns parâmetros cardiovasculares (pressão arterial, freqüências cardíaca e respiratória, e eletrocardiograma) em ratos anestesiados com uretana. Ratos Wistar (300-400 g) foram canulados na arteria carótida esquerda para monitoramento contínuo da pressão arterial sistêmica e na veia femoral para administração das peçonhas e frações cromatográficas. A freqüência cardíaca e o ECG foram monitorados por um eletrocardiógrafo. No final do experimento, coração, rins, fígado e pulmão foram processados para avaliação histológica. Os ratos foram monitorados durante 120 min. Para análise histológica, foram coletados amostras de coração, pulmão, rim e fígado. A peçonha (0.25, 0.5 and 0.75 mg/kg, i.v.) casou queda acentuada da pressão arterial nos até os 5 minutos após administração das peçonhas, tendo recuperação para valores de níveis basais nas doses menores, e a dose maior não houve recuperação. As doses menores não causaram alterações nas freqüências cardíacas e respiratórias, porem a dose maior causou queda irreversivel destes parâmetros. Alterações transitórias vistas no ECG foram extra sístole, taquicardia ventricular e alteração na amplitude do complexo QRS. Ratos injetados com a menor dose sobreviveram durante os 120 minutos monitorados no experimento, já os injetados com a maior dose morreram com aproximadamente 15 minutos após a administração da peçonha. A gel filtração resultou em 5 picos (PI-PV), sendo que a administração dos 2 primeiros picos mostraram alterações semelhantes a peçonha bruta. O fracionamento do pico I por troca iônica, não resultou em alterações cardiovasculares,pois provavelmente eles agem em sinergismo. Similarmente, a Bothropstoxina isolada do pico III não causou alterações. Analise histológica mostraram alterações em órgãos, principalmente em pulmões. Adicionalmente,foi visualizado mionecrose, edema e infiltrado inflamatório no coração, perda da arquitetura tecidual no fígado, e microaneurismas capilares, presença de proteína na luz tubular, e infiltrado inflamatório nos rins. Os picos I, II e III mostraram alterações similares a peçonha bruta. Estes resultados mostram que as peçonhas botrópicas produzem alterações cardiovasculares importantes, alem de alterações morfológicas em diversos órgãos. A predominância de hemorragia e presença de atividade hemorrágica nos picos I, II e III indicam a presença de diversas proteínas hemorrágicas nesta peçonha. / Abstract: Envenoming by Bothrops snakes results in systemic alterations that include coagulopathy, internal hemorrhage, hypovolemic shock and acute renal failure. In this work, we investigated the action of Bothrops jararacussu snake venom and its chromatographic fractions on arterial blood pressure, heart and respiratory rates, and electrocardiogram in urethane-anesthetized male Wistar rats. The rats were cannulated for blood pressure measurements (carotid artery) and the injection of venom or fraction (femoral vein). The heart rate and electrocardiogram (ECG) were measured with an ECG recorder. At the end of the experiments, samples of heart, liver, lung and kidney were processed for histological analysis. Venom (0.25, 0.5 and 0.75 mg/kg, i.v.) caused immediate hypotension that lasted for 5 min followed by a gradual recovery to pre-venom levels with the two lowest doses, whereas there was no recovery with the highest dose. The two lowest doses did not significantly affect the heart rate or respiratory rate, but these parameters were depressed with the highest dose. Transient changes in the ECG seen during the first 5 min included ventricular extrasystoles, ventricular tachycardia and alterations in the QRS complex amplitude. Rats injected with the two lowest doses survived for 120 min post-venom, whereas with the highest dose the survival time was 15 min at the most. Gel filtration (Sephacryl 75) of venom resulted in five peaks (PI - PIV), the first two of which produced cardiovascular alterations similar to those of the venom. Fractionation of PI resulted in two major peaks, neither of which produced significant cardiovascular alterations, perhaps because they normally act in synergy. Similarly, a PLA2 (bothropstoxin) isolated from peak PIII did not alter the parameters investigated. Histological analysis revealed hemorrhage in the organs examined, particularly the lungs. In addition, there were focal lesions in hepatic and renal tissue, as well as renal epithelial desquamation, glomerular microaneurysms, an increase in the capsular space and the presence of protein-like material in the lumen of proximal and distal tubules. Peaks PI, PII and PIII produced histological alterations similar to those of the venom. These results show that B. jararacussu venom causes important cardiovascular changes in anesthetized rats, in addition to morphological alterations in a variety of organs. The predominance of hemorrhage and the presence of hemorrhagic activity in peaks PI - PIII indicate the presence of a variety of hemorrhagic proteins in this venom. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento da semente de Araucaria angustifolia através da proteômica comparativa, buscando compreender as alterações fisiológicas e metabólicas que ocorrem durante esse processo. Inicialmente, foram avaliados três diferentes metodologias de extração de proteínas. A metodologia composta por solução de extração contendo 7 M de uréia, 2 M de tiouréia, 1% de ditiotreitol, 2% de Triton-100, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil e 5 µM de pepstatina, seguido de precipitação em 20% de ácido tricloroacético apresentou géis de maior resolução e reprodutibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para o estudo das alterações no proteoma da semente de A. angustifolia. Uma dificuldade associada ao estudo do proteoma de espécies não sequenciadas é a baixa representatividade nos bancos de dados protéicos, resultando em identificações baseadas em homologia. Estratégias proteômicas baseadas em fracionamento em gel resultam em grandes contaminações por fragmentos de queratina. Sendo assim, foi desenvolvido um programa de remoção de espectros de baixa qualidade para utilização em proteômica baseada em homologia. As análises mostraram que o programa reduz o tempo de busca, melhora a qualidade dos alinhamentos e não resulta em perda de identificações positivas. Finalmente, utilizando as metodologias descritas, foram estudadas as alterações no proteoma durante o desenvolvimento da semente de A. angustifolia. Noventa e seis proteínas foram identificadas e agrupadas de acordo com sua função biológica e padrão de detecção. Os resultados obtidos permitiram o estabelecimento de marcadores protéicos no início e final do desenvolvimento embrionário. A análise das proteínas abundantes no início da embriogênese indica um maior controle no metabolismo oxidativo em relação aos estádios finais. Contrariamente, o final da embriogênese é caracterizado por um alto metabolismo de assimilação de carbono e acúmulo de proteínas de reserva. As implicações dos resultados obtidos no controle e melhoramento de sistemas de embriogênese somática na espécie também foram discutidas / The aim of the present work was to characterize the seed development of Araucaria angustifolia through proteomics in order to understand the physiological and biochemical changes during this process. For that, initially, three different protein extraction methods were evaluated. The extraction based on protein solubilization in 7 M urea, 2 M thiourea, 1% dithiothreitol, 2% Triton-100, 1 mM phenylmethylsulphonyl fluoride, 5 µM pepstatin, followed by 20% trichloroacetic acid precipitation showed the highest gel resolution and reprodutivity and, thus, was chosen to be used in the analysis of the proteome of A. angustifolia seeds. One aspect that hampers the proteome study of unsequenced species is the low protein representativity in databases. So, protein identification is usually carried out through homology. Strategies based on 2-DE result in high keratin contamination. In the present work a spectra filtering software was developed and evaluated for use in homology driven proteomics. The software reduced the time of search, improved alignment quality and did not result in lost of positive identifications. Finally, using the described strategies, the changes in the proteome of A. angustifolia seeds were studied. Ninety six proteins were identified and classified according to their biological functions and expression profiles during seed development. The identified proteins may be used as protein markers of early and late embryogenesis. Proteins involved in the control of oxidative metabolism were highly expressed during the early stages of seed development; while, carbon metabolism and storage proteins were highly expressed in late stages. Considerations on the improvement and control of somatic embryogenesis through medium manipulation and protein markers screening using data generated are also discussed.

Orientador: Lea Rodrigues Simioni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T11:19:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_PriscilaRandazzode_D.pdf: 2478214 bytes, checksum: bbb891d96754c5530c891d237eeb45c9 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os efeitos miotóxicos dos venenos botrópicos são inquestionáveis pela exuberante manifestação clínica e são extensivamente relatados na literatura. Já os efeitos neurotóxicos têm sido descritos sob condições in vitro, em preparações neuromusculares, com pouca ou nenhuma evidência clínica. O objetivo do presente estudo foi o de contribuir para o conhecimento sobre a caracterização bioquímica e farmacológica da Bp-12, uma nova miotoxina do veneno de B. pauloensis. O perfil cromatográfico do veneno evidenciou 18 picos, o pico 12 (Bp-12) refere-se a nova fração estudada, uma vez que em ensaios preliminares apresentou efeito sobre a JNM. O perfil eletroforético da Bp-12 mostrou a presença de uma única banda protéica com aproximadamente 14 kDa, confirmado pela espectrometria de massa (13.789,56 Da). A composição de aminoácidos apresentou alto conteúdo dos resíduos, Lys, Tyr, Gly, Pro e Cys, típicos de PLA2 básicas. A Bp-12 possui 122 resíduos de a.a.: SLFELGKMIL QETGKNPAKS LGAFYCYCGW GSQGQPKDAV DRCCYVHKCC YKKITGCNPK KDRYSYSWKD KTLVCGEDNS CLKELCECDK AVAICLRENL NTYNKKYRYF LKPLCKKADA AC, com pI de 8,55 e uma alta homologia com outras PLA2 Lys49 botrópicas (92,6 %). A preparação nervo frênico-diafragma (NFD) de camundongo foi mais sensível à ação da toxina do que a preparação biventer cervicis de pintainho. Em preparações NFD, a Bp-12 (3,6 ?M) induziu 50% de bloqueio em 17 ± 7 min, inibindo completamente a resposta contrátil a estímulos indiretos (120 min, 37 °C); o bloqueio neuromuscular irreversível também foi observado, quando o Ca2+ foi substituído pelo Sr2+ na solução de Tyrode, quando a preparação foi curarizada (estímulo direto) ou quando submetida à baixa temperatura (22 °C). O registro do PM mostrou que a partir de 15 min de incubação com a Bp-12 (3,6 ?M) ocorreu uma progressiva despolarização da membrana, com valores de -20,2 ± 1 mV (90 min, p<0,05). Após 60 min de incubação, o efeito da Bp-12 (3,6 ?M) sobre os valores do conteúdo e tamanho quântico e amplitude média foram respectivamente: 50 ± 8; 0,09 ± 0,01 e 3,0 ± 0,3 mV, estes não foram significativamente diferentes quando comparados com os valores controle (68 ± 9; 0,07 ± 0,01 e 3,3 ± 0,2 mV). Nos estudos de miotoxicidade, após 120 min de incubação com 50 ?g/mL de veneno de B. pauloensis ou de Bp-12, o músculo diafragma apresentou áreas de mionecrose da ordem de 26 ± 2 % e 27 ± 1 % (p<0,05), respectivamente. Os níveis de CK plasmático aumentaram significativamente após a administração intramuscular de Bp-12, sendo: 827 ± 92 U/L (50 ?g) e 225 ± 36 U/L (20 ?g) versus 48,3 ± 8 U/L (controle), entretanto, com a via intravenosa não houve aumento significativo, mostrando que a Bp-12 não produz miotoxicidade sistêmica. A Bp-12 (2,5; 5,0 e 10,0 ?g/pata) induziu edema de pata dependente da dose, caracterizada por apresentar início de ação rápido, em torno de 30 min, sendo: 0,4 ± 0,02 mL; 0,6 ± 0,05 mL e 0,7 ± 0,07 mL, respectivamente; também foi calculada a área sob a curva para cada dose injetada, cujos valores foram (mL.h): 0,5 ± 0,02 (salina); 0,9 ± 0,11; 1,3 ± 0,15 e 1,7 ± 0,19, respectivamente. Conclui-se que a Bp-12 é uma nova PLA2 Lys49 miotóxica, de caráter básico, com baixa atividade catalítica, que induz bloqueio neuromuscular irreversível dependente do tempo e da concentração e que apresenta atividades farmacológica e bioquímica características de miotoxinas botrópicas. / Abstract: The myotoxic effects caused by bothropics venoms are unquestionable by their exuberant clinic manifestation and are extensively related in literature, since the neurotoxic effects have been described in vitro conditions, in nerve-muscle preparations, with little or neither clinic evidence. The aim of this study was to contribute for the knowledge about the pharmacological and biochemical characterization of Bp-12, a new myotoxin from B. pauloensis snake venom. The elution profile of B. pauloensis crude venom after purification in one chromatographic step presented eighteen peaks ranging from Bp-1 to Bp-18. Peak 12 was named Bp-12 and resulted in one small peak with a retention time of 37 min, eluting at 56% of buffer B. The SDS-PAGE gel showed one electrophoretic band, indicating that this toxin was obtained with high homogeneity and a molecular mass of around 14 kDa, confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry, which showed that the protein had a molecular mass of 13789.56 Da. The amino acids composition showed that Bp-12 presented high content of Lys, Tyr, Gly, Pro, and 14 half-Cys residues, typical of a basic PLA2. The sequence of Bp-12 contains 122 amino acid residues: SLFELGKMIL QETGKNPAKS LGAFYCYCGW GSQGQPKDAV DRCCYVHKCC YKKITGCNPK KDRYSYSWKD KTLVCGEDNS CLKELCECDK AVAICLRENL NTYNKKYRYF LKPLCKKADA AC, with a pI value of 8.55 and with a high homology with Lys49 PLA2 from other bothropics venoms. In mouse phrenic nerve-diaphragm (PND), the time needed for 50% paralysis was 17 ± 7 min (3.6 ?M). Bp-12 can induce indirect and directly blocked evoked twitches, even in the preparations in which Ca2+ is replaced by Sr2+ or low temperature (22 °C), being the addition of d-tubocurarine required for direct blocking. The resting membrane potential showed that after 15 min of incubation with Bp-12 (3.6 ?M), progressive despolarization decreased from -83.9 ± 1 mV to -20.2 ± 1 mV (90 min, p<0.05). Intracellular recordings of endplate potentials (EPPs) from mouse diaphragm preparations revealed that Bp-12 did no alter the quantal content (50 ± 8, t60, p>0.05 of the control). Incubation with Bp-12 (50 ?g/mL) or B. pauloensis (50 ?g/mL) for 120 min damaged 26 ± 2 % and 27 ± 1 % (p<0,05), respectively. Bp-12 (20 and 50 ?g/50 ?L) has significantly increased the release of CK levels in the serum after 60 min of i.m. administration, being the values: 827 ± 92 U/L and 225 ± 36 U/L (20 ?g/mL). However, i.v. administration has not presented significant increased. Bp-12 (2.5 - 10.0 ?g/paw) induced local oedema formation in rat paw in vivo at around 30 min, being found the values of: 0.4 ± 0.02 mL (2.5 ?g/paw), 0.6 ± 0.05 mL (5.0 ?g/paw) and 0.7 ± 0.07 mL (10.0 ?g/paw). In conclusion, Bp-12 is a new myotoxic PLA2 (Lys49), with low catalitic activity, that is able to induce irreversible neuromuscular blockade and presents biochemical and pharmacological activities characteristic of bothropics miotoxins. / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Stephen Hyslop / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:01:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_IgorRappFerreirada_M.pdf: 2311174 bytes, checksum: c1f5a65bf448cb7a06bd5d1b0764ad1e (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O envenenamento causado por Bothrops jararaca pode resultar em dor local, edema, hemorragia e mionecrose, parcialmente causados por SVMPs. Neste trabalho, descrevemos a caracterização da BJ-PI2, uma metaloprotease da classe P-I da peçonha de B. jararaca e suas ações em tecidos locais. BJ-PI2 foi purificada por uma combinação cromatográfica de gel-filtração, troca aniônica e fase reversa em HPLC, e identificada por espectrometria de massas. As atividades coagulante e fibrin(ogen)olítica foram medidas por métodos convencionais. A atividade hemorrágica e as alterações na permeabilidade vascular foram examinadas em pele dorsal de ratos. A mionecrose e a atividade inflamatória foram avaliadas em músculo gastrocnêmio de camundongos. BJ-PI2, uma proteína de cadeia única com massa molecular de 23,08 kDa. Fragmentos trípticos da BJ-PI2 mostraram alta homologia com a SVMP insularinase A oriunda de Bothrops insularis, mas também com a bothrojaractivase, uma SVMP oriunda de B. jararaca; foi observada similaridade menor com a BJ-PI e jararafibrases II e IV isoladas de B. jararaca. A BJ-PI2 não coagula fibrinogênio nem plasma citratado de rato porém teve atividade ?- e ?-fibrinogenase (inibidas por EDTA e 1,10- fenantrolina mas não por PMSF) e atenuou a coagulação de plasma induzida pela recalcificação. BJ-PI2 tem atividade fibrinolítica. BJ-PI2 aumentou a permeabilidade vascular em pele dorsal de rato (atividade inibida por 1,10-fenantrolina). BJ-PI2 não provocou hemorragia ou mionecrose, contudo causou migração de células inflamatórias. Em contrapartida, a peçonha foi fortemente hemorrágica e mionecrótica porém causou pouca infiltração de células inflamatórias. Estes resultados indicam que a BJ-PI2 é uma SVMP não hemorrágica, não mionecrótica e não coagulante da classe PI que pode aumentar a permeabilidade vascular e a migração de células inflamatórias in vivo, mas não contribui com a hemorragia e a necrose induzidas pela peçonha / Abstract: Envenoming by Bothrops jararaca can result in local pain, edema, hemorrhage and necrosis, partially mediated by snake venom metalloproteinases (SVMPs). In this work, we describe the characterization of BJ-PI2, a P-I class SVMP from B. jararaca venom, and its local tissue actions. BJ-PI2 was purified by a combination of gel filtration, anion-exchange chromatography and reverse phase HPLC, and identified by mass spectrometry. Clotting and fibrin(ogen)olytic activities were assayed using conventional methods. Hemorrhagic activity and changes in vascular permeability were examined in rat dorsal skin. Myonecrosis and inflammatory activity were examined in mouse gastrocnemius muscle. BJ-PI2 was a 23.08 kDa single-chain polypeptide. Tryptic fragments showed highest homology with SVMP insularinase A from Bothrops insularis, but also with B. jararaca SVMP bothrojaractivase; less similarity was observed with B. jararaca SVMPs BJ-PI and jararafibrases II and IV. BJ-PI2 did not clot fibrinogen or rat citrated plasma but had ?- and ?-fibrinogenolytic activity (inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline but not by PMSF) and attenuated coagulation after plasma recalcification. BJ-PI2 had fibrinolytic activity. BJ-PI2 increased the vascular permeability of rat dorsal skin (inhibited by 1,10-phenanthroline). BJ-PI2 was not hemorrhagic or myonecrotic but caused migration of inflammatory cells. In contrast, venom was strongly hemorrhagic and myonecrotic but caused less infiltration of inflammatory cells. These results indicate that BJ-PI2 is a non-hemorrhagic, non-myonecrotic, non-coagulant P-I class SVMP that may enhance vascular permeability and inflammatory cell migration in vivo, but is not a major contributor to venom-induced hemorrhage and necrosis / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Léa Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T16:19:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Collaco_RitadeCassiadeOliveira_M.pdf: 3001453 bytes, checksum: ea83fa3506989e7f90775d8ab6cf742a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Venenos de serpentes botrópicas são caracterizados pela indução de extenso dano local associado a feitos sistêmicos. Bothrops fonsecai é uma serpente de distribuição geográfica restrita das regiões montanhosas de Mata Atlântica cujo veneno é pobremente estudado. Recente estudo proteômico identificou que esse veneno possui principalmente metaloproteases, fosfolipases A2, Lectinas tipo C e serinoproteases. Ensaios experimentais utilizando antiveneno botrópico comercial para neutralizar as atividades biológicas de venenos botrópicos possibilitam não somente respostas de cunho clínico (tratamento de acidentes), mas também se constitui em uma valiosa ferramenta farmacológica para avaliar a existência de diferenças na composição dos diversos venenos através da reatividade cruzada entre veneno e antiveneno. Levando em consideração esses fatos, este trabalho teve como objetivo estudar a toxicidade do veneno de B. fonsecai através da atividade bloqueadora sobre a junção neuromuscular, atividade miotóxica, hemorrágica, edematogênica e coagulante assim como a sua caracterização bioquímica. A neutralização dessas atividades por antiveneno botrópico comercial e a comparação das ligações antígeno:anticorpo (veneno:antiveneno) entre B. fonsecai e os antivenenos botrópico comercial e específico usando SE-HPLC e immunoblotting também foram avaliadas. O veneno de B. fonsecai apresentou atividade fosfolipásica, sendo essa provavelmente a maior responsável pelo bloqueio neuromuscular e miotoxicidade, além de ser uma das mediadoras da atividade edematogênica; a inibição parcial dessa atividade pelo antiveneno comercial corrobora com a neutralização parcial dos efeitos na junção neuromuscular e redução da atividade edematogênica, já a neutralização total da atividade miotóxica demonstra que as PLA2 catalíticas podem não ser as principais responsáveis pela miotoxicidade. Embora o veneno apresente metaloproteinases P-I e P-III, a atividade proteolítica não demonstrou-se marcante in vitro, diferente do ensaio de atividade hemorrágica (induzida principalmente por essas enzimas e que foi completamente inibida pelo antiveneno comercial) o que leva a crer que o ensaio enzimático esteja subestimando essa atividade. O veneno exibiu atividades esterásica e coagulante que são normalmente causadas por serinoproteases e ambas foram inibidas pelo antiveneno botrópico comercial, em menor grau na proporção 5:1 (recomendada pelo fabricante) que a obtida em 5:2. O antiveneno botrópico comercial apresentou reatividade-cruzada em todas as atividades testadas, porém sua afinidade com o veneno de B. fonsecai demonstrou-se baixa ressaltando que o veneno de B. fonsecai possui composição diferente do veneno das serpentes utilizadas na produção do antiveneno comercial, em especial as fosfolipases catalíticas, metaloproteinases P-I e serinoproteases / Abstract: Bothropic snake venoms are characterized for a marked local damage associated to systemic effects. Bothrops fonsecai is a Brazilian pit viper of restrict distribution (Atlantic Forest at high altitude regions) and its venom has been poorly studied but is known it has phospholipases A2, metalloproteases (P-I and P-III) and serine proteases. Experimental assays using commercial bothropic antivenom to neutralize the bothropic venom activities allows clinical responses (snakebites treatment) and also is a pharmacological tool to evaluate different venoms composition through venom:antivenom cross-reactivity. Thinking in all this, the aim of this work were the B. fonsecai venom toxicity analysis through the in vitro neuromuscular junction action, the myotoxic, hemorrhagic, edema-forming and coagulant activities, as well its biochemical characterization. The neutralization of those activities by the commercial bothropic antivenom and the comparison of venom:antivenom bindings (Bothrops fonsecai venom : Commercial and specific antivenoms) by SE-HPLC and immunoblotting were also evaluated. B. fonsecai venom had a high phospholipasic activity and this probably is the major responsible for neuromuscular blockade and miotoxicity caused by this venom. This activity is also one of edema-forming activity mediator (with metalloproteases P-I). The partial inhibition of this activity with both proportions (5:1 and 5:2) corroborates the partial neuromuscular blockade and edema neutralization; in contrast total the inhibition of miotoxicity allows us to suppose that the catalytic PLA2 are not the major responsible for the miotoxicity. The venom also showed a low metalloprotease activity (caused principally by P-I once is more abundant on this venom) and was not significantly inhibited by commercial bothropic antivenom at both proportions; these enzymes (especially P-III) also induced hemorrhage totally inhibited by commercial bothropic antivenom. The esterase and coagulant activities of this venom are caused mainly by serine-proteases; the commercial antivenom neutralization was more potent at 5:2 than 5:1 proportion. The commercial antivenom presented cross-reactivity in all tested activities but its low affinity with B. fonsecai venom indicates that the venom composition is a quite different than the composition of snake venoms used to produce the commercial antivenom, specially catalytic phospholipases, metalloproteases P-I and serine proteases / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

A Bothrops jararaca é a serpente de maior importância médica no Brasil. Vários estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar os componentes do veneno de serpentes, entretanto, a base molecular dos genomas das serpentes é pouco conhecida. Assim, foi realizado o sequenciamento e montagem do genoma da serpente Bothrops jararaca. Foram construídas bibliotecas tipo shotgun e mate-pair para realização de corridas de sequenciamento usando a tecnologia Illumina e sequências complementares foram obtidas em equipamento PACBIO RS II. Uma biblioteca de BACs também foi construída e 768 pools de 12 BACs foram sequenciados. Um grande conjunto de segmentos genômicos foi obtido e foi possível identificar genes de várias toxinas, entre elas SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs e VEGF. Ainda foi possível depreender o contexto genômico de muitos destes genes e identificamos os principais elementos repetitivos genômicos. Estes achados são relevantes para o entendimento da função e evolução do sistema venenífero e podem servir de base para outros estudos futuramente. / The pit viper Bothrops jararaca is the most medically important snake in Brazil. Several studies were conducted in order to characterize the components of snake venom. However, the molecular basis of snake genomes is poorly known. Hence, it was carried out the sequencing and assembly of the Bothrops jararaca snake genome. Shotgun and mate-pair libraries were constructed to perform sequencing runs using Illumina technology and complementary sequences were obtained in PACBIO RS II equipment. A BAC library was also constructed and 768 pools of 12 BACs were sequenced. A large number of genomic segments was obtained. It was possible to identify genes of several toxins, including SVMPs, SVSPs, BPPs, CRISPs and VEGF. In addition, it was possible to infer the genomic context related to most of these genes and identify the main genomic repetitive elements. These findings are relevant for understanding the function and evolution of the venom system and it provides the basis for further studies.

A espécie Bothrops atrox é responsável por grande parte dos acidentes no estado do Amazonas. No entanto, ainda são poucos os estudos sobre as toxinas que compõem o veneno dessa serpente, os mecanismos envolvidos na sintomatologia dos acidentes, bem como de formas de inibição. Os soros antiveneno utilizados atualmente com o objetivo de neutralizar as atividades sistêmicas e locais dos venenos mostraram reatividade cruzada entre componentes dos venenos de serpentes do gênero Bofhrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). No entanto alguns componentes do veneno não apresentaram essa reatividade (SILES-VILARROEL et al.., 1974), mostrando a existência de toxinas espécie específicas.Os venenos de serpentes estão sujeitos a grandes variações induzidas por diversos aspectos ontogenéticos e influencia do habitat. Assim, essas variações podem gerar toxinas espécie específicas cujos mecanismos de ação ainda são desconhecidos e que os anticorpos presentes nos antivenenos disponíveis não sejam capazes de reconhecer e neutralizar eficientemente. O gênero Bothrops possui espécies extremamente variáveis, algumas de difícil classificação taxonõmica, e novas espécies têm sido descobertas recentemente. Como contribuição para o acúmulo de informações a respeito das diferentes composições do veneno do gênero Bothrops, e para o conhecimento de toxinas já isoladas e as ainda não isoladas na espécie tipo Bothrops atrox, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno.Os dados obtidos são importantes para a elaboração de um painel da expressão gênica dessa espécie e permitirá a identificação de toxinas que podem ser comuns ou não ao veneno de outras espécies do gênero. Aliado a isso, esses dados permitirão a correlação com o estudo proteõmico, e possivelmente fornecerão subsídios para a melhoria da terapêutica empregada no tratamento dos casos envenamento na região. / The species Bothrops atrox is responsible for most accidents in state of Amazonas. However, there are few studies on toxins that make up the venom of this snake, mechanisms involved in symptomatology of accidents, as well as inhibition forms. Sera antivenom currently used in order to neutralize the systemic and local activities of the venoms showed cross-reactivity between components of the venom of Bothrops (MOURA DA SILVA et al., 1990). However some components of the venom showed no reactivity (SILES-VILARROEL et al., 1974), indicating the existence of species-specific toxins. Snake venoms are subject to large variations induced by several aspects and influences of ontogenetic habitat. Thus, these variations can produce toxins whose mechanisms of species-specific action are still unknown and antibodies present in available antivenoms maybe not are capable to recognize and neutralize some toxins efficiently. Bothrops species have highly variable, some of difficult taxonomic classification and new species have been discovered recently. As a contribution to gain of information about of different compositions of Bothrops venom and to knowledge of toxins not yet isolated and the isolated in Bothrops atrox type species we constructed a venom gland cDNA library . The data obtained are important for the development of gene expression panel of this species and enable the identification of toxins common or not in the venom of other species. These data will allow correlation with the proteomic study, and possibly provide input for improving the therapeutic used in the treatment of accidents cases in the region.

DANTAS, R. T. Injúria renal induzida pelo veneno de Bothrops insularis e o papel da molécula KIM-1 como biomarcador precoce. 2016. 115 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-05-02T12:14:21Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rtdantas.pdf: 2850420 bytes, checksum: 973812f956568b671c624d424164e595 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-05-02T12:14:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rtdantas.pdf: 2850420 bytes, checksum: 973812f956568b671c624d424164e595 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T12:14:45Z (GMT). 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The effects of BinsV were also evaluated after incubation with renal cell lines of proximal tubules of monkeys and humans, LLC-MK2 and HK2, respectively; in the absence and presence of phenanthroline and catalase enzymes. Male Swiss mice weighing between 25 and 30 g were inoculated with BinsV intramuscularly (3.5 mg / kg) and observed for 24 hours in the metabolic cage model. The animals’ urine, blood, and kidneys were collected for analysis of the following parameters: urinary and serum levels of creatinine, urinary levels of the KIM-1 protein, histological analysis of the kidneys and oxidoreductive balance evaluation in renal tissue. In the renal tubular cell study, cell viability and cell death profile were evaluated for necrosis/apoptosis using annexin/7-AAD markers, whereas rhodamine was used for evaluation of mitochondrial transmembrane potential and dichlorofluorescein (DCF) for the evaluation of reactive oxygen species (ROS) production. BinsV promoted an increase in plasma creatinine, reduced glomerular filtration rate, and increased urinary levels of the biomarker KIM-1. Histological analysis of renal tissue disclosed mesangial swelling, glomerular degeneration and swelling, hydropic degeneration, tubular swelling, and interstitial edema in the renal cortex of animals treated with BinsV. In the medulla, the following alterations were identified: inflammatory cell infiltration, small congested vessels, hydropic tubular degeneration with Tamm-Horsfall protein (THP) secretion, as well as the presence of inflammatory cells in the interstitium. LLC-MK2 cells that were incubated with BinsV had viability reduction, with partial blocking of this effect in the presence of the catalase enzyme. There was an increase in the number of cells labeled with 7-AAD, an effect not observed in the presence of phenanthroline or catalase; however, phenanthroline promoted an increase in the number of cells with double labeling, whereas catalase caused an increase in the number of non-labeled cells. BinsV induced loss of mitochondrial transmembrane potential, which did not change when incubated with phenanthroline, whereas this effect was partially reversed in the presence of catalase. A reduction in the viability of HK2 cells was observed in the presence of BinsV, an effect that was partially blocked in the presence of phenanthroline or catalase. There was a reduction in the mitochondrial transmembrane potential, an effect exacerbated by phenanthroline and partially blocked by catalase. An increase in ROS production was also observed, an effect that was partially blocked in the presence of phenanthroline or catalase. These data suggest BinsV toxicity on renal tissue and proximal tubular cells. / A lesão renal aguda (LRA) é uma das mais importantes complicações do envenenamento botrópico, sendo considerada uma das principais causas de morte nestes acidentes. A creatinina plasmática vem sendo utilizada como biomarcador de injúria renal há mais de 90 anos, entretanto tem baixa sensibilidade e especificidade para a lesão renal aguda. A demanda por um teste capaz de detectar os estágios desta lesão tem estimulado a busca de novas ferramentas diagnósticas. Uma vez que células tubulares epiteliais são os principais alvos dos efeitos tóxicos dos venenos, este trabalho avaliou as ações do veneno de Bothrops insulairs (BiVT) sobre a função renal de camundongos, examinando o papel da proteína KIM-1 como biomarcador precoce de LRA. Também foram avaliados os efeitos do BiVT após incubação com linhagens celulares renais de túbulos proximais de macaco e humana, LLC-MK2 e HK2, respectivamente; na ausência e na presença das enzimas fenantrolina e catalase. Camundongos Swiss machos pesando entre 25-30 g foram inoculados com o BiVT por via intramuscular (3,5 mg/Kg) e observados por 24 horas no modelo de gaiola metabólica. Urina, sangue e os rins dos animais foram coletados para análise dos seguintes parâmetros: níveis urinário e sérico de creatinina, nível urinário da proteína KIM-1, análise histológica dos rins e avaliação do equilíbrio óxido-redutor no tecido renal. No estudo com células tubulares renais foram avaliados a viabilidade celular, o perfil de morte celular através da marcação com os marcadores anexina/7-AAD para avaliação de necrose/apoptose, rodamina para avaliação do potencial transmembrânico mitocondrial e DCF para avaliação da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). O BiVT promoveu um aumento da creatinina plasmática, reduziu a taxa de filtração glomerular e aumentou os níveis urinários do biomarcador KIM-1. A análise histológica do tecido renal revelou tumefação mesangial, degeneração e tumefação glomerulares, degeneração hidrópica, tumefação tubular e edema intersticial no córtex renal dos animais tratados com o BiVT. Na medula foram visualizadas as seguintes alterações: infiltração de células inflamatórias, pequenos vasos congestos, degeneração tubular hidrópica com secreção da proteína Tamm-Hosrsfall; e no interstício, presença de células inflamatórias. Células LLC-MK2 incubadas com o BiVT, tiveram redução de viabilidade, com bloqueio parcial deste efeito na presença da enzima catalase. Houve um aumento do número de células marcadas com 7-AAD, efeito não observado quando na presença de fenantrolina ou catalase; entretanto, a fenantrolina promoveu um aumento no número de células com dupla marcação e a catalase, um aumento no número de células não-marcadas. O BiVT induziu perda de potencial transmembrânico mitocondrial que não sofreu alteração quando incubado com fenantrolina, mas apresentou reversão parcial deste efeito na presença da catalase. Na presença do BiVT foi vista uma redução da viabilidade das células HK2, efeito parcialmente bloqueado na presença da fenantrolina ou catalase. Houve redução do potencial transmembrânico mitocondrial, efeito exacerbado pela fenantrolina e parcialmente bloqueado pela catalase. Também foi visto um aumento na produção de EROs, efeito parcialmente bloqueado na presença de fenantrolina ou catalase. Esses dados sugerem toxicidade do BiVT sobre o tecido renal e células tubulares proximais.

ALVES, Natacha Teresa Queiroz. Efeito do extrato das raízes de Bredemeyera floribunda Willd sobre a ação local do veneno de Bothrops jararacussu em camundongos. 2013. 96 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2014-06-03T13:09:17Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_ntqalves.pdf: 3590591 bytes, checksum: c3151ac025ccd0d99b85c8018cd11480 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2014-06-03T13:09:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_ntqalves.pdf: 3590591 bytes, checksum: c3151ac025ccd0d99b85c8018cd11480 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-03T13:09:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_ntqalves.pdf: 3590591 bytes, checksum: c3151ac025ccd0d99b85c8018cd11480 (MD5) Previous issue date: 2013 / Snakebites are an important public health burden. In Brazil, most of these accidents are caused by snakes of the Bothrops genus that can lead to development of local tissue damage, including edema and hemorrhaging. Traditional antivenom therapy acts in the neutralization of systemic effects, but it has limited effectiveness of neutralizing the local effects. The antivenom activity was evaluated of aqueous extract of Bredemeyera floribunda (Bfe) through inhibition of phospholipase, proteolytic, edematogenic, hemorrhagic, necrotizing and myotoxic actions promoted by the total Bothrops jararacussu venon (Bjuv) in mice. The acute toxicity and the viability cell of the Bfe in RAW 264.7 cells were determined too. The BfE showed to be nontoxic in mice and it showing LD50 greater than the test dose (2000 mg / kg). The Bfe increased cell viability in RAW 264.7 cells. The phospholipase and proteolytic activities induced vBju were inhibited in vitro by EBF in 1:1, 1:2 and 1:3 ratios. 1:2 (Bjuv /Bfe; w/w). The Bfe also inhibited significantly edema induced by Bjuv, with a reduction of the peak oedematogenic in the venom and carrageenan groups, mainly in the group pretreated i.p. The Bfe decreased considerably hemorrhagic, necrotizing and myotoxic actions by Bjuv. Compounds isolated from plants popularly used to treat snake poisoning show good alternative to complement the antivenom treatment. Constituents of the Bfe may act by binding to Bjuv components as phospholipase A2 and their homologues and matalloproteases too, partly blocking the action of these proteins, reducing edema and phospholipasic activities, but also hemorrhaging and proteolytic activities. So there is real antiophidic activity of the extract, making necessary to study it with isolated components of the Bfe and Bjuv to achieve better evidences of the effects and possible mechanisms. / Acidentes ofídicos representam considerável problema de saúde pública. No Brasil, a maior parte desses acidentes é causada por serpentes do gênero Bothrops, que podem levar ao desenvolvimento de dano tecidual local, incluindo edema e hemorragia. A soroterapia tradicional atua na neutralização de efeitos sistêmicos, mas tem eficácia limitada contra efeitos locais. Compostos isolados de plantas usadas popularmente para tratar envenenamentos ofídicos mostram-se uma boa alternativa a fim de se complementar o tratamento. Avaliou-se a atividade antiofídica do extrato aquoso de Bredemeyera floribunda (Ebf) através de testes de inibição de atividades fosfolipásica, proteolítica, edematogênica, hemorrágica, necrosante e miotóxica promovidas pelo veneno total de Bothrops jararacussu (vBju) em camundongos. Também foi realizado o teste de toxicidade aguda do Ebf e de viabilidade celular em células RAW 264.7. O EBf mostrou-se átoxico em camundongos, apresentando DL50 maior do que a dose teste (2000 mg/kg). O EBf aumentou a viabilidade celular em células RAW 264.7. As atividades fosfolipásica e proteolítica induzidas pelo vBju foram inibidas in vitro pelo EBf nas razões de 1:1. 1:2 e 1:3 (vBju/EBf) (massa/massa). O EBf também inibiu significativamente edema induzido por vBju, havendo redução do pico edematogênico máximo do veneno e da carragenina, nos grupo pré-tratado i.p e pré-incubado. O EBf diminuiu consideravelmente as ações hemorrágica, necrosante e miotóxica do vBju. Constituintes do EBf, podem estar se ligando a componentes do vBju como as fosfolipases A2 e seus homólogos e também as metaloproteases, bloqueando parcialmente a ação dessas enzimas e diminuindo as atividades fosfolipásica e edematogênica, como também, as ações hemorrágica e proteolítica do veneno. Verifica-se, então, atividade antiofídica do extrato, fazendo-se necessário o estudo com componentes isolados do EBf e do vBju a fim de se conseguir melhor comprovação dos efeitos e possíveis mecanismos.

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 carolina_nicolau_ioc_dout_2016.pdf: 5977694 bytes, checksum: af8dc8894964ad483ed199c8a766fe4e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Além de potencialmente letais, envenenamentos ofídicos frequentemente acarretam elevados índices de morbidade e são reconhecidos pela Organização Mundial da Saúde como uma condição negligenciada de saúde pública. Atualmente, um dos maiores problemas associados ao envenenamento por serpentes é a baixa eficácia dos soros antiofídicos em neutralizar os efeitos tóxicos locais (ex.: hemorragia e necrose). A seleção dos venenos que compõem o pool de imunização dos cavalos é uma etapa crucial na produção do soro antiofídico e um dos critérios utilizados é a classificação filogenética das serpentes. Neste contexto, com vistas à possível otimização do soro antiofídico produzido no Brasil, utilizamos a abordagem proteômica shotgun para caracterizar os venenos utilizados como antígenos na produção do soro antibotrópico produzido pelo Instituto Butantan. Outros dois venenos que não fazem parte do pool também foram analisados. Os resultados proteômicos deste trabalho indicaram que a classificação filogenética (baseada fundamentalmente em características morfológicas das serpentes e análises de DNA mitocondrial) não mostra boa correlação com a composição proteica dos venenos. Como os efeitos do envenenamento estão diretamente relacionados com os componentes proteicos, análises venômicas podem auxiliar na escolha do pool de imunização, aprimorando a eficácia do soro antiofídico. O emprego de inibidores toxinoespecíficos para administração local é uma possível alternativa na busca de terapias antiofídicas mais efetivas. Metalopeptidases (SVMP) são as principais responsáveis pela hemorragia local, sendo sintetizadas na forma de pró-enzimas. Acredita-se que o pró-domínio destas toxinas seja responsável pela modulação de sua atividade catalítica, através de um mecanismo conhecido por cysteine-switch Utilizamos as abordagens de avaliação de formação de complexo em condições nativas e cross-linking aliado à espectrometria de massas de alta resolução, para mapearmos a região de interação entre o pró-dominio recombinante (PD-Jar) de jararagina (principal metalopeptidase do veneno de Bothrops jararaca) e diferentes metalopeptidases isoladas de venenos botrópicos. Os resultados mostraram que, em concentrações equimolares, PD-Jar foi capaz de interagir com as SVMP da classe PI (BaP1, atroxlisina-I e leucurolisina-a), porém, foi degradado por todas as SVMP estudadas. Desta forma, o uso de PD-Jar na terapia antiveneno pode não ser efetivo; entretanto, pode auxiliar na elucidação do mecanismo de ativação das SVMP. Por outro lado, ainda que os componentes dos venenos possam causar efeitos deletérios significativos, eles também podem apresentar valor terapêutico. Recentemente, observamos que o peptidoma do veneno de B. jararaca é significativamente mais complexo do que previamente descrito na literatura. Desta forma, utilizando genômica funcional aliada à abordagem connectivity map, triamos o peptidoma por possíveis novas atividades biológicas relevantes. Diversas atividades potenciais, tais como antimalárica, anti-inflamatória e imunossupressora foram detectadas e serão submetidas à etapa de validação complementar. Em resumo, o presente trabalho mostrou a necessidade de estudos venômicos apara aperfeiçoar a escolha do pool de imunização para a produção do soro antibotrópico, confirmou a interação entre PD-Jar e algumas SVMP-PI e foi mostrado, pela primeira vez, um peptidoma de serpentes significativamente diverso com potencial terapêutico. Esses resultados poderão contribuir para o aprimoramento da terapia antiofídica atual e para a prospecção por novos fármacos para o tratamento de diferentes patologias / Snakebite envenoming induces high levels of morbidity, besides its lethality potential and have been classified as a neglected health condition by the World Health Organization. Currently, the major issue associated to snakebite envenoming is the low efficacy of the antiophidic serum to neutralize the toxic local effects such as hemorrhage and necrosis. One of the most essential steps in antivenom production is the appropriate choice of venoms to compose the horses\2019 immunization pool, which takes into account the phylogenetic classification of snakes. Thus, aiming at improvements in the efficacy of antibothropic sera produced in Brazil, we used shotgun proteomics to characterize the venoms used as antigens for the antibothropic serum production by the Butantan Institute. We also analyzed two other venoms not used in the immunization pool. The proteomic results indicated that phylogenetic classification (based on morphological features and mitochondrial DNA analysis) does not display good correlation to snake venom composition. Considering that the envenoming effects are directly related to venom proteins, venomic analysis may contribute for a more rational design for immunization pool, improving the efficacy of the antiophidic serum. The local administration of toxin-specific inhibitors may represent a good alternative for development of more effective antiophidic therapies. Metallopeptidases (SVMPs), mainly responsible for the local hemorrhage, are synthesized as a pro-enzyme. It is believed that the prodomain of SVMPs is responsible for the modulation of their catalytic activity, through a mechanism known as cysteine-switch Thus, we used complex formation assays in native conditions and with cross-linking allied to high resolution mass spectrometry, to map the interaction region between a recombinant prodomain (PD-Jar) from jararhagin (major class PIII SVMP from Bothrops jararaca venom), and different SVMPs isolated from bothropic venoms. The results indicated that PD-Jar is able to interact, in equimolar concentrations, with class P-I SVMPs (BaP1, atroxlysin-I and leucurolysin-a) but it was degraded by all SVMPs studied. Thus, PD-Jar may not be effective in antivenom therapy; however, it may contribute for the elucidation of the mechanism of activation of SVMPs. On the other hand, besides the dreadful effects of snake venom components, they display a therapeutic potential. Recently, we observed that the B. jararaca venom peptidome is far more complex than previously reported in the literature. Thus, using functional genomics associated to connectivity map approach, we screened for novel relevant activities in this peptidome. We identified different potential activities such as antimalarial, anti-inflammatory and immunosuppressive, which will be further validated through biological assays. In summary, in the present work we showed the importance to use venomic studies to improve the rational design for immunization pool for antibothropic serum production, we confirmed the interaction between PD-Jar and some SVMP-PI and we showed, for the first time, a significant diverse snake venom peptidome with therapeutic potential. Thus, these results may further contribute for improvements in the antiophidic therapy and for prospecting novel drugs to be applied to the treatment of different pathologies